Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Live-celle måling av Odorant reseptor aktivisering benytter en sanntid leiren analysen

Published: October 2, 2017 doi: 10.3791/55831
Automatic Translation
*1, *1, 2,3, 1,4
1Department of Pathophysiology, Key Laboratory of Cell Differentiation and Apoptosis of National Ministry of Education, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine, 2Department of Molecular Genetics and Microbiology, Duke University Medical Center, 3Department of Neurobiology, Duke Institute for Brain Sciences, Duke University Medical Center, 4Institute of Health Science, Chinese Academy of Science/Shanghai Jiao Tong University School of Medicine
* These authors contributed equally

Summary

Karakterisere funksjon odorant reseptorer serverer en uunnværlig del i deorphanization prosessen. Vi beskriver en metode for å måle aktivering av odorant reseptorer i sanntid ved hjelp av en leir analysen.

Abstract

Enorme størrelsene av pattedyr odorant reseptor (OR) presentere vanskeligheter å finne deres beslektet ligander blant mange flyktige kjemikalier. For å effektivt og nøyaktig deorphanize ORs, kombinere vi bruk av en heterologous celle linje å uttrykke pattedyr ORs og en genetisk modifisert biosensor plasmider for å måle leiren produksjon nedstrøms av OR aktivisering i sanntid. Denne analysen kan brukes til skjermen odorants mot ORs og vice versa. Positiv odorant-reseptor interaksjoner fra skjermene kan bekreftes senere ved å teste mot ulike lukt konsentrasjoner, genererer konsentrasjon svar kurver. Her brukte vi denne metoden til å utføre en høy gjennomstrømming screening av en illeluktende sammensatte mot et menneskelig OR bibliotek uttrykt i Hana3A celler og bekreftet at positivt-svare reseptoren beslektet reseptoren for sammensatte interesse. Vi fant denne høy gjennomstrømming oppdagelsen metoden å være effektive og pålitelige vurdere OR aktivisering og våre data gir et eksempel på bruken potensielle OR funksjonelle studier.

Introduction

Luktesans spiller en viktig rolle i dyrenes overlevelse som de er avhengige av sine olfactory evner til å skaffe mat, unngå rovdyr og fare, skille arter og velg kompis1,2. Realisering av disse funksjonene avhenger odorant receptors (ORs), som er individuelt på ciliary overflaten av olfactory sensoriske neurons (OSNs) i olfactory epitel (OE). ORs utgjør den største familien av G-protein kombinert reseptor (GPCR) gruppe med ca 400 og 1200 forskjellige OR gener i menneskelig og mus, henholdsvis3,4,5. ORs aktivert ved odorants føre til økt intracellulær leiren nivå via sekvensiell aktivering av olfactory G-protein (Golf) og type III adenylyl cyclase (ACIII). Den resulterende intensivering av intracellulær leiren kan fungere som en andre budbringer, som åpner nukleotid-gated kanal på celleoverflaten, utløser tilstrømningen av kasjoner inkludert Ca2 + og handling potensialer, og til slutt starte Nevro-potensielle overføring og olfactory oppfatning. Oppdage og diskriminerende mange odorants av ORs regnes som det første trinnet olfactory oppfatning6,7.

Siden Buck og Axel8 først ble klonet odorant reseptorer og belyst mekanismen av olfactory oppfatning initiert av ORs, ble deorphanization av OR familien en av hotspots i dette feltet. Ulike i vivo, ex vivo og i vitro metoder for å måle OR aktivisering har vært rapportert9,10,11,12. En tradisjonell metode som brukes Ca2 + imaging etterfulgt av encellede RT PCR på OSNs aktivert identifikasjon av ulike ORs til alifatisk odorants13,14,15. Flere nylig, bruk av store transcriptome analyser promoterte utviklingen av flere høy gjennomstrømming i vivo metoder. Kentucky analysen identifiserte eugenol - og muscone-responsive musen ORs med bruk av S100a5-tauGFP reporter musen belastning og microarray analyse9. DREAM teknologien basert på nedgangen i OR mRNA nivåer etter odorant eksponering, og ansatt en transcriptomic tilnærming til å bestemme OR aktivisering profiler i begge vertebrate og ikke-virveldyr16. Tilsvarende gitt fosforylering av S6 i neuronal aktiveringer, Matsunami gruppe sekvensert mRNAs fra fosforylert ribosom immunoprecipitations å identifisere forståelsesfull ORs12. Til slutt, gruppen Feinstein rapportert super snuse mus som kan tjene som en plattform for å studere lukt koding i vivo, kjent som MouSensor teknologi17.

