Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Chemistry
Click here for the English version

Chemistry

Kemo-enzymatisk syntes av N- glycans för Array utveckling och HIV-antikroppar profilering

Published: February 5, 2018 doi: 10.3791/55855
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Genomics Research Center, Academia Sinica

Summary

Ett modulärt tillvägagångssätt till syntesen av N- glycans för fastsättning på en aluminiumoxid-belagda glas Skjut (ACG bild) som en glycan microarray har utvecklats och dess användning för profilering av en HIV i stort sett neutraliserande antikropp har påvisats.

Abstract

Vi presenterar ett mycket effektivt sätt för snabb beredning av ett brett utbud av N-länkade oligosackarider (beräknas överstiga 20.000 strukturer) som ofta finns på människans glykoproteiner. För att uppnå den önskade strukturella mångfalden, strategin började med kemo-enzymatisk syntesen av tre sorters oligosaccharyl fluor moduler, följt av deras stegvis α-selektiv Glykosyleringar på 3-O och 6-O placerar av den mannos rester av den gemensamma kärnan trisaccharide att ha en avgörande β-mannoside koppling. Vi ytterligare bifogas den N- glycans ytan av en aluminiumoxid-belagda glas (ACG) bild vill skapa en kovalent blandade matris för analys av hetero-ligand interaktion med en HIV-antikroppar. I synnerhet typ bindande beteende nyligen isolerade HIV-1 i huvudsak neutraliserande antikroppar (bNAb), PG9, blandning av tättliggande Man5GlcNAc2 (mannen5) och 2,6-di-sialylated bi-antennary komplex N- glycan (SCT ) på en ACG matris, öppnar en ny väg för att vägleda den effektiva immunogen designen för HIV vaccinutveckling. Dessutom förkroppsligar våra ACG matrisen ett kraftfullt verktyg för att studera andra HIV-antikroppar för hetero-ligand bindande beteende.

Introduction

N- glycans på glykoproteiner är kovalent kopplade till asparagin (Asn) rester av de samförstånd Asn-Xxx-Ser/Thr sequon, som påverkar flera biologiska processer såsom protein konformation, antigenicitet, löslighet och lectin erkännande 1 , 2. den kemiska syntesen av N-länkade oligosackarider representerar en betydande syntetiska utmaning på grund av deras enorma strukturella micro heterogenitet och mycket förgrenade arkitektur. Noggrant urval av skydda grupper för att finjustera Reaktiviteten hos byggstenar, att uppnå selektivitet vid anomera centers och korrekt användning av arrangören / activator(s) är nyckelfaktorer i syntes av komplexa oligosackarider. För att lösa problemet av komplexitet, en stor mängd arbete att avancera N- glycan syntes rapporterades nyligen3,4. Trots dessa robusta metoder, att hitta en effektiv metod för beredning av ett brett utbud av N- glycans (~ 20 000) återstår en stor utmaning.

Den snabba mutationshastighet för HIV-1 att uppnå omfattande genetiska mångfalden och dess förmåga att fly från neutraliserande antikroppssvar, är bland de största utmaningarna att utveckla en säker och profylaktiskt vaccin mot HIV-1-5,6 , 7. en effektiv taktik som HIV använder för att undvika värd immunsvaret är den post-translationella glycosylation av kuvert glykoprotein gp120 med en olika N-länkade glycans härrör från värd glycosylation maskiner8, 9. En färsk rapport angående exakt analys av rekombinant monomer HIV-1 gp120 glycosylation från mänskliga embryonala njurar (HEK) 293T celler tyder på förekomsten av strukturella microheterogeneity med en karakteristisk-specifika mönster10 , 11 , 12. därför förståelse glycan särdragen hos HIV-1 bNAbs kräver väl karakteriserade gp120 med N- glycan strukturer i en mängd som är tillräcklig för analys.

Upptäckten av glycan Mikroarrayteknik förutsatt hög genomströmning-baserade utforskning av särdrag av ett varierat utbud av kolhydrat-bindande proteiner, virus/bakterie adhesiner, toxiner, antikroppar och lectines13,14 . Den systematiska glycans arrangemanget i en klädd chip-baserat format kunde avgöra problematiska låg affinitet protein-glycan interaktioner genom multivalenta presentation15,16,17,18. Detta chip-baserade glycan arrangemang visas bekvämt att effektivt efterlikna cell cell gränssnitt. För att berika tekniken och övervinna den ojämna frågan som är associerad med konventionella array format, utvecklat vår grupp nyligen en glycan matris på en aluminiumoxid-belagda glas (ACG) bild med fosfonsyraderivat syra-slutade glycans för att öka signal intensiteten, homogenitet och känslighet19,20.

För att förbättra den nuvarande förståelsen om glycan epitoper av nyligen isolerade HIV-1 i huvudsak neutraliserande antikroppar (bNAbs), har vi utvecklat en mycket effektiv modulär strategi för beredning av ett brett spektrum av N-länkade glycans21 ,22 ska skrivas på en ACG Skjut (se figur 1). Specificitet profilering studier av HIV-1 bNAbs på en ACG array erbjuds ovanlig upptäckt av hetero-glycan bindande beteende mycket potent bNAb PG9 som isolerades från HIV-infekterade individer23,24,25.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. beredning av D1/D2 Arm moduler22

