Tre-dimensionelle Tissue Engineering justeret Astrocyte netværk for at sammenfatte udviklingsmæssige mekanismer og lette nervesystem regenerering

Summary

Vi fremvise udviklingen af selvsamlede, tre-dimensionelle bundter langs justeret astrocytic somata og processer inden for en roman biomateriale encasement. Disse manipuleret “levende stilladser”, udstiller micron-skala diameter, endnu udvide centimeter i længden, kan tjene som prøvestande til at studere udviklingsforstyrrelser mekanismer eller lette neuroregeneration ved at lede neuronal migration og/eller cytoskeletale pathfinding.

Abstract

Neurotrauma og neurodegenerative sygdomme ofte resulterer i varige neurologiske underskud på grund af den begrænsede kapacitet på det centrale nervesystem (CNS) til at erstatte tabte neuroner og regenerere cytoskeletale veje. Dog under udvikling af nervesystem, neuronal migration og cytoskeletale udvidelse ofte opstå langs veje udgøres af andre celler, betegnes som “levende stilladser”. Søger at efterligne disse mekanismer og for at udforme en strategi, der omgår de hæmmende miljø af CNS, dette manuskript præsenterer en protokol til at fremstille væv manipuleret astrocyte-baserede “levende stilladser”. Hvis du vil oprette disse konstruktioner, ansat vi en roman biomateriale encasement ordningen til at fremkalde astrocytter selv samle i tætte tredimensionale bundter af bipolar langs justeret somata og processer. Første, hule hydrogel mikro-kolonner var samlet, og den indre lumen var belagt med ekstracellulære kollagen matrix. Dissocierede cerebral kortikale astrocytter blev derefter leveret i lumen af cylindrisk mikro-kolonnen, og på en kritisk indre diameter på < 350 µm, spontant selvstændig justeret og ansat til at producere lange fiber-lignende kabler består af tætte bundter astrocyte processer og kollagen fibriller måling 97% cellernes levedygtighed og var næsten udelukkende består af astrocytter udtrykker en kombination af de mellemliggende glødetrådens proteiner glial-fibrillære sure protein (GFAP), vimentin, og nestin. Disse justeret astrocyte netværk fandtes for at give en eftergivende substrat for neuronal vedhæftet fil og justeret neurite forlængelse. Desuden, disse konstruktioner bevare integritet og justering når udvundet fra hydrogel encasement, hvilket gør dem egnede til CNS implantation. Disse præfabrikerede konstruktioner strukturelt emulere centrale cytoarchitectural elementer af naturligt forekommende glial-baserede “living stilladser” in vivo. Som sådan, kan disse manipuleret levende stilladser tjene som prøvestande til at studere udviklingsforstyrrelser mekanismer i in vitro eller lette neuroregeneration ved at dirigere neuronal migration og/eller cytoskeletale pathfinding efter CNS degeneration in vivo .

Introduction

Det centrale nervesystem (CNS) har en begrænset kapacitet til at modvirke tab og/eller dysfunktion af neuroner og cytoskeletale veje, der ledsager betingelser såsom traumatisk hjerneskade (TBI), slagtilfælde, rygmarv skade (SCI), og neurodegenerative sygdomme^{1 ,2,3,4,5}. Neurogenese i CNS er begrænset til et begrænset antal områder i hjernen, hæmmer genoprettelse af tabte neuroner^6,7. Derudover er regenerering af tabt cytoskeletale veje i CNS utilstrækkelig på grund af manglen på styret vejledning, tilstedeværelsen af udvækst hæmmere og reaktive astrogliosis efter skader til neurale væv^{2,8, 9,10}. Astrocytter har typisk forskellige funktioner i bistå neuroner med ion homøostase, neurotransmitter clearance, synapse dannelse og neurovaskulært kobling¹¹. Ikke desto mindre kan astrocytter efter endda milde skader på neurale væv underkastes Molekylær, strukturelle og funktionelle ændringer som de overgang til en hypertrofisk stat¹¹. Reaktion på svær neurotrauma resultere disse ændringer i dannelsen af et ar med en penumbra indeholdende overflytter reaktive astrocytter og en læsion kerne, der omfatter leukocytter lækket fra bristet blod – hjerne barrieren (BBB), mikroglia, oligodendrocytes, og fibroblaster^11,12,13. Disse reaktive astrocytter nå en morfologi af fintrådede, uorganiseret processer og udviser øget udtryk for mellemliggende glødetrådens proteiner og chondroitin sulfat proteoglycaner (CSPGs), hvilket hindrer neurale regenerering¹². Selvom glial arret oprindeligt hjælper genindføre BBB integritet og undgå overførsel af den inflammatoriske reaktion på omkringliggende raske væv, tjener det som en fysisk og biokemisk barriere mod axon regenerering^{12,14 ,15,16}. For eksempel, axoner, der støder glial arret vise løgformet dystrofe vækst kegler og hæmmet vækst¹². Derudover hindrer uorganiseret astrocytic processer efter skade udvidelsen af regenererende axoner¹⁷. Resultatet af disse hæmmende egenskaber er manifesteret i de ofte-permanent fysiske og neurologiske handicap, at patienter lider efter alvorlige neurotrauma, herunder TBI og SCI.

