Summary
我々は、摂動に応答して異種細胞集団動態を研究するための新規プロトコールを開発した。この原稿では、異種細胞集団の複数の細胞表現型を堅牢な方法で同時に特性決定するための定量的データセットを作成する画像ベースのプラットフォームについて説明します。
Abstract
細胞プロセスは複雑であり、複数の細胞タイプとそれらの環境との間の相互作用から生じる。既存の細胞生物学技術は、しばしばこの相互作用の正確な解釈を可能にしない。定量的イメージングベースのアプローチを用いて、我々は、異種細胞集団の動的表現型応答（ すなわち、形態変化、増殖、アポトーシス）を環境刺激の変化に特徴付けるための高含量プロトコルを提示する。用途に応じて、蛍光強度または固有の形態学的特徴に基づいて細胞タイプを区別する能力を強調する。このプラットフォームは、伝統的な細胞生物学的アッセイより短い時間、より少ない量の試薬およびエラーの可能性を利用しながら、摂動に対する亜集団応答のより包括的な特性決定を可能にする。しかし、場合によっては、細胞集団は複雑な細胞に基づいて同定および定量するのが困難な場合があります追加機能のトラブルシューティングが必要になります。私たちはこれらの状況のいくつかを議定書で強調します。我々は、癌モデルにおける薬物に対する応答を用いて、この適用を実証する。しかし、それは他の生理学的プロセスに対してより広範に容易に適用することができる。このプロトコルは、共培養系内の亜集団を同定し、それぞれの外部刺激に対する特定の応答を特徴付けることを可能にする。
Introduction
細胞ベースのアッセイは、基礎研究および医薬品開発のセッティングにおいて重要な役割を果たしてきました。しかし、これらの標準的なアッセイの限界は、インビトロおよび臨床データ間の不一致およびFDAの承認を受けるためのほとんどの薬物の不具合によってますます明らかになってきている。ここでは、関連する共存する環境刺激に応答して異種細胞表現型を同時に分析するために、定量的イメージングを利用するための新規な方法を提示する。
細胞生存率を測定するために使用される従来の細胞ベースのアッセイには、トリパンブルー排除アッセイ、MTT / MTS、およびアネキシンV-FITCフローサイトメトリー染色が含まれる。トリパンブルー排除アッセイは、単純かつ安価でありながら多数の細胞を必要とし、時間がかかり、しばしばユーザバイアス1の影響を受ける。 MTTおよびMTSアッセイは、ミトコンドリアの代謝速度の測定を介して間接的に細胞生存率を測定する。しかしながら、代謝活性物質（培地や酸素濃度など）の影響を受ける可能性があり、不正確な結果を招き、細胞の種類や状態を問わず標準化を妨げる2,3 。これらの技術のもう一つの大きな欠点は、複数の細胞タイプを区別できないことです。ほとんどの生物システムは異種細胞です。フローサイトメトリー法は複数の細胞集団を区別する能力を有するが、細胞標識が必要であり、動的サンプリングが困難であり、付着細胞を用いる場合、この適用は時間がかかり、誤りを起こしやすい。
形態学的変化を含む他の重要な細胞表現型は、環境刺激に応答して生じるが、伝統的な細胞ベースのアッセイによっては捕捉されない。形態学的特徴付けおよびサンプル間の類似性マッピングによって細胞状態をプロファイリングすることは、a基本的な細胞生物学や創薬を含む、基礎と翻訳の研究の多くの側面に新しい洞察を提供する可能性4 。さらに、腫瘍細胞の形態学は、腫瘍亜型5および攻撃性6と相関することが示されている。したがって、これらの細胞の特徴およびそれらがどのような特定の環境摂動に関連するかを研究することは、大きな関心事である。さらに、形態学的特徴の相違を用いて、共培養系における亜集団を識別することができる。蛍光標識細胞は、欠点（ すなわち 、固有の細胞特性の変更、時間のかかる）を有し、したがって、細胞型を分類するためのさらなる方法が有利である。
顕微鏡検査に基づくイメージングは、細胞表現型を多重化し、定量的かつ堅牢な方法でプロファイリングするための代替方法である。この原稿では、定量的なイメージングパイプラインを適用して、エボリューション腫瘍内の異種細胞集団のダイナミクス。私たちは、非小細胞肺癌（NSCLC）細胞と癌関連線維芽細胞（CAF）との相互作用に焦点を当てています。 CAFは、腫瘍の開始、進行および治療応答に関与している。したがって、CAFの非存在下で腫瘍細胞に対して表現型アッセイを行うことは、誤解を招く可能性がある7,8,9。特に、本発明者らは、NSCLCの臨床処置においてしばしば使用される上皮増殖因子受容体（EGFR）を標的とする小分子であるエルロチニブに応答する腫瘍細胞に対するCAFの効果を評価した。我々は、評価のためにハイコンテンツスクリーニングプラットフォームおよびそれに付随する画像分析ソフトウェアを利用した。しかし、この方法論を他の研究者が利用できるようにするために、私たちはオープンソースソフトウェアを使って同等の下流プロトコルを開発しました。CellProfiler 10およびCellProfiler Analyst 11ほとんどの画像ベースの高含量スクリーニングアッセイは、所定の機器モデルに特有の商品化されたソフトウェアで分析される。基礎となるアルゴリズムはしばしば専有であるため、異なるソフトウェアを使用する他のラボでは結果を複製することは困難です。この画像ベースのパイプラインを用いて、蛍光および形態学的分類の両方を用いた薬物治療に応答した異種細胞培養の各亜集団の細胞増殖、死および形態を測定した。以下のプロトコルは、複雑な細胞プロセスをプロービングするための堅牢な方法を提供します。
Protocol
1.細胞培養
注：ここでは肺線維芽細胞（CCD-19Lu GFP）と共培養したときのEGFRターゲッティング剤であるエルロチニブに対するNSCLC細胞（H3255）の表現型応答を調べた。同じデータセットについて、2つの細胞集団（H3255およびCCD-19Lu GFP）の蛍光ベースおよび形態ベースの分類を、それらの一致度を例示するために行った。しかしながら、1つの分類方法のみが使用される必要があり、その用途に基づいて選択されるべきである。
- 10％熱不活性化FBSおよび1％ペニシリン/ストレプトマイシンを補充した500mLのRPMI-1640を調製する。
注：増殖培地およびサプリメントは、他の細胞タイプの必要に応じて交換することができます。 - 37℃で5％CO 2中の純粋な集団として10cm 3プレート中の細胞を培養し、3〜4日ごとに適切な割合で通過させる。
細胞の調製
- 細胞懸濁液を調製するために、c5mLの1Xリン酸緩衝生理食塩水（PBS）で細胞を洗浄する。
- PBSから吸引し、37℃で加温した0.05％トリプシン1 mLを添加し、37℃で5分間（または細胞がもはやプレートに付着しなくなるまでインキュベートする）インキュベートする。
- トリプシンを中和するために、4mLのRPMIをH3255およびCCD-19Lu GFPプレートに加え、細胞溶液を15mLコニカルチューブにピペットで分注する。
- 室温で5分間150xgで細胞を遠心分離する。
- 上清を吸引し、円錐管のRPMI培地10mLに細胞ペレットを再懸濁して、播種の準備をします。
3.セルメッキ
- シードを標準化するために細胞を数える。
- チューブを反転させて細胞を溶液中に混合する。各細胞懸濁液10μLをマイクロ遠心管にピペットで入れ、10μLのトリパンブルーを加える。
- この溶液10μLを細胞計数スライドにピペットで入れ、自動細胞計数器に挿入する。
注：細胞計数の他の方法（ すなわち、。血球計算盤）を使用することができる。 - 細胞カウントを少なくとも3回、または得られたカウントが一致するまで繰り返す。
- マルチウェルプレート上にシード細胞を接種する
注：シードするプレートの数は、画像化される時点の数に依存します。あるいは、細胞がヒストン-2B-GFP（または適切な核セグメント化を提供する他の安定なレンチウイルス核染色）で形質導入される場合、1つのプレートを経時的に再撮像することができる。- 100μLのRPMI中に合計で1,500細胞/ウェルで播種する。 H3255、CCD-19Lu GFP、および50％H3255 + 50％CCD-19Lu GFPの3つの細胞集団をプレートするための3つの細胞懸濁液を調製する。それぞれの時点で同一のプレート設定で3通りずつ実行します。
注：初期播種密度は、細胞株およびプレートサイズごとに最適化する必要があります。 - マルチチャネルピペットを用いて3×96ウェルプレートに細胞を播種する。細胞を37℃、5％CO 2でインキュベートする。
- 100μLのRPMI中に合計で1,500細胞/ウェルで播種する。 H3255、CCD-19Lu GFP、および50％H3255 + 50％CCD-19Lu GFPの3つの細胞集団をプレートするための3つの細胞懸濁液を調製する。それぞれの時点で同一のプレート設定で3通りずつ実行します。
4.薬物投与
- エルロチニブ粉末にDMSOを添加して、10mM濃度の最終的なエルロチニブ原液を作製する。
注：薬物は必要に応じて置換することができます。 - 細胞培養培地で薬物を希釈して最終濃度10μMの最終濃度で最終濃度を2倍にし、1:10の比で4回連続して希釈して合計5種類の薬物濃度と無薬物対照とする。
