Summary
Her præsenterer vi eksperimentelle og analytiske procedurer for at beskrive den tidsmæssige dynamik af de neurale og hjertevariablerne af ikke-REM-søvn hos mus, som modulerer søvnresponsen over for akustiske stimuli.
Abstract
Tre årvågenhed stater dominerer pattedyrs liv: vågenhed, ikke-hurtig øjenbevægelse (ikke-REM) søvn og REM søvn. Da flere neurale korrelater af adfærd er identificeret i fritflytende dyr, bliver denne tredobbelte underopdeling for forenklet. Under vågenhed definerer ensembler af globale og lokale kortikale aktiviteter sammen med perifere parametre som pupildiameter og sympatovagalbalance forskellige grader af ophidselse. Det er fortsat uklart, i hvilken grad søvn også udgør et kontinuum af hjernestater - inden for hvilken grad af modstandsdygtighed overfor sensoriske stimuli og arousability og måske andre søvnfunktioner varierer gradvist - og hvordan perifere fysiologiske tilstande varierer. Forskning, der fremmer metoderne til overvågning af flere parametre under søvn, samt tilskrivning af konstellationer af disse funktionelle egenskaber, er centralt for at forbedre vores forståelse af søvn som en multifunktionel proces, hvor mange gavnlige virkninger skal være executed. At identificere nye parametre, der karakteriserer søvntilstand, vil åbne muligheder for nye diagnostiske veje i søvnforstyrrelser.
Vi præsenterer en procedure for at beskrive dynamiske variationer af mus-ikke-REM søvntilstande via den kombinerede overvågning og analyse af elektroencefalogram (EEG) / elektrokortikogram (ECoG), elektromyogram (EMG) og elektrokardiogram (EKG) signaler ved anvendelse af standardpolysomnografiske optagelsesteknikker. Ved hjælp af denne tilgang fandt vi, at mus-ikke-REM-søvn er organiseret i cykler af koordinerede neurale og hjerteoscillationer, der genererer successive 25-s intervaller med høj og lav sårbarhed overfor eksterne stimuli. Derfor koordineres centrale og autonome nervesystemer for at danne adfærdsmæssigt forskellige søvntilstande under konsolideret ikke-REM-søvn. Vi præsenterer kirurgiske manipulationer for polysomnografisk ( dvs. EEG / EMG kombineret med EKG) overvågning for at spore disse cykler i den frit sovende mus, analysen til quantiFy deres dynamik, og de akustiske stimuleringsprotokoller til at vurdere deres rolle i sandsynligheden for at vågne op. Vores tilgang er allerede blevet udvidet til menneskelig søvn og løfter om at løse fælles organiseringsprincipper for ikke-REM søvntilstande hos pattedyr.
Introduction
Sygeplejerske søvn er en adfærdsmæssig hvilestilstand og modstandsdygtighed over for miljømæssige stimuli. På trods af denne tilsyneladende ensartethed indikerer polysomnografiske og autonome parametre, at søvn bevæger sig mellem kvalitativt og kvantitativt forskellige neurale og somatiske tilstande på forskellige tidsmæssige og rumlige skalaer 1 . I løbet af minutter til mange minutter, skifter kontakten mellem ikke-REM og REM søvn. Non-REM-søvn ledsages af stor amplitude lavfrekvent aktivitet i EEG med en spektral peak omkring ~ 0,5-4 Hz, mens REM-søvn viser regelmæssig EEG-aktivitet i theta-båndet (6 - 10 Hz) sammen med Muskel atonia 2 . Inden for ikke-REM søvn cykler mennesker gennem lys (S2) og dyb langsom bølgesøvn (SWS). Som deres navngivning angiver, viser disse to faser henholdsvis lavere og højere ophobningstærskler 3 , 4 , og de afviger primært i tætheden af lavfrekvensEncycortical EEG-effekt, kaldet slow-wave-aktivitet (SWA; 0,75-4 Hz). Ikke-ensartethed fortsætter i løbet af individuelle udfald af S2 og SWS i minut- til sub-anden-tidsskalaen, som udførligt dokumenteret af den variable tilstedeværelse af SWA i løbet af en bout 5 , 6 , men også ved EEG og feltpotentiale rytmer ved Højere frekvenser, herunder spindelbølger i sigma båndet (10-15 Hz) og gamma rytmer (80 - 120 Hz) (for en anmeldelse, se 7 , 8 , 9 , 10 ).
