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Chemistry

N型糖鎖アレイ開発および HIV 抗体のための化学酵素合成プロファイリング

Published: February 5, 2018 doi: 10.3791/55855
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Genomics Research Center, Academia Sinica

Summary

酸化アルミニウム コーティング ガラスに添付ファイルのN型糖鎖の合成にモジュラー アプローチは、糖鎖マイクロ アレイを開発し、広く中和抗体、HIV のプロファイリングの使用が示されている (ACG スライド) をスライドさせます。

Abstract

Nの広い範囲の急速な準備のための非常に効率的な方法を提案する-人間の糖タンパク質でよく見られる (20,000 構造を超過する推定) オリゴ糖をリンクします。目的の構造の多様性を達成するために戦略から始まった、3 -Oと 6 -Oで彼らの段階的 α-選択的グリコシル化に続いて、oligosaccharyl フッ化物モジュールの 3 種類の化学酵素合成の位置、重要な β-マンノシドのリンケージを持つ共通のコア三のマンノース残基。我々 はさらに、HIV 抗体とヘテロ-リガンド相互作用の分析のための共有結合混合配列を作成する酸化アルミニウム コーティング ガラス (ACG) スライドの表面にN型糖鎖を添付しました。特に、バインディング動作を新たに単離した HIV 1 広く中和抗体 (bNAb)、PG9、密接に間隔をあけられた男5GlcNAc2の混合物の (男5) と 2, 6-ジ-還元末端 bi antennary 複合型N型糖鎖 (SCT) ACG 配列の HIV ワクチン開発のための効果的な免疫原設計に新しい道を開きます。また、ACG 配列は異種リガンド結合動作の他の HIV 抗体を研究する強力なツールを体現しています。

Introduction

糖タンパク質糖鎖のN共有にリンクされて、アスパラギン コンセンサス Asn-Xxx-セリン/スレオニン sequon の (Asn) 残基蛋白質の構造、抗原性、溶解性、レクチン認識などいくつかの生物学的プロセスに影響を与える1,2。 Nの化学合成-糖鎖は彼らの巨大な構造マイクロ不均一性と高分岐建築のため重要な合成挑戦を表します。保護を慎重に選択グループ ビルディング ブロック、アノマー中心とプロモーターの適切な使用に選択性を達成するための反応性を調整する/activator(s) 複雑なオリゴ糖の合成における重要な要素です。N型糖鎖の合成を進める作業の偉大な量が報告された複雑なこの問題を解決するために最近3,4。これらの堅牢なアプローチにもかかわらず、(〜 20,000) 残る主要な挑戦のN型糖鎖の広い範囲の準備のための効果的な方法を見つけること。

広範な遺伝的多様性と中和抗体から脱出する能力を達成するために HIV-1 の急速な突然変異率は HIV 15,6に対して安全と予防ワクチンの開発に最大の課題の一つです。,7. HIV を使用してホストの免疫反応を回避する 1 つの効果的な戦術は多様なN封筒糖蛋白質 gp120 の翻訳後修飾糖鎖-ホスト糖機械8から派生した糖鎖のリンク 9。人間の萌芽期の腎臓 (HEK) 293 t 細胞からの組換えの単量体 1 HIV gp120 糖鎖の精密解析に関する最近の報告書は、セル固有の特徴10構造異種性の発生を示唆しています。,11,12します。 したがって、HIV-1 bNAbs の糖鎖特異性も特徴と gp120 が必要です理解関連N型糖鎖構造解析のための十分な量で。

糖鎖マイクロ アレイの技術の発見は、炭水化物結合蛋白質、ウイルス/細菌アドヘシン、毒素、抗体、および lectines1314,の多様な範囲の特異性の高スループットに基づく探査を提供.アレイ チップ ベース形式で体系的な糖鎖の配置は、多価プレゼンテーション15,16,17,18まで問題となる低親和性タンパク質糖鎖の相互作用を決定でした。このチップに基づく糖鎖の配置が効果的に細胞インターフェイスを模倣する便利に表示されます。技術を豊かにし従来の配列形式に関連付けられているムラの問題を克服する、私たちのグループは最近ホスホン酸終わった糖鎖を使用して信号強度を高めるのに酸化アルミニウム コーティング ガラス (ACG) スライドの糖鎖アレイを開発均一性、そして感度19,20。

新たに単離した HIV 1 広く中和抗体 (bNAbs) の糖鎖エピトープに関する現在の理解を向上させるため、我々 はNの広範な配列の準備のための高効率モジュール戦略を開発している-リンク糖鎖21 、、ACG に印刷される22スライド (図 1参照)。ACG 配列の HIV-1 bNAbs のプロファイリング研究を提供して非常に強力な bNAb HIV からが分離された PG9 のヘテロ糖鎖連結動作の異常検出感染個人23,24,25特異性。

