Nous avons développé un nouveau protocole pour étudier la dynamique de la population hétéro-cellulaire en réponse à des perturbations. Ce manuscrit décrit une plate-forme basée sur l'imagerie qui produit des jeux de données quantitatifs pour la caractérisation simultanée de multiples phénotypes cellulaires de populations hétéro-cellulaires de manière robuste.
Les processus cellulaires sont complexes et résultent de l'interaction entre plusieurs types de cellules et leur environnement. Les techniques existantes de biologie cellulaire ne permettent souvent pas une interprétation précise de cette interaction. En utilisant une approche quantitative basée sur l'imagerie, nous présentons un protocole de contenu élevé pour caractériser les réponses phénotypiques dynamiques ( c'est-à-dire les changements de morphologie, la prolifération, l'apoptose) des populations de cellules hétérogènes aux changements dans les stimuli environnementaux. Nous mettons en évidence notre capacité à distinguer les types de cellules en fonction de l'intensité de fluorescence ou des caractéristiques morphologiques inhérentes selon l'application. Cette plate-forme permet une caractérisation plus complète de la réponse de la sous-population à la perturbation tout en utilisant un temps plus court, de plus petites quantités de réactifs et une plus faible probabilité d'erreur que les tests traditionnels de biologie cellulaire. Cependant, dans certains cas, les populations de cellules peuvent être difficiles à identifier et à quantifier en fonction de cellules complexesEt nécessite un dépannage supplémentaire; Nous mettons en évidence certaines de ces circonstances dans le protocole. Nous démontrons cette application en utilisant une réponse au médicament dans un modèle de cancer; Cependant, il peut être facilement appliqué plus largement à d'autres processus physiologiques. Ce protocole permet d'identifier les sous-populations dans un système de co-culture et de caractériser la réponse particulière de chacun aux stimuli externes.
Les tests basés sur les cellules ont été un travail de travail dans la recherche fondamentale et les paramètres de développement de médicaments. Cependant, les limites de ces tests standard sont de plus en plus apparentes avec la discordance entre les données in vitro et cliniques et l'échec de la plupart des médicaments à recevoir l'approbation de la FDA. Ici, nous présentons une nouvelle méthode pour utiliser l'imagerie quantitative pour analyser simultanément les phénotypes hétocellulaires en réponse à des stimuli environnementaux pertinents et coexistant.
Les tests traditionnels basés sur les cellules qui sont utilisés pour mesurer la viabilité cellulaire comprennent: les analyses d'exclusion de trypan bleu, les MTT / MTS et la coloration par cytométrie de flux V-FITC d'annexine. Les essais d'exclusion de Trypan Blue, bien que simples et peu coûteux, nécessitent un grand nombre de cellules, prennent beaucoup de temps et sont souvent influencés par le biais de l'utilisateur 1 . Les analyses MTT et MTS mesurent indirectement la viabilité cellulaire grâce à des mesures du taux métabolique mitochondrial. Cependant, l'activité métaboliqueLes cellules peuvent être affectées par différentes conditions de culture (telles que les médias ou la concentration en oxygène), ce qui conduit à des résultats inexacts et empêche la standardisation à travers les types de cellules et les conditions 2 , 3 . Un autre inconvénient majeur de ces techniques est leur incapacité à distinguer les multiples types de cellules – la plupart des systèmes biologiques sont hétéro-cellulaires. Bien que les méthodes de cytométrie en flux aient la possibilité de distinguer entre les populations de cellules multiples, les étiquettes des cellules sont requises, l'échantillonnage dynamique est difficile et, lors de l'utilisation de cellules adhérentes, cette application devient de plus en plus longue et présente des erreurs.
D'autres phénotypes cellulaires importants, y compris les changements morphologiques, se produisent en réponse à des stimuli environnementaux mais ne sont pas pris en compte par des essais traditionnels basés sur des cellules. Le profil des états cellulaires grâce à la caractérisation morphologique et à la cartographie des similitudes entre les échantillons est un outil puissant et impartial avec le aAfin de fournir de nouvelles connaissances sur de nombreux aspects de la recherche fondamentale et translationnelle, y compris la biologie cellulaire de base et la découverte de médicaments 4 . En outre, la morphologie des cellules tumorales s'est avérée être en corrélation avec les sous-types de tumeur 5 et l'agressivité 6 . Par conséquent, il est très intéressant d'étudier ces caractéristiques cellulaires et leur lien avec des perturbations environnementales spécifiques. En outre, on peut utiliser des différences dans les caractéristiques morphologiques pour discriminer les sous-populations dans les systèmes de co-culture. L'étiquetage fluorescent des cellules a des chutes ( c'est-à-dire une modification des propriétés cellulaires inhérentes, prend beaucoup de temps) et, par conséquent, des méthodes supplémentaires pour classer les types de cellules sont avantageuses.
L'imagerie à base de microscopie est une méthode alternative pour le profilage des phénotypes cellulaires de manière multiplexée, quantitative et robuste. Dans ce manuscrit, nous appliquons notre pipeline d'imagerie quantitative pour mettre en évidence l'évolutionUne dynamique de populations de cellules hétérogènes dans une tumeur. Nous nous concentrons sur l'interaction entre les cellules de cancer du poumon non à cellules petites (CPNPC) et les fibroblastes associés au cancer (CAF), le type de cellules stromales les plus répandues dans les tumeurs. Les CAF ont été impliqués dans l'initiation, la progression et la réponse thérapeutique de la tumeur; Par conséquent, effectuer des tests phénotypiques sur les cellules tumorales en l'absence de CAF peut tromper 7 , 8 , 9 . Plus précisément, nous avons évalué les effets des CAF sur les cellules tumorales en réponse à l'erlotinib, une petite molécule ciblant le récepteur du facteur de croissance épidermique (EGFR) qui est souvent utilisé dans le traitement clinique du CPNPC. Nous avons utilisé une plate-forme de dépistage de contenu élevé et son logiciel d'analyse d'image qui l'accompagne pour l'évaluation; Cependant, dans le but de rendre cette méthodologie accessible à d'autres chercheurs, nous avons également développé un protocole en aval comparable à l'aide du logiciel open source:CellProfiler 10 et CellProfiler Analyst 11 . La plupart des tests de dépistage à haute teneur en image sont analysés avec un logiciel commercialisé spécifique à un modèle d'instrument donné. Les résultats sont difficiles à reproduire dans d'autres laboratoires avec des logiciels différents car les algorithmes sous-jacents sont souvent exclusifs. À l'aide de ce pipeline basé sur l'image, on a mesuré la prolifération cellulaire, la mort et la morphologie de chaque sous-population d'une culture hétéro-cellulaire en réponse au traitement médicamenteux à l'aide de la classification à base de fluorescence et de morphologie. Le protocole suivant fournit une méthodologie robuste pour sondage de processus cellulaires complexes.
The protocol described above improves upon current cell biology assays by providing more comprehensive insights into phenotypic dynamics of multiple cell types in response to environmental perturbations while using reduced reagents and time. A major advantage of this experimental design is the ability to analyze multiple phenotypes with a single setup and generate quantitative data characterizing these phenotypes on a single cell level. One technical advantage to this platform is the ease of initial troubleshooting compared to other assays. Because this method is image-based, one is able to visualize the wells for apparent over/under seeding. It is advisable to have cells in the exponential growth phase for the duration of the experiment and not be limited by nutrient or spatial constraints or confounded by senescence due to scarce seeding. Otherwise, birth and death rates may not be reproducible between experiments. For reference, CellPD is a publicly available program for computation of birth and death rates14. Additionally, one can visualize whether adequate concentrations of dyes were added to each well. Pipetting issues in an individual well could result in missegmentation and skewed data, but can easily be detected with the aforementioned protocol.
Unfortunately, not all cell types may be amenable to this application. It is important to be able to accurately segment the nuclei and cells, therefore analysis of cells that organize in more sphere-like or clumped structures may not be suitable. For some cells, it also may be advantageous to use a cell strainer prior to seeding to ensure initial seeding of single cells. In addition, the linear classifier technique is only applicable to cell types that can be readily distinguished based on morphology features.
For the success of the protocol, it is important to first optimize the imaging conditions, as the validity of downstream analyses is dependent on the quality of the images. While here we performed experiments using a high-content screening platform, image acquisition can also be performed using any fluorescent microscope (although an automated imaging platform is ideal for high-throughput approaches). Test images should be taken prior to each imaging time point to ensure that there are no problems with the microscope or protocol. The signal to noise ratio should be high, especially for the channels that will be used for segmentation (i.e. nuclei, cell stains). Additionally, it is important to image in the optimal plane of focus. If the images are out of focus, segmentation becomes much more difficult and the calculated morphological features will likely be inaccurate. Illumination differences between fields can cause problems with image segmentation as well. Large differences in brightness make the automated selection of threshold values difficult. Additionally, if there are heterogeneous fluorescence intensities between cells, a single threshold value may not sufficiently segment all the cells in an image. In this analysis, these problems were overcome by creating masks around brighter and dimmer cell populations and segmenting each population separately.
While the phenotypes under investigation in this protocol are limited to live, dead, and morphological characterization, they can easily be expanded to investigate other features. For example, functional genetic studies can be added with RNAi, overexpression, or other chemical perturbations.
In this paper, the capabilities of the protocol to measure the response of non-small cell lung cancer cells to erlotinib in the presence and absence of CAFs was demonstrated. However, this is merely one example of the many cell types and microenvironmental parameters that can be tested. We have extended this protocol to be used with other cell types and drug studies, including primary cells isolated from patient tumors13,15.
The authors have nothing to disclose.
Ce travail a été financé par les Subventions U54CA143798 et U54CA143907 de l'Institut national du cancer (NCI) pour établir des centres de sciences et d'sciences de la physique (PS-OC) au Dana-Farber Cancer Institute et University of Southern California, respectivement. SM Mumenthaler a reçu un prix PS-OC transnetwork qui a soutenu certains de ces travaux.
Nous souhaitons exprimer notre plus grand gratitude à nos partisans philanthropiques, en particulier à la famille Stephenson, Emmet, Toni et Tessa, pour leur don de la plate-forme Operetta HCS. Nous remercions également J. Foo pour l'orientation et les membres de l'équipe Centre for Applied Molecular Medicine: D. Agus pour l'orientation clinique et le mentorat, K. Patsch pour des discussions significatives avec le design expérimental, R. Rawat pour l'aide aux protocoles d'analyse d'image , J. Katz pour une assistance technique avec l'Opérette, et P. Macklin et D. Ruderman pour des discussions et des commentaires utiles.
RPMI-1640 | Corning | 10-040-CV | cell culture medium |
FBS | Gemini | 100-106 | medium supplement |
Penicillin/streptomycin | Gibco | 15-140-122 | medium supplement |
TC20 | Biorad | 1450102 | cell counter |
TC20 slides with trypan blue | Biorad | 1450003 | cell counter slides |
96-well plates | Corning | 3904 | clear bottom black plates |
Erlotinib | LC Laboratories | E-4007 | |
DMSO | VWR | 317275-100ML | solution to resuspend drug |
Hoechst | Invitrogen | H21491 | nuclear dye |
Propidium Iodide | Invitrogen | P1304MP | dead cell stain |
Cell Tracker Orange CMRA | Life Technologies | C34551 | whole cell stain |
Operetta high content imaging system | Perkin Elmer | ||
CellProfiler | Broad Institue | version 2.2.0 (rev 9969f42) | http://cellprofiler.org/releases/ |
Cell culture incubator | Any cell culture incubator will be suitable – cells were cultured under 37 ºC at 5% CO2. | ||
15 mL Falcon conical tubes | Falcon | 14-959-53A | |
10 cm2 cell culture plates | TPP | 93040 |