Summary
Caracterizando a função dos receptores de odorante serve uma parte indispensável do processo de deorphanization. Nós descrevemos um método para medir a ativação dos receptores odorant em tempo real, usando um ensaio de campo.
Abstract
Os tamanhos enormes das famílias do receptor (OR) odorant mamíferos apresentam dificuldades para encontrar seus cognatos ligantes entre numerosos produtos químicos voláteis. Para eficiência e precisão deorphanize ORs, podemos combinar o uso de uma linha de celular heteróloga para expressar ORs mamíferos e um plasmídeo geneticamente modificado biosensor para medir a produção de acampamento a jusante de ativação OR em tempo real. Este ensaio pode ser usado para tela odorantes contra ORs e vice-versa. Interações de odorante-receptor positivo das telas podem ser posteriormente confirmadas por teste em relação a várias concentrações de odor, gerando curvas concentração-resposta. Aqui nós usamos este método para executar um rastreio do elevado-throughput de um composto odoríferos contra uma biblioteca de OR humano expressos nas células Hana3A e confirmou que o receptor está respondendo positivamente é o receptor cognato para o composto de interesse. Encontramos este método de deteção de alta produtividade para ser eficiente e confiável na avaliação da ativação OR e nossos dados fornecem um exemplo de seu uso potencial em estudos funcionais de OR.
Introduction
O sentido do olfato desempenha um papel importante na sobrevivência dos animais, como eles dependem de suas habilidades olfativas para obter alimentos, evitar predadores e perigo, distinguir a espécie e selecione companheiro1,2. A realização dessas funções depende os receptors odorant (SRO), que individualmente são expressos na superfície ciliar dos neurônios sensoriais olfativos (OSNs) localizada no epitélio olfativo (OE). RUP constituem a maior família da superfamília de receptores (GPCR) G-proteína juntamente com aproximadamente 400 e 1200 diversas OR genes em humanos e rato, respectivamente3,4,5. SRO ativado por odorantes leva ao aumento dos níveis intracelular de cAMP através da ativação sequencial de olfativa G-proteína (Golf) e digite adenilato ciclase III (ACIII). O resultante aumento do nível de cAMP intracelular pode funcionar como um segundo mensageiro, que abre o canal do nucleotide-gated na superfície das células, provocando o influxo de cátions incluindo Ca2 + e potenciais de ação e, finalmente, iniciar neuro-potencial transmissão e percepção olfativa. O processo de detectar e discriminar um grande número de odores pelo RUP é considerado como o primeiro passo de percepção olfativa6,7.
Desde que Buck e Axel8 primeiro com êxito clonado odorant receptores e elucidado o mecanismo da percepção olfativa, iniciada pelo RUP, deorphanization da família OR tornou-se um dos hotspots neste campo. Vários métodos in vivo, ex vivo e in vitro , para medir a ativação OR foram relatados9,10,11,12. Um método tradicional usado Ca2 + imagem seguida de célula única RT-PCR na OSNs permitiu a identificação de diferentes RUP para alifáticos odorantes13,14,15. Mais recentemente, o advento das análises em larga escala transcriptome promoveu o desenvolvimento de métodos de alta produtividade na vivo mais. O ensaio de Kentucky identificou ORs eugenol e muscona-responsivo do mouse com o uso do S100a5-tauGFP repórter rato estirpe e microarray análise9. Baseia a diminuição nos níveis de RNAm OR após exposição odorante, a tecnologia de sonho empregou uma abordagem transcriptomic para determinar perfis de ativação OR em ambas as espécies de vertebrados e non-vertebrado16. Da mesma forma, dada a fosforilação de S6 em ativações neuronais, o Matsunami grupo sequenciados mRNAs de moleculas de Ribossoma fosforilada para identificar responsivo ORs12. Finalmente, o grupo de Feinstein relatou ratos super cheirador que poderiam servir como uma plataforma para estudar o odor de codificação na vivo, conhecido como o de tecnologia de MouSensor17.