Uanset de ydre udfordringer funktionelle regenerering i CNS, har axoner vist sig at besidde en iboende evne til at regenerere. For eksempel, tyder den dynamiske karakter af dystrofe vækst kegler i kontakt med glial arret på, at disse endelser bevarer deres evne til at udvide¹². Derfor, det menes, at en vigtigste hindring for cytoskeletale re-vækst er den hæmmende miljø efter skade CNS og det giver en mere eftergivende miljø via nedsætte glial ardannelse og/eller leverer regenerativ broer på tværs af arret vil være fordelagtig. Faktisk, tidligere undersøgelser har vist at CNS neuroner var i stand til at udvide axoner via en læsion ved hjælp af perifere nerve grafts som broer, som udgør et gunstigere miljø for axon regenerering^{12,18, 19}. Flere andre strategier har været forfulgt for at udnytte denne rudimentære regenerationsevne. For eksempel, har manipulation af celle vækst signaling veje i forskellige skade modeller resulteret i cytoskeletale regenerering og glial ar reduktion^10,20,21. Desuden, har undersøgelser vist, at behandling med chondroitinase ABC, som kløver fleste for sukker kæderne i CSPGs, mindsker den hæmmende effekt af CSPGs udskilles af reaktive astrocytter²². Trods opmuntrende resultater, disse tilgange giver ikke instrueret vejledning af vækst kegler, som kan potentielt resultere i afvigende regenerering¹², og også ikke højde for tab af neuroner. Celle-baserede tilgange har været udnyttet i forsøg på at overvinde virkningerne af glial arret og genopbygge tabt celler, især neuroner. Nogle grupper har dedifferentiated reaktiv astrocytter til neuroner, mens andre har transplanterede neurale stamceller i CNS læsioner til repopulate området skade og fremme axon regenerering^{23,24, 25}. dog stamcelletransplantation alene er begrænset af lav overlevelsesrate, dårlig integration og beskedne fastholdelse i beskadiget væv⁵. Derudover undlader disse celle-baserede strategier at gendannelse langdistance cytoskeletale skrifter, især på en kontrolleret måde. Derfor, biomaterialer i kombination med andre tilgange er ved at blive undersøgt som levering køretøjer til forskellige neurale og stamceller og vækst faktorer²⁶. Biomateriale-baserede tilgange har en høj grad af kontrol til at producere konstruktioner, der efterligner den specifikke fysiske, haptotaxic, og chemotaxic stikord til stede i de tre-dimensionelle (3D) mikromiljø target host væv^{27, 28,29,30,31,32,33,34}. Reproduktion af disse miljømæssige signaler er altafgørende for transplanterede celler præsentere native-lignende morfologi, spredning, migration og signalering, blandt andre neurobiologiske karakteristika²⁹. Trods disse fordelagtige egenskaber er avancement ud over traditionelle celle seedede biomateriale stilladser påkrævet samtidig fremme styret langdistance cytoskeletale regenerering og erstatte tabte neuroner.