  1. Beredning av mellanliggande 2
    1. Väga start material 1 (visas i figur 2, p-methoxyphenyl-O-2-acetamido-2-deoxy-β-D-glucopyranosyl-(1→2)-α-D-mannopyranoside (100 mg, 0,204 mmol)) in i en 15 mL tub och lös i Tris buffert (25 mM, pH 7.5) som innehåller mangan-diklorid (MnCl2, 10 mM) för att uppnå en slutlig glycan koncentration på 5 mM.
    2. Lägg till 2 medel av uridin diphosphate galaktos (UDP-Gal).
    3. Tillsätt 150 enheter av enzymet β-1, 4 galactosyl transferaser från komjölk, och inkubera blandningen på 37 oC för 15 h.
    4. Efter 15 h, utföra tunnskiktskromatografi (TK) att indikera Totalförbrukningen av utgångsmaterial av spotting reaktionsblandningen på en TLC-platta, utveckla med n-butanol/ättiksyra/vatten (H2O) i en 1:1:1 ratio och färgning av en lösning 0,25 M cerium ammoniummolybdat följt av värme. Sedan släcka reaktionen av värme på 90 oC i 5 min.
    5. Centrifugera reaktionsblandningen med en hastighet av 2,737 x g i 3 min och ladda supernatanten vid toppen av Polyakrylamidgelen kolumn (se Tabell för material). Eluera kolumnen använda destillerat avjoniserat vatten, och samla produkten med fraktioner av 1-2 mL.
    6. Övervaka de insamlade fraktionerna av TLC26, utveckla med n-butanol: H2O: ättiksyra i en 1:1:1 ratio och färgning av en lösning av cerium ammoniummolybdat följt av värme. Lyophilize27 produkt med fraktioner för att skaffa mellanliggande 2 (115 mg, 86%) som vitt pulver. Karakterisera produkten av NMR28 och massa spektroskopi29 (se kompletterande Data File).
  2. Beredning av mellanliggande 3
    1. Väga start material 2 (visas i figur 2, p-methoxyphenyl-O-β-D-galactopyranosyl-(1→4)-2-acetamido-2-deoxy-β-D-glucopyranosyl-(1→2)-α-D-mannopyranoside (80 mg, 0.122 mmol)) i en 15 mL tub och Lös det i Tris buffert (25 mM, pH 7.5) innehållande MnCl2 (10 mM) att förbereda en sista glycan koncentration av 5 mM.
    2. Lägg till 2 medel guanosin 5'-uridin-β-L-fukos dinatriumsalt (BNP-Fuc).
    3. Tillsätt 150 enheter av enzymet α-1, 3 fucosyl transferaser från Helicobacter pylori (Hp1-3FTΔ26695), och inkubera blandningen på 37 oC för 15 h.
    4. Följ steg 1.1.4.
    5. Följ steg 1.1.5.
    6. Följ steg 1.1.6 skaffa mellanliggande 3 (82 mg, 84%) som vitt pulver. Karakterisera produkten av NMR och massa spektroskopi (se kompletterande Data File).
  3. Beredning av modulerna 4 och 5
    1. Väga sammansatta 2, p-methoxyphenyl-O-β-D-galactopyranosyl-(1→4)-2-acetamido-2-deoxy-β-D-glucopyranosyl-(1→2)-α-D-mannopyranoside (0.230 g, 0.360 mmol) eller sammansatta 3, p- methoxyphenyl-O-β-D-galactopyranosyl-(1→4)-[α-L-fucopyranosyl-(1→3)-2-acetamido-2-deoxy-β-D-glucopyranosyl]-(1→2)-α-D-mannopyranoside (0,100 g, 0,125 mmol) in i en 25 mL singel-hals runda-botten kolven och torka under vakuum i 30 min.
    2. Ta bort kolven från vakuum, fylla den med kvävgas, lägga till en magnetisk uppståndelse, råga med en gummi septum och bifoga en kväve-ballong.
    3. Injicera 7 mL torrt pyridin och 3 mL ättiksyraanhydrid (Ac2O) i kolven placeras på ett isbad på 0 oC. rör resulterande reaktionen för 12 timmar vid rumstemperatur med en magnetomrörare vid 600-700 rpm. Avdunsta lösningsmedel använder en roterande förångare vid ett vakuum tryck på 0 - 10 mbar vid 50 oC.
    4. Späd den obearbetade blandningen med 30 mL diklormetan (DCM) och extrahera med mättad vattenlösning natriumvätekarbonat (NaHCO3) (2 x 20 mL) i en 50 mL separatory tratt.
    5. Extrahera det vattenhaltiga skiktet med DCM (3 x 15 mL) och torka de kombinerade organiska skikt över natriumsulfat. Ta bort natriumsulfat genom filtrering och tvätta med DCM (5 mL). Avdunsta lösningsmedlet med en rotationsindunstare vid 400 mbar vakuum på 40 oC.
    6. Läsa in lösningen av rå blandningen i 2 mL av DCM ovanpå kiseldioxid sängen.
    7. Eluera kolumnen med en blandning som innehåller toluen och aceton från 0 - 20% aceton i toluen och samla fraktioner av 5-10 mL.
    8. Övervaka de insamlade fraktionerna av TLC (steg 1.1.4 och 1.1.6), utveckla med toluen/aceton (7/3), och färgning med en lösning av cerium ammoniummolybdat följt av värme på en värmeplatta.
    9. Avdunsta produkten som innehåller bråk med en rotationsindunstare för att få önskade produkter som vitt skum i 72% och 85% avkastning, respektive.
    10. Lös upp produkterna i 7 mL acetonitril: toluen: H2O i en 4:2:1 förhållande i en 25 mL kolv med rund botten.
    11. Lägg till cerium ammoniumnitrat (2-ekvivalenter) medan nedkylning till 0 oC med ett isbad. Rör om reaktionen i rumstemperatur i 3 h på ~ 500-800 rpm.
    12. Efter TLC indikerar Totalförbrukningen av utgångsmaterial (TLC utveckla med toluen/aceton (7/3) och visualisera genom UV absorbansen vid 254 nm eller genom färgning med en lösning av cerium ammoniummolybdat följt av värme), späd reaktionsblandningen med etylacetat (30 mL) och extrakt med H2O (15 x 2 mL).
    13. Extrahera de kombinerade organiska skikt med 5 mL mättad natriumkloridlösning (NaCl).
    14. Avdunsta lösningsmedlet med en rotationsindunstare vid 240 mbar vakuum på 40 oC.
    15. Läsa in lösningen av rå produkt i 2 mL av DCM ovanpå kiseldioxid sängen. Eluera kolumnen med en blandning som innehåller toluen och aceton (0 - 20% aceton i toluen) och samla fraktioner av 5-10 mL. Övervaka de insamlade fraktionerna av TLC, utveckla med toluen/aceton (7/3).
    16. Avdunsta produkt-innehållande fraktioner med en rotationsindunstare vid 77 mbar vakuum och 40 oC för att få önskade produkter som vitt skum.
    17. Lös de respektiva alkoholerna i 10 mL av DCM i en 25 mL singel-hals runda-botten kolven och coolt att-30 oC.
    18. Lägg till diethylaminosulfur Kvävetrifluorid (DAST, 2 medel). Rör reaktionsblandningen på-30 oC för 2 h.
    19. Efter TLC indikerar konsumtion av utgångsmaterial (TLC utveckla med toluen/aceton (4/1) och visualisera genom UV absorbansen vid 254 nm eller genom färgning med en lösning av cerium ammoniummolybdat följt av värme), späd reaktionsblandningen med DCM (30 mL) , och tvätta med mättad NaHCO3 (15 x 2 mL).
    20. Extrahera det kombinera organiska skiktet med 5 mL mättad NaCl-lösning, torka den genom att lägga till vattenfritt magnesiumsulfat, filtrera blandningen efter en tvätt med DCM (5 mL) och samla ihop det till en 100 mL singel-hals runda-botten kolv.
    21. Avdunsta lösningsmedlet med en rotationsindunstare vid 400 mbar vakuum på 40 oC.
    22. Ladda lösningen av rå produkt i 2 mL av DCM ovanpå kiseldioxid sängen. Eluera kolonnen med en blandning av toluen och aceton (0-20% aceton i toluen) och samla fraktioner av 5-10 mL.
    23. Övervaka de insamlade fraktionerna av TLC, utveckla med toluen/aceton (7/3).
    24. Avdunsta produkten som innehåller bråk med en rotationsindunstare för att få önskade produkter 4, [2,3,4,6-O-tetraacetyl-β-D-galactopyranosyl]-(1→4)-[3,6-O-diacetyl-2-acetamido-2-deoxy-β-D-glucopyranosyl]-(1→2)-3,4,6- O-triacetyl-α-D-mannopyranosyl fluor (54% över 2 steg) och 5, [2,3,4,6-O-tetraacetyl-β-D-galactopyranosyl]-(1→4)-[2,3,4-O-triacetyl-α-L-fucopyranosyl-(1→3)-3,6-O-diacetyl-2-acetamido-2-deoxy-β-D-glucopyranosyl]-(1→2)- 3,4,6-O-triacetyl-α-D-mannopyranosyl fluor (67% över 2 steg) som vita fasta ämnen.
    25. Karakterisera produkten av NMR och massa spektroskopi (se kompletterande Data File).