No Reino em vitro , o desafio de cultivo OSNs faz um sistema de expressão heteróloga que imita OR expressão funcional na vivo uma solução ideal para realizar a triagem em larga escala de produtos químicos odoríferos para RUP. No entanto, desde linhas de células cultivadas de origens não-olfactory diferem OSNs nativas ou proteínas são retidas no retículo endoplasmático e incapaz de tráfego para a membrana plasmática, resultando em OR degradação e perda da função de receptor18 , 19. para resolver este problema, foram feitas obras extensas para replicar a expressão funcional de OR na membrana celular em linhagens celulares heteróloga. Krautwurst et al primeiro anexados os 20 primeiros aminoácidos da rodopsina (Rho-marca) do N-terminal da proteína OR e isto promoveu a expressão da pilha-superfície de alguns ORs em células de rim humano embrionário (HEK)20. Realizando uma análise serial de análise de biblioteca de expressão (SAGE) gene do único OSNs, Saito et al. primeiro clonado do receptor-transportando proteínas (RTP) os membros da família, RTP1 e RTP2 e a proteína de potenciador de expressão do receptor 1 (REEP1) que facilitou OR tráfico para a membrana celular e aprimorado mediada por odorant respostas das RUP em células HEK293T 21. com base nesses resultados, o grupo Matsunami estabelecida com êxito a linha de celular Hana3A, estàvel transfected com RTP1, RTP2, REEP1 e Gαolf em HEK293T e transitoriamente transfected com RUP Rho-tag, para eficiente ou funcional expressão. Posteriores estudos revelaram 1) um formulário mais curto da RTP1, RTP1S, que poderia promover mais robustamente ou função do que o original proteína RTP1 e 2) o receptor de acetilcolina muscarínicos tipo 3 (M3R) que pode aumentar a atividade de OR através da inibição da β-arrestin-2 recrutamento, ambos os quais foram introduzidos no sistema de expressão heteróloga para otimizar experimental de saída22,23.
Vários métodos de deteção têm sido utilizados para quantificar a ativação do receptor em sistemas heterólogos. O ensaio da fosfatase alcalina placentária secretado (SEAP) trabalha com uma enzima reveladora transcriptionally regulamentada por elementos de resposta acampamento (CREs), tornando-se uma opção atraente para avaliar a ativação OR. A fluorescência é facilmente detectada em uma amostra de meio de cultura após a incubação com SEAP deteção reagente24. Usando este método, as funções das regiões ultraperiféricas, bem como uma classe secundária dos receptores chemosensory, expressado no OE, o rastreamento associado da amina receptores (TAARs) tem sido caracterizam25,26,27. Um outro método comum, o ensaio de luciferase, usa um gene de repórter de luciferase de vaga-lume sob o controle do elemento de resposta acampamento (CRE). Medição da luminescência gerada pela produção de luciferase oferece um meio eficiente e robusto de quantificar OR ativação10,11,28.
Ensaios de campo em tempo real também têm sido amplamente utilizados na monitoração dinamicamente a função de GPCRs heterólogos ou endógenas. Um exemplo desses ensaios avançados aproveita-se de uma variante geneticamente codificado biosensor, que possui um domínio de ligação de acampamento fundido a uma forma mutante de luciferase. Quando vincula de acampamento, a mudança conformacional leva à ativação de luciferase, luminescência, que então pode ser medida com um leitor de quimioluminescência29,30. A tecnologia de campo em tempo real tem sido relatada apropriado para o de orfandade de odorante humana receptores nas células de 108CC15 HEK293 e NxGbunda = "xref" > 31,32,33, como bem como o Hana3A HEK293T-derivado de células34,35. O grupo de Krautwurst também descrito em detalhes a tecnologia de campo em tempo real para ser apropriado para abordagens em grande escala ou triagem de bi-direcional de32,33.
