Summary

תלת מימדי רקמות מהונדסים מיושר אסטרוציט רשתות כדי לסכם מנגנונים התפתחותית וכדי להקל על מערכת העצבים התחדשות

Published: January 10, 2018
doi:

Summary

אנחנו ראווה הפיתוח של חבילות שהורכב עצמית, תלת מימדי של somata astrocytic longitudinally מיושר ותהליכים בתוך למטרתו biomaterial הרומן. אלה מהונדסים “חי פיגומים”, מפגין בקנה מידה מיקרון קוטר עדיין הארכת ס מ אורך, עשוי לשמש מבחן-מיטות לימוד מנגנוני התפתחותיות או להקל על neuroregeneration על-ידי הגירה העצבית המשגה ו/או עצב pathfinding.

Abstract

מחלת Neurotrauma, ניווניות לעיתים קרובות לגרום שנמשך גרעונות בשל הקיבולת המוגבלת של מערכת העצבים המרכזית (CNS) כדי להחליף את הנוירונים לאיבוד והפק מסלולים עצב. עם זאת, במהלך פיתוח מערכת העצבים, הגירה העצבית והסיומת עצב לעיתים קרובות להתרחש לאורך מסלולים נוצר על ידי תאים אחרים, המכונה “חיים פיגומים”. המבקשים לחקות מנגנונים אלה לתכנן אסטרטגיה העוקפות את הסביבה המעכבת של מערכת העצבים, כתב יד זה מציג את פרוטוקול כדי לבדות רקמות מהונדסים מבוססי אסטרוציט “חי פיגומים”. כדי ליצור את המבנים האלה, אנחנו מועסקים ערכה למטרתו biomaterial הרומן לזירוז האסטרוציטים להרכיב עצמית צפופה תלת מימדי בחבילות של הפרעה דו קוטבית somata מיושר לימין longitudinally ותהליכים. ראשית, חלול הידרוג מיקרו-עמודות כונסו ולאחר לומן הפנימי היה מצופה מטריצה חוץ-תאית של קולגן. חלופה מועדפת את מוחי האסטרוציטים בקליפת המוח ואז נשלחו לתוך לומן של המיקרו-העמודה גלילי, קריטי בקוטר הפנימי של < מיקרומטר 350, באופן ספונטני עצמית ויישור מתכווץ כדי לייצר זמן כמו סיבים כבלים המורכב חבילות עבות תהליכים אסטרוציט ו קולגן הסיבים מדידה 97% תא הכדאיות והיו כמעט באופן בלעדי מורכבת האסטרוציטים לבטא שילוב של פילמנט ביניים חלבונים גליה-fibrillary חומצי החלבון (GFAP), vimentin, ו nestin. אלה המיושר אסטרוציט רשתות נמצאו לספק מצע מתירניות עבור הקובץ המצורף עצביים וכל neurite הרחבה. יתר על כן, מבנים אלה לשמור על שלמות ויישור כאשר מופק למטרתו הידרוג, שהופך אותם למתאימים להשתלה CNS. אלה בונה preformed מבנית לחקות את יסודות cytoarchitectural מפתח באופן טבעי מבוסס על גליה “חיים פיגומים” בתוך vivo. ככזה, פיגומים מהונדסים חיים אלה עשוי לשמש מבחן-מיטות לימוד התפתחותיות מנגנונים במבחנה או להקל על neuroregeneration על ידי הפניית הגירה העצבית ו/או עצב pathfinding בעקבות התנוונות מערכת העצבים המרכזית ויוו .

Introduction

מערכת העצבים המרכזית (CNS) בעל קיבולת מוגבלת כדי לנטרל את אובדן ו/או תפקוד לקוי של נוירונים מסלולים עצב שמלווים מצבים כגון פגיעה מוחית טראומטית (TBI), שבץ, מחלת פציעה (מדע), ניווניות חוט השדרה1 ,2,3,4,5. נוירוג’נסיס ב מערכת העצבים היא מוגבלת למספר מוגבל של אזורים במוח, פוגעות השיקום של נוירונים אבודים6,7. בנוסף, התחדשות של מסלולים עצב לאיבוד בתוך מערכת העצבים אינה מספיקה בשל העדר הדרכה מכוונת, הנוכחות של מעכבי תוצר, ו astrogliosis תגובתי בעקבות נזק רקמה עצבית2,8, 9,10. האסטרוציטים בדרך כלל יש פונקציות מגוונות בקליטת נוירונים עם יון הומאוסטזיס, סיווג נוירוטרנסמיטר, היווצרות סינפסה נוירו-וסקולריים צימוד11. יחד עם זאת, בעקבות פגיעה קלה אפילו רקמה עצבית, האסטרוציטים עלול לעבור שינויים מולקולרית מבנית, פונקציונלי במעבר המדינה היפרטרופית11. בתגובה neurotrauma חמורה, שינויים אלה לגרום היווצרות צלקת עם הילה המכילה האסטרוציטים תגובתי נודדים, ליבה של הנגע הכולל לויקוציטים דלף מן קרע מחסום הדם – מוח (BBB), מיקרוגלייה, oligodendrocytes להפוך ולאחר fibroblasts11,12,13. האסטרוציטים הממוגן אלה להשיג את המורפולוגיה של תהליכים filamentous, לא מאורגן ולהציג ביטוי מוגבר של חלבונים פילמנט ביניים, כונדרויטין סולפט proteoglycans (CSPGs), אשר להפריע התחדשות עצבית12. אף-על-פי הצלקת גליה בתחילה עוזר לשחזר BBB שלמות ולהימנע שידור של תגובת דלקתית לרקמות בריאות, משמשת מחסום פיזי וביוכימי נגד האקסון התחדשות12,14 15, ,16. למשל, אקסונים המפגש הצלקת גליה להציג צמיחה dystrophic בולבוסי קונוסים, ננסיים צמיחה12. יתר על כן, חוסר הארגון של תהליכים astrocytic לאחר פציעה פוגעת ההרחבה של רגנרציה אקסונים17. התוצאה של תכונות מעכבות אלה באה לידי ביטוי את קבוע לעיתים קרובות נוירולוגיות פיזיקליות ליקויי חולים סובלים לאחר neurotrauma חמורות, לרבות TBI לביוטכנולוגיה