I stedet for at være subtile skifter disse variationer den sovende kortikale tilstand hos mennesker til ekstremerne af spektret. For ikke-REM-søvn spænder disse fra en overvejelse af SWA til stater, der tilnærmer sig vævlignende aktivitet, fordi de indeholder en betydelig andel af højfrekvente komponenter 11
Mammalian non-REM søvn er langt fra ensartet. Hvorvidt en sådan ikke-ensartethed fører til stater, der adskiller sig i funktion og adfærdsmæssige attributter, er ikke klart. I flere typer søvnforstyrrelser er kontinuerlig søvn forstyrret af spontane vækkelser og uhensigtsmæssig motorisk adfærd. Desuden viser spektrale analyser ændringer i den relative tilstedeværelse af højere frekvenser i EEG 21Og i autonome parametre, såsom vejrtrækninger og hjerteslag 22 . Den ordnede sekvens af stabile søvntilstande er således forstyrret, og elementer af kortisk og / eller autonom oprykning trænger på en ukontrolleret måde. Derfor er forståelse af kontinuum for søvntilstanden mulig for sygdommen. Desuden er forstyrrelsen af søvn ved miljøstøj i bymiljøer forbundet med generelle sundhedsrisici, hvilket gør det afgørende at identificere øjeblikke med øget sårbarhed i søvn 23 .
Adfærdsmæssige opvågningsforsøg hos sovende mennesker indikerer, at det er sværest at vågne op fra SWA-domineret ikke-REM-søvn (stadium S3), mens lys ikke-REM-søvn (stadium S2) og REM-søvn viser sammenlignelige og lavere ophobningstærskler 4 . Den kortikale behandling af korte lydstimuli varierer væsentligt mellem REM-søvn, S2 og S3 24 ,25 , hvilket indikerer at statsspecifikke kortikale aktivitetsmønstre modulerer de første faser af sensorisk behandling. For ikke-REM søvn hos mennesker varierer tilbøjelighed til at vågne op som følge af støj med tilstedeværelsen af spindelbølger og alfa-rytmer i EEG 26 , 27 , 28 . Thalamocortical rytmicitet under spindler ledsages af øget synaptisk hæmning ved både thalamins og kortikale niveauer, hvilket antages at bidrage til dæmpning af sensorisk behandling 7 .
Hvordan er støjbestandige og sårbare søvnperioder organiseret i tide, og hvad er deres determinanter? I både mus og menneske identificerede vi for nylig en infrarad, 0,02-Hz oscillation i neurale rytmer. Afhængig af fasen af denne 0,02 Hz-svingning viste musene variabel reaktivitet over for eksterne stimuli enten ved at vågne op eller sove throuGh støjen. Interessant nok var denne oscillation korreleret med hjerteslagets hastighed, hvilket indikerer, at det autonome nervesystem deltager i moduleringen af søvnens sårbarhed over for eksterne stimuli 1 . Hukommelsesrelaterede hippocampale rytmer blev også organiseret inden for denne rytme, og mest påfaldende var dets styrke korreleret med kvaliteten af hukommelseskonsolidering hos mennesker. 0,02 Hz-svingningen ser således ud til at være et organiserende princip for gnaver og human ikke-REM-søvn, som modulerer både følsomhed over for miljøet og intern hukommelse. Dette fremhæver igen behovet for multiparametriske og kontinuerlige vurderinger af søvntilstande for at genkende deres funktionalitet og for at identificere steder med potentiel sårbarhed.
Her præsenterer vi en procedure for at udvinde bølgeformen af disse dynamikker, herunder kirurgisk implantation af mus til kombineret EEG / ECoG og EMG-EKG målinger, eksponering for sensoriske stimuli, enNd analyse rutiner. Denne procedure tilvejebringer et grundlag for visning af søvn som en kontinuerligt varierende, dog højorganiseret årvågenhedstilstand, hvor forskellige grundlæggende søvnfunktioner udføres sekventielt. Mere generelt er proceduren anvendelig for fremgangsmåder, der sigter mod at udtrække de spektrale og autonome træk, der går forud for et adfærdsmæssigt resultat under søvn i både sundhed og sygdomstilstande.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle forsøgsprocedurer blev udført i overensstemmelse med Lausanne Animal Care Committee og Service de la Consommation et des Affaires Vétérinaires af Canton de Vaud.
1. Kirurgi til EEG / EMG-EKG-optagelser
- Dyrhus og udvælgelse.
- Opbevares dyr (C57Bl / 6J, 7 - 9 uger, 25 - 30 g) i en 12: 12-h mørk / lyscyklus, enkeltindrettet og under standardbetingelser (40% fugtighed, 22 ° C) med mad og vand Tilgængelig ad libitum .
- Brug kun mandlige individer for at undgå alle påvirkninger af hormoncyklussen i søvn.
- Fremstilling af elektroder.
- Opbyg EEG / ECoG-elektroder (anvendt i trin 1.3.11) ved hjælp af 0,5 cm lange stykker guldtråd (75% Au, 13% Ag og 12% Cu, Diameter: 0,2 mm), hver loddet på toppen af et guld -pladet stålskrue (3 mm længde, 1,1 mm diameter ved bunden; se FigurE 1). Forbered 2 EEG elektroder pr. Dyr og rens dem i 70% ethanol.