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Protocol

1. D1, D2 の準備アーム モジュール22

  1. 中間 2 の準備
    1. 材料1 (図 2 p-methoxyphenyl-O-2-acetamido-2-deoxy-β-D-glucopyranosyl-(1→2)-α-D-mannopyranoside (100 mg、0.204 ミリ モル) で表示) 15 mL チューブに開始の重量を量るし、含む Tris バッファー (25 mM、pH 7.5) に溶解マンガン塩化 (MnCl2, 10 mM) 5 mM の最終的な糖濃度を達成するために。
    2. ウリジン二リン酸ガラクトース (UDP-Gal) の 2 の同等物を追加します。
    3. 酵素 β-1、牛乳から 4 ガラクトシル トランスフェラーゼの 150 単位を追加し、37 oC 15 時間で混合物を孵化させなさい。
    4. 実行後、15 h で、薄層クロマトグラフィー (TLC) TLC プレートに反応混合物をスポッティングの開始材料の総消費量を示すため、 nを開発-ブタノール/酢酸/水 (H2O) 1:1:1 比とによる染色、暖房に先行 0.25 M セリウム アンモニウム モリブデン酸のソリューションです。90 oC 5 分で加熱することにより反応を消すし。
    5. 3 分間 2,737 x g の速度で反応混合物を遠心し、ポリアクリルアミドゲルの列の上部に上清を読み込む (材料の表を参照してください)。脱イオン蒸留水を使用して列を溶出し、1-2 の mL の小数部を持つ製品を収集します。
    6. TLC26、 nの開発によって収集された分数を監視-ブタノール: H2o: 酢酸 1:1:1 の比率と暖房に先行セリウム アンモニウム モリブデン酸の溶液で染色します。白い粉として27中間 2 (115 mg, 86%) を取得する分数を含む製品を凍結乾燥します。NMR28と質量29 (データの補足ファイルを参照) によって製品を特徴付けます。
  2. 中間 3 の準備
    1. 開始材料2 (図 2 p-methoxyphenyl-O-β-D-galactopyranosyl-(1→4)-2-acetamido-2-deoxy-β-D-glucopyranosyl-(1→2)-α-D-mannopyranoside (80 mg, 0.122 モル) で表示) 15 mL チューブの重量を量るし、トリスを溶かすバッファー (25 mM、pH 7.5) 含む MnCl2 (10 mM) 5 mM の最終的な糖濃度を準備します。
    2. グアノシン 5'-diphospho-β-L-フコース ナトリウム塩 (GDP-フコース) 2 同等物を追加します。
    3. 酵素 α-1、ピロリ菌(Hp1 3FTΔ26695) から 3 フコシル トランスフェラーゼの 150 単位を追加し、37 oC 15 時間で混合物を孵化させなさい。
    4. 1.1.4 の手順に従ってください。
    5. 1.1.5 の手順に従ってください。
    6. 白い粉として 1.1.6 中間3 (82 mg, 84%) を取得するための手順に従ってください。NMR、質量分析法 (参照してください補足データ ファイル) によって製品を特徴付けます。
  3. 4、5 モジュールの準備
    1. 化合物2、 p-methoxyphenyl-O-β-D-galactopyranosyl-(1→4)-2-acetamido-2-deoxy-β-D-glucopyranosyl-(1→2)-α-D-mannopyranoside (0.230 g、0.360 モル) または化合物3 p- の重量を量るmethoxyphenyl-O-β-D-galactopyranosyl-(1→4)-[α-L-fucopyranosyl-(1→3)-2-acetamido-2-deoxy-β-D-glucopyranosyl]-(1→2)-α-D-mannopyranoside (0.100 g、0.125 ミリ モル) 25 mL 単一首丸底フラスコに 30 分間の真空下でドライ。
    2. 真空からフラスコを取り外し、窒素ガスでそれを埋める、電磁攪拌棒を追加、ゴム中隔とキャップ、窒素風船を取り付けます。
    3. 0 oC. 炒め 600 700 rpm で磁性攪拌器を使用して室温で 12 h の結果として得られる反応で氷浴にフラスコに乾燥ピリジンの 7 mL と無水酢酸 (Ac2O) の 3 mL を注入します。回転を使用して溶媒を蒸発させる 0 - 真空圧蒸発器 50 oc 以上で 10 mbar
    4. (DCM) ジクロロ メタン 30 mL を使用して原油の混合物を希釈し、飽和水溶液ナトリウム炭酸水素 (NaHCO3) 抽出 (2 x 20 mL) 50 mL, 漏斗に。
    5. DCM (3 x 15 mL) の水層を再抽出した有機層を硫酸ナトリウム上乾燥.濾過により硫酸ナトリウムを削除し、DCM (5 mL) で洗浄します。400 mbar 真空圧 40 oC. ロータリーエバポレーターを使用して溶媒を蒸発させる
    6. 原油の混合溶液をシリカのベッドの上に DCM の 2 mL に読み込みます。
    7. トルエンとアセトン トルエンに 0 - 20% アセトンからを含む混合物で列を溶出し、5-10 mL の分数を収集します。
    8. トルエン ・ アセトンで開発 TLC (手順 1.1.4 および 1.1.6) によって収集された分数を監視 (7/3)、ホット プレート加熱後はセリウム アンモニウム モリブデン酸の溶液で染色します。
    9. それぞれ 72% と 85% の利回りで白い泡として目的の製品を得るため、ロータリーエバポレーターを使用して分数を含む製品を蒸発させます。
    10. 製品を 7 mL のアセトニ トリルに溶解: トルエン: H2O 4:25 mL の丸底フラスコに 2:1 の比率。
    11. 0 o氷浴を使用して C に冷却しながら硝酸セリウム アンモニウム (2 同等) を追加します。500 〜 800 rpm で 3 時間室温で反応をかき混ぜます。
    12. TLC の開始材料の総消費量後 (TLC トルエン ・ アセトンで開発 (7/3) 254 UV 吸光度による可視化と nm、暖房に先行セリウム アンモニウム モリブデン酸の溶液で染色)、反応混合物を希釈酢酸エチル (30 mL) と (15 x 2 mL) H2O で抽出。
    13. 5 ml の飽和食塩水 (NaCl) の結合された有機層を抽出します。
    14. 240 mbar 真空圧 40 oC. ロータリーエバポレーターを使用して溶媒を蒸発させる
    15. シリカのベッドの上に DCM の 2 mL に原油製品のソリューションを読み込みます。トルエンとアセトン (0 - 20% アセトン トルエン) を含む混合物で列を溶出し、5-10 mL の分数を収集します。トルエン ・ アセトンで開発、TLC により収集された分数を監視 (7/3)。
    16. 77 mbar 真空と 40 oC 白発泡体として目的の製品を得るために回転蒸発器を用いて製品を含む画分を蒸発させます。
    17. それぞれのアルコールを 25 mL 単一首丸底フラスコと-30 oc. にクールで DCM の 10 mL に溶解します。
    18. グラムジエチルアミノ三 (DAST、2 同等物) を追加します。-30 oC 2 h のために反応混合物をかき混ぜなさい。
    19. TLC の開始材料の消費後 (トルエン ・ アセトンで開発 TLC (4/1) 254 UV 吸光度による可視化と nm、暖房に先行セリウム アンモニウム モリブデン酸の溶液で染色)、DCM (30 mL) の反応混合物を希釈、洗濯は飽和 NaHCO3 (15 x 2 mL)。
    20. 飽和塩化ナトリウム溶液の 5 mL の結合された有機層を抽出、無水硫酸マグネシウムを追加することによって乾燥、次の DCM (5 mL) で洗浄混合物をフィルター処理、100 mL 単一首丸底フラスコに集めます。
    21. 400 mbar 真空圧 40 oC. ロータリーエバポレーターを使用して溶媒を蒸発させる
    22. シリカのベッドの上に DCM の 2 mL の原油製品のソリューションを読み込みます。トルエンとアセトン (0 20% アセトン トルエン) の混合物と 5-10 mL の収集分数列を溶出します。
    23. トルエン ・ アセトンで開発、TLC により収集された分数を監視 (7/3)。
    24. ロータリーエバポレーターを使用して希望の製品4、 [2,3,4,6-O-tetraacetyl-β-D-galactopyranosyl]-(1→4)-[3,6-O-diacetyl-2-acetamido-2-deoxy-β-D-glucopyranosyl]-(1→2)-3,4,6-を取得する分数を含む製品を蒸発します。O オプティカルコンポーネント α D mannopyranosyl フッ化物 (2 つのステップに 54%)、 5、 [2,3,4,6-O-tetraacetyl-β-D-galactopyranosyl]-(1→4)-[2,3,4-O-triacetyl-α-L-fucopyranosyl-(1→3)-3,6-O-diacetyl-2-acetamido-2-deoxy-β-D-glucopyranosyl]-(1→2)-3,4,6-O-triacetyl-α-D-mannopyranosyl フッ化物 (2 つのステップで 67%) 白色固体として。
    25. NMR、質量分析法 (参照してください補足データ ファイル) によって製品を特徴付けます。