Aqui descrevemos um protocolo para medir a ativação OR usando um ensaio de campo em tempo real em células Hana3A. Neste protocolo, a luminescência de células vivas pre-equilibradas cineticamente é medida por 30 min após o tratamento com compostos voláteis específicos, o que representa uma análise mais eficiente e precisa de ativação OR que são menos suscetíveis a artefatos que ocorrem no ambiente celular com tempo prolongado e toxicidades celular induzida pelo odor. Esta medição em tempo real permite uma triagem em larga escala do RUP e ligantes, bem como a caracterização de pares específicos de OR-ligante de interesse. Usando esse método, com sucesso identificamos OR5AN1 como receptor para a muscona composto de almíscar executando um rastreio contra 379 ORs humanos e posteriormente confirmando o resultado da seleção positiva.
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Protocol
1. Culturing e manutenção de células Hana3A
- manter as células em 10 mL de meio essencial mínimo (MEM) com 10% soro bovino fetal (FBS), 100 µ g/mL penicilina-estreptomicina e 1,25 µ g/mL anfotericina B em um 100-mm placa de cultura de células em uma incubadora de cultura de célula de 37 ° C com 5% de CO 2. Com cada outra passagem, adicionar 1 puromicina µ g/mL para manter estável transfection de plasmídeos (ver introdução).
Nota: Executar todas as etapas que envolvem a cultura de células em uma classe de segurança biológica II para garantir ambiente esterilizado. - Subcultura na proporção de 10-20% em 100mm pratos cada 2-3 dias.
2. Chapeamento de células para transfeccao
- observar as Hana3A células sob um microscópio de contraste de fase para garantir a viabilidade celular e estimar a confluência.
- Aspirar todos os meio do prato de cultura celular.
- Lavar as células adicionando 10 mL de tampão fosfato salino (PBS) na chapa, rodando o prato, e aspirando a PBS.
- Adicionar 3 mL de 0.05% tripsina-ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) na chapa. Mistura por 1 min ou até que todas as células estão à tona.
Nota: Observar o progresso de células desanexação da parte inferior da placa sob o microscópio como necessário. - Inativar tripsina pela adição de 5 mL de MEM com 10% FBS e pipeta de cima e para baixo para quebrar pedaços de célula Mass.
Nota: Para o chapeamento antes de transfeccao, o meio utilizado não deve conter antibióticos. Adição de antibióticos pode diminuir a eficiência do transfection. - Transferir uma quantidade adequada de células para um tubo de 15-mLl dependendo do número de placas a transfected. Para cada placa de 96 poços, placa de 2 x 10 6 células ou aproximadamente 1/5 de um prato de 100mm confluente de 100%, dando uma contagem de células de 2 x 10 4 células por poço ou uma densidade de aproximadamente 15-30% confluência por bem. Centrifugar tubos a 200 x g por 5 min e aspirar o sobrenadante sem perturbar o centrifugado.
Nota: Calcular a quantidade correta de células a ser chapeado em placas de 96 poços para evitar sobrecrescimento ou células antes da estimulação de undergrowing. - Adicionar uma quantidade adequada de MEM com 10% FBS na 15 mL do tubo e pipetar para cima e para baixo para quebrar pedaços da célula em massa. Para cada placa de 96 poços, Ressuspender as células com 6 mL de MEM com 10% FBS.
Nota: Tenha cuidado para não gerar bolhas de ar no tubo. - Adicionar as células suspensas em um reservatório. Usando uma pipeta multicanal, pipete 50 µ l de células em cada poço de uma placa de 96 poços. Incubar durante uma noite a 37 ° C com 5% de CO 2.
3. Transfection de plasmídeos
- antes de transfeccao, observar as células chapeadas para assegurar uma adequada confluência de aproximadamente 30-50% por alvéolo sob um microscópio de contraste de fase e voltar para a incubadora.