2. förberedelse av Glycan 10

  1. Beredning av intermidiate 7
    1. Väga silver triflate (AgOTf) (0,039 g, 0.155 mmol), bis(cyclopentadienyl)hafnium(IV) diklorid (Cp2HfCl2) (0,041 g, 0,108 mmol) i en 25 mL singel-hals runda-botten kolv, torka den under schlenk linje vakuum för 30 min, ta bort det från den Dammsug, och fyll den med kvävgas.
    2. Överföra de nyligen torkad 4 Å molekylsiktar (0.2 g) i kolven som innehåller den AgOTf och Cp2HfCl2, lägga till en magnetisk uppståndelse bar, keps med septum omedelbart och lägga till en kväve ballong.
    3. Överför 3 mL torrt toluen i kolven med en spruta torrt glas. Rör om reaktionsblandningen för 1 h i rumstemperatur och sedan svalna till 0 oC.
    4. Injicera en lösning av givare 4 (figur 2, 0,043 g, 0.046 mmol) och acceptor 6, 5-Azidopentyl-O-2-O-acetyl-4,6-O-benzylidine-β-D-mannopyranosyl-(1→4)-O-(3,6-di-O-benzyl-2-deoxy-2-(2,2,2-trichloroethoxy) carbonylamino-β-D-glucopyranosyl)-(1→4)-O-3,6-di-O-benzyl-2-deoxy-2-(2,2,2-trichloroethoxy)carbonylamino-β-D-glucopyranoside (figur 3, 0,045 g, 0,031 mmol) i 3 mL toluen i kolven genom septum med en 10 mL spruta vid 0 o C. rör reaktionsblandningen i rumstemperatur i 3 h.
    5. Efter TLC indikerar konsumtion av utgångsmaterial (TLC, utveckla med DCM/aceton (8,5/1,5) och visualisera genom UV absorbansen vid 254 nm eller genom färgning med en lösning av cerium ammoniummolybdat följt av värme), släcka reaktionen genom att injicera 10 medel triethyl Amin.
    6. Filtrera de molekylära siktarna genom en clotting säng till en 50 mL rundkolv och tvätta ytterligare med 10 mL etylacetat. Extrahera de kombinerade organiska skikt med en mättad lösning av vattenhaltigt NaHCO3 (2 x 20 mL) i en 50 mL separatory tratt. Extrahera vattenskiktet med etylacetat (3 x 15 mL).
    7. Extrahera de kombinerade organiska skikt med mättad NaCl-lösning (5 mL), torka den med hjälp av vattenfritt magnesiumsulfat, filtrera blandningen för att ta bort magnesiumsulfat, tvätta med etylacetat (3 x 15 mL) och samla upp filtratet i en 100 mL rundkolv.
    8. Avdunsta lösningsmedlet med en rotationsindunstare vid 240 mbar vakuum på 40 oC.
    9. Ladda lösningen av rå produkt i DCM ovanpå kolumnen kiseldioxid säng. Eluera kolumnen med en blandning som innehåller DCM och aceton (0-10% aceton i DCM) och samla fraktioner av 5-10 mL.
    10. Övervaka de insamlade fraktionerna av TLC, utveckla med DCM/aceton (8,5/1,5). Avdunsta fraktioner som innehåller produkten med en rotationsindunstare för att erhålla intermidiate 7, 5-Azidopentyl-O-{[2,3,4,6-O-tetraacetyl-β-D-galactopyranosyl]-(1→4)-[3,6-O-diacetyl-2-acetamido-2-deoxy-β-D-glucopyranosyl]-(1→2)-[ 3,4,6-O-triacetyl-α-D-mannopyranosyl]}-(1→3)-[2-O-acetyl-4,6-O-benzylidine-β-D-mannopyranosyl-(1→4)-O-(3,6-di-O-benzyl-2-deoxy-2-(2,2,2-trichloroethoxy)carbonylamino-β-D-glucopyranosyl)-(1→4)-O-3,6-di-O-benzyl-2-deoxy-2-( 2,2,2-trichloroethoxy) carbonylamino-β-D-glukopyranosid (0,052 g, 70%), som vitt skum.
    11. Karakterisera produkten av NMR och massa spektroskopi (se kompletterande Data File).
  2. Beredning av intermidiate 8
    1. Väger hexasaccharide 7 (figur 3, 0,040 g, 0,016 mmol) i en 25 mL singel-hals runda-botten kolv, torka den under vakuum för 1 h, ta bort den från vakuum, fylla den med kvävgas, lägga till en magnetisk uppståndelse och råga med en gummi septum.
    2. Över 3 mL acetonitrile:methanol (MeOH) (2:1 förhållande) i kolven.
    3. Lägg till p-toluen sulfonsyra monohydrat (0,001 g, 0,008 mmol) in i reaktionskolven och uppståndelse reaktionen vid 800 rpm i 5 h.
    4. Efter TLC indikerar comsumption av utgångsmaterial (TLC, utveckla med DCM/aceton (8,5/1,5) och visualisera genom UV absorbansen vid 254 nm eller genom färgning med en lösning av cerium ammoniummolybdat följt av värme), släcka reaktionen genom att injicera 10 medel triethyl Amin.
    5. Avdunsta lösningsmedlet med en rotationsindunstare vid 337 mbar vakuum på 40 oC.
    6. Lös upp rå blandningen med cirka 2 mL av DCM och ladda det på toppen av kiseldioxid sängen.
    7. Eluera kolonnen med en blandning av DCM och aceton (0 - 10% aceton i DCM) och samla delar av 5-10 mL. Övervaka de insamlade fraktionerna av TLC, utveckla med DCM/aceton (8,5/1,5). Avdunsta lösningsmedlet med en rotationsindunstare vid 400 mbar vakuum och 40 oC.
    8. Torka återstoden under reducerat tryck att ge mellanliggande 8, 5-Azidopentyl-O-(2-O-acetyl-3,4,6-tri-O-benzyl-ced pressure to give →3)-2-O-acetyl-4, 6-O-benzylidine-β - D - mannopyranosyl-(1→4) - O-(3,6- di-O-benzyl-2-deoxy-2-phthalimido-β-D-glucopyranosyl)-(1→4)-O-3,6 - di-O-benzyl-2-deoxy-2-phthalimido-nzyl-2-deoxy-2-phth. (Figur 3, 0.022 g, 57%) som en vit solid. Karakterisera produkten av NMR och massa spektroskopi (se kompletterande Data File).
  3. Beredning av intermidiate 9
    1. Beredning av intermidiate 9 (figur 3) var fulländad med givare 5 (0,015 g, 13,2 µmol) och acceptor 8 (figur 3, 0,020 g, 8,80 µmol).
    2. AgOTf (0,011 g, 44,1 µmol) och Cp2HfCl2 (0,012 g, 30,8 µmol) användes som en promotorer.
    3. Utför steg 2.1.1 till 2.1.10 att få mellanliggande 9, 5-Azidopentyl - O-{[2,3,4,6-O-tetraacetyl-β-D-galactopyranosyl]-(1→4)-[3,6-O-diacetyl-2-acetamido-2-deoxy-β-D-glucopyranosyl]-(1→2)-[3,4,6-O-triacetyl-α-D-mannopyranosyl]} -(1→3)-{2,3,4,6-O-tetraacetyl-β-D-galactopyranosyl]-(1→4)-[2,3,4-O-triacetyl-α-LS160fucopyranosyl-(1→3)-3,6-O-diacetyl-2-acetamido-2-deoxy-β-D-glucopyranosyl]-(1→2)-3,4,6-O-triacetyl-α-D-mannopyranosyl}-(1→6)-[2- O-acetyl-β-D-mannopyranosyl-(1→4)-O-(3,6-di-O-benzyl-2-deoxy-2-(2,2,2-trichloroethoxy)carbonylamino-β-D-glucopyranosyl)-(1O-benzyl-2-deoxy-2-(2,2,2-trichloroethoxy)carbonylamino-β-D-glucopyranosyl)-D-glucopyra (0.010 g, 34%), as vitt skum.
  4. Globala deprotection av intermidiate
    1. Väga förening 9 (0,010 g, 2.9 µmol) i en 25 mL singel-hals runda-botten kolv, lägga till en magnetisk uppståndelse bar, keps med en gummi septum, och bifoga en kväve-ballong.
    2. 2 ml av 1, 4 dioxan: H2O (4:1) i kolven. Tillsätt lithiumhydroxide (LiOH) (0,005 g, 50% av WT) i kolven. Rör om reaktionsblandningen på 90-100 oC för 12 h och låt den svalna på RT.
    3. Avdunsta lösningsmedel med en rotationsindunstare och torka kolven under vakuum för 1 h, fylla den med kväve, ta bort den från vakuum grenröret och råga med en gummi septum.
    4. Injicera 4 mL torrt pyridin och 2 mL av ättiksyraanhydrid i kolven genom septum med en 10 mL spruta på 0 oC. rör reaktionsblandningen för 12 h på RT.
    5. Avdunsta lösningsmedel med en rotationsindunstare vid 0-10 mbar vakuum på 50 oC.
    6. Lös upp rå blandningen med 30 mL av DCM och extrahera lösningen med mättad vattenlösning NaHCO3 (2 x 20 mL) i en 50 mL separatory tratt.
    7. Extrahera det vattenhaltiga skiktet med DCM (3 x 15 mL). Avdunsta lösningsmedlet med en roterande indunstare.
    8. Ladda en lösning av produkten i ca 2 mL DCM ovanpå C18 kiseldioxid sängen. Eluera kolonnen med en blandning av vatten och metanol (0 - 100% metanol i vatten) och samla fraktioner av 5-10 mL.
    9. Samla de produkt-fraktionerna och avdunsta under reducerat tryck att få önskad produkt som vitt skum.
    10. Lös upp produkten i 5 mL torrt metanol i en 25 mL rund botten kolven och råga med en gummi septum.
    11. Överföra 0,1 mL natrium methoxide (Viktoria) i metanol och cool till 0 oC med ett isbad och rör blandningen för 12 h.
    12. Bort vätskan med en rotationsindunstare och torka produkten under vakuum.
    13. Lös upp rå produkterna i 5 mL metanol: H2O: ättiksyra (6:3:1).
    14. Lägga till palladium hydroxid (Pd(OH)2) (50% av wt) och rör om reaktionen under väte atmosfär med en vätgas ballong för 15 h.
    15. Filtrera reaktionen genom en clotting säng och tvätta med 2 mL metanol följt av 2 mL dd vatten.
    16. Avdunsta lösningsmedel med en roterande indunstare.
    17. Lös upp rå blandningen med ca 1 mL vatten och ladda den ovanpå Polyakrylamidgelen sängen (se Tabell för material). Eluera produkten med vatten och samla fraktioner av 1-2 mL.
    18. Övervaka de insamlade fraktionerna av TLC, utveckla med n-butanol: H2O: ättiksyra (1:1:1).
    19. Samla de produkt-fraktionerna och lyophilize för att få den önskade produkt 10, 5-Aminopentyl-β-D-galactopyranosyl-(1→4)-2-acetamido-2-deoxy-β-D-glucopyranosyl-(1→2)-α-D-mannopyranosyl]-(1→3),-[β-D-galactopyranosyl-(1→4)-( α-L-fucopyranosyl-(1→3)-2-2-acetamido-2-deoxy-β-D-glucopyranosyl)-(1→2)-α-D-mannopyranosyl]-(1→6)-β-D-mannopyranosyl-(1→4)-2-acetamido-2-deoxy-β-D-glucopyranosyl-(1→4)-2-acetamido-2-deoxy-β-D-glucopyranoside (0.002 g, 36%), as a vitt pulver.
    20. Karakterisera produkten av NMR och massa spektroskopi (se kompletterande Data File).