- Forbered EMG-EKG-elektroder med 3 - 4 cm lange guldtråde (75% Au, 13% Ag og 12% Cu, Diameter: 0,2 mm). Bøj ledningerne 90 ° vinkel 1 cm fra den ene ende og lav en spole (1 - 2 mm ø) i den anden ende ( Figur 1 ). Mellem de to ender bøjes ledningen for at skabe en lille krumning, der svarer til overfladeprofilen af knoglen mellem cerebellum og lambda.
- Forbered 2 EMG-EKG-elektroder pr. Dyr.
- Forbered en 6-kanals hane til hane hovedstik (raster: 2,54 mm x 2,54 mm, størrelse: 5 mm x 8 mm x 9 mm, stiftstørrelse: 5 mm, se figur 1 ).
- Dæk stikket i bunden af både hun- og hanstifter med tape.
- Tilsæt en lille mængde lodningstråd til spidserne på 4 af de 6 hanstifter for at hjælpe med lodning af EEG- og EMG-EKG-elektroderne under operationen(Se trin 1.3.16).
Figur 1 . Skematisk visning af webstederne til EEG- og EMG-elektrodeimplantation på musens kranium.
Craniotomier # 1 og # 2 er placeret ~ 2 mm lateral til midterlinjen og ~ 2 mm rostral til bregma. Craniotomier # 3 og # 4 er placeret ~ 2 mm rostral til lambda og er henholdsvis 4 og 2 mm laterale til midterlinien. De to EEG-elektroder, der er lavet af lodning en guldtråd til toppen af en forgyldt stålskrue (# 2 og # 4), er på højre halvkugle. De 2 venstre skruer (# 1 og # 3) fungerer som understøtninger. Bemærk, at EMG-EKG-elektroder ikke bør komme i kontakt med disse 2 understøtende skruer. EMG-EKG-elektroder er 3 - 4 cm lange guldtråde, bøjet 90 ° vinkler over 1 cm på deres rostrale ender og viklet (1 - 2 mm ø) på de kaudale ender. 2 EEG og 2 EMG elektrodenS er forbundet til 2 x 3-kanals hovedkontakt ved lodning af en ledning til en hjørnetappe, som vist med de punkterede linjer. Yderligere detaljerede oplysninger om disse elektroder og deres implantation kan findes I 29 . Klik her for at se en større version af denne figur.
- Implantation kirurgi.
- Bedøver dyret i en isofluran inducerende kammer (4. - 5.% isofluran + O2 1 - 2 L / min over 3 - 4 min). Injicer 5 μg / g carprofen intraperitonealt (ip) ved fjernelse af musen fra kammeret forud for stereotaxisk fiksering.
- Følg standardprocedurer for at reparere musen på det stereotaxiske apparat. Opretholde isoflurananæstesi gennem en gasmaske (3% isofluran + O2 under fiksering på 1 l / min). Opretholdelse af kropstemperaturen gennem kirurgi ved 37 ° C usinGa opvarmning pad.
- Beskyt øjnene mod udtørring ved at anvende A-salve af A-vitamin. Kontroller niveauet af kirurgisk tolerance hos dyret ved at teste pokudtrækningsrefleksen.
- Fastgør hovedet ved at placere ørestængerne på kraniet med deres stumpe, omvendte ender i stedet for deres tip (uden at komme ind i ørekanalerne) 29 . Placer mundstangen (som sædvanlig) for at sikre hovedets vandrethed.
BEMÆRK: Fastgørelse minimerer skader på ørerne, hvilket er vigtigt for de akustiske opvågningsforsøg (se afsnit 4 i denne procedure). - Overvåg dyrets åndedræt under proceduren, som bør forblive ved ~ 2 - 3 åndedræt / 2 s. Juster isoflurankoncentrationen i gasdispenseren om nødvendigt; Det bør falde lidt efter lidt under operationen, fra 3% under fiksering til 1,0 - 1,5% mod slutningen af proceduren.
- Injicer 100 μL 0,9% NaCl ip en gang pr. H ved hjælp af en ultrafine insuliN sprøjte for at holde dyret hydreret.
- Sørg for, at dyrets hoved er tændt med en lys lyskilde.
- Rens området med 70% EtOH og jodbaseret desinfektionsmiddel (våd pels forhindrer hår i at komme ind i kirurgisk vindue).
- Løft huden i midten af kraniet med Adson pincet og skær forsigtigt den løftede del af huden langs midterlinjen, fra toppen af halsen til øjnene, ved hjælp af en fin saks. Fjern hovedbunden (~ 1 cm anteroposterior, ~ 0,5 - 0,8 cm lateral).
- Sørg for, at vinduet er stort nok (mod begge sider) for tydeligt at se bregmaen og lambdafissurerne på kraniet. Fastgør huden på begge sider med bulldog serrefiner for at sikre adgang til knoglen.
- Fjern konjunktivvævet (periosteum) ved omhyggeligt at ridse med en skalpel. Rengør området med jodbaseret desinfektionsmiddel og tørr kraniet med en antiseptisk vatpind.
- Brug et skarpt skalpelsblad (størrelse 15), ridse sKull for at opnå en renset og mattificeret knogleoverflade. Brug kun scalpel-spidsen til at ridse et gitterlignende netværk af riller, med en afstand på ~ 1 - 2 mm mellem rillerne.
BEMÆRK: Dette forbedrer fastgørelsen af to-komponent epoxylimen til kraniet i trin 1.3.15. - Brug en microdrill med en 1/005 borestørrelse til at udføre 4 craniotomier (~ 0,7 mm ø) i kraniet på bestemte steder ( figur 1 ; se også trin 1.3.11.3.). Sprænge knoglestøv ved hjælp af en Pasteur pipette og rengør enhver blødning med antiseptiske vatpind.
- Hvis der opstår blødning, skal du sikre dig, at den stoppes helt, inden processen genoptages. Brug en hæmostatisk svamp til at accelerere hæmostasen.
- Brug de to craniotomier på højre halvkugle til at indsætte skruelektroderne (craniotomier # 2 og # 4).
- Brug de to craniotomier på venstre halvkugle til at indsætte forankringsskruer, der stabiliserer implantatet (craniotomier # 1 og # 3).
BEMÆRK: For at øgeSe stabilitet, er der brugt op til 4 forankringsskruer 29 .
BEMÆRK: De præcise stereotaksiske koordinater er: 2 mm fra midterlinien på begge halvkugler og 2 mm rostral fra bregma (kraniotomier nr. 1 og nr. 2), 2 mm rostral fra lambda og 4 mm venstre fra midterlinjen (kraniotomi # 3) 2 mm rostral fra lambda og 2 mm lateral-højre fra midline (kraniotomi # 4). Se figur 1 .
- På venstre halvkugle skrue to guldbelagte skruer gennem craniotomierne til støtte.
- Fastgør skruen i en hæmostatisk klemme og hold den lodret over craniotomi. Nær forsigtigt bunden af skruen oven på craniotomi. Drej det, mens det ikke afviger fra den vertikale position.
BEMÆRK: Kun 1,5 rotationer er tilstrækkelige til at opnå god mekanisk stabilitet og højkvalitetssignaler, samtidig med at trykket på det underliggende væv minimeres 25 . - Til højre skal du skrue fordelenViously prepared electrodes (beskrevet i trin 1.2.1) gennem craniotomierne.
- Fastgør skruen i en hæmostatisk klemme og hold den lodret over craniotomi. Nær forsigtigt bunden af skruen oven på craniotomi. Drej det, mens det ikke afviger fra den vertikale position.
- Ved hjælp af pincet løft forsigtigt grænsen af huden fra nakke muskler. Indsæt EMG-EKG-ledningerne, med de spirede ender inde i musklerne (venstre og højre). Lim midterdelene til kraniet, så den venstre EMG-EKG kommer ud ved siden af den venstre venstre forankringsskrue, mens den højre EMG-EKG er placeret ved siden af den forreste venstre forankringsskrue.
- For at detektere EKG-signaler fra hjertet under søvn, skal du sikre dig, at EMG-EKG-ledningerne indsættes i musklen til en dybde på ~ 0,8 - 1 cm, med deres loopender så langt fra hinanden som muligt.
- Brug en spatel dækket med to-komponent epoxy lim til at påføre limen på kraniet mellem og omkring skruerne. Lad det tørre i lyset, men beskytt øjets øjne mod for meget lyn.
BEMÆRK: Skruernes baser skal være dækket, og kun ledningerne skal være tilgængelige, nye frOm limen. - Sørg for, at limen fylder rummet mellem de to EMG-EKG-elektroder, der strækker sig fra overfladen, således at der ikke er elektrisk kontakt mellem dem og støtteskruerne. Vær forsigtig med at ikke klæbe huden til kraniet; Huden skal forblive fri til at bevæge sig rundt om limen.
- Skær EEG og EMG-EKG ledningerne sådan, at de når ~ 0,5 mm ud af limen. Lod de fire ben i hjørnet af stikket udarbejdet i trin 1.2.3. Til de fire ledninger, der kommer ud af limen ( figur 1 ).
- Prøv at placere stikstifterne så tæt som muligt for at minimere implantatets højde; Brug en lille krokodilklemme fastgjort til stereotaktisk holderen, der fastholder stikets placering. Minimer tiden i kontakt med loddetippen, da dette hurtigt opvarmer skruerne.
- Fyld mellemrummet mellem limen og stikket med dentalcement for at dække de lodde dele. Opret smooAnsigter og undgå skarpe kanter, der kan skade dyret. Undgå at røre ved huden, da det fører til kløe.
- Fjern bulldog serrefinerne. Hvis det er nødvendigt, lukk såret ved hjælp af en steril suturtråd (absorberbar sutureringsfiber) foran og bag stiket, hvilket skaber enkle afbrudte lukkemønstre og to firkantede knuder (5-0 FS-3 nål, 45 cm filament).
- Overvåg dyret, indtil det er helt vågen. Væg dyret efter operationen og returner det til sit hjem bur for genopretning.
- Postoperativ pleje og forbindelse til systemet.
- Overvåg dyret hver dag i en uge. Kig efter vægttab, reduceret eller abnorm aktivitet og tegn på infektioner. Følg scoringsproceduren, der er opstillet af dine veterinærmyndigheder.
- 5-6 dage efter operationen skal du tilslutte optagelseskablet til hovedstikket på dyret og efterlade det i sit husbage. Vent en ekstra 4 - 5 dage før starten af recorDing så dyret er habituated til tilstanden og sover naturligt.
2. Grundlæggende scoring af EEG / EMG-EKG-data for Vigilance State Determination
- Optag EEG- og EMG-EKG-data i løbet af 48 timer med en kommerciel polysomnografisk software ( f.eks. Somnologica, SleepSign eller Sirenia). Brug typiske indstillinger, såsom 2.000x gain; En 2.000 Hz-prøveudtagningshastighed ved opkøb, nedsamplet til 200 Hz efter anskaffelse; Og et 0,7-Hz højpasfilter til EEG og et 10 Hz højpassfilter til EMG-EKG.
- Eksporter dataene i filformatet ".edf".
- Åbn ".edf" -filerne med en brugerdefineret ( f.eks. I Matlab) software, der automatisk klassificerer hver 4-epoke som vågen, ikke-REM-søvn, REM-søvn og tilsvarende artefakter.
BEMÆRK: Alternativt findes der flere semi-automatiserede scoringssoftware. Denne procedure beskriver nogle af de grundlæggende trin, der skal gøres for at oprette scoring wMed den scoring software, der anvendes her; Andre semi-automatiske scoring systemer kan være baseret på andre parametre. - Brug softwaren til at adskille ".edf" -filerne i 4 gange 12 timer med optagelser.
- Fjern genstande, der opstår som følge af EMG-ECG-aktivitet, der findes i EEG-signalet eller fra en uadskillelig adfærdsmæssig tilstand 1 , 29 .
- Beregn gennemsnittet af de absolutte EEG- (EEG- middelværdier ) og EMG-værdier (EMG- middelværdier ) i løbet af de 12 h optagelser fra henholdsvis EEG- og EMG-EKG-sporene.
- Identificer de gennemsnitlige EEG / EMG værdier for hver 4-epoke (EEG epok / EMG epok ).
- Klassificere epokerne som "Wake" når EEG- epok <EEG- middel og EMG- epok > EMG betyder og som "Non-REM sleep", når EEG- epok > EEG- middel og EMG- epok <EMG betyder.
- Klassificer de epoker, der ikke er Atisfy disse kriterier med en korrigerende algoritme baseret på foregående og efterfølgende epoker.
- Klassificer epokerne som REM-søvn, når EEG- epok <EEG- middel og EMG- epok <EMG betyder .
- Definer de kritiske punkter, såsom overgange fra ikke-REM-søvn til at vække, REM-søvnperioder og mikro-arousaler under ikke-REM-søvn. Visuelt inspicere scoringen for at sikre korrekt vigilance tilstand bestemmelse 29 , 30 .
BEMÆRK: Udfør altid en endelig visuel inspektion og validering af scoringen.
3. Analyse af den langsommelige oscillation for EEG og hjerteslag
- For denne analyse skal du kun vælge ikke-REM-søvnkonkurrencer, der varer ≥ 96 s ( dvs. mindst 24 epoker på 4 s); Se figur 2 .
BEMÆRK: Tilpassede rutiner er tilgængelige efter anmodning 1 .
Figur 2 . Bestemmelse af Sigma Power Dynamics under uforstyrret non-REM Sleep.
( A ) Top, EEG (sort) og EMG-EKG (grå) spor i løbet af de første 100 min af lysfasen i en mus. Vigilance stater er angivet med den farvede bjælke oven på de rå spor. Midt, typisk eksempel på en kontinuerlig (> 96 s) ikke-REM sovebold. Nederst, et tilfældigt valgt 16-s interval, der illustrerer underopdelingen i 4-s epoker. Følgende trin i analysen er kun vist for disse fire epoker, men det gælder for hver epoke indeholdt i kampen. ( B ) Top, fire på hinanden følgende FFT'er genereret fra 4-epokerne vist i bundpanelet A. A. Sigma-båndet (10-15 Hz) er skygget i rødt. Øverst til højre, 1 s indsats fra den sidste epoke, der viser de nuværende R-bølger i det kvadratiske EMG-EKG-signal. Bund, tidskursus for Sigmaffekt ekstraheret fra det tilsvarende spektrum ovenfor. De stiplede linjer illustrerer fortsættelsen af effektværdierne før og efter de fire ikke-REM-udfald, der er valgt til visning. ( C ) Normaliseret sigmaffekt (rød) og hjerteslag (i BPM) (grå) tidskurser med den del, der er vist i (B), der er placeret mellem de lodrette punkterede linjer. Nedenfor er det tilsvarende filtrerede EEG signal i sigma båndet (10-15 Hz). ( D ) Resultat af FFT'et beregnet på sigma-effekt-tidskurset vist i (C), hvilket demonstrerer en dominerende top ved 0,016 Hz. Klik her for at se en større version af denne figur.
- Uddrag kraftværdierne for sigma frekvensbåndet (10-15 Hz) spektralkraft i 4-s-bakker ( Figur 2 A og B ) ved hjælp af beregninger af hurtige Fourier-transformer (FFT)"> 1.
- Beregn baseline spektral effekt for ikke-REM søvn ved at gennemsnitliggøre værdierne i hver frekvensbakke for alle ikke-REM soveperioder (artefakter og overgangsperioder mellem årvågenhedstilstande er udelukket fra denne gennemsnit). Normaliser sigmaffektværdierne for hver epoke til den gennemsnitlige effekt af sigmabåndet under ikke-REM-søvn i den relevante periode. Plot mod tid ( figur 2 C ).
- Beregn FFT af sigma power time kurset med Hamming windowing for at afsløre oscillatorfrekvenskomponenterne i effektdynamikken ( Figur 2 D ) 1 .
- Bemærk, at da de ikke-REM soveventer har forskellige varigheder, har de resulterende FFT'er forskellige frekvensopløsninger. Interpolere for at justere opløsningen til den højeste, der opnås fra den længste ikke-REM søvnbøjle og gennemsnittet FFT'erne for alle bouts.
- Fortsæt denne analyseEs for at beskrive faseforholdene mellem dynamikken i EEG- og EKG-signaler.
- Uddrag hjerteslagsdata fra det kvadratiske EMG-EKG-signal efter 30 Hz højpasfiltrering ved hjælp af passende rutiner til peak-detektion af R-bølgen.
BEMÆRK: At begrænse det mindste tidsinterval mellem to på hinanden følgende R-bølger til 80 ms hjælper med til at undgå optagelse af lejlighedsvise artefaktive toppe på grund af muskelstrækninger 1 . - Mål RR-intervallerne, og bereg den gennemsnitlige hjertefrekvens i slag pr. Minut (BPM) hver 4-s kasse ( Figur 2 B og C ).
4. Eksponering for støj
- Generer lyde (dvs. hvid støj) gennem en brugerdefineret software. Indstil varigheden til 20 s og intensiteten til 90 dB SPL (målt inde i buret). Spil lydene gennem standard aktive højttalere 1 .
- Efter operationen, under opholdet til recorDing tilstand, spil eksperimentelle lyde tilfældigt, flere gange i løbet af dagen og på forskellige øjeblikke 1 .
- I den eksperimentelle tilstand (under optagelse af EEG / EMG / EKG-data) skal du spille støj pseudo-tilfældigt i løbet af de første 100 min ved lysindgang (ZT0). For at afspille støj skal du opfylde følgende betingelser 1 :
- Sørg for, at musen har været i ikke-REM-søvn i> 40 s.
- Sørg for, at den tidligere eksponering skete mere end 4 minutter før.
BEMÆRK: Dette resulterer i ~ 15 engagementer pr. Session.
- Marker begyndelsen af optagetiden og begyndelsen af hver støjeksponering. Hold eksperimentet blind til spektral sammensætningen af ikke-REM søvn under proceduren.
- Indhent alle data med polysomnografisk software 1 , 29 .
5. Retrospektiv analyse af søvn baseret på adfærdsmæssigt resultat underUdsættelse for støj
- Manuelt score EEG / EMG-ECG spor i en 4-s opløsning uden kendskab til støj eksponering gange 1 .
- Brug et brugerdefineret script til at udtrække EEG / EMG-ECG / støjeksponeringsdata 1 .
- Score som sleep-through, når både EEG- og EMG-signaler forbliver uændrede under støjeksponering ( Figur 3A ). Overvej en wake up, når EEG amplitude falder og EEG frekvensen stiger, i kombination med detekteret muskulær aktivitet på EMG-ECG elektroden ( Figur 3B ).
- Kassere forsøg, hvor dyrene vågnede i pre-stimulusperioden eller i de første 4 s af støjeksponering ( Figur 3D ).
- Definer arousal succesrate som andelen af wake-up forsøg i alle inkluderede forsøg ("Wake-up" og "Sleep-through").
- I alle inkluderede forsøg skal du undersøge dynamikken i sigmakraften i løbet af denE pre-stimulus periode ( Figur 3 E ) 1 .
Figur 3 . Adfærdsmæssige resultater som reaktion på støjbegyndelse: Repræsentative resultater, der blev tilbageholdt eller udelukket fra analyse.
( AD ) Råspor af EEG (sort) og tilsvarende EMG-EKG (grå) signaler i 40 s før støjbegyndelse og i løbet af 20 s af støj, repræsenteret af det blåskraverede område. Vigilance states er angivet i farvekoden. For at illustrere data, der blev inkluderet i analysen, vises repræsentative "Sleep-through" ( A ) og "Wake-up" ( B ) -hændelser. Resultater, der blev kasseret indeholdt overgange til REM-søvn ( C ) og et prædiktivt "Wake-up" -svar ( D ). Indsætet viser en udvidelseDed del af EEG og EMG-ECG spor karakteristisk for REM søvn. ( E ) Typiske eksempler på sigma-effektdynamik i 40'ens vindue før støjbegyndelse under en "Sleep-through" (venstre) og en "Wake-up" (højre) begivenhed. Det rå EEG-sporbåndsfilter filtreret til sigmabåndet er vist ovenfor. Det blå område repræsenterer støjbegyndelsen. Klik her for at se en større version af denne figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 2 A (øverste panel) viser 100 min. Spontane søvnvågens adfærd registreret ved hjælp af polysomnografiske elektroder implanteret som beskrevet (se figur 1 ). Øgene og faldene i EEG- og EMG-amplitude ved ikke-REM-søvnbetændelse er tydeligt synlige. Intermitterende REM søvn er præget af et fald i EEG amplitude og et yderligere fald i EMG tone, der ikke er synlig på denne komprimerede tidsskala. Zoomning ind på en ikke-REM sovebøjle afslører de langsomme bølger med høj amplitude i EEG og i EMG-EKG-sporen den lavmuskelaktivitet, som RR-intervallerne på hjertefrekvensen overlejrer som vertikale afbøjninger ( figur 2 A , Mellem og nederste paneler). En FFT afslører SWA's dominans i alle 4 s epoker ( figur 2 B ). Plotte den mellemliggende sigmEn kraft (10-15 Hz, rød skyggebøjle) for hver af disse epoker afslører dens varierende tidskursus sammen med variationer i hjertefrekvens med den modsatte retning. Gennemførelsen af denne analyse over hele ikke-REM-udfaldet og normalisering for at betyde effektværdier eliminerer de regelmæssige variationer i sigmakraft omkring gennemsnittet ( figur 2 C ). Fourier-analyse over dette strømtidsforløb viser en stor top omkring 0,02 Hz, hvilket afspejler den periodiske stigning i sigmaffekt i 50-s intervaller ( figur 2D ).
For at undersøge funktionen af 0,02 Hz-oscillationen i arousabilitet blev mus udsat for 20 s pulser på 90 dB, når de sovede, under de beskrevne betingelser. Figur 3 viser nogle af de eksperimentelle resultater af sådanne støjeksponeringer. Da mus ikke vågnede under støj, og EEG og EMG-ECG-kurver forblev uændrede, var resultatet klassenIfied som en "Sleep-through" ( Figur 3 A ). Når EEG amplitude faldt og EMG aktivitet blev observeret, blev resultatet scoret som en "Wake-up" ( Figur 3 B ). Lejlighedsvis skiftede musene til REM-søvn under et forsøg ( Figur 3 C ) eller vågnede i 40-s intervalet før lydstart ( Figur 3 D ). Disse hændelser blev udelukket fra analysen, fordi vores interesse var specifikt at identificere kendetegnene ved konsolideret ikke-REM-søvn, der går forud for resultatet af støjeksponering ("Sleep-through" eller "Wake-up"). Beregning af sigmakraften i 40-s-perioden forud for støjstimulering viste, at 0,02 Hz-svingningen var ved dens trug, da der opstod en "Sleep-through" ( Figur 3 E , venstre panel), mens det toppede for en "Wake- op" Begivenhed ( figur 3 E , højre panel). Derfor identificerer fasen af 0,02 Hz-svingningen i sigmakraft som et kendetegn for søvntilstande med variabel modstandsdygtighed over for støj ved at scorere en muses ikke-REM-søvn efterfølgende, baseret på et variabelt adfærdsmæssigt resultat for akustisk stimulering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Her viser vi, hvordan man etablerer en kontinuerlig tidsmæssig profil for ikke-REM-søvn, der integrerer EEG-, EMG- og EKG-variabler. Dette er et første skridt i retning af at udvikle en integreret beskrivelse af musesøvn, som kan hjælpe med at identificere den tidligere uigenkaldelige tidsskala, over hvilken høj og lav modstandsdygtighed over for støj er organiseret under ikke-REM-søvn 1 . En lignende tidsmæssig struktur blev også beskrevet i human ikke-REM søvn gennem en analog analyse 1 .