- Preparar antecipadamente o Rho-tag OR construção 11 , 21 , 22 , 28, o fator acessório constrói (RTP1S 22 , 36 e M3R 23), e a variante de biosensor construir 29 , 30 de miniprep. Quantificar a concentração de DNA por um espectrofotômetro e ajustar as concentrações de DNA do plasmídeo (por exemplo, a 100 ng / µ l) com água destilada, conforme necessário. Preparação de misturas a transfeccao de
- de
- prepara uma mistura de transfeccao Plasmideo em 500 µ l de MEM para cada placa de 96 poços, de acordo com a tabela 1.
Nota: Quando diferentes RUP é testados sobre a mesma placa de 96 poços, o volume da mistura de transfeccao e a quantidade de Plasmideo DNA adicionado deve ser adaptado em função do número de poços transfectados com um determinado OR. - Prepare uma mistura de transfeccao num tubo com 18 µ l de reagente de transfeccao mediada por lipídios em 500 µ l de Madame
- Misturar a mistura com a mistura de transfeccao Plasmideo pipetando para cima e para baixo. Incubar a temperatura ambiente por 15 min.
- Pare a reação adicionando 5 mL de MEM com 10% FBS.
- Espalhar uma camada espessa de toalhas de papel estéril do capuz de cultura de células. Pegue uma placa de 96 poços com células da incubadora. Suavemente e repetidamente toque placa de cabeça para baixo sobre a pilha de papel toalha para que o meio é completamente absorvido pela toalha de papel.
Nota: Não à força ou abruptamente tocar a placa como um poderia perder células. - Transferir 50 µ l da mistura de transfeccao combinada a cada poço da placa de 96 poços e incubar durante uma noite por 18-24h a 37 ° C com 5% de CO 2.
Nota: Uma agenda de transfecção e estimulação tempo gerenciado deve preceder a medição quando mais de uma placa de 96 poços são testados em um experimento para ter todas as placas medidas após o mesmo tempo de transfecção e tempo de exposição de estímulo.
4. Estimulação e a medição ou a atividade usando o ensaio de campo em tempo real
- observar as células transfectadas sob um microscópio de contraste de fase para garantir uma adequada confluência de 50-80% por poço e voltar para a incubadora.
- Prepare o suporte de estimulação adicionando o ácido de piperazineethanesulfonic de hidroxietil (HEPES) 10 mM e 5 mM de glicose para Hank ' s solução sal equilibrado (HBSS).
- Descongelar as alíquotas de reagente de substrato de ensaio de campo em tempo real no gelo. Armazenar reagente substrato a-80 ° C a 55 µ l pelo tubo em cadeia da polimerase. Use 1 tubo por placa.
- Preparar 2% solução de equilibração misturando 55 µ l de reagente substrato e solução de glicose/HBSS/HEPES 2750 µ l.
- Espalhar uma camada espessa de toalhas de papel no banco. Suavemente e repetidamente toque placa de cabeça para baixo sobre a toalha de papel para que a transfeccao é completamente absorvido pela toalha de papel.
- Lavar as células por pipetagem 50 µ l de solução HBSS/HEPES/glicose em cada Pocito.
- Suavemente e repetidamente toque a solução HBSS/HEPES/glicose da placa de 96 poços.
- Pipetar 25 µ l de solução de equilíbrio de 2% a cada bem e incubar a temperatura ambiente no escuro por 2 h.
- Preparar antecipadamente 1m odorant Soluções conservadas em estoque em DMSO e loja a-20 ° C até usado.
- Antes do final do tempo de incubação, diluir as soluções estoque de odorante de concentrações de trabalho no meio de estimulação HBSS/HEPES/glicose.
Nota: As concentrações de odorante diluições preparadas nesta etapa devem ser duplicadas para render as concentrações finais corretas em cada poço. - Usando uma quimioluminescência placa leitor e antes da adição de odorante, medir o nível basal de luminescência da placa por 2 vezes consecutivas a uma taxa de 1000 ms por bem 34.
