תלת מימדי רקמות מהונדסים מיושר אסטרוציט רשתות כדי לסכם מנגנונים התפתחותית וכדי להקל על מערכת העצבים התחדשות

Summary

אנחנו ראווה הפיתוח של חבילות שהורכב עצמית, תלת מימדי של somata astrocytic longitudinally מיושר ותהליכים בתוך למטרתו biomaterial הרומן. אלה מהונדסים “חי פיגומים”, מפגין בקנה מידה מיקרון קוטר עדיין הארכת ס מ אורך, עשוי לשמש מבחן-מיטות לימוד מנגנוני התפתחותיות או להקל על neuroregeneration על-ידי הגירה העצבית המשגה ו/או עצב pathfinding.

Abstract

מחלת Neurotrauma, ניווניות לעיתים קרובות לגרום שנמשך גרעונות בשל הקיבולת המוגבלת של מערכת העצבים המרכזית (CNS) כדי להחליף את הנוירונים לאיבוד והפק מסלולים עצב. עם זאת, במהלך פיתוח מערכת העצבים, הגירה העצבית והסיומת עצב לעיתים קרובות להתרחש לאורך מסלולים נוצר על ידי תאים אחרים, המכונה “חיים פיגומים”. המבקשים לחקות מנגנונים אלה לתכנן אסטרטגיה העוקפות את הסביבה המעכבת של מערכת העצבים, כתב יד זה מציג את פרוטוקול כדי לבדות רקמות מהונדסים מבוססי אסטרוציט “חי פיגומים”. כדי ליצור את המבנים האלה, אנחנו מועסקים ערכה למטרתו biomaterial הרומן לזירוז האסטרוציטים להרכיב עצמית צפופה תלת מימדי בחבילות של הפרעה דו קוטבית somata מיושר לימין longitudinally ותהליכים. ראשית, חלול הידרוג מיקרו-עמודות כונסו ולאחר לומן הפנימי היה מצופה מטריצה חוץ-תאית של קולגן. חלופה מועדפת את מוחי האסטרוציטים בקליפת המוח ואז נשלחו לתוך לומן של המיקרו-העמודה גלילי, קריטי בקוטר הפנימי של < מיקרומטר 350, באופן ספונטני עצמית ויישור מתכווץ כדי לייצר זמן כמו סיבים כבלים המורכב חבילות עבות תהליכים אסטרוציט ו קולגן הסיבים מדידה 97% תא הכדאיות והיו כמעט באופן בלעדי מורכבת האסטרוציטים לבטא שילוב של פילמנט ביניים חלבונים גליה-fibrillary חומצי החלבון (GFAP), vimentin, ו nestin. אלה המיושר אסטרוציט רשתות נמצאו לספק מצע מתירניות עבור הקובץ המצורף עצביים וכל neurite הרחבה. יתר על כן, מבנים אלה לשמור על שלמות ויישור כאשר מופק למטרתו הידרוג, שהופך אותם למתאימים להשתלה CNS. אלה בונה preformed מבנית לחקות את יסודות cytoarchitectural מפתח באופן טבעי מבוסס על גליה “חיים פיגומים” בתוך vivo. ככזה, פיגומים מהונדסים חיים אלה עשוי לשמש מבחן-מיטות לימוד התפתחותיות מנגנונים במבחנה או להקל על neuroregeneration על ידי הפניית הגירה העצבית ו/או עצב pathfinding בעקבות התנוונות מערכת העצבים המרכזית ויוו .

Introduction

מערכת העצבים המרכזית (CNS) בעל קיבולת מוגבלת כדי לנטרל את אובדן ו/או תפקוד לקוי של נוירונים מסלולים עצב שמלווים מצבים כגון פגיעה מוחית טראומטית (TBI), שבץ, מחלת פציעה (מדע), ניווניות חוט השדרה^{1 ,2,3,4,5}. נוירוג’נסיס ב מערכת העצבים היא מוגבלת למספר מוגבל של אזורים במוח, פוגעות השיקום של נוירונים אבודים^6,7. בנוסף, התחדשות של מסלולים עצב לאיבוד בתוך מערכת העצבים אינה מספיקה בשל העדר הדרכה מכוונת, הנוכחות של מעכבי תוצר, ו astrogliosis תגובתי בעקבות נזק רקמה עצבית^{2,8, 9,10}. האסטרוציטים בדרך כלל יש פונקציות מגוונות בקליטת נוירונים עם יון הומאוסטזיס, סיווג נוירוטרנסמיטר, היווצרות סינפסה נוירו-וסקולריים צימוד¹¹. יחד עם זאת, בעקבות פגיעה קלה אפילו רקמה עצבית, האסטרוציטים עלול לעבור שינויים מולקולרית מבנית, פונקציונלי במעבר המדינה היפרטרופית¹¹. בתגובה neurotrauma חמורה, שינויים אלה לגרום היווצרות צלקת עם הילה המכילה האסטרוציטים תגובתי נודדים, ליבה של הנגע הכולל לויקוציטים דלף מן קרע מחסום הדם – מוח (BBB), מיקרוגלייה, oligodendrocytes להפוך ולאחר fibroblasts^11,12,13. האסטרוציטים הממוגן אלה להשיג את המורפולוגיה של תהליכים filamentous, לא מאורגן ולהציג ביטוי מוגבר של חלבונים פילמנט ביניים, כונדרויטין סולפט proteoglycans (CSPGs), אשר להפריע התחדשות עצבית¹². אף-על-פי הצלקת גליה בתחילה עוזר לשחזר BBB שלמות ולהימנע שידור של תגובת דלקתית לרקמות בריאות, משמשת מחסום פיזי וביוכימי נגד האקסון התחדשות^{12,14 15, ,16}. למשל, אקסונים המפגש הצלקת גליה להציג צמיחה dystrophic בולבוסי קונוסים, ננסיים צמיחה¹². יתר על כן, חוסר הארגון של תהליכים astrocytic לאחר פציעה פוגעת ההרחבה של רגנרציה אקסונים¹⁷. התוצאה של תכונות מעכבות אלה באה לידי ביטוי את קבוע לעיתים קרובות נוירולוגיות פיזיקליות ליקויי חולים סובלים לאחר neurotrauma חמורות, לרבות TBI לביוטכנולוגיה

ללא קשר חיצוני האתגרים התחדשות תפקודית של מערכת העצבים, אקסונים הוכחו בעלי יכולת מהותי להתחדש. למשל, באופי הדינמי של הקונוסים צמיחה dystrophic בקשר עם הצלקת גליה מציע סופים אלה שומרים על היכולת שלהם להרחיב את¹². כתוצאה מכך, הוא האמין כי ליצור הפרעה עצב מחדש את הצמיחה העיקרי הוא הסביבה המעכבת של מערכת העצבים לאחר פציעה, וכי מתן סביבה מתירנית יותר באמצעות הפחתת גליה הצטלקות ו/או במתן משובי גשרים על פני הצלקת יהיה יתרון. ואכן, מחקרים קודמים הדגימו כי CNS הנוירונים מסוגלים הארכת אקסונים באמצעות פגיעה באמצעות שתלי במערכת העצבים ההיקפית כמו גשרים, מציג סביבה אוהדת יותר האקסון התחדשות^{12,18, 19}. כנראה תפס מספר אסטרטגיות אחרות כדי לנצל את יכולת ההתחדשות מנוונת. לדוגמה, מניפולציה של התא צמיחה איתות המסלולים במודלים שונים של פגיעה הביא התחדשות עצב וגליה הצלקת הפחתת^10,20,21. בנוסף, מחקרים הראו כי טיפול עם chondroitinase ABC, אשר cleaves את רוב הרשתות סוכר ב- CSPGs, מפחיתה את ההשפעה המעכבת של CSPGs מופרש על ידי האסטרוציטים תגובתי²². למרות מעודד תוצאות, גישות אלה אינם מספקים מכוונת ההדרכה של גביעי צמיחה, אשר יכול לגרום פוטנציאל התחדשות aberrant¹², גם חשבון על האובדן של נוירונים. כבר מנוצל גישות תא ניסיונות כדי להתגבר על ההשפעות של הצלקת גליה וכדי לחדש תאים אבודים, במיוחד נוירונים. כמה קבוצות יש dedifferentiated האסטרוציטים תגובתי לתוך הנוירונים, בעוד אחרים יש מושתלים ובתאים העצבי לתוך נגעים CNS לאכלס אזור הפציעה ולקדם האקסון התחדשות^{23,24, 25}. עם זאת, השתלת תא גזע לבד הוא מוגבל על ידי שיעורי הישרדות נמוכים, אינטגרציה המסכן ושמירה צנוע רקמות שנפגעו⁵. יתר על כן, אסטרטגיות אלו מבוססת תא להיכשל לשחזר ספינלי עצב למרחקים ארוכים, במיוחד בצורה מבוקרת. לכן, להיות נידונות biomaterials בשילוב עם גישות אחרות כמו רכבי ההעברה שונות עצבית, ובתאים וצמיחה גורמים²⁶. גישות biomaterial כוללים רמה גבוהה של עיצוב פקד כדי לייצר מבנים המחקים את haptotaxic הפיזי, ספציפי, וכן רמזים chemotaxic להציג microenvironment תלת מימדי (3D) המטרה המארח רקמות^{27, 28,29,30,31,32,33,34}. רבייה של אותות סביבתיים אלה הוא בעל חשיבות עליונה עבור התאים המושתלים להציג מורפולוגיה מקורי כמו התפשטות, הגירה, איתות, בין שאר המאפיינים הנוירוביולוגי²⁹. למרות מאפיינים אלה יתרון, קידום מעבר תא מסורתי נזרע biomaterial פיגומים נדרש בעת ובעונה אחת לקדם התחדשות שיחות לחו ל עצב מכוונת ולהחליף נוירונים אבוד.

התחלה מבטיחה גישה חלופית מבוססת על רקמה עצבית מהונדסים “חי פיגומים”, אשר נבדלים גישות אחרות בשל נוכחותם של לחיות תאים עצביים עם cytoarchitecture preformed שמדמה נוירואנטומיה מקורית מבוססת-תא או מנגנונים התפתחותית כדי להקל על החלפת יישוב, שיקום והתחדשות של המעגלים העצביים^4,35. שיקולים על העיצוב של פיגומים המגורים כוללים את פנוטיפים ואת מקורות של תאים עצביים, כמו גם את תכונות מכאניות/פיזי, אותות ביוכימיים שמכתיבה ההרכב של כל biomaterials הנלווה³⁵. לאחר ייצור במבחנה, פיגומים החיים האלה יכולים להיות מושתל ויוו מולקולות אדהזיה התא הנוכחי, chemotactic ואותות neurotrophic להסדיר באופן פעיל את נדידת תאים עצביים, האקסון תוצר בהתאם למצב, התפתחות לתהליכי הרגנרציה³⁵… גלייה יכול לשמש כבסיס cytoarchitecture שעברו הנדסה לאחור של פיגומים החיים מאז תאים אלה לתווך שונים מנגנוני התפתחותית ויוו. במהלך התפתחות המוח, נוירונים חדשים להסתמך על תהליכים הבזליים המורחבת על ידי עכשיו, דונלד רדיאלי מאזור חדרית לעבר הצלחת בקליפת המוח המתפתח כמו חיים פיגומים עבור ההעברה מכוונת^36,37. יתר על כן, הרחבת צמיחה קונוסים הינם שמוצג כדי להציב את עצמם על ידי חש אותות דוחה ומושכת שהפיק תאי גליה guidepost, מה שנקרא “חלוצי” אקסונים מוצעים כדי להגיע אל המטרות הנכונות על-ידי הרחבת לאורך מראש בדוגמת גליה פיגומים^35,38,39. לפיכך, גלייה נחוצים עבור ההדרכה של חלוצי אקסונים, אשר מאוחר יותר משרתים גם מבוסס על האקסון “חי פיגומים” לכוון את הקרנת אקסונים “חסיד”. יתר על כן, מנגנוני גדילה בתיווך עכשיו, דונלד הוכחו להתמיד נוצרו אחרי הלידה, כפי neuroblasts לכו בעקבות הזרם נודדות rostral (RMS) כדי לנווט מאזור subventricular (SVZ), אחד האזורים הנותרים האחרונים של נוירוג’נסיס במוח למבוגרים, הריח הנורה (אבוב)⁴⁰. Neuroblasts אלה ב- RMS להעביר בתוך הצינור גליה (איור 1 א’-1), אשר כולל מיושר לימין longitudinally תהליכים astrocytic, באמצעות תאים תאים ישירה הדבקויות, לשפות אחרות גורמים מסיסים-^{37, 41}. סוף סוף, בעוד נזק CNS יונקים גורם שיבשו סידור תהליך astrocytic ויוצרים צלקת גליה פיזית פוגעת התחדשות עצב¹⁷, מערכות מידע שאינם יונקים רבים חוסר היווצרות צלקת גליה מזיקה. במקום זאת, תאי גליה של מינים שאינם מידע יונקים לשמור על יותר מאורגן, מיושר תבניות המשמשות כקווי עזר דרך^42,17,האזור הפגוע⁴³. למשל, מידע שאינם יונקים SCI דגמים, אקסונים מוצגים לגדול בשיתוף הדוק עם גליה הגשרים שחוצים את הנגע, רומז תפקיד חשוב עבור פיגומים גליה מאורגן בשם דיאלקטריים הקלת עצב רגנרציה ומחזור (שחזור פונקציונלי איור 1A -2) ^{42 , 44 , 45}. החוק הביוגנטי של התכונות neuroanatomical ואת המנגנונים התפתחותית/משובי שתוארו לעיל, תניב סוג חדש של פיגומים מהונדסים מבוסס על גליה חי במקביל שיכולים להביא הגירה העצבית ילדותי, עצב pathfinding דרך סביבות אחרת שאינה מתירני, שעשוי להיות ובכך מקלים את ההשפעות של עצביים האקסון בדרכי ניוון המשויך CNS פציעות ומחלות.

קבוצת המחקר שלנו תוכנן בעבר מספר סוגים של פיגומים חי עבור שחזור ומתוכננים התחדשות של עצב ספינלי מערכת העצבים, מערכת העצבים ההיקפית (מערכת העצבים ההיקפית) באמצעות מיקרו-רקמת רשתות עצביות (מיקרו-TENNs) ורקמות מתוכנן החוצפה-שתלים (TENGs), בהתאמה^27,46,47,48. שתי אסטרטגיות מבוססים מטבעם על ביומימטיקה. מיקרו-TENNs הם מבנים בהשראת אנטומית המיועד מבחינה מבנית והן מבחינה תפקודית להחליף שטחים עצב המחבר ברורים אוכלוסיות עצביים במוח. TENGs לנצל את מנגנון התפתחותית של התחדשות עצב הקלו האקסון, ומעוררות “חסיד” צמיחה האקסון לאורך אקסונים “חלוץ”, כדי להשיג את מארח היעד התחדשות עצב^35,46,48. אנחנו לאחרונה מהוונות על צדדיות של לגרדום חיים טכניקה באמצעות ערכה דומה למטרתו כמו מיקרו-TENNs ומחפשים השראה מן המנגנונים מבוסס עכשיו, דונלד להציג במהלך הפיתוח. . הנה, פיתחנו בונה המורכב מיושר חבילות astrocytic פורש לומן סילוק של מיקרו-טור הידרוג⁴⁹. פיגומים אלו החיים astrocytic מפותחים באמצעות מילוי אסיפה המחט צינור קפילר-דיקור עם agarose נוזלי כדי ליצור של הידרוג גליל חלול עם הקוטר החיצוני (OD), הקוטר הפנימי (ID) המתאים הקוטר של שפופרת ואת המחט, בהתאמה. בעקבות agarose gelation החילוץ של המיקרו-העמודה הידרוג מהצינור נימי, הפנים חלול הוא מצופה סוג אני קולגן לספק סביבה מתירניות עבור אדהזיה אסטרוציט ו מיושר צרור היווצרות (איור 1B -1). לאחר מכן, לומן הוא נזרע עם מוחי האסטרוציטים קורטיקלית מבודד מן החולדה לאחר הלידה הגורים (איור 1B-2). בניגוד דו-ממדית (2D) שיטות ליישור המסתמכים על היישום של שדות חשמליים, חריצים micropatterned מטריצה חוץ-תאית חלבון (ECM) תכנים, היישור אסטרוציט לגרדום חיים טכניקה מסתמך על הרכבה עצמית לפי משתני לשליטה כגון עקמומיות המצע (העמודה ID), צפיפות תא קולגן ריכוז^50,51,52. האסטרוציטים חוזה לשפץ הקולגן ו לרכוש מורפולוגיה דו-קוטבי, מיושר לימין longitudinally מקביל פיגומים טבעי ויוו (איור 1B-3). אכן, אנחנו הם שואפים השימוש של המבנים האלה, כמו כבלים בשם דיאלקטריים פיזי עבור הדרכה ממוקד של העברת נוירונים לא בוגר, כמו גם בקידום התחדשות עצב באמצעות הסביבה שלילי של מערכת העצבים פגום, במיוחד בתרבית של גליה הצלקת (איור 1C). במאמר זה תוכלו להציג את שיטת ייצור מפורט עבור העמודות-המיקרו astrocytic, שלב תמונות חדות עם immunofluorescence את cytoarchitecture הצפוי, דיון מקיף על המגבלות הנוכחי וכיוונים עתידיים של טכניקה.