2. 糖鎖 10 の準備

  1. 中間 7 の準備
    1. 銀トリフラート (AgOTf) (0.039 g、0.155 モル) bis(cyclopentadienyl)hafnium(IV) 二塩化 (Cp2要約2) (0.041 g、0.108 mmol) の重量を量る 25 mL 単一首丸底フラスコに、30 分間 schlenk ライン真空下で乾燥、それからを削除、真空、窒素ガスでそれを記入してください。
    2. AgOTf と Cp2要約2を含むフラスコに、新鮮な乾燥 4 Å モレキュラーシーブス (0.2 g) を転送、a 磁気攪拌棒を追加、鼻中隔と、すぐにキャップおよび a 窒素風船を追加します。
    3. 乾燥したガラスの注射器とフラスコに 3 mL の乾燥トルエンを転送します。室温で 1 時間反応混合物を攪拌し、0 oc 以上に冷却してから
    4. ドナー 4 (図 2、0.043 g、0.046 モル) と受容体65-Azidopentyl-O-2-O-acetyl-4,6-O-benzylidine-β-D-mannopyranosyl-(1→4)-O-(3,6-di-O-benzyl-2-deoxy-2-(2,2,2-trichloroethoxy) の溶液を注入して0 から 10 mL 注射器を使用して隔壁を通してフラスコに 3 mL のトルエンの carbonylamino-β-D-glucopyranosyl)-(1→4)-O-3,6-di-O-benzyl-2-deoxy-2-(2,2,2-trichloroethoxy)carbonylamino-β-D-glucopyranoside (図 3, 0.045 g, 0.031 モル)oC. 3 時間室温で反応混合物をかき混ぜなさい。
    5. TLC の出発原料の消費後 (TLC、DCM/アセトン (8.5/1.5) で開発と 254 で紫外線吸光度によって可視化 nm、暖房に先行セリウム アンモニウム モリブデン酸の溶液で染色)、注入 10 によって反応を抑制トリエチルアミンの同等のもの。
    6. 50 mL の丸底フラスコにセライト ベッドを通して分子ふるいをフィルター、さらに酢酸エチル 10 mL で洗います。水性 NaHCO3 (2 x 20 mL) 50 mL, 漏斗での飽和溶液とした有機層を抽出します。酢酸エチル (3 x 15 mL) で水層を抽出します。
    7. 飽和塩化ナトリウム溶液 (5 mL) を合わせた有機層を抽出、無水硫酸マグネシウムを使用して乾燥、硫酸マグネシウムを削除、酢酸エチル (3 x 15 mL) で洗浄し、100 mL の丸底フラスコに濾液を収集する混合物をフィルター処理します。
    8. 240 mbar 真空圧 40 oC. ロータリーエバポレーターを使用して溶媒を蒸発させる
    9. シリカ ベッド ・ コラムの上に DCM の原油製品のソリューションを読み込みます。DCM とアセトン (DCM で 0-10% アセトン) を含む混合物で列を溶出し、5-10 mL の分数を収集します。
    10. DCM/アセトン (8.5/1.5) で開発、TLC により収集された分数を監視します。ロータリーエバポレーターを使用して中間7、 5-Azidopentyl-O-{[2,3,4,6-O-tetraacetyl-β-D-galactopyranosyl]-(1→4)-[3,6-O-diacetyl-2-acetamido-2-deoxy-β-D-glucopyranosyl]-(1→2)-[を取得する製品を含む画分を蒸発します。3,4,6-O-triacetyl-α-D-mannopyranosyl]}-(1→3)-[2-O-acetyl-4,6-O-benzylidine-β-D-mannopyranosyl-(1→4)-O-(3,6-di-O-benzyl-2-deoxy-2-(2,2,2-trichloroethoxy)carbonylamino-β-D-glucopyranosyl)-(1→4)-O-3,6-di-O-benzyl-2-deoxy-2-(2,2,2-trichloroethoxy) carbonylamino-β-D-グルコピラノシド (0.052 g、70%)、白い泡として。
    11. NMR、質量分析法 (参照してください補足データ ファイル) によって製品を特徴付けます。
  2. 中間 8 の準備
    1. 25 mL 単一首丸底フラスコに hexasaccharide 7 (図 3, 0.040 g 0.016 ミリ モル) の重量を量る、1 h の真空下で乾燥、真空から削除、窒素ガスでそれを埋める、電磁攪拌棒を追加、ゴムキャップとキャップします。
    2. Acetonitrile:methanol (メタノール) (2:1 の比率) の 3 mL をフラスコに転送します。
    3. Pを追加-トルエンスルホン酸一水和物 (0.001 g、0.008 モル) 反応フラスコにかき混ぜる 5 時間 800 rpm で反応。
    4. TLC の開始材料の消費後 (TLC、DCM/アセトン (8.5/1.5) で開発と 254 で紫外線吸光度によって可視化 nm、暖房に先行セリウム アンモニウム モリブデン酸の溶液で染色)、注入 10 によって反応を抑制トリエチルアミンの同等のもの。
    5. 337 mbar 真空圧 40 oC. ロータリーエバポレーターを使用して溶媒を蒸発させる
    6. DCM の約 2 mL と原油の混合物を溶解し、シリカ ベッドの上にロードします。
    7. DCM とアセトン (DCM で 0 - アセトン 10%) の混合物と 5-10 mL の収集分数列を溶出します。DCM/アセトン (8.5/1.5) で開発、TLC により収集された分数を監視します。400 mbar の真空および 40 oC. ロータリーエバポレーターを使用して溶媒を蒸発させる
    8. 中間8 5 を与えるため減圧残渣を乾燥-Azidopentyl-O-(2-O-acetyl-3,4,6-tri-O-benzyl-ced pressure to give →3)-2-O-アセチル-4、6-O-benzylidine-β - d-mannopyranosyl-(1→4) - O-(3, 6-di-O-benzyl-2-deoxy-2-phthalimido-β-D-glucopyranosyl)-(1→4)-O-3,6 - di-O-benzyl-2-deoxy-2-phthalimido-nzyl-2-deoxy-2-phth。(図 3、0.022 g 57%) 白色固体として。NMR、質量分析法 (参照してください補足データ ファイル) によって製品を特徴付けます。