ללא קשר חיצוני האתגרים התחדשות תפקודית של מערכת העצבים, אקסונים הוכחו בעלי יכולת מהותי להתחדש. למשל, באופי הדינמי של הקונוסים צמיחה dystrophic בקשר עם הצלקת גליה מציע סופים אלה שומרים על היכולת שלהם להרחיב את12. כתוצאה מכך, הוא האמין כי ליצור הפרעה עצב מחדש את הצמיחה העיקרי הוא הסביבה המעכבת של מערכת העצבים לאחר פציעה, וכי מתן סביבה מתירנית יותר באמצעות הפחתת גליה הצטלקות ו/או במתן משובי גשרים על פני הצלקת יהיה יתרון. ואכן, מחקרים קודמים הדגימו כי CNS הנוירונים מסוגלים הארכת אקסונים באמצעות פגיעה באמצעות שתלי במערכת העצבים ההיקפית כמו גשרים, מציג סביבה אוהדת יותר האקסון התחדשות12,18, 19. כנראה תפס מספר אסטרטגיות אחרות כדי לנצל את יכולת ההתחדשות מנוונת. לדוגמה, מניפולציה של התא צמיחה איתות המסלולים במודלים שונים של פגיעה הביא התחדשות עצב וגליה הצלקת הפחתת10,20,21. בנוסף, מחקרים הראו כי טיפול עם chondroitinase ABC, אשר cleaves את רוב הרשתות סוכר ב- CSPGs, מפחיתה את ההשפעה המעכבת של CSPGs מופרש על ידי האסטרוציטים תגובתי22. למרות מעודד תוצאות, גישות אלה אינם מספקים מכוונת ההדרכה של גביעי צמיחה, אשר יכול לגרום פוטנציאל התחדשות aberrant12, גם חשבון על האובדן של נוירונים. כבר מנוצל גישות תא ניסיונות כדי להתגבר על ההשפעות של הצלקת גליה וכדי לחדש תאים אבודים, במיוחד נוירונים. כמה קבוצות יש dedifferentiated האסטרוציטים תגובתי לתוך הנוירונים, בעוד אחרים יש מושתלים ובתאים העצבי לתוך נגעים CNS לאכלס אזור הפציעה ולקדם האקסון התחדשות23,24, 25. עם זאת, השתלת תא גזע לבד הוא מוגבל על ידי שיעורי הישרדות נמוכים, אינטגרציה המסכן ושמירה צנוע רקמות שנפגעו5. יתר על כן, אסטרטגיות אלו מבוססת תא להיכשל לשחזר ספינלי עצב למרחקים ארוכים, במיוחד בצורה מבוקרת. לכן, להיות נידונות biomaterials בשילוב עם גישות אחרות כמו רכבי ההעברה שונות עצבית, ובתאים וצמיחה גורמים26. גישות biomaterial כוללים רמה גבוהה של עיצוב פקד כדי לייצר מבנים המחקים את haptotaxic הפיזי, ספציפי, וכן רמזים chemotaxic להציג microenvironment תלת מימדי (3D) המטרה המארח רקמות27, 28,29,30,31,32,33,34. רבייה של אותות סביבתיים אלה הוא בעל חשיבות עליונה עבור התאים המושתלים להציג מורפולוגיה מקורי כמו התפשטות, הגירה, איתות, בין שאר המאפיינים הנוירוביולוגי29. למרות מאפיינים אלה יתרון, קידום מעבר תא מסורתי נזרע biomaterial פיגומים נדרש בעת ובעונה אחת לקדם התחדשות שיחות לחו ל עצב מכוונת ולהחליף נוירונים אבוד.

