Um ensaio de inibição (HI) de hemaglutinação otimizado para quantificar os anticorpos específicos de gripe
Summary
Os protocolos apresentados descrevem como realizar um ensaio de inibição de hemaglutinação para quantificar os anticorpos específicos de gripe de amostras de soro de destinatários de vacina contra gripe. O primeiro ensaio determina as concentrações de antígeno viral ideal por hemaglutinação. O segundo ensaio quantifica anticorpos específicos da gripe através da inibição da hemaglutinação.
Abstract
Anticorpos são comumente usados como marcadores de substituto para serológica proteção contra gripe e outros patógenos. Conhecimento detalhado da produção de anticorpos pré- e pós-vacinação é necessária para entender a imunidade induzida pela vacina. Este artigo descreve um protocolo ponto-a-ponto fiável para determinar anticorpos específicos de gripe. O primeiro protocolo descreve um método para especificar os montantes de antigénio necessários para hemaglutinação, que padroniza as concentrações para uso posterior no segundo protocolo (ensaio de hemaglutinação, ensaio HA). O segundo protocolo descreve a quantificação de anticorpos específicos de gripe contra diferentes cepas virais usando uma diluição serial de humana soro ou célula sobrenadantes de cultura (ensaio de inibição da hemaglutinação, ensaio HI).
Como um exemplo aplicado, mostramos a resposta imunitária de uma coorte saudável, que recebeu uma vacina trivalente inativada. Além disso, é mostrada a reactividade cruzada entre os vírus da gripe de diferentes e métodos para minimizar a reactividade cruzada usando diferentes tipos de animais células vermelhas do sangue (hemácias) são explicados. A discussão destaca vantagens e desvantagens dos ensaios apresentados e como a determinação de anticorpos específicos de gripe pode melhorar a compreensão da imunidade vacina-relacionados.
Introduction
Infecção com vírus da gripe está associada com altos custos de saúde1,2,3,4, mortalidade e morbidade considerável. Em particular, idosos, recém-nascidos, gestantes e pacientes com doença crônica são em risco para desfechos clínicos mais graves. Portanto, a vacinação contra estirpes de vírus da gripe de circulação é a principal medida para diminuir o fardo da doença nessas populações de alto risco. O aumento da resposta imune individual após a vacinação, por exemplo, anticorpos específicos gripe acima de um limite de proteção, reduz o risco individual de infecção e, em geral, a probabilidade de transmissão viral dentro de uma população de 5. um entendimento detalhado de induzida pela vacina resposta imune humoral em diferentes populações e em vários grupos de idade é um elemento-chave para responder a questões clínicas importantes6,7,8 , 9, tais como: por que alguns pacientes idosos têm infecções apesar da vacinação anterior? O que é uma “bom” e “suficiente” proteção induzida pela vacina? Quantas vezes uma vacina deve ser aplicada a um paciente imunodeprimidos para alcançar títulos protetoras? Qual é a dosagem mais eficaz? Qual é o impacto de um romance adjuvante na pós-vacinação anticorpos? A medição da produção de anticorpos específicos de vacina pode ajudar a responder a estas importantes questões e melhorar os resultados da vacinação.
A quantificação de anticorpos específicos do vírus pode ser executada com vários métodos imunológicos. Isso inclui a fase sólida10 ou ensaios de11 ELISA grânulo-based, o HI ensaio12e neutralizante ensaios13. Métodos baseados em ELISA permitam o rastreio de relativamente grandes quantidades de amostras de soro contra vários antígenos. Além disso, imunoglobulinas (Ig) M e IgG patógeno-específicos podem ser separadamente explorados. Embora as características de um antígeno, por exemplo, a sequência linear de aminoácidos ou vírus-como partículas podem influenciar a ligação de anticorpos, o espectro de epítopos potenciais é muito amplo e não fornece informações sobre se um anticorpo resposta tem relevância funcional.
Em contraste, o ensaio de neutralização determina o potencial de anticorpos de funcionalmente inibir a infecção das células e, portanto, reflete a potencial de neutralização. No entanto, esse método é muito trabalhoso, exige o cultivo de específicos de linhas de células e viver o vírus, e portanto, é demorado, caro e requer equipamentos especiais.
Este artigo descreve um passo a passo o protocolo baseado na organização mundial de saúde OMS HI12 para quantificar os anticorpos específicos de gripe. Hemaglutinação é um efeito característico de alguns vírus, levando à aglutinação dos eritrócitos. A inibição deste efeito com soros de doentes permite a medição das concentrações de anticorpos inibitório, que reflete um efeito neutralizante.
Modificamos o fluxo de trabalho do WHO-protocolo para permitir uma manipulação mais eficiente de várias amostras ao mesmo tempo e reduzindo o tempo necessário. O primeiro protocolo descreve a determinação do potencial de aglutinação de um antigénio específico da gripe. Ao fazer isso, a concentração do antígeno de gripe correto é determinada para o segundo protocolo. Esta parte deve ser repetida com cada novo antígeno viral, bem como cada lote de sangue.