I området i vitro gjør utfordringen med dyrking OSNs et heterologous uttrykk system som etterligner OR funksjonelle uttrykk i vivo en ideell løsning å gjennomføre omfattende screening av luktende kjemikalier for ORs. Likevel, siden kulturperler linjer av ikke-olfactory opprinnelse avvike fra opprinnelige OSNs eller proteiner er beholdt i det endoplasmatiske retikulum og ikke trafikk til plasma membranen, som resulterer i OR fornedrelse og tap av reseptor funksjonen18 , 19. for å løse dette problemet, omfattende verk er gjort å gjenskape OR funksjonelle uttrykk i cellemembranen i heterologous linjer. Krautwurst et al. først knyttet de første 20 aminosyrene av rhodopsin (Rho-tag) til N-terminalen OR protein og dette forfremmet celle-overflate uttrykk for noen ORs i menneskelige embryonale nyre (HEK) celler20. Ved å gjennomføre en seriell analyse av gene expression (SAGE) bibliotek analyse fra enkelt OSNs, Saito et al. først klonet reseptor-transport familiemedlemmer for protein (RTP), RTP1 og RTP2 og reseptor uttrykk enhancer protein 1 (REEP1) som muliggjorde OR smuglingen til cellemembranen og forbedret odorant-mediert svar av ORs i HEK293T celler 21. basert på disse resultatene, gruppen Matsunami opprettet Hana3A celle linjen stabilt transfekterte med RTP1, RTP2, REEP1 og Gαolf i HEK293T og transiently transfekterte med Rho-merket ORs, for effektiv eller funksjonell uttrykk. Senere studier avdekket 1) kortformen av RTP1, RTP1S, som mer robust fremme eller funksjon enn det opprinnelige RTP1 proteinet og 2) den type 3 muscarinic acetylcholin reseptoren (M3R) som kan forbedre OR aktivitet via hemming av β-arrestin-2 Rekruttering, begge ble introdusert til heterologous uttrykk systemet å optimalisere eksperimentelle utgang22,23.

Flere gjenkjenningsmetoder har blitt brukt å kvantifisere reseptor aktivisering i heterologous systemer. Utskilles placental alkalisk fosfatase (SEAP) analysen fungerer med en reporter enzymet transcriptionally regulert av leiren respons elementer (CREs), noe som gjør det til et attraktivt alternativ for å vurdere OR aktivisering. Fluorescensen oppdages lett i et utvalg av kultur medium etter inkubasjon med SEAP gjenkjenning reagens24. Bruker denne metoden, preget funksjonene ORs samt en sekundær klasse av chemosensory reseptorer uttrykt i OE-sporet Amin-assosiert reseptorer (Milton) har vært25,26,27. En annen vanlig metode, luciferase analysen, bruker et firefly luciferase reporter gen under kontroll av leiren svar elementet (Grobunn). Måle luminescence generert av luciferase produksjon gir en effektiv og robust måte å kvantifisere OR aktivisering10,11,28.

Sanntid leiren analyser har også vært mye brukt i dynamisk overvåking funksjon heterologous eller endogene GPCRs. Et eksempel på slike avanserte analyser utnytter en genetisk kodet biosensor varianten, som besitter en cAMP-bindende domene smeltet sammen til en mutant form av luciferase. Når leiren binder fører conformational endringen til aktivering av luciferase, luminescence som kan deretter måles med chemiluminescence leseren29,30. Sanntid leiren teknologien har blitt rapportert egnet for de orphaning av menneskelig odorant reseptorer i HEK293 og NxG 108CC15 cellerass = "xref" > 31,32,33, så vel som Hana3A HEK293T-avledet celler34,35. Gruppen Krautwurst også beskrevet i detalj i sanntid leiren teknologi for å være egnet for toveis store eller sortering tilnærminger32,33.

Her beskriver vi en protokoll for å måle OR aktivisering benytter en sanntid leiren analysen i Hana3A celler. I denne protokollen målt luminescence pre equilibrated levende celler kinetically i 30 min etter behandling med bestemt flyktige forbindelser, som representerer en mer effektiv og nøyaktig analyse av OR aktivisering som er mindre utsatt for gjenstander som oppstår i mobilnettet miljø med lengre tid og lukt-indusert celle toksisitet. Denne sanntids måling gir en storstilt screening ORs og ligander, samt karakteristikk av OR-ligand datamaskinpar rundt. Bruker denne metoden, identifisert vi har OR5AN1 som reseptoren for moskus sammensatte muscone ved å utføre en screening mot 379 menneskelige ORs og deretter bekrefter positive screening resultatet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Culturing og vedlikehold av Hana3A celler

  1. vedlikeholde celler i 10 mL av minimum viktig medium (MEM) med 10% fosterets bovin serum (FBS), 100 µg/mL penicillin-streptomycin, og 1,25 µg/mL amfotericin B i en 100 mm celle kultur parabol i en 37 ° C celle kultur inkubator med 5% CO 2. Hver annen passasje, legge til 1 µg/mL puromycin for å opprettholde stabil transfection av plasmider (se innledningen).
    Merk: Utfører alle trinn som involverer cellekultur i en klasse II biologiske sikkerhetskabinett regjering å sikre sterilt miljø.
  2. Subkultur i forholdet 10-20% i 100 mm retter hver 2-3 dager.