- Rapidamente, retire a placa do leitor de placa e adicionar as diluições de odorante 25 µ l de cada poço e começar imediatamente a medição contínua da luminescência de todos os poços para 20 ciclos dentro de 30 min.
Nota: Pipeta com cuidado para não poluir os vizinhos poços quando usando diferentes odores e/ou concentrações diferentes de odorantes a mesma no mesmo prato.
5. Análise de dados
- exportar os dados a partir do software de leitor de placa de quimioluminescência.
- Calcular normalizado resposta OR para cada ponto de tempo, usando a fórmula de
(luminescência N – luminescência basal) / (luminescência maior – luminescência basal)
onde N = valor de luminescência de um certo bem; basal = valor médio da luminescência dos dois basais valores de luminescência; maior = maior valor de luminescência de uma placa ou um conjunto de placas de.
Nota: Dependendo da finalidade do experimento, representações gráficas alternativas podem ser adoptadas. Por exemplo, para a seleção de ensaios (ver Figura 1) e para a geração de curvas concentração-resposta, o valor de luminescência de um determinado bem em um ponto de tempo desejado durante a medição cinético, tais como o valor máximo ou o valor final, podem ser usados.
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Representative Results
Muscona é o principal componente aromático de almíscar natural. Recentes estudos de OR5AN1 identificado como um receptor humano para muscona e outros compostos de almíscar macrociclos com base na homologia com o mouse ou, MOR215-1, clonado de glomérulos muscona-responsivos em comportar-se de ratos37,38. Selecionando o repertório OR humano, nosso grupo e o grupo de Touhara também identificado OR5AN1 como um grande receptor para dois macrociclos almíscar compostos, cyclopentadecanone e muscona, respectivamente, usando a luciferase ensaio sistema38,39 .
Usando o ensaio de campo em tempo real descrito aqui, nós selecionados do repertório OR humano contra 30 µM muscona (Figura 1). Entre o 379 ORs humano selecionado, OR5AN1 surgiu com uma proeminente resposta a muscona, enquanto as outras RUP e os controles negativos (o controle de não-odor e o controle de vetor vazio) não apresentaram uma resposta significativa. O controlo positivo testado OR5AN1 contra 30 µM tibetene de almíscar, um ligante para OR5AN1 (dados não publicados) e foi usado para normalizar a resposta dos RUP para muscona. Para a representação gráfica deste conjunto de dados, escolhemos o ponto de tempo quando a leitura máxima luminescência foi alcançada para OR5AN1 contra tibetene de almíscar 30 µM.
Em seguida examinamos a relação concentração-resposta do odor-par OR com 3 diferentes concentrações de muscona. Para cada concentração de muscona testada, durante a primeira 20 min após a adição da muscona, a resposta por OR5AN1 aumentou gradualmente e então se estabilizou nos último 10 min (Fig. 2A) enquanto o rastreamento para o controle da adição de nenhum odor (0 µM muscona) permaneceu relativamente plana. Concentrações mais altas de muscona evocados respostas de OR mais fortes do que os mais baixos, que é distinguível durante a medição. Usando o último ponto de tempo de medição cinética, geramos uma curva concentração-resposta e a concentração de 50% do valor máximo efeito (CE50) da curva é estimada em 20.82 µM (Figura 2B).
Figura 1: Triagem para RUP humana da muscona.
379 único humano RUP foram projectados contra 30 µM muscona usando o ensaio de campo em tempo real. Blocos ao longo do xcoloridos-eixo indicam as diferentes famílias OR humanas. Cada coluna no x-axis representa um único tipo de OR, exceto para as três últimas colunas, que são a resposta de OR5AN1 a 30 µM musk tibetene (um controlo positivo), a resposta da OR5AN1 para a solução de glicose/HBSS/HEPES (nenhum odor controlo negativo), e a resposta de Rho-pCI para 30 µM muscona (um controlo negativo vetor vazio), da esquerda para a direita. y-eixo representa luminescência normalizada em 30 min após a adição de odorant quando a resposta atingiu um máximo para o controlo positivo (N = 3). Todas as respostas são normalizadas para o controlo positivo. Barras de erro representam o erro padrão média (SEM). Para maior clareza, são mostradas somente as barras de erro positivo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Medições cinéticas da resposta de OR5AN1 a muscona.
(A) foram realizadas medidas em tempo real da ativação de OR5AN1 por muscona de diferentes concentrações e um controle negativo não-odor dentro de 30 min de adição de odorante. Seta indica o ponto de tempo de adição de odorante. (B) concentração-resposta curva OR5AN1 contra muscona em 30 min após a adição de odorante. y-eixos representam luminescência normalizada (N = 3). Todas as respostas são normalizadas para a maior resposta a 100 µM muscona. Barras de erro representam SEM. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Plasmídeo | Quantidade por placa de 96 poços (µ g) |
| Rho- ou | 5 |
| RTP1S | 1 |
| M3R | 0,5 |
| variante de acampamento biosensor | 1 |
Tabela 1: Componentes da mistura do transfection.
Por quantidade de placa de 96 poços do Rho-M3R OR, RTP1S, e os plasmideos variante biosensor acampamento em tempo real.
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Discussion
Medir com precisão a ativação de um Bo após exposição a um determinado odorant é o primeiro passo para decifrar a codificação da informação olfactiva. Os experimentos mostrado neste estudo representam que um exemplo de como um pode identificar, usando um em vitro sistema de expressão OR, RUP ágil entre o repertório OR humano para o produto químico odoríferos de interesse e posteriormente, caracterizando o receptor Farmacologia, utilizando diferentes concentrações do produto químico. Nossos resultados confirmam OR5AN1 como um receptor de bona fide para muscona. Isto é consistente com um anterior relatório39 e fornece evidência adicional para a especulação de que apenas um pequeno número de receptores está envolvido na detecção do odor de almíscar27,40. Quando comparados com os dados de rastreio de Sato-Akuhara et al . que é gerado pelo ensaio de luciferase em um sistema de expressão heteróloga ou similar, nossos resultados de rastreio mostraram um pouco pior relação sinal-ruído. Além das variações inerentes às diferentes técnicas envolvidas, a diferença na saída poderia ser devido ao fato de que nós usamos uma concentração mais baixa de muscona (30 µM vs 100 µM). Na verdade, o valor de50 CE da curva concentração-resposta de OR5AN1 contra muscona que obtivemos através do ensaio de campo em tempo real está na mesma ordem de magnitude que Sato-Akuhara et al obtidos em seu sistema de ensaio de luciferase, demonstrando resultados comparáveis para o mesmo sistema de expressão de heteróloga OR mesmo quando são utilizados métodos de deteção diferentes. Em outro estudo, nosso grupo encontrou que o sistema de campo em tempo real pode ser ligeiramente mais sensível do que o sistema de gene repórter do luciferase em avaliar a seletividade do receptor de OR2T11, dado que um número pequeno de odorantes foram o único ativo na antiga, mas não no último sistema de35. Quando comparado com a série de dados relatados por Geithe et al . 31 em OR1A1 contra (+)-carvona, nossos dados na OR5AN1 contra muscona mostrou um atraso no tempo necessário para atingir o planalto, que diretamente pode resultar de diferentes tipos de RUP e odorantes usado. Em outros ensaio de campo em tempo real dados relatados do nosso grupo, mostramos também variadas vezes até o máximo dependendo do RUP e odorantes34,35. Além disso, linhas de célula diferente usadas para expressar o RUP, diferente substrato utilizado, variante plasmídeos diferentes biosensor acampamento em tempo real, sensibilidade diferente do leitor de placa de quimioluminescência, e/ou diferentes condições experimentais, tais como a variação em temperatura ambiente, todos poderão contribuir para as variações na saída de luminescência.