התחלה מבטיחה גישה חלופית מבוססת על רקמה עצבית מהונדסים “חי פיגומים”, אשר נבדלים גישות אחרות בשל נוכחותם של לחיות תאים עצביים עם cytoarchitecture preformed שמדמה נוירואנטומיה מקורית מבוססת-תא או מנגנונים התפתחותית כדי להקל על החלפת יישוב, שיקום והתחדשות של המעגלים העצביים4,35. שיקולים על העיצוב של פיגומים המגורים כוללים את פנוטיפים ואת מקורות של תאים עצביים, כמו גם את תכונות מכאניות/פיזי, אותות ביוכימיים שמכתיבה ההרכב של כל biomaterials הנלווה35. לאחר ייצור במבחנה, פיגומים החיים האלה יכולים להיות מושתל ויוו מולקולות אדהזיה התא הנוכחי, chemotactic ואותות neurotrophic להסדיר באופן פעיל את נדידת תאים עצביים, האקסון תוצר בהתאם למצב, התפתחות לתהליכי הרגנרציה35… גלייה יכול לשמש כבסיס cytoarchitecture שעברו הנדסה לאחור של פיגומים החיים מאז תאים אלה לתווך שונים מנגנוני התפתחותית ויוו. במהלך התפתחות המוח, נוירונים חדשים להסתמך על תהליכים הבזליים המורחבת על ידי עכשיו, דונלד רדיאלי מאזור חדרית לעבר הצלחת בקליפת המוח המתפתח כמו חיים פיגומים עבור ההעברה מכוונת36,37. יתר על כן, הרחבת צמיחה קונוסים הינם שמוצג כדי להציב את עצמם על ידי חש אותות דוחה ומושכת שהפיק תאי גליה guidepost, מה שנקרא “חלוצי” אקסונים מוצעים כדי להגיע אל המטרות הנכונות על-ידי הרחבת לאורך מראש בדוגמת גליה פיגומים35,38,39. לפיכך, גלייה נחוצים עבור ההדרכה של חלוצי אקסונים, אשר מאוחר יותר משרתים גם מבוסס על האקסון “חי פיגומים” לכוון את הקרנת אקסונים “חסיד”. יתר על כן, מנגנוני גדילה בתיווך עכשיו, דונלד הוכחו להתמיד נוצרו אחרי הלידה, כפי neuroblasts לכו בעקבות הזרם נודדות rostral (RMS) כדי לנווט מאזור subventricular (SVZ), אחד האזורים הנותרים האחרונים של נוירוג’נסיס במוח למבוגרים, הריח הנורה (אבוב)40. Neuroblasts אלה ב- RMS להעביר בתוך הצינור גליה (איור 1 א’-1), אשר כולל מיושר לימין longitudinally תהליכים astrocytic, באמצעות תאים תאים ישירה הדבקויות, לשפות אחרות גורמים מסיסים-37, 41. סוף סוף, בעוד נזק CNS יונקים גורם שיבשו סידור תהליך astrocytic ויוצרים צלקת גליה פיזית פוגעת התחדשות עצב17, מערכות מידע שאינם יונקים רבים חוסר היווצרות צלקת גליה מזיקה. במקום זאת, תאי גליה של מינים שאינם מידע יונקים לשמור על יותר מאורגן, מיושר תבניות המשמשות כקווי עזר דרך42,17,האזור הפגוע43. למשל, מידע שאינם יונקים SCI דגמים, אקסונים מוצגים לגדול בשיתוף הדוק עם גליה הגשרים שחוצים את הנגע, רומז תפקיד חשוב עבור פיגומים גליה מאורגן בשם דיאלקטריים הקלת עצב רגנרציה ומחזור (שחזור פונקציונלי איור 1A -2) 42 , 44 , 45. החוק הביוגנטי של התכונות neuroanatomical ואת המנגנונים התפתחותית/משובי שתוארו לעיל, תניב סוג חדש של פיגומים מהונדסים מבוסס על גליה חי במקביל שיכולים להביא הגירה העצבית ילדותי, עצב pathfinding דרך סביבות אחרת שאינה מתירני, שעשוי להיות ובכך מקלים את ההשפעות של עצביים האקסון בדרכי ניוון המשויך CNS פציעות ומחלות.

קבוצת המחקר שלנו תוכנן בעבר מספר סוגים של פיגומים חי עבור שחזור ומתוכננים התחדשות של עצב ספינלי מערכת העצבים, מערכת העצבים ההיקפית (מערכת העצבים ההיקפית) באמצעות מיקרו-רקמת רשתות עצביות (מיקרו-TENNs) ורקמות מתוכנן החוצפה-שתלים (TENGs), בהתאמה27,46,47,48. שתי אסטרטגיות מבוססים מטבעם על ביומימטיקה. מיקרו-TENNs הם מבנים בהשראת אנטומית המיועד מבחינה מבנית והן מבחינה תפקודית להחליף שטחים עצב המחבר ברורים אוכלוסיות עצביים במוח. TENGs לנצל את מנגנון התפתחותית של התחדשות עצב הקלו האקסון, ומעוררות “חסיד” צמיחה האקסון לאורך אקסונים “חלוץ”, כדי להשיג את מארח היעד התחדשות עצב35,46,48. אנחנו לאחרונה מהוונות על צדדיות של לגרדום חיים טכניקה באמצעות ערכה דומה למטרתו כמו מיקרו-TENNs ומחפשים השראה מן המנגנונים מבוסס עכשיו, דונלד להציג במהלך הפיתוח. . הנה, פיתחנו בונה המורכב מיושר חבילות astrocytic פורש לומן סילוק של מיקרו-טור הידרוג49. פיגומים אלו החיים astrocytic מפותחים באמצעות מילוי אסיפה המחט צינור קפילר-דיקור עם agarose נוזלי כדי ליצור של הידרוג גליל חלול עם הקוטר החיצוני (OD), הקוטר הפנימי (ID) המתאים הקוטר של שפופרת ואת המחט, בהתאמה. בעקבות agarose gelation החילוץ של המיקרו-העמודה הידרוג מהצינור נימי, הפנים חלול הוא מצופה סוג אני קולגן לספק סביבה מתירניות עבור אדהזיה אסטרוציט ו מיושר צרור היווצרות (איור 1B -1). לאחר מכן, לומן הוא נזרע עם מוחי האסטרוציטים קורטיקלית מבודד מן החולדה לאחר הלידה הגורים (איור 1B-2). בניגוד דו-ממדית (2D) שיטות ליישור המסתמכים על היישום של שדות חשמליים, חריצים micropatterned מטריצה חוץ-תאית חלבון (ECM) תכנים, היישור אסטרוציט לגרדום חיים טכניקה מסתמך על הרכבה עצמית לפי משתני לשליטה כגון עקמומיות המצע (העמודה ID), צפיפות תא קולגן ריכוז50,51,52. האסטרוציטים חוזה לשפץ הקולגן ו לרכוש מורפולוגיה דו-קוטבי, מיושר לימין longitudinally מקביל פיגומים טבעי ויוו (איור 1B-3). אכן, אנחנו הם שואפים השימוש של המבנים האלה, כמו כבלים בשם דיאלקטריים פיזי עבור הדרכה ממוקד של העברת נוירונים לא בוגר, כמו גם בקידום התחדשות עצב באמצעות הסביבה שלילי של מערכת העצבים פגום, במיוחד בתרבית של גליה הצלקת (איור 1C). במאמר זה תוכלו להציג את שיטת ייצור מפורט עבור העמודות-המיקרו astrocytic, שלב תמונות חדות עם immunofluorescence את cytoarchitecture הצפוי, דיון מקיף על המגבלות הנוכחי וכיוונים עתידיים של טכניקה.