2. Kontaktflate celler for hva

  1. observere Hana3A cellene under et mikroskop kontrast å sikre celle levedyktighet og beregne samløpet.
  2. Sug opp alle medium fra celle kultur parabol.
  3. Vask celler ved å legge 10 mL fosfat-bufret saltoppløsning (PBS) på tallerkenen, virvlende parabolen og aspirating PBS.
  4. Legge 3 mL 0,05% trypsin-ethylene diamine tetraacetic syre (EDTA) på platen. Blandingen i 1 min eller til alle celler er flytende.
    Merk: Observere utviklingen av celler frakobling fra bunnen av platen under mikroskopet nødvendig.
  5. Inactivate trypsin ved å legge til 5 mL av MEM med 10% FBS og pipette opp og ned for å bryte opp biter av celle Mass
    Merk: For plating før transfection, mediet som brukes bør ikke inneholde antibiotika. Tillegg av antibiotika kan redusere transfection effektivitet.
  6. Overføre en passende mengde celler slik 15-mLl hvor mange plater å bli transfekterte. For hver 96-brønns plate, plate 2 x 10 6 celler eller ca 1/5 av en 100% confluent 100 mm rett, gi en celletall 2 x 10 4 celler per brønn eller en tetthet ca 15-30% samløpet per brønn. Sentrifuge rør på 200 x g i 5 min og Sug opp nedbryting uten å forstyrre den cellen pellet.
    Merk: Beregne riktig mengde celler for å være belagt på 96-brønns plater å unngå gjengroing eller undergrowing celler før stimulering.
  7. Legge til en passende mengde MEM med 10% FBS i 15-mL tube og Pipetter opp og ned for å bryte opp biter av cellen masse. For hver 96-brønns plate, resuspend cellene med 6 mL av MEM med 10% FBS.
    Merk: Vær forsiktig med å generere luftbobler i røret.
  8. Legge suspendert cellene i et reservoar. Bruker en flerkanals pipette, Pipetter 50 µL av celler på hver brønn av en 96-brønns plate. Ruge over natten på 37 ° C med 5% CO 2.

3. Hva av plasmider

  1. før transfection, observere belagt cellene å sikre et riktig samløpet av ca 30-50% per brønn under fase kontrast mikroskop og inkubator.
  2. Forberede på forhånd Rho-merket OR konstruere 11 , 21 , 22 , 28, tilbehør faktoren konstruerer (RTP1S 22 , 36 og M3R 23), og biosensor varianten konstruere 29 , 30 av miniprep. Kvantifisere DNA konsentrasjonen av et spektrofotometer og justere plasmider DNA konsentrasjoner (f.eks til 100 ng/µL) med destillert vann nødvendig.
  3. Utarbeidelse av Transfection blandinger
    1. forberede en plasmider transfection blanding i 500 µL av MEM hver 96-brønns plate etter tabell 1.
      Merk: Når forskjellige ORs er testet på samme 96-brønns plate, volumet av transfection blandingen og mengden plasmider DNA lagt må tilpasses i funksjonen antall transfekterte brønner med et gitt eller.
    2. Forbered en transfection blanding i et rør med 18 µL av lipid-formidlet transfection reagensen i 500 µL av MEM.
  4. Blande plasmider blandingen med transfection blanding av pipettering opp og ned. Inkuber ved romtemperatur i 15 min.
  5. Stoppe reaksjonen ved å legge til 5 mL av MEM med 10% FBS.
  6. Spredt ut et tykt lag av sterile papirhåndklær i celle kultur panseret. Ta en 96-brønns plate med celler fra inkubator. Forsiktig og gjentatte trykk platen opp ned på haugen med papirhåndkle slik at mediet er helt absorbert av papirhåndkle.
    Merk: Ikke kraftig eller brått trykk platen som en kunne miste celler.
  7. Overføre 50 µL av kombinerte transfection blandingen i hver brønn av 96-brønns plate og ruge over natten for 18-24 h på 37 ° C med 5% CO 2.
    Merk: En tid-klart hva og stimulering tidsplan bør foran målingen når flere 96-brønns plate er testet i ett eksperiment for å ha alle platene målt etter transfection samtidig og stimulans eksponeringstid.