En lovende alternativ tilgang er baseret på neurale væv manipuleret “levende stilladser”, som adskiller sig fra andre celle-baserede tilgange på grund af tilstedeværelsen af levende neurale celler med en præfabrikerede cytoarchitecture, der emulerer indfødte Neuroanatomi og/eller udviklingsmæssige mekanismer til fremme af målrettet udskiftning, genopbygning og genrejsning af neurale kredsløb^4,35. Overvejelser ved design af levende stilladser omfatter fænotyper og kilder af neurale celler samt de mekaniske/fysiske egenskaber og de biokemiske signaler dikteret af sammensætningen af eventuelle ledsagende biomaterialer³⁵. Efter fabrikation i vitro, disse levende stilladser kan være implanteret i vivo til stede celle-adhæsionsmolekyler og kemotaktisk og neurotrope signaler til aktivt regulere neurale celle migration og axon udvækst afhængigt af staten og progression af regenerative processer³⁵. Gliaceller kan tjene som grundlag for de manipuleret cytoarchitecture af levende stilladser, da disse celler mægle forskellige udviklingsmæssige mekanismer i vivo. I løbet af hjernens udvikling stole nye neuroner på basal processer udvidet af radial glia fra zonen ventrikulær mod udvikle kortikale pladen som levende stilladser for styret migration^36,37. Desuden udvide vækst kegler er vist at orientere sig ved sensing tiltrækkende og frastødende signaler fremkaldes ved glial guidepost celler, og såkaldte “banebrydende” axoner er foreslået at nå frem til de korrekte mål ved at udvide langs pre mønstrede glial scaffolds^35,38,39. Gliaceller er således nødvendige for vejledning af banebrydende axoner, som senere tjene som axon-baserede “levende stilladser” for direkte projektion af “follower” axoner. Derudover glia-medieret vækst mekanismer har vist at fremture efter fødslen, som neuroblasts følger den rostralt vandrende strøm (RMS) til at navigere fra den subventricular zone (SVZ), en af de få tilbageværende områder af neurogenese i den voksne hjerne, at den olfaktoriske pære (OB)⁴⁰. Disse neuroblasts i RMS migrere i glial røret (figur 1A-1), som består af langs justeret astrocytic processer, via direkte celle-celle sammenvoksninger og lokaliseret opløselige faktorer^{37, 41}. Endelig, mens CNS skader i pattedyr årsager afbrudt astrocytic proces arrangement danner et glial ar, der fysisk hindrer cytoskeletale regenerering¹⁷, mange ikke-pattedyr systemer mangler dannelsen af en skadelig glial ar. Tværtimod opretholde glial celler af ikke-pattedyr arter mere organiseret, justeret mønstre, der anvendes som guider gennem sårede region^17,42,43. For eksempel, i ikke-pattedyr SCI modeller, er axoner vist at vokse i tæt tilknytning til glial broer krydser læsion, tyder på en vigtig rolle for organiseret glial stilladser som substrater lette cytoskeletale regenerering og funktionel genopretning ( Figur 1A -2) ^{42 , 44 , 45}. Sammenfatning af de neuroanatomical funktioner og udviklingsmæssige/regenerativ mekanismer beskrevet ovenfor kan give en ny klasse af manipuleret glial-baserede levende stilladser, der samtidigt kan drive umodne neuronal migration og cytoskeletale pathfinding gennem ellers ikke-eftergivende miljøer, dermed potentielt afdæmpe virkningerne af neuronal og axon tarmkanalen degeneration tilknyttet CNS skade og sygdom.

Vores forskergruppe har tidligere udviklet flere typer af levende stilladser til genopbygning og genopretning af cytoskeletale skrifter i CNS og det perifere nervesystem (PNS) via mikro-væv manipuleret neurale netværk (micro-mine) og væv manipuleret nerve grafts (TENGs), henholdsvis^27,46,47,48. Begge strategier er baseret i sagens natur på Biomimetik. Mikro-mine er anatomisk inspireret strukturer designet til strukturelt og funktionelt erstatte cytoskeletale skrifter forbinder adskilte neuronal populationer af hjernen. TENGs udnytter den udviklingsmæssige mekanisme af axon-faciliteret cytoskeletale regenerering, eksemplificeret ved “follower” axon vækst langs “pioneer” axoner, at opnå målrettede vært cytoskeletale regenerering^35,46,48. Vi for nylig med store bogstaver på alsidigheden af levende stillads teknik ved hjælp af en lignende encasement ordningen som mikro-mine og søger inspiration fra de glia-baserede mekanismer til stede i hele udvikling. Her, udviklet vi konstruktioner bestående af justeret astrocytic bundter spanning kollagen lumen af en hydrogel mikro-kolonne⁴⁹. Disse astrocytic levende stilladser er udviklet af første udfylde en kapillær tube-akupunktur nål forsamling med flydende Agarosen for at oprette en hul cylindrisk hydrogel med en ydre diameter (OD) og indre diameter (ID) svarende til diameteren af den rør og nål, hhv. Efter Agarosen gellation, og udvindingen af hydrogel mikro-kolonnen fra den kapillarrør kraterets hule er belagt med type kollagen til at levere en eftergivende for astrocyte vedhæftning miljø og justeret bundt dannelse (figur 1B -1). Bagefter, lumen er seedet med cerebral kortikale astrocytter isoleret fra postnatal rotte unger (figur 1B-2). I modsætning til todimensionale (2D) justering teknikker, der er baseret på anvendelsen af elektriske felter, micropatterned riller og ekstracellulære matrix (ECM) protein mønster, astrocyte justering i levende stillads bygger teknik på samlesæt i henhold til kontrollerbare variabler som substrat krumning (kolonne-ID), celle tæthed og kollagen koncentration^50,51,52. Astrocytter kontrakt og remodel kollagen, og erhverve en bipolar, langs justeret morfologi analog til de naturligt stilladser observeret i vivo (figur 1B-3). Ja, vi aktivt forfølger brugen af disse kabel-lignende strukturer som fysiske substrater for målrettet vejledning af overflytning umodne neuroner samt lette cytoskeletale regenerering gennem den ugunstige miljø af den beskadigede CNS, især pattedyr glial arret (figur 1 c). Denne artikel vil fremlægge detaljerede fabrikation metode for astrocytic mikro-kolonnerne, fase kontrast og immunfluorescens billeder af de forventede cytoarchitecture, og en omfattende diskussion om de nuværende begrænsninger og fremtidige retninger af den teknik.