3. förberedelse av Glycans med fosfonsyraderivat syra svans19,22

  1. Väger den respektive glycan (2-5 µmol) i en 5 mL kolv med rund botten, lägga till en magnetisk uppståndelse och råga med en gummi septum.
  2. Över 400 µL nyligen torkad dimetylformamid.
  3. Lägg till [2 (2 (2 (bis (benzyloxy) phosphorylen) ethoxyethoxy) etyl (2, 5-dioxopyrrolidin1-yl) karbonat] (10-25 µmol, tillagas i huset) till glycan lösning. Rör blandningen vid 800 rpm i 5 h.
  4. Avdunsta lösningsmedel med en rotationsindunstare vid 5-10 mbar vakuum på 40 oC.
  5. Lös upp reaktionsblandningen i 0,5 mL vatten och ladda överst på Polyakrylamidgelen sängen (se Tabell för material). Eluera produkten med vatten och samla fraktioner av 1-2 mL.
  6. Övervaka de insamlade fraktionerna av TLC26. Reaktionsblandningen på en TLC-platta, och lägga till fläcken lösning 0,25 M cerium ammoniummolybdat; Följ genom uppvärmning med en värmeplatta. Samla den produkten som innehåller bråk och lyophilize för att få önskad produkt som ett vitt pulver.
  7. Lös upp produkten i 2 mL vatten och tillsätt Pd (OH)2 (50% av vikten). Rör om reaktionen vid 800 rpm under väte atmosfär med en vätgas ballong för 15 h.
  8. Filtrera reaktionen genom en flux-kalcinerats säng och tvätta med 2 mL metanol följt av 2 mL destillerat avjoniserat vatten. Avdunsta lösningsmedel med en rotationsindunstare vid 300 mbar vakuum på 40 oC.
  9. Lös upp rå blandningen med ca 1 mL vatten och ladda den ovanpå Polyakrylamidgelen sängen (se Tabell för material).
  10. Eluera produkten med vatten och samla fraktioner av 1-2 mL. Övervaka de insamlade fraktionerna av TLC26. Lyophilize fraktioner (frysa produkten med hjälp av flytande kväve sedan placera på lyophilizer under ett vakuum) att få den önskade produkten som ett vitt pulver. Karakterisera produkterna av NMR och massa spektroskopi (se kompletterande Data File) använder D2O som lösningsmedel.