O ensaio de campo em tempo real mostra várias vantagens sobre outros métodos para medir a ativação OR. Primeiro, semelhante do ensaio de gene repórter do luciferase, o ensaio de campo em tempo real oferece um meio adicional em vitro de identificação de alta produtividade de repertórios OR respondendo a odorantes. Em grande escala do receptor e/ou odorante telas por ensaio de campo em tempo real podem oferecer uma grande quantidade de informações sobre o receptor-odor de emparelhamento com o uso de um pequeno número de placas. Quando avançado luminometers e pipetagem robôs estão disponíveis, o protocolo de 96 poços descrito aqui pode ser facilmente atualizado para um formato de 384-poço, no qual ainda menos plasmídeo e reagentes são necessários por unidade de saída de dados. Em segundo lugar, o método de campo em tempo real é capaz de medir as mudanças na concentração intracelular de cAMP em tempo real. Enquanto a maioria dos ensaios utilizados para medir a atividade OR até à data são baseado em fluorescência ou quimioluminescência ponto de extremidade deteção exigindo lysis da pilha, o acampamento em tempo real do ensaio isimplemented sob condições não-lítica, viver-pilha que são mais similares a endógena situação e que permitem o monitoramento das mudanças nos níveis de acampamento. Em terceiro lugar, um tempo relativamente mais curto é necessário para executar o método em tempo real. Outro método de análise do elevado-throughput de função OR, que se baseia em uma expressão de gene do repórter do luciferase, precisa de um adicional 4 h após a estimulação de odor para completar um experimento. Em alguns casos, um intervalo de incubação odor prolongada pode resultar em potenciais odorant toxicidade às células, que é efetivamente atenuada sob exposição transitória. Além disso, em experimentos de longa duração, as chances de contaminação dos poços vizinhos por volatilização quando usando diferentes odores e/ou concentrações diferentes de odorante o mesmo no mesmo prato também aumentam. Detecção imediata após a adição de odor faz o ensaio de campo em tempo real um paradigma rápido e confiável.
As limitações do campo de dados em tempo real do ensaio de medição ou ativação é a seguinte. Em primeiro lugar, nosso ensaio em vitro é baseado em uma linha de celular HEK293T-derivado que carece de muitas moléculas endógenas de neurônios sensoriais olfativos nativos. Além disso, proteínas solúveis e conversões enzimáticas que ocorrem no muco nasal podem vincular com odores e/ou influenciar a afinidade do OR para odorantes. Portanto, ativação do sistema heterólogo pode diferir a situação na vivo em termos de sensibilidade e sintonia de odor. Em segundo lugar, a identificação das RUP para um determinado odorant requer um repertório OR pelo menos uma dada espécie. RUP são uma grande família de GPCRs e os números das proteínas OR em humanos e rato são muito grandes,4,5,41. Considerável tempo e esforço podem estar envolvidos na clonagem cada repertório OR de interesse. Em terceiro lugar, embora o sistema de expressão heteróloga OR inclui modificações de sequência OR (como o Rho-tag) e algumas das proteínas chaves ou acessórias (tais como RTP1S e M3R), suspeitamos que nem todas as RUP funcionalmente é expressas na membrana celular do HEK293T-derivado de células. Portanto, a ausência de respostas para um determinado odorant em vitro não necessariamente exclui OR resposta na vivo, como resultado do fato de que algumas RUP pode ser apenas mal expressa na superfície das células e incapaz de reconhecer seus ligantes. Assim, sempre que possível em tempo real acampamento deve ser usado em conjunto com outros ensaios in vitro e in vivo para obter resultados mais convincentes.