Figur 1: Inspiration, fabrikation protokol og foreslåede programmer for de justerede Astrocytic net. (A) neurobiologiske inspiration: (1) Neuroblasts stammer fra den neurogen subventricular zone (SVZ) udnytte langs justeret glial røret i den rostralt vandrende strøm (RMS) for styret migration hen imod de olfaktoriske pære (OB); (2) ikke-pattedyr padder og fisk kan opretholde regenerering efter neurale væv skade delvis på grund af dannelsen af en glial bro, der forbinder enderne af en læsion (f.eks. transected rygmarven) og tjener som et stillads til vejledning for Regenerating axoner. (B) fabrikation oversigt: (1) opbygningen af en micron mellemstore, hule hydrogel mikro-kolonne med lumen belagt med ECM, (2) såning af primære kortikale astrocytter isoleret fra postnatal rotte unger, (3) samlesæt af langs-orienterede bundter i kultur, og (4) udvinding af pakke fra biomateriale encasement for fremtidige implantation undersøgelser. (C) In vivo ansøgninger: (1) disse levende stilladser kan tjene som manipuleret glial rør til styret neuron migration fra neurogen centre til repopulate neuron-mangelfuld regioner; (2) sammenfatning af de udviklingsmæssige mekanisme af banebrydende axon vejledning og glial broer i ikke-pattedyr regenerativ mekanisme kan give disse astrocytic stilladser med kapacitet til direkte axon regeneration på tværs af de ikke-eftergivende miljø af pattedyr glial arret. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Protocol

Alle procedurer blev godkendt af institutionelle Animal Care og brug udvalg på University of Pennsylvania og Michael J. Crescenz veteraner anliggender Medical Center og overholdt retningslinjerne i NIH Public Health Service politik på human Pleje og brugen af forsøgsdyr (2015). 1. udvikling af Agarosen Hydrogel mikro-kolonner Gøre en Agarosen 3% vægt/volumen (w/v) opløsning af vejer 3 g af Agarosen og overføre den til et sterilt bæger indeholdende 100 mL Dulbeccos fosfatbuffe…

Representative Results

I første omgang fasekontrast mikroskopi blev brugt til at overvåge udviklingen af astrocyte vedhæftning og bundt dannelse og den overordnede stabilitet af cytoarchitecture som funktion af tiden. På 1 time efter plating, blev astrocytter fundet i hele lumen af mikro-kolonner med en sfærisk morfologi (figur 2A). På 5 h, astrocytter begyndte at udvide processer og kontraherende, mens af 8 h celler udstillet en komplet proces-bærende morfologi og dannet ka…

Discussion

Sammenlignet med de mere støttende miljø af PNS, forringes CNS især ved håndtering af de skadelige konsekvenser af neurotrauma og neurodegeneration. Efter en alvorlig fornærmelse til pattedyr CNS dannes en glial ar, bestående af en kerne af fibrotisk og inflammatoriske celler omgivet af en tæt meshwork af uorganiseret reaktive astrocytter, der udskiller axon udvækst-hæmmende proteoglycaner¹⁴. Dette ar fungerer som en fysiske og biokemiske obstruktion mod regenerering af axon endelser<sup …

Materials

Acupuncture needle (300 µm diameter)	Lhasa Medical	HS.30×40	The diameter may be varied according to the desired size for the micro-column lumen.
Petri dish	Fisher	08772B
Dulbecco's phosphate buffered saline (DPBS)	Invitrogen	14200075
Polystyrene disposable serological pipet	Fisher	13-678-11D
Agarose	Sigma	A9539-50G
Microliter glass capillary tube (701 µm)	Fisher	21-170J	The diameter may be varied according to the desired size for the micro-column shell.
Microcap bulb dispenser	Fisher	21-170J	Bulb comes with the microcap tubes.
Hot plate	Fisher	SP88857200
Magnetic bar	Fisher	1451352
Micropipette	Sigma	Z683884-1EA
25 mm gauge needle	Fisher	14-826-49
Microscalpel	Roboz Surgical	RS-6270
Scissors	Fine Science Tools	14081-09
Forceps	World Precision Instruments	501985
Hot bead sterilizer	Sigma	Z378550-1EA
Stereoscope	Nikon	SMZ800N
Micro-spatula	Fisher	S50821
Rat tail type I collagen	Corning	354236	Maintain at 4 ºC and remove only when needed. Use ice to preserve its temperature when in use.
Microcentrifuge tube	Fisher	02-681-256
Sodium hydroxide (NaOH)	Fisher	SS2661
Hydrochloric acid (HCl)	Fisher	SA48-1
Litmus paper	Fisher	09-876-18
Hank's balanced salt solution (HBSS)	Invitrogen	14170112	Store at 4 ºC.
0.25% Trypsin-EDTA	Invitrogen	25200056	Store at -20 ºC and warm at 37 ºC before use.
Bovine pancreatic deoxyribonuclease (Dnase) I	Sigma	10104159001	Store at -20 ºC and warm at 37 ºC before use.
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) with Ham's F-12 Nutrient Mixture	Gibco	11330-032	Store at 4 ºC.
Fetal bovine serum (FBS)	Atlanta Biologicals	S11195	Store at -20ºC.
Postnatal day 0 or day 1 Sprague Dawley rat pups	Charles River	Strain 001
Neurobasal embryonic neuron basal medium	Invitrogen	21103049	Store at 4ºC and warm at 37 ºC before use.
B-27 serum free supplement	Invitrogen	12587010	Store at -20 ºC and warm at 37 ºC before use.
L-glutamine	Invitrogen	35050061	Store at -20 ºC and warm at 37 ºC before use.
G5 astrocytic supplement	Invitrogen	17503012
Sprague Dawley embryonic day 18 rats	Charles River	Strain 001
Pasteur pipette	Fisher	22-042816
15 mL centrifuge tube	EMESCO	1194-352099
Vortex	Fisher	02-215-414
Centrifuge	Fisher	05-413-115
Hemocytometer	Fisher	02-671-6
Incubator	Fisher	13 998 076
Formaldehyde 40%	Fisher	F77P-4	Formaldehyde is a toxic compound known to be carcinogenic, and must be disposed of in a separate container.
Glass cover slip	Fisher	12-548-5M
Nail polish	Electron Microscopy Sciences (EMS)	72180
Fluoromont mounting medium	Southern Biotech	0100-01
Poly-L-lysine	Sigma	P4707
Phosphate buffered saline	Fisher	BP3994
Triton X-100	Sigma	T8787
Normal horse serum	Gibco	16050-122
Rabbit anti-glial acidic fibrillary protein (GFAP) primary antibody	Millipore	AB5804	Store at -20ºC.
Mouse anti-beta-tubulin III primary antibody	Sigma	T8578	Store at -20ºC.
Rabbit anti-collagen I primary antibody	Abcam	ab34710	Store at -20ºC.
Rabbit anti-vimentin	Millipore	AB3400	Store at -20ºC.
Mouse anti-nestin	Millipore	AB5326	Store at -20ºC.
Donkey anti-mouse 568 secondary antibody	Invitrogen	A10037	Store at 4ºC.
Donkey anti-rabbit 568 secondary antibody	Invitrogen	A10042	Store at 4ºC.
Donkey anti-rabbit 488 secondary antibody	Invitrogen	A21206	Store at 4ºC.
Hoechst 33342, Trihydrochloride	Invitrogen	H3570	Store at 4ºC. Hoechst is a known mutagen that should be treated as a carcinogen. Therefore, it must be disposed of in a separate container.
Calcein AM	Sigma	C1359	4 mM in anhydrous DMSO
Ethidium homodimer-1	Life Technologies	E1169	2 mM in DMSO/H2O 1:4 (v/v)
Dimethyl sulfoxane (DMSO)	Sigma	276855
A1RSI Laser Scanning Confocal Microscope	Nikon	————–	Used for taking the confocal reconstructions of immunolabeled constructs.
Eclipse Ti-S Microscope	Nikon	————–	Used for taking the phase-contrast images. With digital image acquisition using a QiClick camera interfaced with Nikon Elements Basic Research software (4.10.01).