4. Stimulering og måle eller aktivitet ved hjelp av Real-Time cAMP analysen

  1. observere transfekterte cellene under et mikroskop kontrast å sikre et riktig samløpet mellom 50-80% per brønn og inkubator.
  2. Forberede stimulering medium ved å legge 10 mM hydroxyethyl piperazineethanesulfonic acid (HEPES) og 5 mM glukose til Hank ' s balansert Salt løsning (HBSS).
  3. Tine sanntid leiren analysen substrat reagens dele på is. Lagre substrat reagens ved-80 ° C til 55 µL per rør i PCR rør. Bruk 1 t per plate.
  4. Forberede 2% balanse løsning ved å blande 55 µL av underlaget reagensen og 2750 µL HBSS/HEPES/glukose løsning.
  5. Spredt ut et tykt lag med papirhåndklær på benken. Forsiktig og gjentatte trykk platen opp ned på papirhåndkle slik at hva mediet er helt absorbert av papirhåndkle.
  6. Vask cellene av pipettering 50 µL av HBSS/HEPES/glukose løsning i hver brønn.
  7. Forsiktig og gjentatte trykk HBSS/HEPES/glukose løsningen fra 96-brønns platen.
  8. Pipette 25 µL av 2% balanse løsning til hver godt og ruge ved romtemperatur i mørket 2 h.
  9. Forberede på forhånd 1 M odorant lager løsninger i DMSO og butikk på 20 ° C til brukes.
  10. Før slutten av inkubasjon tiden, fortynne odorant lager løsninger til arbeider konsentrasjoner i HBSS/HEPES/glukose stimulering medium.
    Merk: Konsentrasjonen av odorant fortynninger i dette trinnet burde bli doblet for å gi de riktige siste konsentrasjonene i hver brønn.
  11. Bruker en chemiluminescence plate leseren og før odorant tillegg, måle basal luminescence nivået av platen for 2 ganger etter hverandre med en hastighet på 1000 ms per vel 34.
  12. Fjerne raskt plate fra platen leseren og tilsett 25 µL odorant fortynninger hver brønn og umiddelbart begynne å kontinuerlig luminescence måling av alle brønner for 20 sykluser innen 30 min.
    Merk: Pipette nøye for å unngå forurensende nabolandet brønner når du bruker forskjellige odorants og/eller ulike konsentrasjoner av den samme odorants i den samme platen.

5. Dataanalyse

  1. eksportere dataene fra chemiluminescence plate leseren programvare.
  2. Beregn normalisert OR svaret for hvert punkt ved hjelp av formelen
    (luminescence N – luminescence basale) / (luminescence høyeste – luminescence basale)
    der N = luminescence verdi av en viss godt; basale = gjennomsnittlig luminescence verdi av to basale luminescence verdier. høyeste = høyeste luminescence verdien av en plate eller en rekke plater.
    Merk: Avhengig av formålet av eksperimentet, alternativ grafiske representasjoner kan vedtas. For eksempel for screening analyser (se figur 1) og genererer konsentrasjon svar kurver, luminescence verdien av et bestemt godt på et ønsket tidspunkt under kinetic måling, som maksimumsverdien eller endelige verdien, kan brukes.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Muscone er den viktigste aromatiske komponenten fra naturlige moskus. Nyere studier identifisert OR5AN1 som en menneskelig reseptor for muscone og andre macrocyclic musk forbindelser basert på homologi til musen eller, MOR215-1, Klon fra muscone svarer glomeruli i oppfører seg mus37,38. Screening menneskelige OR repertoaret, vår gruppe og Touhara gruppen også identifisert OR5AN1 som en stor reseptor for to macrocyclic musk forbindelser, cyclopentadecanone og muscone, henholdsvis, bruker den luciferase analysen systemet38,39 .

Med real-time leiren analysen beskrevet her, vist vi menneskelige OR repertoaret mot 30 µM muscone (figur 1). Blant de 379 menneskelige ORs vist, OR5AN1 dukket opp med fremtredende svar på muscone, mens de andre ORs og negative kontroller (no-lukt kontroll og kontrollen tom vektor) ikke viser en betydelig respons. Kontrollen positiv testet OR5AN1 mot 30 µM moskus tibetene, en ligand for OR5AN1 (upublisert data), og ble brukt til å normalisere ORs' svar på muscone. For grafisk fremstilling av dette settet med data plukket vi tidspunktet når den maksimale luminescence lese ble oppnådd for OR5AN1 mot 30 µM moskus tibetene.

Vi deretter undersøkt konsentrasjon svar forholdet mellom lukt-OR par med 3 ulike konsentrasjoner av muscone. For hver konsentrasjonen av muscone testet, de første 20 min etter muscone, responsen av OR5AN1 økt gradvis og deretter platå i de siste 10 min (figur 2A) mens spor for nei-lukt tillegg kontrollen (0 µM muscone) forble relativt flat. Høyere konsentrasjoner av muscone vakte sterkere OR svar enn lavere seg, som skilles gjennom måling. Bruker det siste tidspunktet fra kinetic måling, vi generert en konsentrasjon-respons kurve og konsentrasjonen for 50% av maksimal effekt (EF50) verdien av kurven er anslått til 20.82 µM (figur 2B).

Figure 1
Figur 1: Screening for menneskelig ORs av muscone.
379 unike menneskelige ORs ble vist mot 30 µM muscone bruker sanntid leiren analysen. Fargede blokker langs x-aksen viser ulike menneskelige OR familier. Hver kolonne på x-aksen viser en enkelt OR-type unntak kolonnene siste tre, som er svaret av OR5AN1 30 µM moskus tibetene (en positiv kontroll), responsen fra OR5AN1 til HBSS/HEPES/glukose løsning (en nei-lukt negativ kontroll), og responsen til Rho-pCI til 30 µM muscone (en tom vektor negativ kontroll), fra venstre til høyre. y-aksen viser normalisert luminescence 30 minutter etter odorant når svaret nådd maksimalt for positiv kontrollen (N = 3). Alle svar er normalisert positiv kontrollen. Feilfelt representerer standardfeil gjsnitt (SEM). For klarhets vises bare positive feilfelt. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2: Kinetic målinger av responsen på OR5AN1 muscone.
(A) sanntid målinger av OR5AN1 aktivering av muscone av ulike konsentrasjoner og en nei-lukt negativ kontroll ble utført innen 30 min odorant tillegg. Pilen viser tidspunktet odorant tillegg. (B) konsentrasjon-respons kurve av OR5AN1 mot muscone 30 minutter etter odorant. y-akser representerer normalisert luminescence (N = 3). Alle svar er normalisert til høyeste svaret 100 µM muscone. Feilfelt representerer SEM. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Plasmider Beløp per 96-brønns plate (µg)
Rho- eller 5
RTP1S 1
M3R 0,5
Leiren biosensor variant 1

Tabell 1: Komponenter av hva blandingen.
Per 96-brønns plate mengden av Rho-OR RTP1S, M3R, og sanntids leiren biosensor variant plasmider.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Nøyaktig måle en OR aktivisering ved eksponering til en viss odorant er det første trinnet i å tyde koding av olfactory informasjon. Eksperimentene vist i denne studien viser et eksempel på hvordan man kan identifisere, bruke en i vitro OR uttrykk system, forståelsesfull ORs blant menneskelige OR repertoaret for illeluktende kjemiske av interesse og senere karakteriserer reseptoren farmakologi ved hjelp av ulike konsentrasjoner av kjemiske. Resultatene bekrefter OR5AN1 som en bona fide reseptor for muscone. Dette er i samsvar med en tidligere rapport39 og gir ytterligere bevis for spekulasjon at bare et lite antall reseptorer er involvert i sensing moskus lukt27,40. Sammenliknet med screening dataene fra Sato-Akuhara et al. som genereres av luciferase analysen på et system som ligner eller heterologous, screening resultatene viste litt dårligere signal-til-støy-forhold. Foruten variasjoner iboende til de forskjellige teknikkene som er involvert kunne forskjellen i resultatet skyldes det faktum at vi brukte en lavere muscone konsentrasjon (30 µM vs 100 µM). Faktisk er EF50 verdien av konsentrasjon svar kurven av OR5AN1 mot muscone vi innhentet via sanntid leiren analysen i samme størrelsesorden som Sato-Akuhara et al. fikk i deres luciferase analysen system, demonstrere sammenlignbare resultater for det samme heterologous OR uttrykk systemet selv når forskjellige oppdagingsmetoder brukes. I en annen studie fant vår gruppe at sanntid leiren systemet kan være litt mer følsom enn luciferase reporter genet systemet i vurderingen OR2T11 reseptor selektivitet, gitt at et lite antall odorants var bare aktiv i det tidligere, men ikke i sistnevnte systemet35. Sammenlignet med en rekke data som rapporteres av Geithe et al. 31 på OR1A1 mot (+)-carvone, våre data på OR5AN1 mot muscone viste en forsinkelse i tiden det tar å nå platå, som kan direkte følge av forskjellige typer ORs og odorants brukes. I andre sanntid leiren analysen data rapportert fra vår gruppe, viste vi også varierende ganger toppen avhengig av ORs og odorants34,35. I tillegg ulike cellelinjer å uttrykke ORs, ulike substrat brukes, annen sanntid leiren biosensor variant plasmider, ulike følsomhet for chemiluminescence plate leseren, eller annen eksperimentelle forhold, for eksempel variasjoner i romtemperatur, kan alle bidra til variasjoner i luminescence utgang.

Sanntid leiren analysen viser flere fordeler sammenlignet med andre metoder for å måle OR aktivisering. Første, ligner luciferase reporter genet analysen, sanntid leiren analysen er en ekstra i vitro høy gjennomstrømming identifikasjon av OR repertoar svarer på odorants. Store reseptor og/eller odorant skjermbilder av sanntids leiren analysen kan tilby en stor mengde informasjon på reseptor-lukt sammenkobling med bruk av et lite antall plater. Når avanserte luminometers og pipettering roboter, 96-brønns protokollen beskrevet her lett kan oppgraderes til en 384-vel-format, i hvilken enda mindre plasmider DNA og reagenser kreves per enhet av data. Andre er metoden for sanntids leiren i stand til å måle endringer i intracellulær konsentrasjonen av leiren i sanntid. Mens de fleste analyser brukes til å måle OR aktiviteten hittil fluorescens - eller chemiluminescence-baserte endepunktet oppdagelsen krever celle lysis, sanntid leiren analysen isimplemented under ikke-lytisk, live-celle forhold som er mer lik den endogene situasjonen og som aktiverer overvåking av endringer i leiren nivåer. Tredje er relativt kortere tid nødvendig for å utføre sanntid metoden. En annen høy gjennomstrømming analysemetode for eller-funksjonen, som er avhenger av en luciferase reporter genuttrykk, trenger en ekstra 4 h etter lukt stimulering å fullføre et eksperiment. I noen tilfeller kan en langvarig lukt inkubasjon intervall føre potensielle odorant toksisitet til cellene, som er effektivt lindres under forbigående eksponering. I tillegg, mer langvarig eksperimenter, er sjansene for forurensning av nærliggende av volatilization når du bruker forskjellige odorants og/eller ulike konsentrasjoner av den samme odorant i samme plate også økt. Umiddelbar gjenkjenning etter lukt tillegg gjør sanntid leiren analysen en rask og pålitelig paradigme.

Begrensningene i sanntid leiren analysen for måling eller aktivisering er som følger. Først er vår i vitro analysen basert på en HEK293T-avledet cellen linje som mangler mange endogene molekyler av innfødte olfactory sensoriske neurons. Videre løselig proteiner og enzymatiske konverteringer forekommer i nasal Slim kan binde med odorants og/eller påvirke ORS affinitet for odorants. Derfor kan aktivisering i heterologous systemet avvike fra situasjonen i vivo følsomhet og lukt tuning. Andre krever identifikasjon av ORs for en gitt odorant et helt OR repertoar av minst en artene. Musen er svært store4,5,41ORs er familien GPCRs og antall OR proteiner i menneskelig. Arbeid kan være involvert i kloning hver OR repertoar av interesse. Tredje, selv om OR heterologous uttrykk systemet inkluderer OR sekvens endringer (for eksempel Rho-koden), og noen av nøkkel eller tilbehør proteiner (som RTP1S og M3R), mistenker vi at ikke alle ORs uttrykkes funksjonelt på cellemembranen av den HEK293T-avledet celler. Derfor utelukke mottar svar til en bestemt odorant i vitro ikke nødvendigvis OR svar i vivo, som følge av at noen ORs kan bare være dårlig uttrykt på cellens overflate og ikke kan anerkjenne deres ligander. Således, når mulig sanntid cAMP bør brukes sammen med andre i vitro og vivo analyser for å oppnå mer overbevisende resultater.

Flere kritiske trinn bør gis ekstra oppmerksomhet under sanntid leiren analysen. Først for eksperimenter med luminescence generelt, er temperatur en nøkkelfaktor som påvirker resultatet av eksperimentet som økning i temperaturen redusere basal og indusert nivåer av lys og nedgang i temperaturen øker lysmengden. Derfor equilibrating pre platene med stabil drift temperaturen på instrumeNT før odorant tillegg er nødvendig for å unngå påvirker resultatene skyldes temperaturendringer. Andre bør konsentrasjonen av sanntids leiren analysen substrat reagensen justeres i henhold til faktiske situasjon. Når basale luminescence ikke nå laveste oppdagelsen terskelen chemiluminescence plate leseren, bør man vurdere å øke substrat konsentrasjonen for å øke signalet. Til slutt, til tross for å være en tilhenger cellen linje, Hana3A celler løsne under eksperimentet. Når aspirating eller legge til mediet, kan plassere pipette-spisser ved siden av brønnen minimere avbrudd i celle monolayer. Det er også viktig å plate celler i en passende og ensartet tetthet å unngå gjengroing celler som tett flekker av celler pleier å løsner under endring av medium.

I tillegg til å identifisere OR(s) for en odorant av interesse, sanntid leiren analysen kan også brukes til skjermen for beslektet ligander for en gitt eller når biblioteker av kjemikalier er tilgjengelige. Til slutt når riktig celletyper og transfection betingelser brukes, kan analysen også tillater påvisning av overexpressed eller endogene GPCR aktivisering og gi konsentrasjon avhengige av respons kurver for både agonister og antagonister.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne ikke avsløre.

Acknowledgments

Arbeidet ble støttet av kinesiske National Science Foundation (31070972), vitenskap og teknologi kommisjonen i Shanghai kommune (16ZR1418300), programmet for nyskapende forskning Team av Shanghai kommunale utdanning provisjon, Shanghai øst Forsker Program (J50201) og nasjonale grunnforskning programmet Kina (2012CB910401).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Amphotericin B Sigma A2942
DMSO Sigma D2650
FBS Gibco 10099-141
GloSensor cAMP reagent Promega E1290
pGloSensor-20F cAMP plasmid Promega E1171
Hana3A cells available from authors upon request
HBSS, without calcium or magnesium GIBCO 14175095
HEPES Hyclone SH30237
Lipofectamine2000 Invitrogen 11668-019
M3R plasmid cloned into a mammalian expression vector such as pCI
MEM, with EBSS and L-glutamine Hyclone SH30024
Muscone Santa Cruz sc-200528
Musk tibetene Sigma-Aldrich S359165
OR plasmids cloned with a Rho-tag into a mammalian expression vector such as pCI
PBS, without calcium or magnesium Cellgro 21-040-CV
Penicillin-streptomycin Hyclone SV30010
Plasmid miniprep kit Tiangen DP103-03
Puromycin Sigma P8833
RTP1S plasmid cloned into a mammalian expression vector such as pCI
Trypsin-EDTA Hyclone SH30236
0.2-mL PCR tube Axygen PCR-02-C
1.5-mL Eppendorf tube Eppendorf
15-mL 17 mm x 120 mm conical tube BD Falcon 352096
8-well and/or 12-well multichannel pipetman Eppendorf
96-well flat-bottomed white cell culture plate Greiner 655098
100 mm x 20 mm cell culture dish BD Falcon 353003
Class II biological safety cabinet with laminar flow
Cell culture incubator, with 5% CO2
Centrifuge, with swinging bucket rotor for 15-ml conical tubes
Infinite F200 plate reader Tecan
Phase-contrast microscope with x10 and x20 objectives
Spectrophotometer
Sterile reagent reservoirs for multichannel distribution
Sterile paper towel

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Malakoff, D. Following the scent of avian olfaction. Science. 286 (5440), 704-705 (1999).
  2. Zippel, H. P. The ecology of vertebrate olfaction: D.M. Stoddart. Chapman and Hall, Andover, Great Britain, 1980. £15.00, 234 pp. ISBN 0-412-21820-8. Behav Processes. 7 (2), 198-199 (1982).
  3. Dryer, L., Berghard, A. Odorant receptors: a plethora of G-protein-coupled receptors. Trends Pharmacol Sci. 20 (10), 413-417 (1999).
  4. Zhang, X., Firestein, S. The olfactory receptor gene superfamily of the mouse. Nat Neurosci. 5 (2), 124-133 (2002).
  5. Glusman, G., Yanai, I., Rubin, I., Lancet, D. The complete human olfactory subgenome. Genome Res. 11 (5), 685-702 (2001).
  6. Mombaerts, P. Genes and ligands for odorant, vomeronasal and taste receptors. Nat Rev Neurosci. 5 (4), 263-278 (2004).
  7. Reed, R. R. After the holy grail: establishing a molecular basis for Mammalian olfaction. Cell. 116 (2), 329-336 (2004).
  8. Buck, L., Axel, R. A novel multigene family may encode odorant receptors: a molecular basis for odor recognition. Cell. 65 (1), 175-187 (1991).
  9. McClintock, T. S., et al. In vivo identification of eugenol-responsive and muscone-responsive mouse odorant receptors. J Neurosci. 34 (47), 15669-15678 (2014).
  10. Trimmer, C., Snyder, L. L., Mainland, J. D. High-throughput analysis of mammalian olfactory receptors: measurement of receptor activation via luciferase activity. J. Vis. Exp. (88), e51640 (2014).
  11. Saito, H., Chi, Q., Zhuang, H., Matsunami, H., Mainland, J. D. Odor coding by a Mammalian receptor repertoire. Sci Signal. 2 (60), ra9 (2009).
  12. Jiang, Y., et al. Molecular profiling of activated olfactory neurons identifies odorant receptors for odors in vivo. Nat Neurosci. 18 (10), 1446-1454 (2015).
  13. Malnic, B., Hirono, J., Sato, T., Buck, L. B. Combinatorial receptor codes for odors. Cell. 96 (5), 713-723 (1999).
  14. Touhara, K., et al. Functional identification and reconstitution of an odorant receptor in single olfactory neurons. Proc Natl Acad Sci U S A. 96 (7), 4040-4045 (1999).
  15. Kajiya, K., et al. Molecular bases of odor discrimination: Reconstitution of olfactory receptors that recognize overlapping sets of odorants. J Neurosci. 21 (16), 6018-6025 (2001).
  16. von der Weid, B., et al. Large-scale transcriptional profiling of chemosensory neurons identifies receptor-ligand pairs in vivo. Nat Neurosci. 18 (10), 1455-1463 (2015).
  17. D'Hulst, C., et al. MouSensor: A Versatile Genetic Platform to Create Super Sniffer Mice for Studying Human Odor Coding. Cell Rep. 16 (4), 1115-1125 (2016).
  18. Lu, M., Echeverri, F., Moyer, B. D. Endoplasmic reticulum retention, degradation, and aggregation of olfactory G-protein coupled receptors. Traffic. 4 (6), 416-433 (2003).
  19. McClintock, T. S., et al. Functional expression of olfactory-adrenergic receptor chimeras and intracellular retention of heterologously expressed olfactory receptors. Brain Res Mol Brain Res. 48 (2), 270-278 (1997).
  20. Krautwurst, D., Yau, K. W., Reed, R. R. Identification of ligands for olfactory receptors by functional expression of a receptor library. Cell. 95 (7), 917-926 (1998).
  21. Saito, H., Kubota, M., Roberts, R. W., Chi, Q., Matsunami, H. RTP family members induce functional expression of mammalian odorant receptors. Cell. 119 (5), 679-691 (2004).
  22. Zhuang, H., Matsunami, H. Synergism of accessory factors in functional expression of mammalian odorant receptors. J Biol Chem. 282 (20), 15284-15293 (2007).
  23. Li, Y. R., Matsunami, H. Activation state of the M3 muscarinic acetylcholine receptor modulates mammalian odorant receptor signaling. Sci Signal. 4 (155), ra1 (2011).
  24. Durocher, Y., et al. A reporter gene assay for high-throughput screening of G-protein-coupled receptors stably or transiently expressed in HEK293 EBNA cells grown in suspension culture. Anal Biochem. 284 (2), 316-326 (2000).
  25. Liberles, S. D., Buck, L. B. A second class of chemosensory receptors in the olfactory epithelium. Nature. 442 (7103), 645-650 (2006).
  26. Saraiva, L. R., et al. Combinatorial effects of odorants on mouse behavior. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (23), E3300-E3306 (2016).
  27. Nara, K., Saraiva, L. R., Ye, X., Buck, L. B. A large-scale analysis of odor coding in the olfactory epithelium. J Neurosci. 31 (25), 9179-9191 (2011).
  28. Zhuang, H., Matsunami, H. Evaluating cell-surface expression and measuring activation of mammalian odorant receptors in heterologous cells. Nat Protoc. 3 (9), 1402-1413 (2008).
  29. Fan, F., et al. Novel genetically encoded biosensors using firefly luciferase. ACS Chem Biol. 3 (6), 346-351 (2008).
  30. Fan, B. F., Wood, K. V. Live-Cell Luminescent Assays for GPCR Studies: Combination of Sensitive Detection and Real-Time Analysis Expands Applications. Genetic Engineering & Biotechnology News. 29, 30-31 (2009).
  31. Geithe, C., Andersen, G., Malki, A., Krautwurst, D. A Butter Aroma Recombinate Activates Human Class-I Odorant Receptors. J Agric Food Chem. 63 (43), 9410-9420 (2015).
  32. Noe, F., et al. OR2M3: A Highly Specific and Narrowly Tuned Human Odorant Receptor for the Sensitive Detection of Onion Key Food Odorant 3-Mercapto-2-methylpentan-1-ol. Chem Senses. 42 (3), 195-210 (2016).
  33. Geithe, C., Noe, F., Kreissl, J., Krautwurst, D. The broadly tuned odorant receptor OR1A1 is highly selective for 3-methyl-2,4-nonanedione, a key food odorant in aged wines, tea, and other foods. Chem Senses. 42 (3), 181-193 (2016).
  34. Duan, X., et al. Crucial role of copper in detection of metal-coordinating odorants. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (9), 3492-3497 (2012).
  35. Li, S., et al. Smelling Sulfur: Copper and Silver Regulate the Response of Human Odorant Receptor OR2T11 to Low-Molecular-Weight Thiols. J Am Chem Soc. , (2016).
  36. Wu, L., Pan, Y., Chen, G. Q., Matsunami, H., Zhuang, H. Receptor-transporting protein 1 short (RTP1S) mediates translocation and activation of odorant receptors by acting through multiple steps. J Biol Chem. 287 (26), 22287-22294 (2012).
  37. Shirasu, M., et al. Olfactory receptor and neural pathway responsible for highly selective sensing of musk odors. Neuron. 81 (1), 165-178 (2014).
  38. Block, E., et al. Implausibility of the vibrational theory of olfaction. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (21), E2766-E2774 (2015).
  39. Sato-Akuhara, N., et al. Ligand Specificity and Evolution of Mammalian Musk Odor Receptors: Effect of Single Receptor Deletion on Odor Detection. J Neurosci. 36 (16), 4482-4491 (2016).
  40. Gane, S., et al. Molecular vibration-sensing component in human olfaction. PLoS One. 8 (1), e55780 (2013).
  41. Young, J. M., et al. Different evolutionary processes shaped the mouse and human olfactory receptor gene families. Hum Mol Genet. 11 (5), 535-546 (2002).

Tags

Nevrobiologi problemet 128 sanntid leiren analysen odorant reseptor odorant live-celle kinetisk måling muscone
Live-celle måling av Odorant reseptor aktivisering benytter en sanntid leiren analysen
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Zhang, Y., Pan, Y., Matsunami, H.,… More

Zhang, Y., Pan, Y., Matsunami, H., Zhuang, H. Live-cell Measurement of Odorant Receptor Activation Using a Real-time cAMP Assay. J. Vis. Exp. (128), e55831, doi:10.3791/55831 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter