Summary
Işlev propil reseptörlerinin karakterize vazgeçilmez bir parçası deorphanization süreç içinde hizmet vermektedir. Biz gerçek zamanlı bir kamp tahlil kullanarak propil reseptörleri aktivasyonu ölçmek için bir yöntem açıklanmaktadır.
Abstract
Memeli propil reseptör (OR) aileler büyük boyutları arasında çok sayıda uçucu Kimyasalları soydaş onların ligandlar bulmak için zorluklar. ORs verimli bir şekilde ve doğru bir şekilde deorphanize için memeli ORs ve genetiği değiştirilmiş Biyoalgılayıcı plazmid kamp üretim aşağı OR etkinleştirme gerçek zamanlı olarak ölçmek için ifade etmek için bir kapaklı cep satırının kullanımını birleştirir. Bu tahlil için ekran odorants ORs ve ahlak bozukluğu çok yönlükarşı kullanılabilir. Pozitif propil-reseptör etkileşimleri ekranlar üzerinden daha sonra konsantrasyon-yanıt eğrileri oluşturma çeşitli koku konsantrasyonlarının karşı test ederek teyit edilmesi. Burada Hana3A hücrelerde ifade ve olumlu yanıt reseptör soydaş reseptör için faiz bileşik olduğunu doğruladı insan bir OR Kütüphane karşı kokulu bir bileşik bir yüksek-den geçerek tarama gerçekleştirmek için bu yöntem kullanılır. Verimli ve güvenilir OR harekete geçirmek değerlendirirken bu yüksek üretilen iş algılama yöntem bulduk ve bizim veri OR fonksiyonel çalışmalar potansiyel kullanım için bir örnek sağlar.
Introduction
Onlar yiyecek elde kaçının saldırganlar ve tehlike tür ayırt etmek ve dostum1,2seçin için koku alma yeteneklerini üzerinde itimat gibi koku alma duygusu hayvanların hayatta önemli bir rol oynar. Bu işlevlerin gerçekleşme tek tek koku epitel (OE) bulunan silier yüzeyi koku duyusal nöronların (OSNs) ifade edilir propil reseptörleri (ORs), bağlıdır. ORs en büyük ailesi G-protein birleştiğinde reseptör (GPCR) süper yaklaşık 400 ve 1200 farklı OR genleri olan insan ve fare, sırasıyla3,4,5oluşturmaktadır. Odorants tarafından aktive ORs koku G-protein (Golf) sıralı harekete geçirmek yolu ile hücre içi kamp düzeyinin için kurşun ve III gozlemler cyclase (ACIII) yazın. Hücre içi kampı ortaya çıkan artan düzeyde Ca2 + ve aksiyon potansiyelleri de dahil olmak üzere ve sonuçta ilk adım katyonlar akını tetikleme hücre yüzeyinde nükleotit Geçitli kanal açan ikinci habercisi olarak, işlev olabilir Nöro-potansiyel iletim ve koku algı. Saptama ve çok sayıda odorants ORs tarafından ayrımcılık işlemi koku algı6,7ilk adımı olarak kabul edilir.
Buck ve Axel8 ilk başarıyla propil reseptörleri klonlanmış ve ORs tarafından başlatılan koku algı mekanizmasının aydınlatılmamıştır beri deorphanization OR ailesinin bu alandaki hotspots biri haline geldi. OR harekete geçirmek ölçmek için çeşitli içinde vivo, ex vivo ve in vitro yöntemleri bildirilen9,10,11,12olmuştur. Ca2 + görüntüleme tek hücreli RT-PCR tarafından OSNs üzerinde takip kullanılan geleneksel bir yöntem Alifatik odorants13,14,15farklı ORs tanımlaması etkin. Daha yakın zamanlarda, büyük ölçekli transcriptome analizleri gelişiyle daha yüksek üretilen iş in vivo yöntemler geliştirme teşvik. Kentucky tahlil eugenol ve muscone duyarlı fare ORs S100a5-tauGFP muhabir fare zorlanma ve Mikroarray analiz9kullanımı ile tespit edilmiştir. OR mRNA düzeyleri azalma propil maruz kaldıktan sonra dayanarak, rüya teknoloji OR etkinleştirme profilleri her iki tür omurgalı ve omurgalılar16belirlemek için bir transcriptomic yaklaşım istihdam. Benzer şekilde, S6 fosforilasyon nöronal activations içinde göz önüne alındığında, Matsunami grup duyarlı ORs12tanımlamak için fosforile ribozom immunoprecipitations gelen Sıralı mRNA'ların. Son olarak, Feinstein grup içinde vivoMouSensor teknoloji17olarak bilinen, kodlama koku çalışma için bir platform olarak hizmet verebilir süper sniffer fareler bildirdi.
Vitro alanda OSNs kültür meydan OR fonksiyonel ifade içinde vivo taklit eden bir kapaklı ifade sistemi kokulu kimyasallar büyük ölçekli tarama ORs için yapmak için ideal bir çözüm yapar. Yine de, kültürlü hücre hatları sigara koku kökenli yerel OSNs farklı veya proteinler endoplazmik retikulum ve plazma zarı trafik için korunur beri OR bozulması ve reseptör işlevi18 kaybı ile sonuçlanan , 19. bu sorunu çözmek için kapsamlı çalışmalar OR fonksiyonel ifade Contegra hücre hatlarında hücre zarı üzerinde çoğaltmak için yapılmıştır. Krautwurst ve ark. ilk rhodopsin (Rho-etiket) ilk 20 amino asit OR protein N-terminal bağlı. ve bu bazı ORs insan embriyonik böbrek (HEK) hücreleri20hücre yüzeyine ifade yükseldi. Gen ifade (adaçayı) Kütüphane analizi tek OSNs, üzerinden seri bir analiz tarafından Saito ve ark. ilk klonlanmış reseptör taşıma protein (RTP) aile üyeleri, RTP1 ve RTP2 ve OR hücre zarı ticareti kolaylaştırdı ve propil-aracılı yanıtları ORs HEK293T hücrelere Gelişmiş reseptör ifade artırıcı protein 1 (REEP1) 21. bu bulgulara dayanarak, Matsunami grup başarılı Hana3A hücre kültürünü kurdu, stabil RTP1, RTP2, REEP1 ve Gαolf içinde HEK293T ile transfected ve geçici verimli veya fonksiyonel Rho öğesini ORs ile transfected ifade. Sonraki çalışmaları 1) RTP1, RTP1S, daha sağlam teşvik veya işlev özgün RTP1 protein ve β-arrestin-2 inhibisyonu yoluyla OR etkinliği artıran 2) Tip 3 muscarinic asetilkolin reseptörü (M3R) daha kısa biçimi ortaya İşe Alım, ikisi de deneysel optimize etmek için kapaklı ifade sistem kullanılmaya başlanan22,23çıktı.
Birkaç algılama yöntemleri reseptörü harekete geçirmek Contegra sistemlerinde ölçmek için kullanılmaktadır. Salgılanan plasental alkalen fosfataz (SEAP) tahlil OR harekete geçirmek değerlendirmek için çekici bir seçenek yapma transcriptionally kamp yanıt öğeleri (CREs), tarafından düzenlenen bir muhabir enzim ile çalışır. Floresans kolayca SEAP algılama reaktif24ile kuluçka sonra kültür orta bir örneği algılandı. Bu yöntemi kullanarak, ikincil bir sınıf reseptörleri (TAARs) Amin ilişkili olmuştur OE-izlemesinde ifade chemosensory reseptörlerinin yanı sıra ORs fonksiyonları25,26,27ile karakterizedir. Başka bir ortak yöntem, luciferase yöntemi, bir ateş böceği luciferase muhabir gen kamp yanıt öğesi (CRE) kontrolü altında kullanır. Luciferase üretim tarafından üretilen ışıma ölçme OR harekete geçirmek10,11,28miktarının verimli ve güçlü bir araç sağlar.
Gerçek zamanlı kamp deneyleri de dinamik olarak kapaklı veya endojen GPCRs işlev izleme yaygın olarak kullanılmıştır. Bu tür gelişmiş deneyleri bir örnek luciferase mutant bir forma erimiş bir kampı-bağlayıcı etki sahip bir genetik olarak kodlanmış Biyoalgılayıcı değişken yararlanır. Kamp bağlandığında konformasyonal değişim luciferase, ışıma hangi sonra bir Kemiluminesan okuyucu29,30ile ölçülebilir aktivasyonu yol açar. Gerçek zamanlı kamp teknoloji HEK293 ve NxG 108CC15 hücrelerdeki insan propil reseptörlerinin de-orphaning için uygun bildirilmiştireşek "xref" = > olduğu gibi iyi HEK293T elde edilen Hana3A34,35hücreleri gibi 31,32,33,. Krautwurst grup aynı zamanda çift yönlü büyük ölçekli veya eleme yaklaşımlar32,33için uygun olmak için gerçek zamanlı kamp teknoloji ayrıntılı olarak açıklanmıştır.
Burada gerçek zamanlı bir kamp tahlil Hana3A hücrelerde kullanarak OR etkinleştirme ölçmek için bir protokol açıklayın. Bu protokol için önceden dengelenmiş canlı hücreleri ışıldama kinetically belirli uçucu bileşikler ile tedavi takip, üzere OR harekete geçirmek bir daha verimli ve doğru analiz temsil eden 30 dk ölçülür uzun zaman ve koku indüklenen hücre toksisite olan hücresel ortamda ortaya çıkan eserler. Bu gerçek zamanlı ölçüm ORs ve ligandlar büyük ölçekli bir tarama, hem de belirli OR-ligand çiftlere ilgi karakterizasyonu için sağlar. Bu yöntemi kullanarak, biz başarılı bir şekilde OR5AN1 olarak misk bileşik muscone reseptör 379 insan ORs karşı bir tarama gerçekleştirmek ve daha sonra olumlu tarama sonucunu teyit tespit.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Culturing ve Hana3A hücreleri bakım
- 10 mL % 10 fetal sığır serum (FBS), 100 ile minimum temel orta (MEM) hücrelerde koru µg/mL penisilin-streptomisin ve 1,25 µg/mL Amfoterisin B 100 mm hücre kültür çanak 37 ° C hücre kültür kuluçka %5 CO 2. Her diğer geçişiyle plazmid (bkz: giriş) istikrarlı transfection korumak için 1 µg/mL puromisindir eklemek.
Not: steril ortam sağlamak için bir sınıf II biyolojik Emanet dolabı hücre kültüründe içeren tüm adımları. - 100-mm yemeklerinde 2-3 günde % 10-20 oranında alt kültür.
2. Hücreleri Transfection için kaplama
- Hana3A hücreleri hücre canlılığı sağlamak ve izdiham tahmin etmek için bir faz kontrast mikroskop altında dikkat.
- Tüm hücre kültür çanak ortamından Aspire edin.
- Yıkama hücreleri fosfat tamponlu tuz (PBS) 10 mL tabağa ekleme, çanak dönen ve PBS aspirating.
- 3 mL % 0.05 tripsin-etilen diamin tetraacetic asit (EDTA) plaka üzerine ekleyin. Mix 1 dk ya kadar tüm hücreleri ayakta.
Not: plaka gerektiği gibi mikroskop altında alt ayırma hücreleri ilerlemesini gözlemlemek. - %10 FBS ve yukarı ve aşağı parçalarını kırmak için pipet ile 5 mL MEM de ekleyerek Yinele tripsin hücre Mass
Not: transfection önce kaplama için kullanılan orta antibiyotik içermelidir. Ayrıca antibiyotik transfection etkinliğini azaltmak. - 15-mLl tüp transfected için tabak sayısına bağlı olarak uygun bir miktar hücre aktarın. Her 96-şey plaka, plaka 2 x 10 6 hücre veya yaklaşık %1/5 100 Konfluent 100 mm çanak için bir hücre sayısı 2 x 10 4 hücreleri her şey veya yaklaşık % 15-30 izdiham yoğunluğu iyi vererek. Santrifüj kapasitesi 200 x g 5 min için de tüpler ve hücre Pelet bozmadan süpernatant Aspire edin.
Not: overgrowing veya hücreleri stimülasyon önce undergrowing önlemek için 96-şey plakalar üzerine kaplama hücrelerinin doğru tutarını hesaplamak. - MEM uygun bir miktar % 10 ile 15 mL içine FBS tüp ve yukarı ve aşağı pipet hücre topakları kadar kitle kırmak için ekleyin. Her 96-şey plaka için MEM 6 mL % 10 ile hücrelerle resuspend FBS.
Not: Hava kabarcıkları tüp değil oluşturmak için dikkatli olun. - Askıya alınan hücreler bir rezervuar ekleyin. Bir çok kanallı pipet kullanarak, her şey bir 96-şey plaka üzerine hücrelerinin 50 µL pipet. Gecede %5 CO 2 ile 37 ° C'de kuluçkaya.
3. Plazmid transfection
- transfection önce iyi bir faz kontrast mikroskop altında başına yaklaşık % 30-50 uygun bir izdiham sağlamak ve kuluçka makinesi için dönmek için kaplama hücreleri gözlemlemek.
- Hazırla şimdiden Rho öğesini OR yapı 11 , 21 , 22 , 28, Aksesuar faktörü (RTP1S oluşturur. 22 , 36 ve M3R 23), ve Biyoalgılayıcı değişken miniprep tarafından 29 , 30. DNA toplama tarafından Spektrofotometre ölçmek ve gerekli distile su ile plazmid DNA konsantrasyonları (örneğin, 100 ng/µL için) ayarlamak.
- Transfection hazırlaması
- Tablo 1 göre her 96-şey plaka için MEM 500 µL bir plazmid transfection karışımı hazırlayın.
Not: farklı ORs aynı 96-şey plaka üzerinde test ettiğimizde, hacmi transfection karışımı ve plazmid DNA eklenen miktarı verilen OR ile transfected kuyu sayısı işlevindeki adapte olmalı. - Hazırlama bir transfection karışımı bir tüp ile lipid-aracılı transfection reaktif MEM. 500 µL içinde 18 µL
- Tablo 1 göre her 96-şey plaka için MEM 500 µL bir plazmid transfection karışımı hazırlayın.
- Yukarı ve aşağı pipetting tarafından plazmid karışımı transfection karışımı ile karıştırın. 15 dakika süreyle oda sıcaklığında kuluçkaya
- Reaksiyon MEM 5 mL % 10 ekleyerek durdurmak FBS.
- Steril kağıt havlu hücre kültür kapüşonlu kalın bir tabaka dışarı yayılır. 96-şey plaka hücrelerle kuluçka makinesi alın. Böylece orta tamamen kağıt havlu tarafından emilir plaka baş aşağı kağıt havlu yığını üzerinde yavaşça ve tekrar tekrar dokunun.
Not: bir hücre kaybedebilir gibi zorla veya aniden plaka dokunun değil. - Kombine transfection karışımdan 50 µL 96-şey plaka her şey için transfer ve gecede 18-24 h 37 ° c % 5 CO 2 için kuluçkaya.
Not: birden fazla 96-şey plaka test edilirken bir deneyde aynı transfection zaman ve uyarıcı pozlama süresi sonra ölçülen tüm plakaları için bir saat tarafından yönetilen transfection ve stimülasyon zamanlama ölçüm öncesinde.
4. Stimülasyon ve ölçüm veya gerçek zamanlı kampı tahlil kullanarak etkinliğini
- şey başına 50-%80 uygun bir izdiham sağlamak ve kuluçka makinesi için dönmek için faz kontrast mikroskop altında transfected hücreleri gözlemlemek.
- Uyarım orta 10 mM hydroxyethyl piperazineethanesulfonic asit (HEPES) ve 5 mM ekleyerek glikoz Hank'e hazırlamak ' s dengeli tuz çözüm (HBSS).
- Gerçek zamanlı kamp tahlil Substratı reaktif aliquots buz çözme. Substrat reaktif-80 ° c, tüp başına 55 µL PCR tüpleri saklayın. Plaka başına 1 tüp kullanın.
- % 2 denge çözüm 55 µL Substratı reaktif ve 2750 µL HBSS/HEPES/glikoz çözüm karıştırarak hazırlayın.
- Kağıt havlu tezgah üzerine kalın bir tabaka dışarı yayılır. Böylece transfection orta tamamen kağıt havlu tarafından emilir yavaşça ve art arda tabak kağıt havlu üzerinde ters dokunun.
- HBSS/HEPES/glikoz çözüm her şey için pipetting 50 µL tarafından hücreleri yıkayın.
- HBSS/HEPES/glikoz çözüm 96-şey plaka yavaşça ve tekrar tekrar pes.
- Pipet 25 µL % 2 denge çözüm her şey ve 2 h. için karanlık oda sıcaklığında kuluçkaya
- Önceden 1 M DMSO ve store-20 ° c kadar kullanılır propil hisse senedi çözümleri hazırlayın.
- Kuluçka kıyamete öncesinde propil hisse senedi çözümleri çalışma konsantrasyonları HBSS/HEPES/glikoz stimülasyon orta sulandırmak.
Not: Bu adımda hazırlanan propil dilutions konsantrasyonları her şey doğru son konsantrasyonlarda vermeye iki katına. - Bir Kemiluminesan kullanarak plaka okuyucu ve propil toplamadan önce iyi 34 başına 1000 ms oranında 2 ardışık kez için plaka Bazal ışıldama düzeyini ölçmek.
- Hızlı bir şekilde plaka plaka okuyucu kaldırmak ve her şey için 25 µL propil dilutions ekleyin ve hemen bütün Wells sürekli ışıldama ölçümlerinde 20 devir başlatmak 30 dk. içinde
Not: farklı odorants ve/veya aynı odorants farklı konsantrasyonlarda aynı plaka kullanırken dikkatle komşu kirletici önlemek için pipet kuyuları.
5. Veri analizi
- Kemiluminesan plaka okuyucu yazılım veri ihraç.
- Hesaplama formülü kullanarak her zaman için OR yanıt normalleştirilmiş
(ışıldama N – ışıma Bazal) / (ışıldama en yüksek – ışıma Bazal)
nerede N = belirli bir ışıldama değeri iyi; Bazal Bazal iki ortalama ışıldama değeri = Işıma değerleri; en yüksek en yüksek ışıma değer bir plaka veya bir tabak =.
Not: alternatif grafiksel gösterimleri deneme amaçlı bağlı olarak kabul edilebilir. Örneğin, (bkz: şekil 1) deneyleri süzmek için ve konsantrasyon-yanıt eğrileri, en büyük değer gibi Kinetik ölçüm sırasında istenilen zamanda noktada bazı iyi bir ışıldama değerini oluşturmak için veya son değer-ebilmek var olmak kullanılmış.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Muscone doğal misk üzerinden ana aromatik bileşenidir. Son muscone ve fare veya MOR215-1, fareler37,38davranışlar içinde muscone duyarlı glomeruli üzerinden klonlanmış homoloji dayalı diğer macrocyclic misk bileşikler için insan bir reseptör olarak tanımlanan OR5AN1 çalışmalar. İnsan OR repertuar, bizim grup ve Touhara grup Ayrıca tarama tarafından OR5AN1 olarak iki macrocyclic misk bileşikler, cyclopentadecanone ve muscone, büyük bir reseptör sırasıyla, luciferase tahlil sistem38,39 kullanarak tanımlanan .
Burada açıklanan gerçek zamanlı kamp tahlil kullanarak, biz insan OR repertuar 30 µM muscone (şekil 1) karşı tarandı. Diğer ORs ve negatif denetimleri (no-koku kontrol ve boş vektör kontrolü) önemli bir tepki göstermiyor ise 379 insan ORs ekranlı arasında OR5AN1 muscone, tanınmış bir yanıt ile ortaya çıktı. Pozitif kontrol OR5AN1 30 µM misk tibetene, bir ligand OR5AN1 için test edilen (yayınlanmamış veri) ve muscone cevaben ORs normalleştirmek için kullanıldı. En fazla ışıldama okuma 30 µM misk tibetene karşı OR5AN1 için erişildiğinde bu veri kümesini grafik gösterimi için biz zaman nokta aldı.
Biz sonraki koku konsantrasyon-yanıt ilişkisi incelendiğinde-OR çift muscone 3 farklı konsantrasyonları ile. Test sırasında ilk 20 dk sonra muscone ek olarak, muscone her konsantrasyon için OR5AN1 Cevabıyla yavaş yavaş arttı ve no-koku ek denetimi (0 µM muscone) için izleme kaldı son 10 dk (şekil 2A) monoton nispeten düz. Muscone daha yüksek konsantrasyonlarda ölçüm ayırt daha düşük olanlar, daha güçlü OR yanıt-e doğru uyarılmış. Son zaman noktası kullanarak Kinetik ölçüm bir konsantrasyon-yanıt eğrisi oluşturulan ve eğri, maksimal etkisi (EC50) değerinin % 50 için konsantrasyon 20,82 µM (şekil 2B) olduğu tahmin edilmektedir.
Resim 1: muscone insan ORs için eleme.
379 benzersiz insan ORs gerçek zamanlı kamp tahlil kullanarak 30 µM muscone karşı gösterildi. Renkli blok boyunca x-ekseni belirtmek farklı insan OR aileler. Her sütun x-Eksen temsil eder OR5AN1 cevaben 30 µM misk tibetene (pozitif bir denetimi), OR5AN1 yanıt HBSS/HEPES/glikoz çözüm (bir no-koku negatif kontrol), çoğu son üç sütun dışında tek bir OR türü ve Rho-PCI-30 µM muscone (bir boş vektör negatif kontrol), soldan sağa doğru yanıt. y-Eksen temsil eder 30 dk normalleştirilmiş ışıldama propil ek sonra yanıt en olumlu denetim için ulaştı (N = 3). Tüm yanıtları olumlu denetim için normalleştirilmiş. Hata çubukları standart hata demek (SEM) temsil eder. Anlaşılır olması için sadece pozitif hata çubukları gösterilir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Resim 2: OR5AN1 yanıt muscone olarak Kinetik ölçümleri.
(A) gerçek zamanlı ölçüleri farklı konsantrasyonları ve no-koku negatif kontrol muscone tarafından OR5AN1 aktivasyon propil ek 30 dk içinde gerçekleştirilmiştir. Ok propil ek zaman noktasını gösterir. (B) muscone 30 dk sonra propil ek karşı OR5AN1 eğrisini konsantrasyon-yanıt. y-Eksen temsil normalleştirilmiş ışıldama (N = 3). Tüm yanıtları 100 µM muscone en yüksek yanıt için normalleştirilmiş. Hata çubukları temsil SEM Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
| Plazmid | 96-şey plaka (µg) başına miktar |
| Rho- veya | 5 |
| RTP1S | 1 |
| M3R | 0,5 |
| Kamp Biyoalgılayıcı varyant | 1 |
Tablo 1: Bileşenleri transfection karışımı.
96-şey plaka miktarı Rho-OR, RTP1S, M3R ve gerçek zamanlı kamp Biyoalgılayıcı varyant plazmid.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
AMELİYATHANEYİ'ın etkinleştirme maruz bir belirli propil için üzerine doğru ölçme koku bilgi kodlama deşifre ilk adımdır. Deneyler nasıl bir örneği, bir vitro kullanarak tanımlayabilirsiniz bu çalışma temsil OR ifade sistem, duyarlı ORs uygun faiz ve daha sonra reseptör karakterize kokulu gelir insan OR repertuar arasında gösterilen çeşitli kimyasal konsantrasyonları kullanarak Farmakoloji. Bizim sonuçları OR5AN1 muscone için bir bona fide reseptör olarak onaylamak. Bu bir önceki rapor39 ile tutarlı ve az sayıda reseptörleri misk kokusu27,40algılama katılmaktadırlar spekülasyon için daha fazla kanıt sağlar. Bir benzer ya da kapaklı ifade sistemde luciferase tahlil tarafından oluşturulan Sato-Akuhara vd. tarama verilerle karşılaştırıldığında, bizim tarama sonuçları biraz daha kötü sinyal-gürültü oranı gösterdi. Gerçeğini bir alt muscone konsantrasyonu (30 µM vs 100 µM) kullanılan nedeniyle farklı tekniklerin doğal varyasyon yanı sıra, çıktıda fark olabilir. Aslında, EC50 değeri gerçek zamanlı kamp tahlil yolu ile elde edilen muscone karşı OR5AN1 konsantrasyon-yanıt eğrinin aynı büyüklük sırasında Sato-Akuhara vd. luciferase tahlil sisteminde elde bir olarak mevcuttur, farklı algılama yöntemleri kullanıldığında aynı Contegra OR ifade sistemi için bile karşılaştırılabilir sonuçlar gösteren. Başka bir çalışmada, bizim grup odorants az sayıda eski ama içinde ikinci tek etkin olduğunu göz önüne alındığında gerçek zamanlı kamp sistemi biraz daha OR2T11 reseptör seçicilik, değerlendirmede luciferase muhabir gen sisteminden daha duyarlı olabilir bulundu sistem35. Geithe ve ark. tarafından bildirilen veri serisi ile karşılaştırıldığında 31 OR1A1 karşı (+)-carvone, OR5AN1 bizim verileri doğrudan ORs ve kullanılan odorants farklı türleri neden olabilir Plato ulaşmak için gereken süreyi bir gecikme gösterdi muscone karşı. Bizim gruptan bildirilen diğer gerçek zamanlı kamp tahlil verilerde de zirve ORs ve odorants34,35bağlı olarak değişen kez gösterdi. Buna ek olarak, farklı hücre hatları, ORs ifade etmek için kullanılan farklı substrat kullanıldığında, farklı gerçek zamanlı kamp Biyoalgılayıcı varyant Plazmidler, Kemiluminesan plaka okuyucu, ve/veya varyasyon gibi farklı deneysel koşullar farklı duyarlılık oda sıcaklığında, tüm ışıma çıkışında çeşitlemelere katkıda bulunabileceğini.
Gerçek zamanlı kamp tahlil çeşitli yararları OR aktivasyon ölçme diğer yöntemler üzerinde gösterir. İlk, luciferase muhabir gen tahlil için benzer, gerçek zamanlı kamp tahlil yüksek üretilen iş kimliği odorants için yanıt OR repertuarında bir ek vitro anlamına gelir sağlar. Büyük ölçekli reseptör ve/veya propil ekranları tarafından gerçek zamanlı kamp tahlil reseptör-koku tabak az sayıda kullanımı ile eşleştirme hakkında bilgi büyük miktarda sunabilir. Gelişmiş Luminometreler ve pipetting robotlar vardır, burada açıklanan 96-iyi iletişim kuralı kolayca hangi daha az plazmid DNA bir 384-iyi biçimde yükseltilebilir ve reaktifler veri çıkış birimi gereklidir. İkinci olarak, gerçek zamanlı kamp yöntemi değişiklikleri gerçek zamanlı olarak kampın hücre içi konsantrasyon ölçme yeteneğine sahip. Çoğu deneyleri OR aktivite bugüne ölçmek için kullanılan bitiş noktası algılama gerektiren hücre lizis floresan veya Kemiluminesan bağlı olmakla birlikte, gerçek zamanlı kampı tahlil isimplemented endojen için daha fazla benzer litik sigara, canlı-hücre koşullar altında durum ve bu kamp düzeyleri değişiklikleri izlemeyi etkinleştir. Üçüncü olarak, nispeten daha kısa bir sürede gerçek zamanlı yöntemi gerçekleştirmek için gereklidir. Başka bir yüksek üretilen iş analiz yönteminin bir luciferase muhabir gen ekspresyonu dayanır, OR işlevinin bir deney tamamlamak için koku stimülasyon sonra ek bir 4 h gerekir. Bazı durumlarda, bir uzun süreli koku kuluçka aralığı hangi etkili altında geçici pozlama hafifletti potansiyel propil toksisite hücreleri, neden olabilir. Buna ek olarak, uzun süreli deneylerde farklı odorants ve/veya aynı propil farklı konsantrasyonlarda aynı plaka kullanırken volatilization tarafından komşu Wells kirlenme olasılığı da artar. Acil algılama koku ek takip hızlı ve güvenilir bir paradigma gerçek zamanlı kamp tahlil yapar.
Gerçek zamanlı kampı sınırlamaları ölçmek için tahlil veya harekete geçirmek gibidir. İlk olarak, bizim vitro tahlil çok endojen moleküller doğal koku duyusal nöronların yoksun bir HEK293T elde edilen hücre kültürünü temel alır. Ayrıca, çözünür proteinler ve enzimatik dönüşümleri burun mukus meydana gelen odorants ile bağlamak ve/veya odorants benzeşim OR'ın etkisi. Bu nedenle, harekete geçirmek kapaklı sistem içinde duyarlılık ve koku ayarlama açısından vivo içinde durum farklı olabilir. İkinci olarak, ORs tanımlanması için verilen propil verilen en az bir tür tüm OR repertuar gerektirir. ORs GPCRs büyük bir aile ve OR proteinler insan sayısı ve fare çok büyük4,5,41. Önemli bir zaman ve çaba her OR repertuar ilgi klonlama tutulabilir. OR sıra değişiklikleri (örneğin, Rho-etiket) ve bazı (örneğin, RTP1S ve M3R) anahtar veya aksesuar proteinlerin OR Contegra ifade sistemi bulunmasına karşın, üçüncü olarak, biz şüpheli tüm ORs işlevsel olarak üzerinde hücre membran ifade edilir HEK293T kaynaklı hücreler. Bu nedenle, belirli bir propil vitro yanıtlarını yokluğunda mutlaka OR yanıt vivo içindebazı ORs sadece kötü hücre yüzeyinde ifade ve onların ligandlar tanınamıyor olabilir aslında bir sonucu olarak engel değildir. Böylece, her ne zaman mümkün gerçek zamanlı kampı diğer vitro ve in vivo deneyleri ile birlikte daha ikna edici sonuçlar elde etmek için kullanılmalıdır.
Birkaç önemli adımlar gerçek zamanlı kamp tahlil sırasında ekstra dikkat verilmelidir. İlk olarak, genel olarak ışıldama içeren deneyler için Bazal ve indüklenen düzeyde ışık çıkış sıcaklık artışları azaltmak ve sıcaklık düşüş ışık verimi artırmak gibi deney sonucu etkileyen önemli bir faktör sıcaklığıdır. Bu nedenle, plakayı instrume kararlı durum çalışma sıcaklığı için önceden sıcaklığınaNT propil ek önce sıcaklık değişikliklerinden kaynaklanan sonuçları üzerindeki etkisini önlemek gereklidir. İkinci olarak, gerçek zamanlı kamp tahlil Substratı reaktif konsantrasyonları fiili duruma göre ayarlanmalıdır. Kemiluminesan plaka okuyucu en düşük algılama eşiğinin ulaşmak Bazal ışıldama başarısız olduğunda, bir sinyal artırmak için substrat konsantrasyonu artırmayı düşünmelisiniz. Son olarak, bir yapisan hücre kültürünü olmak rağmen Hana3A hücreleri deneme sırasında ayırmak. Ne zaman alıyorum veya orta ekleme, pipet ipuçları iyi tarafında yerleştirerek hücre monolayer bozulma en aza indirebilirsiniz. Ayrıca plaka hücrelerde hücre hücreleri yoğun noktalar overgrowing önlemek için uygun ve düzgün bir yoğunluk orta değişikliği sırasında soyulmak eğilimindedir önemlidir.
Tanımlayan ek olarak bir propil ilgi, gerçek zamanlı kamp tahlil için OR(s)-ebilmek da var olmak kullanılmış için verilen bir OR için soydaş ligandlar ekran kimyasallar kütüphanelerin olduğunda kullanılabilir. Son olarak, uygun hücre tipleri ve transfection koşulları kullanıldığında, tahlil da overexpressed veya endojen GPCR harekete geçirmek algılama için izin ve konsantrasyon bağımlı yanıt eğrileri agonistleri ve antagonistleri için verir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa gerek yok.
Acknowledgments
Çalışma Çin Ulusal Bilim Vakfı (31070972), bilim ve teknoloji Komisyonu, Shanghai Belediyesi (16ZR1418300), yenilikçi araştırma ekibi Şangay Belediye Eğitim Komisyonu, Shanghai Doğu için Program tarafından desteklenmiştir Akademik Program (J50201) ve Çin (2012CB910401) ulusal temel araştırma programı.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Amphotericin B | Sigma | A2942 | |
| DMSO | Sigma | D2650 | |
| FBS | Gibco | 10099-141 | |
| GloSensor cAMP reagent | Promega | E1290 | |
| pGloSensor-20F cAMP plasmid | Promega | E1171 | |
| Hana3A cells | available from authors upon request | ||
| HBSS, without calcium or magnesium | GIBCO | 14175095 | |
| HEPES | Hyclone | SH30237 | |
| Lipofectamine2000 | Invitrogen | 11668-019 | |
| M3R plasmid | cloned into a mammalian expression vector such as pCI | ||
| MEM, with EBSS and L-glutamine | Hyclone | SH30024 | |
| Muscone | Santa Cruz | sc-200528 | |
| Musk tibetene | Sigma-Aldrich | S359165 | |
| OR plasmids | cloned with a Rho-tag into a mammalian expression vector such as pCI | ||
| PBS, without calcium or magnesium | Cellgro | 21-040-CV | |
| Penicillin-streptomycin | Hyclone | SV30010 | |
| Plasmid miniprep kit | Tiangen | DP103-03 | |
| Puromycin | Sigma | P8833 | |
| RTP1S plasmid | cloned into a mammalian expression vector such as pCI | ||
| Trypsin-EDTA | Hyclone | SH30236 | |
| 0.2-mL PCR tube | Axygen | PCR-02-C | |
| 1.5-mL Eppendorf tube | Eppendorf | ||
| 15-mL 17 mm x 120 mm conical tube | BD Falcon | 352096 | |
| 8-well and/or 12-well multichannel pipetman | Eppendorf | ||
| 96-well flat-bottomed white cell culture plate | Greiner | 655098 | |
| 100 mm x 20 mm cell culture dish | BD Falcon | 353003 | |
| Class II biological safety cabinet with laminar flow | |||
| Cell culture incubator, with 5% CO2 | |||
| Centrifuge, with swinging bucket rotor for 15-ml conical tubes | |||
| Infinite F200 plate reader | Tecan | ||
| Phase-contrast microscope with x10 and x20 objectives | |||
| Spectrophotometer | |||
| Sterile reagent reservoirs for multichannel distribution | |||
| Sterile paper towel |
References
- Malakoff, D.
- Zippel, H. P. The ecology of vertebrate olfaction: D.M. Stoddart. Chapman and Hall, Andover, Great Britain, 1980. £15.00, 234 pp. ISBN 0-412-21820-8. Behav Processes. 7 (2), 198-199 (1982).
- Dryer, L., Berghard, A. Odorant receptors: a plethora of G-protein-coupled receptors. Trends Pharmacol Sci. 20 (10), 413-417 (1999).
- Zhang, X., Firestein, S. The olfactory receptor gene superfamily of the mouse. Nat Neurosci. 5 (2), 124-133 (2002).
- Glusman, G., Yanai, I., Rubin, I., Lancet, D. The complete human olfactory subgenome. Genome Res. 11 (5), 685-702 (2001).
- Mombaerts, P. Genes and ligands for odorant, vomeronasal and taste receptors. Nat Rev Neurosci. 5 (4), 263-278 (2004).
- Reed, R. R. After the holy grail: establishing a molecular basis for Mammalian olfaction. Cell. 116 (2), 329-336 (2004).
- Buck, L., Axel, R. A novel multigene family may encode odorant receptors: a molecular basis for odor recognition. Cell. 65 (1), 175-187 (1991).
- McClintock, T. S., et al. In vivo identification of eugenol-responsive and muscone-responsive mouse odorant receptors. J Neurosci. 34 (47), 15669-15678 (2014).
- Trimmer, C., Snyder, L. L., Mainland, J. D. High-throughput analysis of mammalian olfactory receptors: measurement of receptor activation via luciferase activity. J. Vis. Exp. (88), e51640 (2014).
- Saito, H., Chi, Q., Zhuang, H., Matsunami, H., Mainland, J. D. Odor coding by a Mammalian receptor repertoire. Sci Signal. 2 (60), ra9 (2009).
- Jiang, Y., et al. Molecular profiling of activated olfactory neurons identifies odorant receptors for odors in vivo. Nat Neurosci. 18 (10), 1446-1454 (2015).
- Malnic, B., Hirono, J., Sato, T., Buck, L. B. Combinatorial receptor codes for odors. Cell. 96 (5), 713-723 (1999).