4. Glycan Array

  1. Beredning av aluminium belagd objektglas (ACG Skjut) 19 , 20 , 22
    Obs: Tillverkning av aluminium-belagda glas glasen var gjort på tunn Film Technology-divisionen, Instrument teknik Research Center och nationella tillämpas forskningslaboratorier, Hsinchu Science Park, Taiwan.
    1. Packa belagda diabilder, vakuum-seal dem för att förhindra bildandet av NAO, och hålla förseglade till elektrokemisk reaktion för surface anodisering.
  2. Yta anodisering av aluminium belagd glasskivor 19 , 20 , 22
    1. Inställd temperatur-kontrollerad inkubatorn vid 4 ° C. Förbereda 0,3 M oxalsyra vattenlösning och hålla den i ett isbad. Ta den 500 mL-glasbägaren, lägga till en magnetisk omrörare.
    2. Överföra den 0,3 M oxalsyra till 500 mL bägaren, och sedan placera en 10 cm lång platina stav som katod i lösningen. Håll omrörning (vid 300 rpm) oxalsyra genom anodisering processen.
    3. Slå på lab tracer programvara, klicka på ”Ställ in” knappen sedan ”fungerar val sopa spänning”. Ange start och stop spänning till 25,8 V, antal punkter till 100, efterlevnad till 1, och sopa dröjsmål till 1.200 ms och klicka ”ok”.
    4. Klämma aluminium-belagda glas sidan mot katoden. Klicka på knappen ”run test”. Observera den aktuella mätningen (~ 8-10 mA).
    5. Efter ytan anodisering, tvätta bilden ordentligt med dubbel destillerat vatten, rensa torr med kvävgas och sedan lagra i en 30% relativ luftfuktighet kammare tills vidare användning.
  3. Tillverkning av ACG glycan microarray 22
    1. Förbereda 100 µL av alla monovalenta glycans (I-XI) i etylenglykol vid koncentration av 10 mM individuellt.
    2. Späd den ovan glycan med utskrift buffert (80% etylenglykol och 20% avjoniserat vatten) för att göra 100 µM koncentration.
    3. För hetero-ligand studie, förbereda 5 µL av enskilda I-XI glycans, och till varje Tillsätt 5 µL av mannen5GlcNAc2 (1:1 ratio).
    4. Skriv ut microarrays av robotic stift (se Tabell för material) av nedfall av 0,6 nL av den tidigare beredda glycans på ACG glider31.
    5. Förvara de utskrivna bilderna i en luftfuktighet kontrollerad torr låda innan bindande analysen.
  4. Kartläggning glycan epitoper av HIV-1 i huvudsak neutraliserande PG9 22
    1. Förbereda 1 mL BSA innehöll PBST buffert, 3% w/v.
    2. Förbereda 70 µL av PG9 (50 µg/mL) i PBST buffert (BSA innehöll PBST buffert, 3% w/v).
    3. Förbereda 120 µL av sekundära fluorescerande tagg antikroppen Donkey anti-humant IgG (Alexa Fluor 647 konjugerat) 50 µg/mL i PBST buffert (BSA innehöll PBST buffert, 3% w/v) i mörkret.
    4. Blanda primär antikropp (PG9) och sekundära fluorescerande tagg antikropp i förhållandet 1:1 (60 µL varje). Inkubera färdigblandad antikroppar under 30 minuter vid 4 ° C.
    5. Fyll i ACG bilden in i bilden inkubation kammaren som är uppdelad i 16 brunnar. Överför 100 µL av färdigblandad antikroppar till arrayen glycan och inkubera vid 4 ° C för 16 h.
    6. Pipettera ut färdigblandad antikroppar. Ta bort bild inkubation kammaren.
    7. Tvätta i bilden först i PBST buffert (PBS och 0,05% Tween-20), följt av avjoniserat vatten och spin torr vid 2000 x g.
    8. Öppna programvaran microarray bild analys (se Tabell för material). Infoga en bild med klädd funktioner vänd nedåt.
    9. Klicka på ”Inställningar” menyn, ange bildupplösning 5 µm per pixel, och våglängden på 635 nm med PMT450 och kraft till 100%.
    10. Klicka på knappen ”scan” att starta imaging bilden.
    11. Klicka på ikonen ”fil” för att spara Skanna bilden i tif-format.
    12. Utföra bildanalys av efter programanvändarens guide32.
    13. Beräkna den totala intensiteten av fluorescens och illustrera med bildbehandling programvara33 (se Tabell för material).
      Obs: Här, genomsnittliga procentuella felet för alla datapunkter presenteras av felstaplar.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

En modulär chemo-enzymatisk strategi för syntesen av ett brett utbud av N -glycans presenteras i figur 1. Strategin är baserad på det faktum att mångfald kan skapas på början av chemo-enzymatisk syntesen av de tre viktiga moduler, följt av den α-specifika mannosylation på 3-O och/eller 6-O ställning mannos återstoden av gemensamt kärna trisaccharide av N- glycans. Med tanke på den strukturella mångfalden av bi, tri-, tetra-antennary komplex typ N- glycan strukturer, vi trodde att en uppsättning oligosaccharyl givare och den core trisackarider acceptorn med förinstallerade alkyl handlecould användas som utgångsmaterial material för att generera de önskade strukturella mångfalden (figur 1). Tillämpligheten av glycosyl fluor givare i bygga en komplex glycan bibliotek har visat tidigare21.

För att demonstrera effektiviteten av vår strategi, valdes en bi-antennary isomera struktur (10, bild 3) för syntesen. Den D1 arm antenner 4 och D2 arm antenner 5 glycan 10 genererades på stora skalor av chemo-enzymatiska metoder. I synnerhet var disackarid acceptor 1 enzymatiskt galactosylated med hjälp av β-1, 4-galactosyltransferase och uridin 5'-diphosphogalactose (UDP-Gal) för att bilda trisaccharide 2. Nästa, de mellanliggande 2 var fucosylated vid GlcNAc 3 -O i närvaro av α-1, 3-fucosyltransferase från Helicobacter pylori (Hpα1, 3 FT) för att ge den önska tetrasaccharide 3. För kemiska ligatur till kärna, byggstenar 2 och 3 var första peracetylated, och gruppen fenol reducerande slutet p- metoxi togs bort. Slutligen, fluor installerades i närvaro av DAST att få önskad modulerna 4 och 5, respektive (figur 2).

Med önskad moduler i hand, vi nästa gå vidare till den stereoselektiv 3 -O glycosylation 4 till kärna trisaccharide 6 under katalys av silver triflate och hafnocene-diklorid att tillhandahålla de respektive hexasaccharide 7 (Figur 3). Bensylidenkamfer skydd att maskera 4, 6-OH togs bort med katalytisk p-toluen sulfonsyra (p- TSA). Dra nytta av dess reaktivitet, primära 6-OH 8 var reagerade med fluor modul 5 under liknande experimentella förhållanden att uppnå den nödvändiga decasaccharide 9. Äntligen, utfördes globala deprotection för att få glycan 10, som präglades ytterligare med hjälp av NMR och massa spektroskopi (se den kompletterande Data-filen).