Figure 1
איור 1: השראה, ייצור פרוטוקול ויישומים המוצע עבור הרשתות Astrocytic מיושר. ההשראה הנוירוביולוגי (A): Neuroblasts (1) שמקורן באזור ‘ neurogenic subventricular ‘ (SVZ) לנצל את הצינור גליה longitudinally מיושר בזרם נודדות rostral (RMS) עבור העברה מכוונת לעבר הנורה הריח (אבוב); (2) אי-יונקים כגון דו-חיים, דגים יכול להימשך התחדשות לאחר רקמה עצבית נזק בחלקו בשל היווצרות של גליה גשר המחבר את הקצוות של פגיעה (למשל חוט השדרה transected) ומשמש עשו איתו בהדרכת רגנרציה אקסונים. (B) סקירה פבריקציה נוספת: (1) הקמת הידרוג בגודל מיקרון, חלול מיקרו-עמודה בעלת לומן מצופה ECM, (2) זריעה של ראשי האסטרוציטים קורטיקלית מבודד מן הגורים עכברוש כמחנכת, (3) הרכבה עצמית של longitudinally מונחה חבילות תרבות, ו (4) הפקת הצרור מ למטרתו biomaterial ללימודי השתלה עתידית. (ג) יישומים In vivo : (1) פיגומים חיים אלה עשוי לשמש מהונדסים גליה צינורות להעברת נוירון מכוונת ממרכזי neurogenic לשקם אזורים נוירון לקויה; (2) החוק הביוגנטי של מנגנון התפתחותית של חלוצי האקסון הדרכה, מנגנון הרגנרציה של גשרים גליה שאינם יונקים שיעניק אלה פיגומים astrocytic את היכולת לכוון רגנרציה האקסון על פני הלא-מתירני סביבה של הצלקת גליה יונקים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Protocol

כל ההליכים היו אושרה על ידי טיפול בעלי חיים מוסדיים ועדות שימוש ב אוניברסיטת פנסילבניה ו מייקל ג’יי Crescenz ותיקי לענייני המרכז הרפואי, דבקה בהתאם להנחיות המפורטות במדיניות שירות בריאות הציבור NIH על להומניות טיפול ושימוש חיות מעבדה (2015). 1. פיתוח של הידרוג מיקרו-העמודות Agarose <…

Representative Results

בתחילה, שלב-ניגודיות מיקרוסקופ שימש כדי לעקוב אחר ההתקדמות של אדהזיה אסטרוציט היווצרות צרור ואת יציבותו הכללית cytoarchitecture כפונקציה של הזמן. ב- h 1 לאחר ציפוי, האסטרוציטים נמצאו ברחבי לומן של המיקרו-העמודות עם מורפולוגיה כדורית (איור 2 א). -5 שעות, האסטרוציטים ה…

Discussion

כאשר לעומת הסביבה יותר תומכת של מערכת העצבים ההיקפית, מערכת העצבים מוגבל במיוחד בטיפול ההשלכות מזיקה של neurotrauma, הקשורים ניוון מוחיים. לאחר עלבון רציני מערכת העצבים יונקים, נוצרת צלקת גליה המורכב גרעין של תאים דלקתיים שהותירה מוקף meshwork צפופה של האסטרוציטים תגובתי לא מאורגן להפריש proteoglycans ע…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

תמיכה כספית סופק על ידי מכוני הבריאות הלאומיים [U01-NS094340 (קולן) & F31-NS090746 (Katiyar)], מייקל ג’יי פוקס קרן [טיפולית צינור תוכנית #9998 (קולן)], פן רפואה Neuroscience מרכז טייס פרס (קולן), הקרן הלאומית למדע [מחקר לתואר שני מלגות DGE-1321851 (Struzyna)], המחלקה לענייני חיילים משוחררים [RR & D ההצטיינות לסקור #B1097-אני (קולן)], מחקר רפואי של צבא ארה ב ואת פיקוד [#W81XWH-13-207004 (קולן) & W81XWH-15-1-0466 (קולן)].

Materials

Acupuncture needle (300 µm diameter) Lhasa Medical HS.30×40 The diameter may be varied according to the desired size for the micro-column lumen.
Petri dish Fisher 08772B
Dulbecco's phosphate buffered saline (DPBS) Invitrogen 14200075
Polystyrene disposable serological pipet Fisher 13-678-11D
Agarose Sigma A9539-50G
Microliter glass capillary tube (701 µm) Fisher 21-170J The diameter may be varied according to the desired size for the micro-column shell.
Microcap bulb dispenser Fisher 21-170J Bulb comes with the microcap tubes.
Hot plate Fisher SP88857200
Magnetic bar Fisher 1451352
Micropipette Sigma Z683884-1EA
25 mm gauge needle Fisher 14-826-49
Microscalpel Roboz Surgical RS-6270
Scissors Fine Science Tools 14081-09
Forceps World Precision Instruments 501985
Hot bead sterilizer Sigma Z378550-1EA
Stereoscope Nikon SMZ800N
Micro-spatula Fisher S50821
Rat tail type I collagen Corning 354236 Maintain at 4 ºC and remove only when needed. Use ice to preserve its temperature when in use.
Microcentrifuge tube Fisher 02-681-256
Sodium hydroxide (NaOH) Fisher SS2661
Hydrochloric acid (HCl) Fisher SA48-1
Litmus paper Fisher 09-876-18
Hank's balanced salt solution (HBSS) Invitrogen 14170112 Store at 4 ºC.
0.25% Trypsin-EDTA Invitrogen 25200056 Store at -20 ºC and warm at 37 ºC before use.
Bovine pancreatic deoxyribonuclease (Dnase) I Sigma 10104159001 Store at -20 ºC and warm at 37 ºC before use.
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) with Ham's F-12 Nutrient Mixture Gibco 11330-032 Store at 4 ºC.
Fetal bovine serum (FBS) Atlanta Biologicals S11195 Store at -20ºC.
Postnatal day 0 or day 1 Sprague Dawley rat pups Charles River Strain 001
Neurobasal embryonic neuron basal medium Invitrogen 21103049 Store at 4ºC and warm at 37 ºC before use.
B-27 serum free supplement Invitrogen 12587010 Store at -20 ºC and warm at 37 ºC before use.
L-glutamine Invitrogen 35050061 Store at -20 ºC and warm at 37 ºC before use.
G5 astrocytic supplement Invitrogen 17503012
Sprague Dawley embryonic day 18 rats Charles River Strain 001
Pasteur pipette Fisher 22-042816
15 mL centrifuge tube EMESCO 1194-352099
Vortex Fisher 02-215-414
Centrifuge Fisher 05-413-115
Hemocytometer Fisher 02-671-6
Incubator Fisher 13 998 076
Formaldehyde 40% Fisher F77P-4 Formaldehyde is a toxic compound known to be carcinogenic, and must be disposed of in a separate container.
Glass cover slip Fisher 12-548-5M
Nail polish Electron Microscopy Sciences (EMS) 72180
Fluoromont mounting medium Southern Biotech 0100-01
Poly-L-lysine Sigma P4707
Phosphate buffered saline Fisher BP3994
Triton X-100 Sigma T8787
Normal horse serum Gibco 16050-122
Rabbit anti-glial acidic fibrillary protein (GFAP) primary antibody Millipore AB5804 Store at -20ºC.
Mouse anti-beta-tubulin III primary antibody Sigma T8578 Store at -20ºC.
Rabbit anti-collagen I primary antibody Abcam ab34710 Store at -20ºC.
Rabbit anti-vimentin Millipore AB3400 Store at -20ºC.
Mouse anti-nestin Millipore AB5326 Store at -20ºC.
Donkey anti-mouse 568 secondary antibody Invitrogen A10037 Store at 4ºC.
Donkey anti-rabbit 568 secondary antibody Invitrogen A10042 Store at 4ºC.
Donkey anti-rabbit 488 secondary antibody Invitrogen A21206 Store at 4ºC.
Hoechst 33342, Trihydrochloride Invitrogen H3570 Store at 4ºC. Hoechst is a known mutagen that should be treated as a carcinogen. Therefore, it must be disposed of in a separate container.
Calcein AM Sigma C1359 4 mM in anhydrous DMSO
Ethidium homodimer-1 Life Technologies E1169 2 mM in DMSO/H2O 1:4 (v/v)
Dimethyl sulfoxane (DMSO) Sigma 276855
A1RSI Laser Scanning Confocal Microscope Nikon ————– Used for taking the confocal reconstructions of immunolabeled constructs.
Eclipse Ti-S Microscope Nikon ————– Used for taking the phase-contrast images. With digital image acquisition using a QiClick camera interfaced with Nikon Elements Basic Research software (4.10.01).