איור 1: השראה, ייצור פרוטוקול ויישומים המוצע עבור הרשתות Astrocytic מיושר. ההשראה הנוירוביולוגי (A): Neuroblasts (1) שמקורן באזור ‘ neurogenic subventricular ‘ (SVZ) לנצל את הצינור גליה longitudinally מיושר בזרם נודדות rostral (RMS) עבור העברה מכוונת לעבר הנורה הריח (אבוב); (2) אי-יונקים כגון דו-חיים, דגים יכול להימשך התחדשות לאחר רקמה עצבית נזק בחלקו בשל היווצרות של גליה גשר המחבר את הקצוות של פגיעה (למשל חוט השדרה transected) ומשמש עשו איתו בהדרכת רגנרציה אקסונים. (B) סקירה פבריקציה נוספת: (1) הקמת הידרוג בגודל מיקרון, חלול מיקרו-עמודה בעלת לומן מצופה ECM, (2) זריעה של ראשי האסטרוציטים קורטיקלית מבודד מן הגורים עכברוש כמחנכת, (3) הרכבה עצמית של longitudinally מונחה חבילות תרבות, ו (4) הפקת הצרור מ למטרתו biomaterial ללימודי השתלה עתידית. (ג) יישומים In vivo : (1) פיגומים חיים אלה עשוי לשמש מהונדסים גליה צינורות להעברת נוירון מכוונת ממרכזי neurogenic לשקם אזורים נוירון לקויה; (2) החוק הביוגנטי של מנגנון התפתחותית של חלוצי האקסון הדרכה, מנגנון הרגנרציה של גשרים גליה שאינם יונקים שיעניק אלה פיגומים astrocytic את היכולת לכוון רגנרציה האקסון על פני הלא-מתירני סביבה של הצלקת גליה יונקים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Protocol

כל ההליכים היו אושרה על ידי טיפול בעלי חיים מוסדיים ועדות שימוש ב אוניברסיטת פנסילבניה ו מייקל ג’יי Crescenz ותיקי לענייני המרכז הרפואי, דבקה בהתאם להנחיות המפורטות במדיניות שירות בריאות הציבור NIH על להומניות טיפול ושימוש חיות מעבדה (2015). 1. פיתוח של הידרוג מיקרו-העמודות Agarose <…

Representative Results

בתחילה, שלב-ניגודיות מיקרוסקופ שימש כדי לעקוב אחר ההתקדמות של אדהזיה אסטרוציט היווצרות צרור ואת יציבותו הכללית cytoarchitecture כפונקציה של הזמן. ב- h 1 לאחר ציפוי, האסטרוציטים נמצאו ברחבי לומן של המיקרו-העמודות עם מורפולוגיה כדורית (איור 2 א). -5 שעות, האסטרוציטים ה…

Discussion

כאשר לעומת הסביבה יותר תומכת של מערכת העצבים ההיקפית, מערכת העצבים מוגבל במיוחד בטיפול ההשלכות מזיקה של neurotrauma, הקשורים ניוון מוחיים. לאחר עלבון רציני מערכת העצבים יונקים, נוצרת צלקת גליה המורכב גרעין של תאים דלקתיים שהותירה מוקף meshwork צפופה של האסטרוציטים תגובתי לא מאורגן להפריש proteoglycans ע…

Materials

Acupuncture needle (300 µm diameter)	Lhasa Medical	HS.30×40	The diameter may be varied according to the desired size for the micro-column lumen.
Petri dish	Fisher	08772B
Dulbecco's phosphate buffered saline (DPBS)	Invitrogen	14200075
Polystyrene disposable serological pipet	Fisher	13-678-11D
Agarose	Sigma	A9539-50G
Microliter glass capillary tube (701 µm)	Fisher	21-170J	The diameter may be varied according to the desired size for the micro-column shell.
Microcap bulb dispenser	Fisher	21-170J	Bulb comes with the microcap tubes.
Hot plate	Fisher	SP88857200
Magnetic bar	Fisher	1451352
Micropipette	Sigma	Z683884-1EA
25 mm gauge needle	Fisher	14-826-49
Microscalpel	Roboz Surgical	RS-6270
Scissors	Fine Science Tools	14081-09
Forceps	World Precision Instruments	501985
Hot bead sterilizer	Sigma	Z378550-1EA
Stereoscope	Nikon	SMZ800N
Micro-spatula	Fisher	S50821
Rat tail type I collagen	Corning	354236	Maintain at 4 ºC and remove only when needed. Use ice to preserve its temperature when in use.
Microcentrifuge tube	Fisher	02-681-256
Sodium hydroxide (NaOH)	Fisher	SS2661
Hydrochloric acid (HCl)	Fisher	SA48-1
Litmus paper	Fisher	09-876-18
Hank's balanced salt solution (HBSS)	Invitrogen	14170112	Store at 4 ºC.
0.25% Trypsin-EDTA	Invitrogen	25200056	Store at -20 ºC and warm at 37 ºC before use.
Bovine pancreatic deoxyribonuclease (Dnase) I	Sigma	10104159001	Store at -20 ºC and warm at 37 ºC before use.
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) with Ham's F-12 Nutrient Mixture	Gibco	11330-032	Store at 4 ºC.
Fetal bovine serum (FBS)	Atlanta Biologicals	S11195	Store at -20ºC.
Postnatal day 0 or day 1 Sprague Dawley rat pups	Charles River	Strain 001
Neurobasal embryonic neuron basal medium	Invitrogen	21103049	Store at 4ºC and warm at 37 ºC before use.
B-27 serum free supplement	Invitrogen	12587010	Store at -20 ºC and warm at 37 ºC before use.
L-glutamine	Invitrogen	35050061	Store at -20 ºC and warm at 37 ºC before use.
G5 astrocytic supplement	Invitrogen	17503012
Sprague Dawley embryonic day 18 rats	Charles River	Strain 001
Pasteur pipette	Fisher	22-042816
15 mL centrifuge tube	EMESCO	1194-352099
Vortex	Fisher	02-215-414
Centrifuge	Fisher	05-413-115
Hemocytometer	Fisher	02-671-6
Incubator	Fisher	13 998 076
Formaldehyde 40%	Fisher	F77P-4	Formaldehyde is a toxic compound known to be carcinogenic, and must be disposed of in a separate container.
Glass cover slip	Fisher	12-548-5M
Nail polish	Electron Microscopy Sciences (EMS)	72180
Fluoromont mounting medium	Southern Biotech	0100-01
Poly-L-lysine	Sigma	P4707
Phosphate buffered saline	Fisher	BP3994
Triton X-100	Sigma	T8787
Normal horse serum	Gibco	16050-122
Rabbit anti-glial acidic fibrillary protein (GFAP) primary antibody	Millipore	AB5804	Store at -20ºC.
Mouse anti-beta-tubulin III primary antibody	Sigma	T8578	Store at -20ºC.
Rabbit anti-collagen I primary antibody	Abcam	ab34710	Store at -20ºC.
Rabbit anti-vimentin	Millipore	AB3400	Store at -20ºC.
Mouse anti-nestin	Millipore	AB5326	Store at -20ºC.
Donkey anti-mouse 568 secondary antibody	Invitrogen	A10037	Store at 4ºC.
Donkey anti-rabbit 568 secondary antibody	Invitrogen	A10042	Store at 4ºC.
Donkey anti-rabbit 488 secondary antibody	Invitrogen	A21206	Store at 4ºC.
Hoechst 33342, Trihydrochloride	Invitrogen	H3570	Store at 4ºC. Hoechst is a known mutagen that should be treated as a carcinogen. Therefore, it must be disposed of in a separate container.
Calcein AM	Sigma	C1359	4 mM in anhydrous DMSO
Ethidium homodimer-1	Life Technologies	E1169	2 mM in DMSO/H2O 1:4 (v/v)
Dimethyl sulfoxane (DMSO)	Sigma	276855
A1RSI Laser Scanning Confocal Microscope	Nikon	————–	Used for taking the confocal reconstructions of immunolabeled constructs.
Eclipse Ti-S Microscope	Nikon	————–	Used for taking the phase-contrast images. With digital image acquisition using a QiClick camera interfaced with Nikon Elements Basic Research software (4.10.01).