- Touhara, K., et al. Functional identification and reconstitution of an odorant receptor in single olfactory neurons. Proc Natl Acad Sci U S A. 96 (7), 4040-4045 (1999).
- Kajiya, K., et al. Molecular bases of odor discrimination: Reconstitution of olfactory receptors that recognize overlapping sets of odorants. J Neurosci. 21 (16), 6018-6025 (2001).
- von der Weid, B., et al. Large-scale transcriptional profiling of chemosensory neurons identifies receptor-ligand pairs in vivo. Nat Neurosci. 18 (10), 1455-1463 (2015).
- D'Hulst, C., et al. MouSensor: A Versatile Genetic Platform to Create Super Sniffer Mice for Studying Human Odor Coding. Cell Rep. 16 (4), 1115-1125 (2016).
- Lu, M., Echeverri, F., Moyer, B. D. Endoplasmic reticulum retention, degradation, and aggregation of olfactory G-protein coupled receptors. Traffic. 4 (6), 416-433 (2003).
- McClintock, T. S., et al. Functional expression of olfactory-adrenergic receptor chimeras and intracellular retention of heterologously expressed olfactory receptors. Brain Res Mol Brain Res. 48 (2), 270-278 (1997).
- Krautwurst, D., Yau, K. W., Reed, R. R. Identification of ligands for olfactory receptors by functional expression of a receptor library. Cell. 95 (7), 917-926 (1998).
- Saito, H., Kubota, M., Roberts, R. W., Chi, Q., Matsunami, H. RTP family members induce functional expression of mammalian odorant receptors. Cell. 119 (5), 679-691 (2004).
- Zhuang, H., Matsunami, H. Synergism of accessory factors in functional expression of mammalian odorant receptors. J Biol Chem. 282 (20), 15284-15293 (2007).
- Li, Y. R., Matsunami, H. Activation state of the M3 muscarinic acetylcholine receptor modulates mammalian odorant receptor signaling. Sci Signal. 4 (155), ra1 (2011).
- Durocher, Y., et al. A reporter gene assay for high-throughput screening of G-protein-coupled receptors stably or transiently expressed in HEK293 EBNA cells grown in suspension culture. Anal Biochem. 284 (2), 316-326 (2000).
- Liberles, S. D., Buck, L. B. A second class of chemosensory receptors in the olfactory epithelium. Nature. 442 (7103), 645-650 (2006).
- Saraiva, L. R., et al. Combinatorial effects of odorants on mouse behavior. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (23), E3300-E3306 (2016).
- Nara, K., Saraiva, L. R., Ye, X., Buck, L. B. A large-scale analysis of odor coding in the olfactory epithelium. J Neurosci. 31 (25), 9179-9191 (2011).
- Zhuang, H., Matsunami, H. Evaluating cell-surface expression and measuring activation of mammalian odorant receptors in heterologous cells. Nat Protoc. 3 (9), 1402-1413 (2008).
- Fan, F., et al. Novel genetically encoded biosensors using firefly luciferase. ACS Chem Biol. 3 (6), 346-351 (2008).
- Fan, B. F., Wood, K. V. Live-Cell Luminescent Assays for GPCR Studies: Combination of Sensitive Detection and Real-Time Analysis Expands Applications. Genetic Engineering & Biotechnology News. 29, 30-31 (2009).
- Geithe, C., Andersen, G., Malki, A., Krautwurst, D. A Butter Aroma Recombinate Activates Human Class-I Odorant Receptors. J Agric Food Chem. 63 (43), 9410-9420 (2015).
- Noe, F., et al. OR2M3: A Highly Specific and Narrowly Tuned Human Odorant Receptor for the Sensitive Detection of Onion Key Food Odorant 3-Mercapto-2-methylpentan-1-ol. Chem Senses. 42 (3), 195-210 (2016).
- Geithe, C., Noe, F., Kreissl, J., Krautwurst, D. The broadly tuned odorant receptor OR1A1 is highly selective for 3-methyl-2,4-nonanedione, a key food odorant in aged wines, tea, and other foods. Chem Senses. 42 (3), 181-193 (2016).
- Duan, X., et al. Crucial role of copper in detection of metal-coordinating odorants. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (9), 3492-3497 (2012).
- Li, S., et al. Smelling Sulfur: Copper and Silver Regulate the Response of Human Odorant Receptor OR2T11 to Low-Molecular-Weight Thiols. J Am Chem Soc. , (2016).
- Wu, L., Pan, Y., Chen, G. Q., Matsunami, H., Zhuang, H. Receptor-transporting protein 1 short (RTP1S) mediates translocation and activation of odorant receptors by acting through multiple steps. J Biol Chem. 287 (26), 22287-22294 (2012).
- Shirasu, M., et al. Olfactory receptor and neural pathway responsible for highly selective sensing of musk odors. Neuron. 81 (1), 165-178 (2014).
- Block, E., et al.
- Sato-Akuhara, N., et al. Ligand Specificity and Evolution of Mammalian Musk Odor Receptors: Effect of Single Receptor Deletion on Odor Detection. J Neurosci. 36 (16), 4482-4491 (2016).
- Gane, S., et al. Molecular vibration-sensing component in human olfaction. PLoS One. 8 (1), e55780 (2013).
- Young, J. M., et al. Different evolutionary processes shaped the mouse and human olfactory receptor gene families. Hum Mol Genet. 11 (5), 535-546 (2002).