References

  1. Horner, P. J., Gage, F. H. Regenerating the damaged central nervous system. Nature. 407 (6807), 963-970 (2000).
  2. Yiu, G., He, Z. Glial inhibition of CNS axon regeneration. Nat. Rev. Neurosci. 7 (8), 617-627 (2006).
  3. Montani, L., Petrinovic, M. M. Targeting Axonal Regeneration: The Growth Cone Takes the Lead. J. Neurosci. 34 (13), 4443-4444 (2014).
  4. Struzyna, L. A., Harris, J. P., Katiyar, K. S., Chen, H. I., Cullen, D. K. Restoring nervous system structure and function using tissue engineered living scaffolds. Neural Regen. Res. 10 (5), 679-685 (2015).
  5. Li, X., Katsanevakis, E., Liu, X., Zhang, N., Wen, X. Engineering neural stem cell fates with hydrogel design for central nervous system regeneration. Prog. Polym. Sci. 37 (8), 1105-1129 (2012).
  6. Lie, D. C., Song, H., Colamarino, S. A., Ming, G., Gage, F. H. Neurogenesis in the Adult Brain: New Strategies for Central Nervous System Diseases. Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 44, 399-421 (2004).
  7. Gao, Y., Yang, Z., Li, X. Regeneration strategies after the adult mammalian central nervous system injury-biomaterials. Regen. Biomater. 3 (2), 115-122 (2016).
  8. Huebner, E. A., Strittmatter, S. M. Axon Regeneration in the Peripheral and Central Nervous Systems. Results Probl. Cell Differ. 48, 339-351 (2009).
  9. Benowitz, L. I., Yin, Y. Combinatorial Treatments for Promoting Axon Regeneration in the CNS: Strategies for Overcoming Inhibitory Signals and Activating Neurons’ Intrinsic Growth State. Dev. Neurobiol. 67 (9), 1148-1165 (2007).
  10. Kyungsuk, K., Liu, K., et al. Promoting Axon Regeneration in the Adult CNS by Modulation of the PTEN / mTOR Pathway. Science. 322 (5903), 963-966 (2008).
  11. Khakh, B. S., Sofroniew, M. V. Diversity of astrocyte functions and phenotypes in neural circuits. Nat. Neurosci. 18 (7), 942-952 (2015).
  12. Cregg, J. M., DePaul, M. A., Filous, A. R., Lang, B. T., Tran, A., Silver, J. Functional regeneration beyond the glial scar. Exp. Neurol. 253, 197-207 (2014).
  13. Buffo, A., Rolando, C., Ceruti, S. Astrocytes in the damaged brain: Molecular and cellular insights into their reactive response and healing potential. Biochem. Pharmacol. 79 (2), 77-89 (2010).
  14. Silver, J., Miller, J. H. Regeneration beyond the glial scar. Nat. Rev. Neurosci. 5 (2), 146-156 (2004).
  15. Toy, D., Namgung, U. Role of Glial Cells in Axonal Regeneration. Exp. Neurobiol. 22 (2), 68-76 (2013).
  16. Sofroniew, M. V. Molecular dissection of reactive astrogliosis and glial scar formation. Trends Neurosci. 32 (12), 638-647 (2009).
  17. East, E., de Oliveira, D. B., Golding, J. P., Phillips, J. B. Alignment of astrocytes increases neuronal growth in three-dimensional collagen gels and is maintained following plastic compression to form a spinal cord repair conduit. Tissue Eng. Part A. 16 (10), 3173-3184 (2010).
  18. David, S., Aguayo, A. J. Axonal Elongation into Peripheral Nervous System "Bridges" after Central Nervous System Injury in Adult Rats. Science. 214 (4523), 931-933 (1981).
  19. Benfey, M., Aguayo, A. J. Extensive elongation of axons from rat brain into peripheral nerve grafts. Nature. 296 (11), 150-152 (1982).
  20. Fry, E. J., Chagnon, M. J., López-Vales, R., Tremblay, M. L., David, S. Corticospinal tract regeneration after spinal cord injury in receptor protein tyrosine phosphatase sigma deficient mice. Glia. 58 (4), 423-433 (2010).
  21. Lin, B., Xu, Y., Zhang, B., He, Y., Yan, Y., He, M. -. C. MEK inhibition reduces glial scar formation and promotes the recovery of sensorimotor function in rats following spinal cord injury. Exp. Ther. Med. 7 (1), 66-72 (2014).
  22. Bradbury, E. J., Carter, L. M. Manipulating the glial scar: Chondroitinase ABC as a therapy for spinal cord injury. Brain Res. Bull. 84 (4-5), 306-316 (2011).
  23. Vadivelu, S., Stewart, T. J., et al. NG2+ Progenitors Derived From Embryonic Stem Cells Penetrate Glial Scar and Promote Axonal Outgrowth Into White Matter After Spinal Cord Injury. Stem Cells Transl. Med. 4, 401-411 (2015).
  24. Nishimura, Y., Natsume, A., et al. Interferon-beta delivery via human neural stem cell abates glial scar formation in spinal cord injury. Cell Transplant. 22 (12), 2187-2201 (2013).
  25. Guo, Z., Zhang, L., Wu, Z., Chen, Y., Wang, F., Chen, G. In vivo direct reprogramming of reactive glial cells into functional neurons after brain injury and in an Alzheimer’s disease model. Cell Stem Cell. 14 (2), 188-202 (2014).
  26. Tam, R. Y., Fuehrmann, T., Mitrousis, N., Shoichet, M. S. Regenerative therapies for central nervous system diseases: a biomaterials approach. Neuropsychopharmacology. 39 (1), 169-188 (2014).