Glycans som innehåller en så amine svans i reducerande slutet ändrades med fosfonsyraderivat syra linkers och bifogas ACG ytan genom dinatriumfosfat kemi (figur 4). På senaste, HIV-1 bNAb visades PG9 för dess glycan specificitet med homo - och hetero-glycans matriser för att demonstrera för första gången som PG9 interagerat med angränsande heteroglycans i V1/V2 slingan av HIV-1 gp120 ytan (figur 5).

Figure 1
Figur 1: En allmän modulär strategi för beredning av N- glycans. (A) antalet N- glycans genereras av denna strategi som vanligen inträffar på mänskliga glykoproteiner beräknas överstiga 20 000. (B) tre typer av moduler som utarbetats av denna chemo-enzymatisk metod som kan användas för α-seletive Glykosyleringar. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2: Chemoenzymatic syntes av moduler. Jag, UDP-galaktos, β 1, 4-GalT, 15 h, 86%. ii, BNP-fukos, α 1, 3-FucT, 15 h, 84%; III, (1) Ac2O, pyridin, RT, 12 h; (1) kan, ACN: toluen: H2O, (3) DAST, CH2Cl2,-30 oC. kan: Cerium ammoniumnitrat; DAST: Diethylaminosulfur Kvävetrifluorid.
Exportbidragsnomenklaturen: 1, p-methoxyphenyl-O-2-acetamido-2-deoxy-β-D-glucopyranosyl-(1→ 2)-α-D-mannopyranoside; 2, p-methoxyphenyl-O-β-D-galactopyranosyl-(1→4)-2-acetamido-2-deoxy-β-D-glucopyranosyl-(1→2)-α-D-mannopyranoside; 3, p-O-β-D-galactopyranosyl-(1→4)-[α-L-fucopyranosyl-(1→3)-2-acetamido-2-deoxy-β-D-glucopyranosyl]-(1→2)-α-D-mannopyranoside - metoxifenyl; 4, [2,3,4,6-O-tetraacetyl-β-D-galactopyranosyl]-(1→4)-[3,6-O-diacetyl-2-acetamido-2-deoxy-β-D-glucopyranosyl]-(1→2)-3,4,6-O-triacetyl-α-D-mannopyranosyl fluor; 5, [2,3,4,6-O-tetraacetyl-β-D-galactopyranosyl]-(1→4)-[2,3,4-O-triacetyl-α-L-fucopyranosyl(1→3)-3,6-O-diacetyl-2-acetamido-2-deoxy-β-D-glucopyranosyl]-(1→2)-3,4,6-O-triacetyl-α-D-mannopyranosyl fluor Klicka här för att visa en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3: kemiska glycosylation D1/D2 arm moduler till core acceptor. jag, 4, AgOTf, Cp2HfCl2, toluen, 4 Å MS, 0 oC till RT, 70%. ii, p- TSA, acetonitril, RT, 57%; III, 5, AgOTf, Cp2HfCl2, toluen, 4 Å MS, 0 oC till RT, 34%. iv, (1) LiOH, 1,4-dioxan: H2O; 90 oC, 12 h; (2) Ac2O, pyridin, 12 h; (3) Viktoria, MeOH, 12 h; (4) Pd(OH)2, MeOH: H2O: HCOOH (5:3:2), H2, 36%. AgOTf: Silver trifluromethanesulfonate; CP2HfCl2: Bis (cyclopentadienyl) hafnium diklorid, MS: molekylsiktar, exportbidragsnomenklaturen: 7, 5-Azidopentyl-O-{[2,3,4,6-O-tetraacetyl-β-D-galactopyranosyl]-(1→4)-[3,6-O-diacetyl-2- Acetamido-2-deoxy-β-D-glucopyranosyl]-(1→2)-[3,4,6-O-triacetyl-α-D-mannopyranosyl]}-(1→3)-[2-O-acetyl-4,6-O-benzylidine-β-D-mannopyranosyl-(1→4)-O-(3,6-di-O-Benzyl-2-deoxy-2-(2,2,2-trichloroethoxy) carbonylamino-β-D-glucopyranosyl)-(1→4)-O-3,6-di-O-benzyl-2-deoxy-2-(2,2,2-trichloroethoxy)carbonylamino-β-D-glucopyranosid. 8, 5-Azidopentyl - O-(2-O-acetyl-3.4.6-tri-O-benzyl-α-D-mannopyranosyl-(1→3)-2-O-acetyl-4,6-O-benzylidine-β-D-mannopyranosyl-(1→4)-O-(3,6-di-O-benzyl-2-deoxy-2-phthalimido-β-D-glucopyranosyl)-(1→4)-O-3,6- di-O-benzyl-2-deoxy-2-phthalimido-β-D-glucopyranoside. 9, 5-Azidopentyl-O-{[2,3,4,6-O-tetraacetyl-β-D-galactopyranosyl]-(1→4)-[3,6-O-diacetyl-2-acetamido-2-deoxy-β-D-glucopyranosyl]-(1→2)-[3,4,6-O-triacetyl-α-D-mannopyranosyl]}-(1→3)-{2,3,4,6- O-tetraacetyl-β-D-galactopyranosyl]-(1→4)-[2,3,4-O-triacetyl-α-LS160fucopyranosyl-(1→3)-3,6-O-diacetyl-2-acetamido-2-deoxy-β-D-glucopyranosyl]-(1→2)-3,4,6-O-triacetyl-α-D-mannopyranosyl}-(1→6)-[2-O-acetyl-β-D-mannopyranosyl-( 1→4)-O-(3,6-di-O-Benzyl-2-deoxy-2-(2,2,2-trichloroethoxy)carbonylamino-β-D-glucopyranosyl)-(1→4)-O-3,6-di-O-Benzyl-2-deoxy-2-(2,2,2-trichloroethoxy)carbonylamino-β-Dglucopyranoside 10, 5- Aminopentyl-β-D-galactopyranosyl-(1→4)-2-acetamido-2-deoxy-β-D-glucopyranosyl-(1→2)-α-D-mannopyranosyl]-(1→3),-[β-D-galactopyranosyl-(1→4)(α-L-fucopyranosyl-(1→3)-2-2-acetamido-2-deoxy-β-D-glucopyranosyl)-(1→2)- Α-D-mannopyranosyl]-(1→6)-β-D-mannopyranosyl-(1→4)-2-acetamido-2-deoxy-β-D-glucopyranosyl-(1→4)-2-acetamido-2-deoxy-β-D-glucopyranoside Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 4
Figur 4: Glycan immobilisering på en ACG matris. (A) kemisk modifiering av glycan med amino svans i en fosfonsyraderivat syra svans för kovalent fastsättning till ACG bild genom dinatriumfosfat kemi. (B) fördelningen av glycans på en ACG yta. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 5
Figur 5: Glyan array analys. (A) strukturer av syntetiska N- glycans som skrivs ut på en ACG-matris. (B) bindande analys av PG9 på enskilda glycans I-XI tryckt på ACG array (till vänster) och glycan blandningar Man5 blandas med glycans I-XI (höger panel) med 100 µM koncentration. De molära koncentrationerna i µM för PG9 ges i legenden. Den genomsnittliga signal stödnivåer och standardavvikelsen beräknas för fem oberoende replikat på matrisen visas. Inläggningar Visa fluorescens bilder. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

En klass av HIV-1 bNAbs inklusive PG9, PG16 och PGTs 128, 141-145 rapporterades vara mycket potent i neutraliserande 70-80% av cirkulerande HIV-1 isolat. Epitoper av dessa bNAbs bevaras mycket bland varianterna av den hela HIV-1 gruppen M, därför de kan vägleda den effektiva immunogen designen för ett HIV-vaccin att framkalla neutraliserande antikroppar23,24,25 . Som en del av våra pågående ansträngningar för att identifiera den glycan epitoper av HIV-1 i huvudsak neutraliserande antikroppar, rapporterade vi kemiska och enzymatisk syntesen av en panel av hög mannos, hybrid och komplex typ oligosackarider att bilda en glycan matris21, 22. De vanligaste glycan matriserna på N- hydroxysuccinimide-belagd (NHS) glasskivor är dock inte upptäcka låg affinitet kolhydrat-protein interaktioner, förmodligen på grund av heterogena glycan distribution följd hydrolys av reaktiva N- hydroxysuccimide funktionella grupper på dess yta. För att övervinna begränsningarna av konventionella array format, har vi utvecklat en glycan matris på en aluminiumoxid belagda glas (ACG) bild. Vi utförde ytterligare en homogenitet jämförelse mellan arrayen ACG och vanliga NHS matris bevisa att arrayen ACG erbjöd en mer homogen glycan presentation på dess yta22. Vår preliminära bindande analys har inte kunnat iaktta bindande av PG9 till någon av glycans på NHS array (inga data anges). Därför, för att definiera bindande specificitet PG9, den glycans I-XI var kopplad till en fosfonsyraderivat syra svans och tryckt i ACG bilden med 100 µM av enskilda glycans (figur 4). Glycan immobilisering i en ACG-bild genom dinatriumfosfat kemi erbjöd en mer stabil och homogen fördelning. Var och en av glycans trycktes med fem replikat och bilder erhölls från en fluorescens genomsökning efter DyLight649-konjugerad åsna anti-humant IgG antikroppar inkubation. Bindande analysen av PG9 mot enskilda glycans tryckt på ACG array (figur 5, vänstra panelen) föreslår att PG9 starkt interagerat med hybrid-typ glycan (X). Interaktioner upptäcktes också för hög mannos typ Man5 (glycan IV) och den komplexa-typ glycan (XI).

Molekylär nivå interaktioner mellan PG9 och hybrid-typ glycan (X) är svårt att avgöra på grund av deras samtidig crystal strukturera information. Den hybrid-typ glycan X består av en komplex-typen arm vid 3-kärnan och en trimannose arm position påO kopplade till den 6-O placera av den centrala trisaccharide. Bindningen av PG9 till hybrid glycan X antyder att PG9 kräver både mannos och sialic acid rester i närheten för hög affinitet interaktioner. För att identifiera glycan kombinationen som bäst passar i PG9 bindande fickan, utfört vi en blandad-glycan array studie. Glycan IV var blandat med varje glycan från I-XI i förhållandet 1:1 mullvad och fläckig på en ACG-matris. Bindande analysen av PG9 till var och en av blandningarna anges att en kombination av mannen5 och en SCT (IV + XI) resulterade i högsta affiniteten mot PG9 jämfört med IV eller XI ensam. Dessutom upptäckte blandningar innehållande mannen5 och de som innehåller sialylated antenner som glycans VIII och X var också22. För första gången erbjuds dessa resultat en matris baserat bevis för hetero-glycans' bindande beteende PG9 som föreslogs av kristall struktur studier av PG9 med HIV-1 gp120 V1/V2 domän23.

Sammanfattningsvis har vi visat en effektiv modulär chemo-enzymatisk strategi för beredning av mycket skiftande N-länkade oligosackarider som inträffar på mänskliga glykoproteiner. Utvecklingen av en ACG matris ger dessutom ett effektivt sätt att avgöra extremt svag protein-kolhydrater interaktioner och, ännu viktigare, det samspel som sker genom hetero-glycans.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har något att avslöja.

Acknowledgments

Författarna tackar tunn Film Technology-divisionen, Instrument teknik forskning Center (ITRC) och nationella tillämpas forskningslaboratorier, Hsinchu Science Park, Taiwan. Detta arbete stöds av National Science Council (bevilja nr. De flesta 105-0210-01-13-01) och Academia Sinica.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acetic acid Sigma Aldrich 64197
Acetonitrile Sigma Aldrich 75058
Acetic anhydride Sigma Aldrich 108247
Anhydrous magnesium sulfate Sigma Aldrich 7487889
Boron trifluoride ethyl etherate Sigma Aldrich 109637
Bovine serum albumin Sigma Aldrich 9048468
Bio-Gel P2 polyacrylamide Bio-Rad 1504118
Bis(cyclopentadienyl)hafnium(IV) dichloride Sigma Aldrich 12116664
β-1, 4 Galactosyl transferases from bovine milk Sigma Aldrich 48279
BioDot Cartesion technology with robotic pin SMP3 (Stealth Micro Spotting Pins) Arrayit
Cerium ammonium molybdate TCI C1794
Cerium ammonium nitrate Sigma Aldrich 16774213
Clean glass slide  Schott 
Cytidine-5′-monophospho-N-acetylneuraminic acid Sigma Aldrich 3063716
Deuterated chloroform Sigma Aldrich 865496
Donkey Anti-Human IgG (Alexa Fluor647 conjugated Jackson Immuno Research, USA 709605098
Dichloromethane Sigma Aldrich 75092
Diethylaminosulfur trifluoride Sigma Aldrich 38078090
Dimethylformamide Sigma Aldrich 68122
Ethyl acetate Sigma Aldrich 141786
Ethylene glycol Acros Organic 107211
FAST frame slide incubation chambers Sigma Aldrich
Guanosine 5'-diphospho-b-L-fucose disodium salt  Sigma Aldrich 15839700
Lab tracer 2.0 software  Section 4 of the Protocol
GenePix Pro 4300A reader (microarray image analysis) moleculardevices www.moleculardevices.com
GraphPad Prism Software (Image processing ) GraphPad Software, Inc http://www.graphpad.com/guides/prism/6/user-guide/
Lithium hydroxide Sigma Aldrich 1310652
Manganese chloride Sigma Aldrich 7773015
Methanol Sigma Aldrich 67561
N-butanol Sigma Aldrich 71363
Oxalic acid Acros Organic 144627
Palladium hydroxide Sigma Aldrich 12135227
Phosphate Buffered Saline Thermo Fisher Scientific  10010023
Pyridine Sigma Aldrich 110861
P-Toluene sulfonic acid monohydrate Sigma Aldrich 773476
Silver triflate Sigma Aldrich 2923286
Sodium bicarbonate Sigma Aldrich 144558
Sodium chloride Sigma Aldrich 7647145
Sodium hydrogen carbonate Sigma Aldrich 144558
Sodium methoxide  Sigma Aldrich 124414
Sodium sulfate Sigma Aldrich 7757826
Toluene  Sigma Aldrich 108883
Tris buffer  Amresco N/A Ultra-pure grade
Tween-20 Amresco 9005645
Uridine diphosphate galactose (UDP-galactose) Sigma Aldrich 137868521

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kim, P. J., Lee, D. Y., Jeong, H. Centralized modularity of N-linked glycosylation pathways in mammalian cells. PloS one. 4, e7317 (2009).
  2. Townsley, S., Li, Y., Kozyrev, Y., Cleveland, B., Hu, S. L. Conserved Role of an N-Linked Glycan on the Surface Antigen of Human Immunodeficiency Virus Type 1 Modulating Virus Sensitivity to Broadly Neutralizing Antibodies Against the Receptor and Coreceptor Binding Sites. J.virol. 90, 829-841 (2015).
  3. Wang, Z., et al. A General Strategy for the Chemoenzymatic Synthesis of Asymmetrically Branched N-Glycans. Science. 341, 379-383 (2013).
  4. Li, L., et al. Efficient Chemoenzymatic Synthesis of an N-glycan Isomer Library. Chem Sci. 6, 5652-5661 (2015).
  5. Pritchard, L. K., Harvey, D. J., Bonomelli, C., Crispin, M., Doores, K. J. Cell- and Protein-Directed Glycosylation of Native Cleaved HIV-1 Envelope. J.Virol. 89, 8932-8944 (2015).
  6. Behrens, A. J., et al. Composition and Antigenic Effects of Individual Glycan Sites of a Trimeric HIV-1 Envelope Glycoprotein. Cell Rep. 14, 2695-2706 (2016).
  7. Barouch, D. H. Challenges in the development of an HIV-1 vaccine. Nature. 455, 613-619 (2008).
  8. Horiya, S., MacPherson, I. S., Krauss, I. J. Recent Strategies Targeting HIV Glycans in Vaccine Design. Nat Chem Bio. 10, 990-999 (2014).
  9. Wang, L. X. Synthetic carbohydrate Antigens for HIV Vaccine Design. Curr Opin Chem Biol. 17, 997-1005 (2013).
  10. Tian, J., et al. Effect of Glycosylation on an Immunodominant Region in the V1V2 Variable Domain of the HIV-1 Envelope gp120 Protein. PLoS Comput Biol. 12, e1005094 (2016).
  11. Geyer, H., Holschbach, C., Hunsmann, G., Schneider, J. Carbohydrates of human Immunodeficiency Virus. Structures of Oligosaccharides Linked to the Envelope Glycoprotein 120. The J Bio Chem. 263, 11760-11767 (1988).
  12. Lee, J. H., Ozorowski, G., Ward, A. B. Cryo-EM Structure of A Native, Fully Glycosylated, Cleaved HIV-1 Envelope Trimer. Science. 351, 1043-1048 (2016).
  13. Lonardi, E., Balog, C. I., Deelder, A. M., Wuhrer, M. Natural GlycanMicroarrays. Expert Rev Proteomics. 7, 761-774 (2010).
  14. Paulson, J. C., Blixt, O., Collins, B. E. Sweet Spots in Functional Glycomics. Nat. Chem. Bio. 2, 238-248 (2006).
  15. Dotsey, E. Y., et al. A High Throughput Protein Microarray Approach to Classify HIV Monoclonal Antibodies and Variant Antigens. PLoS One. 10, e0125581 (2015).
  16. Wu, C. Y., Liang, P. H., Wong, C. H. New Development of Glycan Arrays. Org Biomol Chem. 7, 2247-2254 (2009).
  17. Scurr, D. J., et al. Surface Characterization of Carbohydrate Microarrays. Langmuir. 26, 17143-17155 (2010).
  18. Blixt, O., et al. Printed Covalent Glycan Array for Ligand Profiling of Diverse Glycan Binding Proteins. Proc Natl Acad Sci U S A. 101, 17033-17038 (2004).
  19. Chang, S. H., et al. Glycan Array on Aluminum Oxide-Coated Glass Slides Through Phosphonate Chemistry. J. Am. Chem. Soc. 132, 13371-13380 (2010).
  20. Tseng, S. Y., et al. Preparation of Aluminum Oxide-Coated Glass Slides for Glycan Microarrays. ACS Omega. 1, 773-783 (2016).
  21. Shivatare, S. S., et al. Efficient Convergent Synthesis of Bi-, Tri-, and Tetra-Antennary Complex Type N-Glycans and Their HIV-1 Antigenicity. J. Am. Chem. Soc. 135, 15382-15391 (2013).
  22. Shivatare, S. S., et al. Modular synthesis of N-Glycans and Arrays for the Hetero-Ligand Binding Analysis of HIV Antibodies. Nat Chem. 8, 338-346 (2016).
  23. McLellan, J. S., et al. Structure of Hiv-1 gp120 V1/V2 Domain with Broadly Neutralizing Antibody PG9. Nature. 480, 336-343 (2011).
  24. Julien, J. P., et al. Asymmetric Recognition of the HIV-1 Trimer by Broadly Neutralizing Antibody PG9. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, 4351-4356 (2013).
  25. Willis, J. R., et al. Long Antibody HCDR3s from HIV-Native Donors Presented on a PG9 Neutralizing Antibody Background Mediate HIV Neutralization. Proc Natl Acad Sci U S A. 113, 4446-4451 (2016).
  26. JoVE Science Education Database. Essentials of Organic Chemistry. Performing 1D Thin Layer Chromatography. JoVE. , Cambridge, MA. (2017).
  27. de Castro, M. D., et al. A useful approach to the automation of analytical processes? J Automat Chem. 12, 267-279 (1990).
  28. JoVE Science Education Database. Essentials of Organic Chemistry. Nuclear Magnetic Resonance (NMR) Spectroscopy. JoVE. , Cambridge, MA. (2017).
  29. JoVE Science Education Database. Essentials of Analytical Chemistry. Introduction to Mass Spectrometry. JoVE. , Cambridge, MA. (2017).
  30. Tseng, S. Y., et al. Preparation of Aluminum Oxide-Coated Glass Slides for Glycan Microarrays. ACS Omega. 1 (5), 773-783 (2016).
  31. Blixt, O., et al. Printed covalent glycan array for ligand profiling of diverse glycan binding proteins. Proc Natl Acad Sci U S A. 101, 17033-17038 (2004).
  32. GenePix Pro 6.0 Microarray Acquisition and Analysis Software for GenePix Microarray Scanners User’s Guide & Tutorial. , Axon Instruments/ Molecular Devices Corp. Sunnyvale, CA. (2017).
  33. GraphPad Prism version 6.01 for Windows. GraphPad Software. , La Jolla California USA. Available from: http://www.graphpad.com/guides/prism/6/user-guide/ (2017).

Tags

Kemi fråga 132 kemo-enzymatisk syntes ACG glycan matriser HIV neutraliserande antikroppar N- glycans specificitet profilering modulsystem
Kemo-enzymatisk syntes av <em>N</em>- glycans för Array utveckling och HIV-antikroppar profilering
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Shivatare, S. S., Shivatare, V. S.,… More

Shivatare, S. S., Shivatare, V. S., Wu, C. Y., Wong, C. H. Chemo-enzymatic Synthesis of N-glycans for Array Development and HIV Antibody Profiling. J. Vis. Exp. (132), e55855, doi:10.3791/55855 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter