एक अनुकूलित Hemagglutination अवरोध (हाय) परख के लिए इंफ्लूएंजा यों तो विशिष्ट एंटीबॉडी Titers
Summary
प्रस्तुत प्रोटोकॉल का वर्णन कैसे एक hemagglutination अवरोध परख प्रदर्शन के लिए इंफ्लूएंजा-विशिष्ट एंटीबॉडी titers इंफ्लूएंजा वैक्सीन प्राप्तकर्ताओं के सीरम के नमूनों से । पहली परख hemagglutination द्वारा इष्टतम वायरल प्रतिजन सांद्रता निर्धारित करता है । दूसरी परख quantifies इंफ्लूएंजा-hemagglutination निषेध द्वारा विशिष्ट एंटीबॉडी titers ।
Abstract
एंटीबॉडी titers सामांयतः इंफ्लूएंजा और अंय रोगजनकों के खिलाफ सीरम संरक्षण के लिए किराए मार्कर के रूप में इस्तेमाल किया जाता है । एंटीबॉडी उत्पादन पूर्व और बाद टीकाकरण की विस्तृत जानकारी के लिए वैक्सीन प्रेरित प्रतिरक्षा समझ की आवश्यकता है । इस लेख का वर्णन एक विश्वसनीय बिंदु द्वारा-point प्रोटोकॉल इंफ्लूएंजा-विशिष्ट एंटीबॉडी titers निर्धारित करने के लिए । पहले प्रोटोकॉल एक विधि का वर्णन करने के लिए antigen hemagglutination, जो दूसरे प्रोटोकॉल (hemagglutination परख, हा परख) में बाद के उपयोग के लिए सांद्रता मानकीकरण के लिए आवश्यक मात्रा निर्दिष्ट करें । दूसरा प्रोटोकॉल का वर्णन इंफ्लूएंजा के ठहराव-विशिष्ट एंटीबॉडी titers अलग वायरल उपभेदों के खिलाफ मानव सीरम या सेल संस्कृति supernatants (hemagglutination अवरोध परख, हाय परख) के एक धारावाहिक कमजोर पड़ने का उपयोग करके ।
एक लागू उदाहरण के रूप में, हम एक स्वस्थ पलटन, जो एक त्रिसंयोजक निष्क्रिय इंफ्लूएंजा वैक्सीन प्राप्त की एंटीबॉडी प्रतिक्रिया दिखाते हैं । इसके अतिरिक्त, विभिंन इंफ्लूएंजा वायरस के बीच पार जेट दिखाया गया है और तरीकों पशु लाल रक्त कोशिकाओं (कोशिकाओं) के विभिंन प्रकार का उपयोग करके पार जेट कम करने के लिए समझाया जाता है । चर्चा के लाभों और प्रस्तुत की परख के नुकसान पर प्रकाश डाला गया और कैसे इंफ्लूएंजा के निर्धारण विशिष्ट एंटीबॉडी titers टीका से संबंधित प्रतिरक्षा की समझ में सुधार कर सकते हैं ।
Introduction
इंफ्लूएंजा वायरस के साथ संक्रमण काफी रुग्णता, मृत्यु दर के साथ जुड़ा हुआ है, और उच्च स्वास्थ्य देखभाल लागत1,2,3,4। विशेष रूप से, बुजुर्ग, नवजात शिशुओं, गर्भवती महिलाओं, और पुराने रोग के साथ रोगियों और अधिक गंभीर नैदानिक परिणामों के लिए जोखिम में हैं । इसलिए, टीकाकरण इंफ्लूएंजा वायरस उपभेदों परिसंचारी के खिलाफ इन उच्च जोखिम आबादी में रोग के बोझ को कम करने के लिए प्राथमिक उपाय है । टीकाकरण के बाद व्यक्तिगत प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया की वृद्धि, जैसे, इंफ्लूएंजा एक सुरक्षात्मक सीमा से ऊपर विशिष्ट एंटीबॉडी, संक्रमण के व्यक्तिगत जोखिम और सामांय में एक जनसंख्या के भीतर वायरल संचरण की संभावना कम कर देता है 5. वैक्सीन की एक विस्तृत समझ अलग आबादी और विभिंन आयु समूहों में प्रेरित विनोदी प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया के लिए महत्वपूर्ण नैदानिक प्रश्नों का उत्तर देने के लिए एक महत्वपूर्ण तत्व है6,7,8 , 9, जैसे: क्यों कुछ बुजुर्ग रोगियों पिछले टीकाकरण के बावजूद संक्रमण है? एक “अच्छा” और “पर्याप्त” वैक्सीन-प्रेरित संरक्षण क्या है? कितनी बार एक टीका एक immunosuppressed रोगी के लिए लागू किया जाना चाहिए सुरक्षात्मक titers तक पहुंचने के लिए? सबसे प्रभावी खुराक क्या है? एक उपंयास सहायक के बाद टीकाकरण एंटीबॉडी titers पर क्या प्रभाव है? टीका-विशिष्ट एंटीबॉडी उत्पादन की माप इन महत्वपूर्ण सवालों के जवाब मदद और टीकाकरण परिणामों में सुधार हो सकता है ।
विषाणु-विशिष्ट एंटीबॉडी titers के ठहराव विभिन्न प्रतिरक्षा विधियों के साथ किया जा सकता है । यह भी शामिल है ठोस चरण10 या मनका आधारित एलिसा11 परख, हाय परख12, और13परख बेअसर । एलिसा आधारित विधियों सीरम नमूनों की अपेक्षाकृत बड़ी मात्रा में विभिंन एंटीजन के खिलाफ स्क्रीनिंग की अनुमति देते हैं । इसके अलावा, रोगज़नक़-विशिष्ट Immunoglobulin (़) एम और आईजीजी अलग से पता लगाया जा सकता है । हालांकि एक प्रतिजन की विशेषताओं, उदा, रैखिक एमिनो एसिड अनुक्रम या वायरस की तरह कण एंटीबॉडी के बंधन को प्रभावित कर सकते हैं, संभावित epitopes के स्पेक्ट्रम बहुत व्यापक है और क्या एक एंटीबॉडी के बारे में जानकारी प्रदान नहीं करता है प्रतिक्रिया कार्यात्मक प्रासंगिकता है ।
इसके विपरीत, बेअसर परख एंटीबॉडी की क्षमता को कार्यात्मक कोशिकाओं के संक्रमण को बाधित करने के लिए निर्धारित करता है और इसलिए बेअसर क्षमता को दर्शाता है । हालांकि, इस विधि बहुत गहन श्रम है, विशिष्ट सेल लाइनों और लाइव वायरस के संवर्धन की आवश्यकता है, और इसलिए, यह समय लेने वाली है, महंगा है, और विशेष उपकरणों की आवश्यकता है ।
इस लेख का वर्णन एक कदम दर कदम विश्व स्वास्थ्य संगठन (डब्ल्यूएचओ)-आधारित हाय प्रोटोकॉल12 इंफ्लूएंजा-विशिष्ट एंटीबॉडी titers यों तो । Hemagglutination कुछ वायरस एरिथ्रोसाइट्स के समूहन के लिए अग्रणी का एक विशिष्ट प्रभाव है । रोगी सीरा के साथ इस आशय के निषेध निरोधात्मक एंटीबॉडी सांद्रता, जो एक बेअसर प्रभाव को दर्शाता है की माप की अनुमति देता है ।
हमने एक ही समय में एकाधिक नमूनों की अधिक कुशल हैंडलिंग और इस प्रकार आवश्यक समय को कम करने की अनुमति देने के लिए डब्ल्यूएचओ-प्रोटोकॉल के कार्यप्रवाह को संशोधित किया है । पहली प्रोटोकॉल एक विशेष इंफ्लूएंजा प्रतिजन के समूहन क्षमता के निर्धारण का वर्णन । ऐसा करने में, सही इंफ्लूएंजा प्रतिजन एकाग्रता दूसरे प्रोटोकॉल के लिए निर्धारित किया जाता है । यह हिस्सा हर नई वायरल प्रतिजन के साथ दोहराया जाना चाहिए, साथ ही रक्त के प्रत्येक बैच ।
दूसरा प्रोटोकॉल इंफ्लूएंजा के निर्धारण-विशिष्ट एंटीबॉडी titers का वर्णन । प्रस्तुत प्रोटोकॉल इंफ्लूएंजा वायरस और मानव सीरम नमूनों की जांच के लिए अनुकूलित कर रहे है तथापि, यह भी माउस सीरम नमूने या कोशिका संस्कृति supernatants के लिए प्रेरित प्रतिरक्षा कोशिकाओं से लागू किया जा सकता है, जैसे, वायरस-विशिष्ट बी कोशिकाओं । परिणाम निरपेक्ष मापा titers के रूप में निर्धारित किया जा सकता है । कई वैक्सीन अध्ययन में, ज्यामितीय माध्य titers और ९५% विश्वास अंतराल प्रत्येक विशेष जनसंख्या के लिए दिखाए जाते हैं । व्याख्या के लिए, seroprotection या seroconversion अक्सर एक निश्चित वायरस के लिए एक जनसंख्या की संवेदनशीलता का वर्णन करने के लिए उपयोग किया जाता है । Seroprotection ≥ 1:40 के एक titer के रूप में परिभाषित किया गया है, और seroconversion दो समय अंकों के बीच titer seroprotective की उपलब्धि के साथ एक से अधिक 4 गुना titers वृद्धि के रूप में (सबसे अधिक पूर्व टीकाकरण और 30 दिनों के बाद टीकाकरण का इस्तेमाल कर रहे हैं) ।
दोनों प्रोटोकॉल का उपयोग करने के लिए आसान कर रहे है और वे अनुसंधान के सवालों का एक व्यापक रेंज के लिए अनुकूलित किया जा सकता है । विशेष रूप से, वे hemagglutination, जैसे खसरा, polyomaviruses, कण्ठमाला, या रूबेला के रूप में क्षमता के साथ विभिन्न अन्य वायरसों के खिलाफ एंटीबॉडी titers मज़बूती से और जल्दी से निर्धारित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है14,15,16 .
Protocol
Representative Results
Discussion
पूर्व के ठहराव और बाद टीकाकरण इंफ्लूएंजा वायरस विशिष्ट एंटीबॉडी titers एक महत्वपूर्ण वैक्सीन अध्ययन के लिए आवश्यक उपकरण है । इस तरह के seroprotection के रूप में वायरस के संक्रमण के खिलाफ सुरक्षा के किराए के उपायों …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
कोई.
Materials
| 25 ml Disposable Multichannel Pipette Reservoirs | Integra | 4312 | |
| 8-well PCR tubes | Brand GMBH | 781332 | For serum aliquots |
| 96-well microtiter plate, U-shaped | TPP | 92097 | For HI assay when using mammalian RBCs |
| 96-well microtiter plate, V-shaped | Corning Costar | 3897 | For HI assay when using avian RBCs |
| Aqua ad iniect. Steril | Bichsel AG | 1000004 | For preparing influenza antigen and cholera filtrate solutions |
| Chicken RBC (10%) | Cedarlane | CLC8800 | 10% suspension of chicken red blood cells in Alsever's solution |
| Cholera filtrate | Sigma-Aldrich | C8772 | Used as receptor destroying enzyme (RDE) |
| Dulbecco's PBS | Sigma-Aldrich | D8537 | For diluting the serum samples, RBCs and antigens |
| Eppendorf Multichannel pipette, 12-channel, 10-100 µl | Sigma-Aldrich | Z683949 | |
| Eppendorf Multichannel pipette, 8-channel, 10-100 µl | Sigma-Aldrich | Z683930 | |
| Guinea Pig RBC (10%) | Cedarlane | CLC1800 | 10% suspension of guinea pig red blood cells in Alsever's solution |
| Influenza Anti-A/California/7/09 HA serum | NIBSC | 14/134 | Used as positive control at the HI assay |
| Influenza Anti-A/Switzerland/9715293/2013-like HA serum | NIBSC | 14/272 | Used as positive control at the HI assay |
| Influenza Anti-A/Texas/50/2012-Like HA Serum | NIBSC | 13/178 | Used as positive control at the HI assay |
| Influenza Anti-B/Brisbane/60/2008-HA serum | NIBSC | 13/254 | Used as positive control at the HI assay |
| Influenza Anti-B/Massachusetts/02/2012 HA serum | NIBSC | 13/182 | Used as positive control at the HI assay |
| Influenza antigen A/California/7/09 (H1N1)(NYMC-X181) | NIBSC | 12/168 | Inactivated, partially purified A/California/7/09 (H1N1)(NYMC-X181) virus (ca. 46µgHA/ml) |
| Influenza antigen A/Switzerland/9715293/2013 (NIB88) | NIBSC | 14/254 | Inactivated, partially purified A/Switzerland/9715293/2013 (NIB88) virus (ca. 55µgHA/ml) |
| Influenza antigen A/Texas/50/2012 (H3N2)(NYMCX-223) | NIBSC | 13/112 | Inactivated, partially purified A/Texas/50/2012 (H3N2)(NYMCX-223) virus (ca. 74µgHA/ml) |
| Influenza antigen B/Brisbane/60/2008 | NIBSC | 13/234 | Inactivated, partially purified B/Brisbane/60/2008 virus (ca. 42µgHA/ml) |
| Influenza antigen B/Massachusetts/02/2012 | NIBSC | 13/134 | Inactivated, partially purified B/Massachusetts/02/2012 virus (ca. 35µgHA/ml) |
| Serum-Tubes | S-Monovette, Sardstedt | 01.1601.100 | For serum extraction with clotting activator |
| Single Donor Human RBC, Type 0 | Innovative Research | IPLA-WB3 | Suspension of single donor human red blood cells in Alsever's solution (ca. 26%) |
| Turkey RBC (10%) | Cedarlane | CLC1180 | 10% suspension of turkey red blood cells in Alsever's solution |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Gibco |
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