  27. Cullen, D. K., Tang-Schomer, M. D., et al. Microtissue engineered constructs with living axons for targeted nervous system reconstruction. Tissue Eng. Part A. 18 (21-22), 2280-2289 (2012).
  28. Cullen, D. K., Wolf, J. A., Vernekar, V., Vukasinovic, J., LaPlaca, M. C. Neural tissue engineering and biohybridized microsystems for neurobiological investigation in vitro (Part 1). Crit. Rev. Biomed. Eng. 39 (3), 201-240 (2011).
  29. Irons, H. R., Cullen, D. K., Shapiro, N. P., Lambert, N. A., Lee, R. H., Laplaca, M. C. Three-dimensional neural constructs: a novel platform for neurophysiological investigation. J. Neural Eng. 5 (3), 333-341 (2008).
  30. Morrison, B. I., Cullen, D. K., LaPlaca, M. In Vitro Models for Biomechanical Studies of Neural Tissues. Stud. Mechanobiol. Tissue Eng. Biomater. 3, 247-285 (2011).
  31. Vukasinovic, J., Cullen, D. K., Laplaca, M. C., Glezer, A. A microperfused incubator for tissue mimetic 3D cultures. Biomed. Microdevices. 11 (6), 1155-1165 (2009).
  32. Cullen, D. K., Lessing, M. C., Laplaca, M. C. Collagen-dependent neurite outgrowth and response to dynamic deformation in three-dimensional neuronal cultures. Ann. Biomed. Eng. 35 (5), 835-846 (2007).
  33. LaPlaca, M. C., Vernekar, V. N., Shoemaker, J. T., Cullen, D. K. Three-dimensional neuronal cultures. Methods Bioeng. 3D Tissue Eng. , (2010).
  34. Chwalek, K., Tang-Schomer, M. D., Omenetto, F. G., Kaplan, D. L. In vitro bioengineered model of cortical brain tissue. Nat. Protoc. 10 (9), 1362-1373 (2015).
  35. Struzyna, L. A., Katiyar, K., Cullen, D. K. Living scaffolds for neuroregeneration. Curr. Opin. Solid State Mater. Sci. 18 (6), 308-318 (2014).
  36. Stiles, J., Jernigan, T. L. The basics of brain development. Neuropsychol. Rev. 20 (4), 327-348 (2010).
  37. Kaneko, N., Marín, O., et al. New neurons clear the path of astrocytic processes for their rapid migration in the adult brain. Neuron. 67 (2), 213-223 (2010).
  38. Hidalgo, A., Booth, G. E. Glia dictate pioneer axon trajectories in the Drosophila embryonic CNS. Development. 127 (2), 393-402 (2000).
  39. Chotard, C., Salecker, I. Neurons and glia: Team players in axon guidance. Trends Neurosci. 27 (11), 655-661 (2004).
  40. Wang, C., Liu, F., et al. Identification and characterization of neuroblasts in the subventricular zone and rostral migratory stream of the adult human brain. Cell Res. 21 (11), 1534-1550 (2011).
  41. Peretto, P., Giachino, C., Aimar, P., Fasolo, A., Bonfanti, L. Chain formation and glial tube assembly in the shift from neonatal to adult subventricular zone of the rodent forebrain. J. Comp. Neurol. 487 (4), 407-427 (2005).
  42. Zukor, K. A., Kent, D. T., Odelberg, S. J. Meningeal cells and glia establish a permissive environment for axon regeneration after spinal cord injury in newts. Neural Dev. 6, (2011).
  43. Reier, P. J. Penetration of grafted astrocytic scars by regenerating optic nerve axons in xenopus tadpoles. Brain Res. 164 (1-2), 61-68 (1979).
  44. Lee-Liu, D., Edwards-Faret, G., Tapia, V. S., Larraín, J. Spinal cord regeneration: Lessons for mammals from non-mammalian vertebrates. Genesis. 51 (8), 529-544 (2013).
  45. Goldshmit, Y., Sztal, T. E., Jusuf, P. R., Hall, T. E., Nguyen-Chi, M., Currie, P. D. Fgf-Dependent Glial Cell Bridges Facilitate Spinal Cord Regeneration in Zebrafish. J. Neurosci. 32 (22), 7477-7492 (2012).
  46. Struzyna, L. A., Wolf, J. A., et al. Rebuilding Brain Circuitry with Living Micro-Tissue Engineered Neural Networks. Tissue Eng. Part A. 21 (21-22), 2744-2756 (2015).
  47. Harris, J. P., Struzyna, L. A., Murphy, P. L., Adewole, D. O., Kuo, E., Cullen, D. K. Advanced biomaterial strategies to transplant preformed micro-tissue engineered neural networks into the brain. J. Neural Eng. 13 (1), 16019-16037 (2016).
  48. Huang, J. H., Cullen, D. K., et al. Long-Term Survival and Integration of Transplanted Engineered Nervous Tissue Constructs Promotes Peripheral Nerve Regeneration. Tissue Eng. Part A. 15 (7), 1677-1685 (2009).
  49. Winter, C. C., Katiyar, K. S., et al. Transplantable living scaffolds comprised of micro-tissue engineered aligned astrocyte networks to facilitate central nervous system regeneration. Acta Biomater. 38, 44-58 (2016).
  50. Alexander, J. K., Fuss, B., Colello, R. J. Electric field-induced astrocyte alignment directs neurite outgrowth. Neuron Glia Biol. 2 (2), 93-103 (2006).
  51. Hsiao, T. W., Tresco, P. A., Hlady, V. Astrocytes alignment and reactivity on collagen hydrogels patterned with ECM proteins. Biomaterials. 39, 124-130 (2015).
  52. Alekseeva, T., Katechia, K., Robertson, M., Riehle, M. O., Barnett, S. C. Long-term neurite orientation on astrocyte monolayers aligned by microtopography. Biomaterials. 28 (36), 5498-5508 (2007).