  3. 中間 9 の準備
    1. 中間9 (図 3) の準備は、ドナー 5 (0.015 g、13.2 µmol) およびアクセプター 8 (図 3、0.020 g 8.80 µmol) を使用して達成されました。
    2. AgOTf (0.011 g、44.1 µmol) と Cp2要約2 (0.012 g, 30.8 µmol) は、休眠打破として使用されました。
    3. 2.1.1 に 2.1.10 中間9 5 を取得する手順を実行します-Azidopentyl - O-{[2,3,4,6-O-tetraacetyl-β-D-galactopyranosyl]-(1→4)-[3,6-O-diacetyl-2-acetamido-2-deoxy-β-D-glucopyranosyl]-(1→2)-[3,4,6-O-triacetyl-α-D-mannopyranosyl]}-(1→3)-{2,3,4,6-O-tetraacetyl-β-D-galactopyranosyl]-(1→4)-[2,3,4-O-triacetyl-α-LS160fucopyranosyl-(1→3)-3,6-O-diacetyl-2-acetamido-2-deoxy-β-D-glucopyranosyl]-(1→2)-3,4,6-O-triacetyl-α-D-mannopyranosyl}-(1→6)-[2-O-acetyl-β-D-mannopyranosyl-(1→4)-O-(3,6-di-O-benzyl-2-deoxy-2-(2,2,2-trichloroethoxy)carbonylamino-β-D-glucopyranosyl)-(1O-benzyl-2-deoxy-2-(2,2,2-trichloroethoxy)carbonylamino-β-D-glucopyranosyl)-D-glucopyra (0.010 g, 34%), as白い泡。
  4. 中間の世界的な脱保護
    1. 25 mL 単一首丸底フラスコに化合物9 (0.010 g、2.9 µmol) の重量を量る、電磁攪拌棒、ゴムキャップ、キャップを追加、窒素風船を取り付けます。
    2. 1, 2 mL に転送 4 ジオキサン: H2O (4:1) フラスコに。フラスコには、水酸化リチウム (LiOH) (0.005 g、重量 50%) を追加します。90-100 oC 12 h で反応混合物を攪拌し、室温冷却します
    3. ロータリーエバポレーターを使用して溶媒を蒸発させると 1 時間真空下でフラスコを乾燥、窒素でそれを埋める、真空マニホールドからそれを削除し、ゴムキャップとキャップします。
    4. 室温 12 h 0 oC. 攪拌反応混合物で 10 mL のシリンジを使用して隔壁を通してフラスコに 4 mL 乾燥ピリジン、無水酢酸 2 mL を注入します。
    5. 0-10 mbar 真空圧 50 oC. ロータリーエバポレーターを使用して溶媒を蒸発させる
    6. DCM の 30 mL を使用して原油の混合物を溶解し、飽和水溶液 NaHCO3 (2 x 20 mL) 50 mL, 漏斗でソリューションを展開します。
    7. DCM (3 x 15 mL) の水層を再抽出します。ロータリーエバポレーターを使用して溶媒を蒸発させます。
    8. DCM の C18 シリカ ベッドの上に約 2 mL の製品のソリューションを読み込みます。水とメタノールの混合物を持つ列を溶出 (0 - 水メタノール 100%) し、5-10 mL の分数を収集します。
    9. 製品分数を収集し、白い泡として目的の製品を得るための減圧下で蒸発します。
    10. 製品を 25 mL の丸底フラスコに乾燥メタノール 5 mL に溶解してゴム隔壁とキャップします。
    11. 0 o氷浴を使用して C にメタノールとクールでナトリウムメトキシド (NaOMe) の 0.1 mL を転送し、12 h の混合物をかき混ぜます。
    12. ロータリーエバポレーターを使用して溶媒を除去し、高真空下で製品を乾燥します。
    13. 5 mL のメタノールの粗製品を溶解: H2o: 酢酸 (6:3:1)。
    14. 水酸化パラジウム (Pd(OH)2) を追加 (50 wt %)、15 h の水素気球を用いた水素雰囲気中での反応をかき混ぜます。
    15. セライト ベッドを通して反応をフィルターし、dd 水 2 mL に続いて 2 mL のメタノールで洗浄します。
    16. ロータリーエバポレーターを使用して溶媒を蒸発させます。
    17. 約 1 mL の水と原油の混合物を溶解し、ポリアクリルアミドゲルのベッドの上に読み込み (材料の表を参照してください)。水で製品を溶出し、1-2 の mL の分数を収集します。
    18. TLC によって収集された分数を監視し、 nを開発-ブタノール: H2o: 酢酸 (1:1:1)。
    19. 製品分数を収集し、目的の製品10、 5-Aminopentyl-β-D-galactopyranosyl-(1→4)-2-acetamido-2-deoxy-β-D-glucopyranosyl-(1→2)-α-D-mannopyranosyl]-(1→3),-[β-D-galactopyranosyl-(1→4)-(を得るため凍乾α-L-fucopyranosyl-(1→3)-2-2-acetamido-2-deoxy-β-D-glucopyranosyl)-(1→2)-α-D-mannopyranosyl]-(1→6)-β-D-mannopyranosyl-(1→4)-2-acetamido-2-deoxy-β-D-glucopyranosyl-(1→4)-2-acetamido-2-deoxy-β-D-glucopyranoside (0.002 g, 36%), as a白色の粉末。
    20. NMR、質量分析法 (参照してください補足データ ファイル) によって製品を特徴付けます。

3 ホスホン酸尾19,22と糖鎖の調製

  1. 5 mL の丸底フラスコにそれぞれ糖 (2-5 µmol) の重量を量る、電磁攪拌棒を追加し、ゴムキャップとキャップします。
  2. たて干しジメチルホルムアミドの 400 μ L を転送します。
  3. 追加 [2 (2 (2 (ビス (ベンジルオキシ) リン酸化) ethoxyethoxy) (2, 5-dioxopyrrolidin1-イル) エチル炭酸] (10-25 µmol、家で準備) 糖鎖のソリューション。5 h の 800 rpm で混合物をかき混ぜます。
  4. 5-10 mbar 真空圧 40 oC. ロータリーエバポレーターを使用して溶媒を蒸発させる
  5. 0.5 mL の水に反応混合物を溶解し、ポリアクリルアミドゲル ベッドの上部にロード (材料の表を参照してください)。水を使用して製品を溶出し、1-2 の mL の分数を収集します。
  6. TLC26によって収集された分数を監視します。TLC プレートに反応混合物をスポットし、汚れ 0.25 M セリウム アンモニウム モリブデン酸; のソリューションを追加ホット プレートを用いる加熱によるに従ってください。分数を含む製品を収集し、白い粉として目的の製品を得るため凍乾します。
  7. 2 mL の水で製品を溶解し、Pd (オハイオ州)2 (重量の 50%) を追加します。15 h の水素気球を用いた水素雰囲気下で 800 rpm で反応をかき混ぜます。
  8. フラックス焼成層反応をフィルター処理および脱イオン蒸留水 2 mL に続いて 2 mL のメタノールで洗浄します。300 mbar 真空圧 40 oC. ロータリーエバポレーターを使用して溶媒を蒸発させる
  9. 約 1 mL の水と原油の混合物を溶解し、ポリアクリルアミドゲルのベッドの上に読み込み (材料の表を参照してください)。
  10. 水で製品を溶出し、1-2 の mL の分数を収集します。TLC26によって収集された分数を監視します。分数を凍乾 (液体窒素を使用して製品を凍結し、真空下でエアカーテンに) 白い粉として目的の製品を得るため。NMR、質量分析法 (参照してください補足データ ファイル) D2O を溶媒として使用して製品を特徴付けます。

4. 糖鎖アレイ

  1. スライド ガラス (ACG スライド) を被覆アルミニウムの作製19,20,22
    注: スライド アルミ コーティング ガラスの作製は、薄いフィルム技術部門、機器技術研究センター、国立応用研究所、新竹サイエン スパーク、台湾で行われました。
    1. パックをスライドに塗った、ナオの形成を防止して陽極酸化表面の電気化学反応までシールを保つ真空シール。
  2. アルミの表面に陽極酸化コーティング スライド ガラス19,20,22
    1. 4 ° C の低温インキュベーターを設定します。0.3 M のシュウ酸水溶液を準備し、氷浴でそれを保ちます。500 mL ビーカーを取る、磁気スターラー バーを追加します。
    2. 0.3 M のシュウ酸を 500 mL のビーカーに転送し、ソリューションに陰極として 10 cm 長いプラチナ ロッドを配置します。陽極酸化プロセス全体でシュウ酸 (300 の rpm) で混ぜ続けます。
    3. ラボのトレーサーのソフトウェアを有効に、「セットアップ」ボタン、「選択スイープ電圧を機能」をクリック開始を設定、25.8 V、100、1 に対応するポイントの数に電圧を停止し 1,200 ms 遅延時間を掃引し、クリックして"ok"。
    4. カソードに向かってアルミ コーティング ガラス側をクランプします。「テスト実行」ボタンをクリックします。電流測定 (8 〜 10 mA) を観察します。
    5. 表面の陽極酸化後二重蒸留水で十分にスライドを洗って、乾燥窒素ガスでパージし、さらに使用まで 30% の相対湿度チャンバーに保管します。
  3. ACG 作製糖鎖マイクロ アレイ22
    1. 10 mM の濃度でエチレング リコールで個別にすべて一価多糖体 (- 11 世) の 100 μ L を準備します。
    2. 印刷バッファー (80% エチレング リコール, 20% 脱イオン水) と上記の糖鎖を希釈すると、100 μ M の濃度を確認します。
    3. ヘテロ配位子に関する個別 XI 糖鎖の 5 μ L を準備し、それぞれに男5GlcNAc2 (1:1) の 5 μ L を追加します。
    4. 0.6 の蒸着によるロボットによって印刷のマイクロ アレイ ピン (材料表参照) ACG に事前に準備された糖鎖の nL スライド31。
    5. 結合の試金する前に湿度制御ドライ ボックスで印刷スライドを格納します。
  4. HIV 1 広く中和抗体 PG9 の糖鎖エピトープ マッピング22
    1. 1 ml 含まれている BSA PBST バッファー、3 w/v。
    2. PG9 の 70 μ L を準備 (50 μ g/mL) PBST バッファー内 (BSA PBST バッファー、3 w/v が含まれている)。
    3. ロバ抗ひと IgG (Alexa Fluor 647 共役) 二次蛍光タグ抗体の 120 μ L を準備 PBST バッファーで 50 μ g/mL (BSA に含まれる PBST バッファー、3 w/v) 暗闇の中で。
    4. 一次抗体 (PG9) と 1:1 の比率 (各 60 μ L) で二次蛍光タグ抗体を混ぜます。4 ° C で 30 分間予混合抗体を孵化します。
    5. 16 井戸に分けられるスライド培養室に ACG スライドをロードします。糖鎖アレイに予混合抗体の 100 μ L を転送し、, 16 h のための 4 ° C で。
    6. 予混合抗体をピペットで移しなさい。スライド培養室を削除します。
    7. PBST バッファーでまずスライドを洗う (PBS と 0.05% Tween 20)、脱イオン水とスピンで 2,000 x g で乾燥が続く。
    8. マイクロ アレイ画像の解析ソフトウェアを開く (材料の表を参照してください)。下向きアレイ機能のスライドを挿入します。
    9. 「設定」メニューをクリックして、画像解像度を設定、ピクセルあたり 5 μ m、波長 635 nm PMT450 と 100% まで。
    10. スライドをイメージングを開始する「スキャン」ボタンをクリックします。
    11. Tif 形式でスキャン画像を保存する「ファイル」アイコンをクリックしてします。
    12. 画像解析を実行するには、次のソフトウェアのユーザー ガイド32。
    13. 蛍光量の合計を計算し、画像処理ソフトウェア33を使用して表現 (材料の表を参照してください)。
      注: ここでは、すべてのデータ ポイントの割合の平均値エラーは誤差範囲が表示されます。

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Representative Results

さまざまなN 型糖鎖の合成のためのモジュラー化学酵素の作戦は、図 1で示されます。戦略は、3 -Oおよび/または 6 -Oで α 固有マンノシル化に続いて、3 つの重要なモジュールの化学酵素合成法による初めの多様性を作成ことができますという事実に基づく共通のマンノース残基の位置N型糖鎖のコア三糖類です。Bi、トリ、テトラ antennary 複合型N型糖鎖構造の構造多様性を考慮した oligosaccharyl ドナーとプリインストールされているアルキル handlecould とコア三糖類受容体のセットの開始として使用することを信じた目的の構造多様性 (図 1) を生成するための材料。糖供与体フッ化物複雑な糖鎖のライブラリを構築する上での有効性は以前21を実証されています。

当社の戦略の有効性を示すためには、bi antennary の異性体構造 (10 図 3) は、合成に選ばれました。D1 の腕のアンテナ4と D2 腕アンテナ5糖鎖10の化学酵素法による大規模なスケールで生成されました。特に、二糖類受容体1は酵素によって galactosylated 三糖類2を形成する β 1, 4 ガラクトース転移酵素、ウリジン 5'-diphosphogalactose (UDP Gal) を使用しています。次に、中級2は α-1, 3-井本ピロリ菌(Hpα1、3 フィート) 目的四3を支払うことからの存在の GlcNAc 3-Oの位置に次にだった。コアに化学 ligation のビルディング ブロック2と3が最初の peracetylated、削減エンドp- メトキシ フェノール グループが削除されました。最後に、フッ化物が目的のモジュール4と5をそれぞれ取得する DAST の存在下でインストールされた (図 2)。

該当するモジュールを手で持つ、次に、銀トリフラートとそれぞれ hexasaccharide 7 を提供する hafnocene 二塩化の触媒下でコア三糖類6に4の立体選択的 3 -O糖鎖(図 3)。4、6 オハイオをマスキングで触媒pを使用してを削除されましたベンジリデン保護-トルエンスルホン酸 (p- TSA)。必要な decasaccharide 9を達成するために同様の実験条件下でフッ化物モジュール5と反応したその反応性、主な 6- 8の OH を活用します。最後に、糖鎖は10NMR、質量分析法 (補足データ ファイルを参照してください) を使用してさらに特徴付けられたを取得するグローバル脱保護を行った。

糖鎖の還元末端のペンチル アミン尾を含むホスホン酸リンカーにホスホン酸化学 (図 4) を介して ACG 表面に付着しました。最後に、HIV-1 の bNAb で PG9 ホモ型とヘテロ糖鎖アレイを使用する初めて PG9 1 HIV gp120 表面 (図 5) の V1 と V2 のループに隣接する heteroglycans との交流を示す糖鎖特異性をスクリーニングを行った。

Figure 1
図 1: N型糖鎖の準備のための一般的なモジュラー戦略。(A) N型糖鎖のこの戦略によって生成される一般的人間の糖タンパク質で発生する数は 20,000 を超えると推定されます。(B)これにより化学酵素 α メタマテリアル グリコシル化に使用することができます準備モジュールの 3 種類。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

Figure 2
図 2: モジュールの化学的酵素合成します。私、udp-ガラクトース、β 1, 4-ゴルト、15 h、86%;iiGDP-フコース、α 1, 3 フコース転移酵素、15 h、84%;iii、(1) Ac2O、ピリジン、RT、12 h;(1) できますが、ACN: トルエン: H2O, (3) DAST、CH2Cl2-30 oC. できます: 硝酸アンモニウム セリウム;DAST: グラムジエチルアミノ三。
製品名称:1、 p-methoxyphenyl-O-2-acetamido-2-deoxy-β-D-グルコピラノシル-(1→ 2)-α-D-mannopyranoside;2、p-methoxyphenyl-O-β-D-galactopyranosyl-(1→4)-2-acetamido-2-deoxy-β-D-glucopyranosyl-(1→2)-α-D-mannopyranoside;3、p- O-β-D-galactopyranosyl-(1→4)-[α-L-fucopyranosyl-(1→3)-2-acetamido-2-deoxy-β-D-glucopyranosyl]-(1→2)-α-D-mannopyranoside-メトキシフェニル;4、[2,3,4,6-O-tetraacetyl-β-D-galactopyranosyl]-(1→4)-[3,6-O-diacetyl-2-acetamido-2-deoxy-β-D-glucopyranosyl]-(1→2)-3,4,6-O-triacetyl-α-D-mannopyranosyl フッ化物;5、[表示する 2,3,4,6-O-tetraacetyl-β-D-galactopyranosyl]-(1→4)-[2,3,4-O-triacetyl-α-L-fucopyranosyl(1→3)-3,6-O-diacetyl-2-acetamido-2-deoxy-β-D-glucopyranosyl]-(1→2)-3,4,6-O-triacetyl-α-D-mannopyranosyl フッ化をここでクリックしてください、この図の拡大版.

Figure 3
図 3: アクセプターをコアに D1, D2 アーム モジュールの化学糖鎖修飾します。私は、 4AgOTf、Cp2要約2トルエン、RT、70% に 4 Å MS 0 oCii、 p- TSA、アセトニ トリル、RT、57%;iii 5AgOTf、Cp2要約2トルエン、RT、34% に 4 Å MS 0 oCiv(1) LiOH、1, 4-ジオキサン: H2O;90 oC、12 h;(2) Ac2O、ピリジン、12 h;(3) NaOMe、メタノール、12 h;(4) Pd(OH)2, メタノール: H2O: ギ酸 (5:3:2) H236%。AgOTf: 銀 trifluromethanesulfonate。Cp2要約2: ビス (シクロペンタジエニル) ハフニウム塩化、MS: 分子ふるい、製品名称: 75-Azidopentyl-O-{[2,3,4,6-O-tetraacetyl-β-D-galactopyranosyl]-(1→4)-[3,6-O-diacetyl-2-acetamido-2-deoxy-β-D-glucopyranosyl]-(1→2)-[3,4,6-O-triacetyl-α-D-mannopyranosyl]}-(1→3)-[2-O-acetyl-4,6-O-benzylidine-β-D-mannopyranosyl-(1→4)-O-(3,6-di-O-benzyl-2-deoxy-2-(2,2,2-trichloroethoxy)carbonylamino-β-D-glucopyranosyl)-(1→4)-O-3,6-di-O-benzyl-2-deoxy-2-(2,2,2-trichloroethoxy)carbonylamino-β-D-glucopyranosid。8 5-Azidopentyl - O-(2-O-アセチル-3,4,6-トライ-O-benzyl-α-D-mannopyranosyl-(1→3)-2-O-acetyl-4,6-O-benzylidine-β-D-mannopyranosyl-(1→4)-O-(3,6-di-O-benzyl-2-deoxy-2-phthalimido-β-D-glucopyranosyl)-(1→4)-O-3,6-di-O-benzyl-2-deoxy-2-phthalimido-β-D-glucopyranoside。9、 5-Azidopentyl-O-{[2,3,4,6-O-tetraacetyl-β-D-galactopyranosyl]-(1→4)-[3,6-O-diacetyl-2-acetamido-2-deoxy-β-D-glucopyranosyl]-(1→2)-[3,4,6-O-triacetyl-α-D-mannopyranosyl]}-(1→3)-{2,3,4,6-O-tetraacetyl-β-D-galactopyranosyl]-(1→4)-[2,3,4-O-triacetyl-α-LS160fucopyranosyl-(1→3)-3,6-O-diacetyl-2-acetamido-2-deoxy-β-D-glucopyranosyl]-(1→2)-3,4,6-O-triacetyl-α-D-mannopyranosyl}-(1→6)-[2-O-acetyl-β-D-mannopyranosyl-(1→4)-O-(3,6-di-O-benzyl-2-deoxy-2-(2,2,2-trichloroethoxy)carbonylamino-β-D-glucopyranosyl)-(1→4)-O-3,6-di-O-benzyl-2-deoxy-2-(2,2,2-trichloroethoxy)carbonylamino-β-Dglucopyranoside 105-Aminopentyl-β-D-galactopyranosyl-(1→4)-2-acetamido-2-deoxy-β-D-glucopyranosyl-(1→2)-α-D-mannopyranosyl]-(1→3),-[β-D-galactopyranosyl-(1→4)(α-L-fucopyranosyl-(1→3)-2-2-acetamido-2-deoxy-β-D-glucopyranosyl)-(1→2)-Α-D-mannopyranosyl]-(1→6)-β-D-mannopyranosyl-(1→4)-2-acetamido-2-deoxy-β-D-glucopyranosyl-(1→4)-2-acetamido-2-deoxy-β-D-glucopyranosideこの図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

Figure 4
図 4: ACG 配列における糖鎖固定化します。(A)ホスホン酸にアミノ尾を持つ糖鎖の化学修飾は、ホスホン酸化学を通して ACG スライド共有添付ファイルの尻尾します。(B) ACG 表面糖鎖の分布。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

Figure 5
図 5: Glyan 配列解析します。(A)構造合成N型糖鎖の ACG 配列に記されています。(B)糖鎖 i-xi (右側のパネル) 100 μ M の濃度で混合男5の糖鎖の混合物および ACG 配列 (左側のパネル) に印刷された個々 の糖鎖 i-xi に PG9 の解析をバインドします。PG9 μ M のモル濃度は、凡例で示されます。平均信号強度と標準エラー配列に 5 つの独立した複製の計算のとおりです。インセットは、蛍光画像を表示します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

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Discussion

HIV 1 菌株を循環の 70-80% の中和に非常に強力なことは、HIV-1 bNAbs PGTs 128、PG16、PG9 141-145 を含むのクラスが報告されました。これらの bNAbs のエピトープが全体の HIV-1 グループ M の変種の間で非常に節約される、従って彼らは23,抗体中和24,25 を引き出すために HIV ワクチンの有効な免疫原設計をガイドがあります。.、HIV-1 広く中和抗体の糖鎖エピトープを識別するために私たちの継続的な努力の一環としてパネル高マンノース、ハイブリッド、および糖鎖アレイ21、を形成する複合型糖鎖の化学的合成を報告しました。 22。ただし、 N-コーティング (NHS) スライド ガラスに一般的に使用される糖鎖配列がおそらくのために異種の糖鎖の分布の加水分解から生じる低親和性炭水化物蛋白質の相互作用を検出することができます。その表面に反応性N- hydroxysuccimide 機能グループ従来の配列形式の限界を克服するためには、酸化アルミニウム コーティング ガラス (ACG) スライドの糖鎖アレイを開発しました。さらに ACG 配列と一般的に使用される NHS の均一性比較を行ったACG 配列がその表面の22のより均一な糖鎖のプレゼンテーションを提供したことを証明するために配列。私たちの予備的な結合の解析で、PG9 NHS 配列 (データは示されていない) の糖鎖のいずれかのバインディングを観察できませんでした。したがって、PG9 の結合特異性を定義する糖鎖私 XI はホスホン酸の尾に接続されている個々 の糖鎖 (図 4) の 100 μ m ACG スライドの印刷し、されました。ホスホン酸化学を通して ACG スライドにおける糖鎖固定化より安定した、均一な分布を提供しています。5 つのレプリケート、糖鎖のそれぞれ印刷された、スライド画像は DyLight649 共役ロバ抗ひと IgG 抗体の孵化後蛍光スキャンから得られました。PG9 の ACG 配列 (図 5、左パネル) に印刷された個々 の糖鎖への結合解析を PG9 がハイブリッド型糖鎖 (X) と強く相互作用を示唆しています。相互作用も高マンノースのタイプ Man5 検出されました (糖 IV) と複合型糖鎖 (XI)。

PG9 とハイブリッド型糖鎖 (X) 間の相互作用のレベルは、共結晶構造情報の不足のため判断が困難です。3 時で複合型 arm を成るハイブリッド型糖鎖 X-コアと trimannose アームのOの位置にリンク、6 -O中央三の位置します。PG9 の糖鎖ハイブリッド X へのバインドでは、PG9 が高親和性の相互作用のためのすぐ近くにあるマンノースとシアル酸残基を必要とすることを示唆しています。PG9 結合ポケットに適した糖鎖の組み合わせを識別するために混合糖鎖アレイ研究を行った。糖鎖 IV は私 XI 1:1 のモル比でからすべての糖と混合され、ACG 配列の上で発見します。混合物の各 PG9 のバインディングの分析は、男5 SCT (IV + XI) の組合せが IV や XI 単独に比べて PG9 に向かって高い親和性で起因したことを示した。さらに、男5 VIII、X 糖鎖もの還元末端アンテナを含むそれらを含有する混合物には、22が検出されました。初めて、これらの結果は、HIV 1 gp120 V1 と V2 ドメイン23PG9 の結晶構造の研究で示唆された PG9 のヘテロ糖鎖の連結動作のアレイ ・ ベースの証明書を提供しています。

結論としては、非常に多様なNの準備のための効率的なモジュール式化学酵素戦略を示しました-ひと糖蛋白質は、オリゴ糖をリンクします。また、ACG 配列の開発は、非常に弱いタンパク質と糖鎖の相互作用と、さらに重要なは、ヘテロ糖鎖を介して発生する相互作用を決定する有効な手段を提供します。

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Disclosures

著者が明らかに何もありません。

Acknowledgments

著者は、薄いフィルム技術部門、楽器技術研究センター (ITRC) と国立応用研究所、台湾・新竹サイエン スパークにありがとうございます。この作品は、国家科学委員会によって支えられた (付与なし。ほとんど 105-0210-01-13-01) と中央研究院。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acetic acid Sigma Aldrich 64197
Acetonitrile Sigma Aldrich 75058
Acetic anhydride Sigma Aldrich 108247
Anhydrous magnesium sulfate Sigma Aldrich 7487889
Boron trifluoride ethyl etherate Sigma Aldrich 109637
Bovine serum albumin Sigma Aldrich 9048468
Bio-Gel P2 polyacrylamide Bio-Rad 1504118
Bis(cyclopentadienyl)hafnium(IV) dichloride Sigma Aldrich 12116664
β-1, 4 Galactosyl transferases from bovine milk Sigma Aldrich 48279
BioDot Cartesion technology with robotic pin SMP3 (Stealth Micro Spotting Pins) Arrayit
Cerium ammonium molybdate TCI C1794
Cerium ammonium nitrate Sigma Aldrich 16774213
Clean glass slide  Schott 
Cytidine-5′-monophospho-N-acetylneuraminic acid Sigma Aldrich 3063716
Deuterated chloroform Sigma Aldrich 865496
Donkey Anti-Human IgG (Alexa Fluor647 conjugated Jackson Immuno Research, USA 709605098
Dichloromethane Sigma Aldrich 75092
Diethylaminosulfur trifluoride Sigma Aldrich 38078090
Dimethylformamide Sigma Aldrich 68122
Ethyl acetate Sigma Aldrich 141786
Ethylene glycol Acros Organic 107211
FAST frame slide incubation chambers Sigma Aldrich
Guanosine 5'-diphospho-b-L-fucose disodium salt  Sigma Aldrich 15839700
Lab tracer 2.0 software  Section 4 of the Protocol
GenePix Pro 4300A reader (microarray image analysis) moleculardevices www.moleculardevices.com
GraphPad Prism Software (Image processing ) GraphPad Software, Inc http://www.graphpad.com/guides/prism/6/user-guide/
Lithium hydroxide Sigma Aldrich 1310652
Manganese chloride Sigma Aldrich 7773015
Methanol Sigma Aldrich 67561
N-butanol Sigma Aldrich 71363
Oxalic acid Acros Organic 144627
Palladium hydroxide Sigma Aldrich 12135227
Phosphate Buffered Saline Thermo Fisher Scientific  10010023
Pyridine Sigma Aldrich 110861
P-Toluene sulfonic acid monohydrate Sigma Aldrich 773476
Silver triflate Sigma Aldrich 2923286
Sodium bicarbonate Sigma Aldrich 144558
Sodium chloride Sigma Aldrich 7647145
Sodium hydrogen carbonate Sigma Aldrich 144558
Sodium methoxide  Sigma Aldrich 124414
Sodium sulfate Sigma Aldrich 7757826
Toluene  Sigma Aldrich 108883
Tris buffer  Amresco N/A Ultra-pure grade
Tween-20 Amresco 9005645
Uridine diphosphate galactose (UDP-galactose) Sigma Aldrich 137868521

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問題 132 化学化学酵素合成、ACG 糖鎖アレイ HIV 中和抗体、 N型糖鎖プロファイリング、モジュール式アプローチの特異性
<em>N</em>型糖鎖アレイ開発および HIV 抗体のための化学酵素合成プロファイリング
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