O segundo protocolo descreve a determinação de anticorpos específicos de gripe. Os protocolos apresentados são otimizados para a investigação de vírus da gripe e amostras de soro humano, no entanto, também pode ser aplicado para as amostras de soro de rato ou sobrenadantes de cultura de células de estimulada células imunes, por exemplo, as células específicas do vírus B. Resultados podem ser determinados como títulos de medida absolutos. Em muitos estudos de vacina, os média geométrica de títulos e o intervalo de confiança de 95% são mostradas para cada população específica. Para interpretação, soroproteção ou seroconversão são frequentemente usados para descrever a susceptibilidade de uma população a um determinado vírus. Soroproteção é definida como um título de ≥1:40 e a seroconversão como um título mais do que 4-fold aumentar com a conquista de títulos seroprotective entre dois pontos de tempo (normalmente mais vacinação pré e pós-vacinação 30 dias são utilizados).
Ambos os protocolos são fáceis de usar e podem ser adaptadas para uma ampla gama de questões de investigação. Em particular, podem ser usados para determinar de forma confiável e rapidamente os anticorpos contra vários outros vírus com capacidade para hemaglutinação, tais como polyomaviruses, sarampo, caxumba ou rubéola14,15,16 .
Protocol
Representative Results
Discussion
Quantificação de anticorpos específicos vírus influenza pré- e pós-vacinação é uma importante ferramenta necessária para estudos de vacina. Com base nas medidas de proteção contra a infecção pelo vírus, tais como soroproteção substituto (> 01:40) ou seroconversão (aumento de 4-fold título), vacinação, estratégias podem ser otimizados9. Usando os protocolos fornecidos pode determinar: (i) o potencial de hemaglutinação, de um vírus específico e (ii) os anticorpos para o ví…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
nenhum.
Materials
| 25 ml Disposable Multichannel Pipette Reservoirs | Integra | 4312 | |
| 8-well PCR tubes | Brand GMBH | 781332 | For serum aliquots |
| 96-well microtiter plate, U-shaped | TPP | 92097 | For HI assay when using mammalian RBCs |
| 96-well microtiter plate, V-shaped | Corning Costar | 3897 | For HI assay when using avian RBCs |
| Aqua ad iniect. Steril | Bichsel AG | 1000004 | For preparing influenza antigen and cholera filtrate solutions |
| Chicken RBC (10%) | Cedarlane | CLC8800 | 10% suspension of chicken red blood cells in Alsever's solution |
| Cholera filtrate | Sigma-Aldrich | C8772 | Used as receptor destroying enzyme (RDE) |
| Dulbecco's PBS | Sigma-Aldrich | D8537 | For diluting the serum samples, RBCs and antigens |
| Eppendorf Multichannel pipette, 12-channel, 10-100 µl | Sigma-Aldrich | Z683949 | |
| Eppendorf Multichannel pipette, 8-channel, 10-100 µl | Sigma-Aldrich | Z683930 | |
| Guinea Pig RBC (10%) | Cedarlane | CLC1800 | 10% suspension of guinea pig red blood cells in Alsever's solution |
| Influenza Anti-A/California/7/09 HA serum | NIBSC | 14/134 | Used as positive control at the HI assay |
| Influenza Anti-A/Switzerland/9715293/2013-like HA serum | NIBSC | 14/272 | Used as positive control at the HI assay |
| Influenza Anti-A/Texas/50/2012-Like HA Serum | NIBSC | 13/178 | Used as positive control at the HI assay |
| Influenza Anti-B/Brisbane/60/2008-HA serum | NIBSC | 13/254 | Used as positive control at the HI assay |
| Influenza Anti-B/Massachusetts/02/2012 HA serum | NIBSC | 13/182 | Used as positive control at the HI assay |
| Influenza antigen A/California/7/09 (H1N1)(NYMC-X181) | NIBSC | 12/168 | Inactivated, partially purified A/California/7/09 (H1N1)(NYMC-X181) virus (ca. 46µgHA/ml) |
| Influenza antigen A/Switzerland/9715293/2013 (NIB88) | NIBSC | 14/254 | Inactivated, partially purified A/Switzerland/9715293/2013 (NIB88) virus (ca. 55µgHA/ml) |
| Influenza antigen A/Texas/50/2012 (H3N2)(NYMCX-223) | NIBSC | 13/112 | Inactivated, partially purified A/Texas/50/2012 (H3N2)(NYMCX-223) virus (ca. 74µgHA/ml) |
| Influenza antigen B/Brisbane/60/2008 | NIBSC | 13/234 | Inactivated, partially purified B/Brisbane/60/2008 virus (ca. 42µgHA/ml) |
| Influenza antigen B/Massachusetts/02/2012 | NIBSC | 13/134 | Inactivated, partially purified B/Massachusetts/02/2012 virus (ca. 35µgHA/ml) |
| Serum-Tubes | S-Monovette, Sardstedt | 01.1601.100 | For serum extraction with clotting activator |
| Single Donor Human RBC, Type 0 | Innovative Research | IPLA-WB3 | Suspension of single donor human red blood cells in Alsever's solution (ca. 26%) |
| Turkey RBC (10%) | Cedarlane | CLC1180 | 10% suspension of turkey red blood cells in Alsever's solution |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Gibco |
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