  53. Pacifici, M., Peruzzi, F. Isolation and culture of rat embryonic neural cells: a quick protocol. J. Vis. Exp. (63), (2012).
  54. Conway, A., Schaffer, D. V. Biomaterial microenvironments to support the generation of new neurons in the adult brain. Stem Cells. 32 (510), 1220-1229 (2014).
  55. Barry, D., McDermott, H. Differentiation of radial glia from radial precursor cells and transformation into astrocytes in the developing rat spinal cord. Glia. 50 (3), 187-197 (2005).
  56. Pertusa, M., Garcia-Matas, S., Rodriguez-Farre, E., Sanfeliu, C., Cristofol, R. Astrocytes aged in vitro show a decreased neuroprotective capacity. J. Neurochem. 101 (3), 794-805 (2007).
  57. Discher, D. E., Janmey, P., Wang, Y. -. L. Tissue Cells Feel and Respond to the Stiffness of Their Substrate. Science. 310 (5751), 1139-1143 (2005).
  58. Balgude, A. P., Yu, X., Szymanski, A., Bellamkonda, R. V. Agarose gel stiffness determines rate of DRG neurite extension in 3D cultures. Biomaterials. 22 (10), 1077-1084 (2001).
  59. Smeal, R. M., Tresco, P. A. The influence of substrate curvature on neurite outgrowth is cell type dependent. Exp. Neurol. 213 (2), 281-292 (2008).
  60. Smeal, R. M., Rabbitt, R., Biran, R., Tresco, P. A. Substrate curvature influences the direction of nerve outgrowth. Ann. Biomed. Eng. 33 (3), 376-382 (2005).
  61. Jain, A., Kim, Y. -. T., McKeon, R. J., Bellamkonda, R. V. In situ gelling hydrogels for conformal repair of spinal cord defects, and local delivery of BDNF after spinal cord injury. Biomaterials. 27 (3), 497-504 (2006).
  62. Katiyar, K. S., Winter, C. C., Struzyna, L. A., Harris, J. P., Cullen, D. K. Mechanical elongation of astrocyte processes to create living scaffolds for nervous system regeneration. J. Tissue Eng. Regen. Med. , (2016).
  63. McCarthy, K. D., De Vellis, J. Preparation of Separate Astroglial and Oligodendroglial Cell Cultures from Rat Cerebral Tissue. J. Cell Biol. 85, 890-902 (1980).
  64. Cullen, D. K., Stabenfeldt, S. E., Simon, C. M., Tate, C. C., LaPlaca, M. C. In Vitro Neural Injury Model for Optimization of Tissue-Engineered Constructs. J. Neurosci. Res. 85, 3642-3651 (2007).
  65. Kim, S. U., Stern, J., Kim, M. W., Pleasure, D. E. Culture of purified rat astrocytes in serum-free medium supplemented with mitogen. Brain Res. 274 (1), 79-86 (1983).
  66. Morrison, R. S., de Vellis, J. Growth of purified astrocytes in a chemically defined medium. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 78 (11), 7205-7209 (1981).
  67. Stopak, D., Harris, A. K. Connective tissue morphogenesis by fibroblast traction. I. Tissue culture observations. Dev. Biol. 90 (2), 383-398 (1982).
  68. Hsiao, T. W., Swarup, V. M., Kuberan, B., Tresco, P. A., Hlady, V. Astrocytes specifically remove surface-adsorbed fibrinogen and locally express chondroitin sulfate proteoglycans. Acta Biomater. 9 (7), 7200-7208 (2013).
  69. Phillips, J. B., Bunting, S. C. J., Hall, S. M., Brown, R. A. Neural tissue engineering: a self-organizing collagen guidance conduit. Tissue Eng. 11 (9), 1611-1617 (2005).
  70. Cullen, D. K., Simon, C. M., LaPlaca, M. C. Strain rate-dependent induction of reactive astrogliosis and cell death in three-dimensional neuronal-astrocytic co-cultures. Brain Res. 1158, 103-115 (2007).
  71. Filous, A. R., Miller, J. H., Coulson-Thomas, Y. M., Horn, K. P., Alilain, W. J., Silver, J. Immature astrocytes promote CNS axonal regeneration when combined with chondroitinase ABC. Dev. Neurobiol. 70 (12), 826-841 (2010).
  72. Johansson, S., Strömberg, I. Guidance of dopaminergic neuritic growth by immature astrocytes in organotypic cultures of rat fetal ventral mesencephalon. J. Comp. Neurol. 443 (3), 237-249 (2002).
  73. Jiang, Z., Han, Y., Cao, X. Induced pluripotent stem cell (iPSCs) and their application in immunotherapy. Cell. Mol. Immunol. 11 (1), 17-24 (2014).
  74. Wang, L., Cao, J., et al. Immunogenicity and functional evaluation of iPSC-derived organs for transplantation. Cell Discov. 1, (2015).
  75. Wolmer-Solberg, N., Cederarv, M., Falci, S., Odeberg, J. Human neural stem cells and astrocytes, but not neurons, suppress an allogeneic lymphocyte response. Stem Cell Res. 2 (1), 56-67 (2009).

Play Video

Cite This Article
Katiyar, K. S., Winter, C. C., Gordián-Vélez, W. J., O’Donnell, J. C., Song, Y. J., Hernandez, N. S., Struzyna, L. A., Cullen, D. K. Three-dimensional Tissue Engineered Aligned Astrocyte Networks to Recapitulate Developmental Mechanisms and Facilitate Nervous System Regeneration. J. Vis. Exp. (131), e55848, doi:10.3791/55848 (2018).

View Video