注：最高薬物用量でDMSOの濃度が0.1％v / vに等しいかそれを超える場合、観察された観察された効果がDMSOの毒性によるものでないことを確実にするために、無薬物対照は同等量のDMSOを含むべきである。 - 適切なウェルに薬物溶液100μLをピペットし、最終薬物濃度を培地で1倍に希釈する。
5.画像取得
注：0日目、2日目および3日目に画像を取得した。研究されている細胞型および細胞プロセスに応じて、所望の時点を研究することができる。
- イメージングの準備のために細胞を染色する。
- 以下の最終濃度で色素溶液を調製する。
- 蛍光ベースの分類のために、5μg/ mLの核染色およびPBS中の5μMの死細胞染色を調製する（ 表の表を参照）。
- 形態学的分類のために、5μg/ mLの核染色剤、5μMの死細胞染色液、およびPBS中の5μM細胞染色液を調製する（ 表の表を参照）。
- 各ウェルに20μLの色素溶液を添加する。光から保護された37℃で30分間インキュベートする。
- 以下の最終濃度で色素溶液を調製する。
- 画像の最適化と取得。
- インキュベーターからウェルプレートを取り出し、プレートの底を70％EtOHで拭き取り、プレートをイメージングチャンバーに置きます。
- [設定]タブで、[チャンネル選択]の下の[+]ボタンをクリックして、適切なチャンネルを追加します。画像（ すなわち、明視野、核染色、死細胞染色、GFPおよびRFPシグナル）。
- 「レイアウト選択」をクリックし、焦点面を特定するために、0μmで始まり2μmで始まるzμmのテスト画像を2μmごとに撮影します。 'Height'の下の各チャンネルのこの距離を入力します。
- 各チャネルの下にある「スナップショット」をクリックして強度を評価し、露光時間を最適化します。必要に応じて、「時間」の下にある値を上または下に入力します。
- 画面の右側で、プレートの回路図の適切なウェル（画像化される）を強調表示します。下の井戸の概略図では、イメージングされる25のフィールドを同様の方法で強調表示します。
- 'Run Experiment'の下で、左のタブの 'Plate Name'でプレートを識別し、 'Start'ボタン（下）をクリックして10X対物レンズで画像取得プロトコルを実行し、前述のチャンネルでグレースケールTIFF画像を生成します。
注：ステップバイステップのinstイメージングプロトコルの破損は計測器によって異なる場合がありますが、パラメータ値は依然として最適化されていなければなりません。 - 2、3日目にイメージングを繰り返します。
6.画像解析
注：すべての画像解析は、独自のソフトウェアを使用して実行されました。しかし、これは一般に公開されていないため、CellProfiler 2.2およびCellProfiler Analyst 2.0で以下の簡単なプロトコルと詳細なプロトコルを補足資料として提供しています（テストイメージはすでにワークフローをテストするためにパイプラインに読み込まれています）。この実験からの画像を、各ウェルを個別にロードすることができるようにウェルごとにまとめた。以下のCellProfilerパイプラインには、各イメージファイル名のメタデータ情報を解析し、チャネル別にイメージをグループ化できる正規表現が含まれています。
- オープンソースソフトウェアをダウンロードしてインストールする： 'CellProfiler9;および 'CellProfiler Analyst'インストール時にすべてのデフォルトオプションとアドオンを受け入れます。
- 異種細胞培養物を亜集団に分類する。
- 'CellProfiler'ソフトウェアを開き、 'ファイル'をクリックします。 'パイプラインのインポート' | 'From File'を選択し、適切なファイル（蛍光ベースの分類の場合は 「Fluorescence_Classification.cppipe」、形態ベースの分類の場合は「Morphology_Classification.cppipe」）を選択します。
注：これらのファイルには、基本的な画像処理と核/セルセグメンテーションのためのプロトコルが含まれています。これらの細胞全体に存在する不均一なHoechst染色のために、核を分割して拡大し、次いで画像をマスクしてより低い強度の核のセグメント化を可能にした。- 蛍光ベースの分類パイプラインを選択して、細胞をeGFP強度に基づいてH3255またはCCD-19Luとして分類し、形態学的特徴を計算する。
注：CCD-19Lu細胞にGFPを形質導入した。 - モルフォロジーに基づく分類パイプラインを選択して、核および細胞をセグメント化し、形態学的特徴を計算する。
注：分類のために 'CellProfiler Analyst'のさらに下流の分析が必要です。死細胞は、蛍光に基づく分類によって分類される。
- 蛍光ベースの分類パイプラインを選択して、細胞をeGFP強度に基づいてH3255またはCCD-19Luとして分類し、形態学的特徴を計算する。
- 画面の左下にある[出力設定の表示]をクリックします。分析用のイメージファイルの場所（ 'Default Input Folder'）と抽出されたデータの保存先（ 'Default Output Folder'）を選択します。
- 'Analyze Images'をクリックして分析を開始します。分析が完了したら、[OK]をクリックして、[Default Output Folder]に移動して、計算されたデータを表示します。
注記：パラメータ値の例と画像は補足ファイル1-CellProfilerProtocol.pdfで利用できます。 - 形態ベースの分類（のみ）については、以下のことを行う。
- 「CellProfiler Analyst」ソフトウェアを開き、CellProfilerで生成されたデータベースプロパティファイルを選択し、「開く」をクリックします。
- 画面の左上にある[クラシファイア]タブをクリックします。実験からランダムなセル画像を呼び出すには、[フェッチ]をクリックします。画像が未分類のウィンドウに表示されます。
- 適切なビンに細胞を選択してドラッグすることにより、細胞を陽性（H3255）または陰性（CCD-19Lu）として手動で分類する（ 補足ファイル2-Pipeline.pdf ： 図B参照）。サブ集団ごとに少なくとも50個の細胞を分類した後、「Train Classifier」をクリックして、「Progressを確認」をクリックします。
注：セルは、ユーザが管理するランダムフォレストマシンラーニングアルゴリズム12によって分類されます。精度が承認されたしきい値（> 90％）を上回らない場合は、「CellProfiler」のセルセグメンテーションを元に戻すか、セルを最適化する必要があります形態学的に怒っている。 - 各小集団の細胞数を含む表を生成するには、[スコアすべて]をクリックします。
- 'CellProfiler'ソフトウェアを開き、 'ファイル'をクリックします。 'パイプラインのインポート' | 'From File'を選択し、適切なファイル（蛍光ベースの分類の場合は 「Fluorescence_Classification.cppipe」、形態ベースの分類の場合は「Morphology_Classification.cppipe」）を選択します。
Representative Results
我々は、合計4,050個の個別画像のために、3枚のプレートにわたり25個のウェル/ウェル、54個のウェル/プレート（3個の細胞集団×6個の薬物濃度×3個の複製物）からなる画像セットを生成した。実験の過程で生成された画像セットは、独自のソフトウェア（材料の表参照）を用いて細胞の様々な定量的性質（ すなわち形態、蛍光）を抽出し、細胞亜集団を分類するために使用することができた。しかし、使用される商用ソフトウェアにはアクセスが制限されているため、CellProfilerとCellProfiler Analystの同等の下流パイプラインが作成されました。
サブ集団への異種細胞分類
核はDNA染色（ここではHoechst）に基づいて同定され、セグメント化され、細胞集団は、蛍光またはモレキュラーに基づいて分類された（ 図1 ）。蛍光に基づく分類のために、線維芽細胞（CCD-19Lu）は、予めGFP-レンチウイルスで形質導入された。 GFP強度レベルを各核について測定し、許容された閾値（バックグラウンドシグナルに基づく）を超えて計算したものをCCD-19Luと分類し、以下のものを腫瘍細胞（H3255）として同定した。形態学的分類のために、細胞を以前に非毒性細胞染色（材料の表参照）で染色し、これを用いて細胞質を同定し、セグメント化した。機械学習アルゴリズムを、各集団から約50〜100個の細胞で訓練した。集団間で有意に異なる形態学的特徴が同定され、次いでそれを用いて、CCD-19Lu細胞とH3255細胞とを区別する線状分類器を設計した。蛍光および形態分類プロトコールは、2つの細胞集団を区別する際に97.4％（n = 1403）の一致性であった（1μMエルロチニブ）で92.5％（n = 916）の一致がみられた（ 図2 ）。
サブポピュレーションの表現型解析
細胞型を区別することに加えて、我々は各亜集団の表現型特性を特徴付けることを目指した。マルチプレックスアッセイは、時間と試薬を節約し、一貫性を高め、研究されているシステムに関する追加情報を提供します。多くの潜在的な表現型産物が存在し、関心のある質問に基づいてそれらを選択すべきである。ここでは、エルロチニブ治療に応答した細胞形態および生存能力状態の変化を調べた。 3日間の薬物処理後、H3255細胞の核領域の減少および細胞面積の増加が観察された（ 図3A ）。核の平均面積の差「無薬物」および「薬物」処置集団は、2型2型（等分散） t検定 （ p = 7.92×10 -16 ）を介して統計的に有意であることが判明した。我々は、この観察は薬物治療によって課せられたストレスに対する細胞応答であると仮説を立てる。
これは、臨床的に重大な影響を及ぼすため、薬物が細胞毒性（ すなわち 、時間の経過とともに死細胞の数が増加する）または細胞分裂抑制（ すなわち 、時間の経過とともに細胞の出生の数が減少する）効果を有するかどうかを調べることもまた興味深い。例えば、細胞増殖抑制薬物効果は成長停止を誘導するが、腫瘍から細胞を排除しないので、薬物が除去されると癌細胞が細胞増殖を再開する可能性がある。薬物効果はしばしば文脈、濃度、および細胞型に依存し得る。我々は以前にエルロチニブが1つの細胞型で細胞傷害性応答を誘発するのを観察したが、ac別の13の反応である。
伝統的な生存能力アッセイは、相対細胞数を出力し、したがって、成長停止と細胞死とを区別しない。ここでは、ヨウ化プロピジウム染色に基づいて死細胞を同定した（ 図3B ）。 H3255細胞に対するエルロチニブの細胞毒性および細胞増殖抑制効果の両方が観察され、薬剤処置後の死亡数および出生数の減少が見られた（ 図3C ）。死亡細胞の数は、細胞クリアランスのため1日後に低下することは注目に値する。 CCD-19Lu細胞は薬物の影響を受けなかった。このプラットフォームのもう一つの利点は、量的データの生成です。例えば、我々の共培養実験では、エルロチンを含まないか、またはエルロチンを含まない3日後に、1,118（75.8％）のH3255細胞の初期亜集団が2,817（87.9％）または396（57.2％）であることが見出された（ 図4 ）。相対的な割合ではなく実際の細胞数を生み出すことができるので（フローサイトメトリー法のように）、薬物処理中の組成の変化はH3255細胞の減少によるものであり、CCD-19Luの増加によるものではないと結論する。細胞のクリアランスのために死亡率が過小評価される可能性は何もありません。これは実験的に評価するのが難しく、細胞タイプによって異なる可能性があります。
図1：画像解析プロトコルの概要形態学ベースの分類または蛍光ベースの分類のいずれかを使用して異種細胞集団を分類する2つの潜在的な下流画像分析パイプライン。スケールバー=100μm。 彼女をクリックしてくださいこの図のより大きなバージョンを表示します。
図2：形態学と蛍光に基づく分類との間の一致。 （ A ）2つの分類プロトコルの重複を示すコンコード図。同じ細胞を形態学的および蛍光に基づく分類の両方を用いてH3255として分類した。 2つのプロトコールは、97.4％（n = 1403）の未処理細胞および92.5％（n = 916）のエルロチニブで処理された細胞の分類（注：白色領域は視覚化するには小さすぎる）で一致した。 （ B ）蛍光ベースの分類と形態ベースの分類との間の良好な一致および劣悪な一致の例を示す10X画像。白い矢印は、プラットフォーム間で一貫して分類されていない細胞を指し示します。入力画像：青 - 核（Hoechst）;緑 - CCD19Lu（GFP）。 Classiイメージ画像：赤 - H3255;緑 - CCD-19Lu。スケールバー=100μm。 この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。
図3：単一の実験的セットアップからの多重表現型測定。 （ A ）薬物の存在下および非存在下での単一細胞レベルで、核および細胞面積などの形態学的特徴を計算した。注：100μm2未満のセル面積は残骸とみなされ、分析から除外されています。ボックスプロットは、第1および第3四分位範囲および95％信頼区間エラーバーを有する中央値を示す。 （ B ）H3255（青色）とCCD-19Lu（緑色）細胞を共培養し、プロティドの強度に基づいて死細胞を同定したヨウ化銀染色（赤色）し、10倍の対物レンズを用いて画像化する。スケールバー= 1mm（上部パネル）。 100μm（下の画像）。 （ C ）生きた細胞および死んだ細胞の総数は、薬物処理の有無にかかわらず、エルロチニブの添加により生存細胞の数が明らかに減少し、死細胞が増加して3日間にわたって計算された。エラーバーは、3回の反復に基づく平均の標準誤差を表す。 この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。
図4：時間の経過に伴う亜集団ダイナミクス 0日または3日目にH3255（青色）およびCCD-19Lu（緑色）を含むウェルの代表的な10X画像。各亜集団に属する細胞を数え、比例円グラフはaサンプル間の集団組成の実際の変化。スケールバー= 1mm（中央のパネル、面取りされたパネル、最上部のパネル）、1mm（上の画像）、100μm（下の画像）。 この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。
Disclosures
著者は何も開示することはない。
Acknowledgments
この研究は、国立がん研究所（NCI）助成金U54CA143798とU54CA143907の資金提供を受けて、ダナファーバー癌研究所と南カリフォルニア大学で物理科学 - 腫瘍センター（PS-OC）を確立しました。 SM Mumenthalerはこの作業の一部をサポートするPS-OCトランスネットワーク賞を受賞しました。
私たちは、Operetta HCSプラットフォームの寄付について、私たちの慈善団体、特にStephenson家、Emmet、Toni、Tessaに深く感謝したいと思います。 J. Foo博士、Applied Molecular Medicineのチームメンバーでもあります。D.臨床的指導と指導のためのAgus、実験デザインとの有意義な議論のためのK. Patsch、R. Rawatによる画像解析プロトコールの支援、Operettaの技術援助のためのJ. Katz、そして有用な議論とフィードバックのためのP. MacklinとD. Ruderman。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI-1640 | Corning | 10-040-CV | cell culture medium |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gemini | 100-106 | medium supplement |
| Penicillin/streptomycin | Gibco | 15-140-122 | medium supplement |
| TC20 | Biorad | 1450102 | cell counter |
| TC20 slides with trypan blue | Biorad | 1450003 | cell counter slides |
| 96-well plates | Corning | 3904 | clear bottom black plates |
| Erlotinib | LC Laboratories | E-4007 | |
| DMSO | VWR | 317275-100ML | solution to resuspend drug |
| Hoechst | Invitrogen | H21491 | nuclear dye |
| Propidium Iodide (PI) | Invitrogen | P1304MP | dead cell stain |
| Cell Tracker Orange CMRA | Life Technologies | C34551 | whole cell stain |
| Operetta high content imaging system | Perkin Elmer | ||
| CellProfiler | Broad Institue | version 2.2.0 (rev 9969f42) | http://cellprofiler.org/releases/ |
| Cell culture incubator | Any cell culture incubator will be suitable - cells were cultured under 37 ºC at 5% CO2. | ||
| 15 mL Falcon conical tubes | Falcon | 14-959-53A | |
| 10 cm2 cell culture plates | TPP | 93040 |
References
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