Vários passos críticos devem ser dada atenção extra durante o ensaio de campo em tempo real. Primeiro, para experimentos envolvendo a luminescência em geral, a temperatura é um factor-chave que afeta o resultado do experimento, como aumentos de temperatura diminuem níveis basais e induzidos de saída de luz e diminuições na temperatura aumentam a saída de luz. Portanto, pre-desenroscada as placas para a temperatura de funcionamento de estado estacionário da musicaNT antes da adição de odorante é necessária para evitar a influência sobre os resultados causados por mudanças de temperatura. Em segundo lugar, as concentrações do reagente substrato em tempo real campo de ensaio devem ser ajustadas de acordo com a situação real. Quando a luminescência basal não consegue atingir o mais baixo limiar de deteção do leitor de placa de quimioluminescência, deve-se considerar aumentar as concentrações de substrato para aumentar o sinal. Finalmente, apesar de ser uma linha de células aderentes, Hana3A células podem desanexar durante o experimento. Quando aspirar ou adicionando o meio, colocar as pontas de pipeta, ao lado do poço pode reduzir as interrupções de monocamada a célula. Também é importante para chapa de células em uma densidade adequada e uniforme para evitar o sobrecrescimento de células como densas manchas de células tendem a descascar fora durante a mudança do meio.
Além de identificar OR(s) para um odorante de interesse, o ensaio de campo em tempo real também pode ser usado para triagem de ligantes cognatos para um determinado OR quando bibliotecas de produtos químicos estão disponíveis. Finalmente, quando são usadas tipos de célula apropriada e condições de transfeccao, o ensaio também pode permitir a detecção de ativação de GPCR Blumental ou endógena e dar curvas concentração-dependente da resposta para agonistas e antagonistas.
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Disclosures
Os autores não têm nada para divulgar.
Acknowledgments
O trabalho foi apoiado pelo chinês National Science Foundation (31070972), ciência e tecnologia Comissão de Xangai município (16ZR1418300), o programa para a inovadora pesquisa equipe de Shanghai Municipal Comissão de educação, o Shanghai Oriental Programa acadêmico (J50201) e o programa nacional de pesquisa básica da China (2012CB910401).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Amphotericin B | Sigma | A2942 | |
| DMSO | Sigma | D2650 | |
| FBS | Gibco | 10099-141 | |
| GloSensor cAMP reagent | Promega | E1290 | |
| pGloSensor-20F cAMP plasmid | Promega | E1171 | |
| Hana3A cells | available from authors upon request | ||
| HBSS, without calcium or magnesium | GIBCO | 14175095 | |
| HEPES | Hyclone | SH30237 | |
| Lipofectamine2000 | Invitrogen | 11668-019 | |
| M3R plasmid | cloned into a mammalian expression vector such as pCI | ||
| MEM, with EBSS and L-glutamine | Hyclone | SH30024 | |
| Muscone | Santa Cruz | sc-200528 | |
| Musk tibetene | Sigma-Aldrich | S359165 | |
| OR plasmids | cloned with a Rho-tag into a mammalian expression vector such as pCI | ||
| PBS, without calcium or magnesium | Cellgro | 21-040-CV | |
| Penicillin-streptomycin | Hyclone | SV30010 | |
| Plasmid miniprep kit | Tiangen | DP103-03 | |
| Puromycin | Sigma | P8833 | |
| RTP1S plasmid | cloned into a mammalian expression vector such as pCI | ||
| Trypsin-EDTA | Hyclone | SH30236 | |
| 0.2-mL PCR tube | Axygen | PCR-02-C | |
| 1.5-mL Eppendorf tube | Eppendorf | ||
| 15-mL 17 mm x 120 mm conical tube | BD Falcon | 352096 | |
| 8-well and/or 12-well multichannel pipetman | Eppendorf | ||
| 96-well flat-bottomed white cell culture plate | Greiner | 655098 | |
| 100 mm x 20 mm cell culture dish | BD Falcon | 353003 | |
| Class II biological safety cabinet with laminar flow | |||
| Cell culture incubator, with 5% CO2 | |||
| Centrifuge, with swinging bucket rotor for 15-ml conical tubes | |||
| Infinite F200 plate reader | Tecan | ||
| Phase-contrast microscope with x10 and x20 objectives | |||
| Spectrophotometer | |||
| Sterile reagent reservoirs for multichannel distribution | |||
| Sterile paper towel |
References
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