Fremgangsmåden, der præsenteres her, opfylder to mål. For det første bemærker vi, at polysomnografiske teknikker pålideligt kan give både EEG- og EMG-EKG-signaler under hele ikke-REM-søvnperioderne i mus. Hjerteslag er mest tydeligt i EMG-spor under REM-søvn på grund af muskelatoni, og det bliver mere skjult i ikke-REM-søvn på grund af øget muskeltonus og lejlighedsvis muskeltraktioner. Indføring af EMG-EKG-elektroder mereDybt ind i musklerne og holde dem så fjernt som muligt øger amplitude af hjertets R-bølger, således at de tydeligt fremkommer fra baggrundsmuskeltonus. Rutiner for peak detektion udtræk derefter hjertefrekvensen fra det ikke-REM søvn EMG-ECG signal og tillade kvantificering af dets variabilitet.
Telemetri-baserede teknologier til samtidig monitorering af EEG / EMG og EKG anvendes i stigende grad, men kvaliteten af de signaler, der kræves til grundig spektralanalyse, forbliver ringere i form af båndbredde og stabilitet. Endvidere er selv enkeltkanalstransmittere af stor størrelse, og deres implantation i den cervikale subkutane region eller i kropshulrummet kan påvirke dyrets trivsel og forstyrre søvn. Ikke desto mindre er det nødvendigt at videreudvikle sådanne anordninger for at udvide området for centrale og autonome parametre, som samtidig kan følges under uforstyrret søvn hos mus, hvilket er dyrmodellen af cHoice til søvnstudier. I kombination med teknikker som nakkestøtter, som muliggør indsamling af data fra både ikke-REM og REM søvn hos mus med uændrede spektrale profiler 1 , 19 , kan multiparametriske målinger i søvn nu kombineres med kontrolleret adfærdstestning.
For det andet kan den analytiske tilgang, vi præsenterer her, også anvendes på lokale feltpotentialer til at definere hjerneområdet, der er involveret i at skabe interesse for 1 . Desuden er den anvendelig for billeddannelsesteknikker, der er hurtig nok til at rapportere om neuronpopulationernes spektrale opførsel og for både kontinuerlige ( f.eks. Spektrale bånd) og diskrete ( f.eks. Pulsfrekvens eller respiration) variabler. Dens tidsopløsning er kun begrænset af varigheden af den epoke, der er valgt til at score årvågenhedstilstanden. I det væsentlige er standard spektrale analyser af signalerne afledt af ikke-REM sLeep bouts efterfølges af en justering af effekt densitet værdier af individuelle signaler for hver epoke. Derefter bruges en spektralanalyse af disse strømdynamikker til at kvantificere periodiciteter i strukturen. I både mus og mennesker gav vores tilgang en oscillation på 0,02 Hz, med sammenlignelige egenskaber 1 , som kvalificerede det som et samlende kendetegn for pattedyrs søvnstruktur.
Et kritisk trin var den funktionelle validering af den observerede periodicitet ved at scorere ikke-REM-søvn efterfølgende baseret på den sovende muss adfærdsmæssige reaktivitet til støj. Her var valget af en støjstimulering, der førte til et variabelt adfærdsmæssigt udfald, der forårsager vækkelse eller søvn, afgørende. Stærke sensoriske stimuli, der forårsager vækkelse i de fleste eksponeringer, ville ikke ophæve 0,02 Hz-svingningen, fordi vågningen ville blive håndhævet fra alle faser. I modsætning hertil ville en for svag stimulus ikke konsekvent afsløre faseforholdet til 0,02-Hz oscillation. Tilsvarende vil enhver observeret periodicitet i et målt parameter sæt være nødvendigt at gå sammen med det variable resultat. For eksempel har vi i det her anførte tilfælde kun skelnet mellem vækkelses- eller sovende hændelser, idet vi ikke overvejer det nøjagtige øjeblik for vækketid under støjeksponeringen eller varigheden af den efterfølgende vævstilstand (se dog 1 ) . Ved hjælp af korte stimuli ved forskellige intensiteter 24 , 25 , 28 kan det hjælpe med at afgrænse de nøjagtige faseforhold mellem 0,02 Hz-svingning og vågne op. Endvidere kan varierende lydkompleks af lydene modulere arousability som en funktion af den nylige historie af søvnvågens adfærd, kødet, tilstedeværelsen af nestlings eller andre former for nylige erfaringer. En anden mulighed kan være at undersøge, om forekomsten af mikroarousaler eller fulde ophidselser afhænger af en given øjeblikkelig søvntilstand. Scoringen af søvn baseret på et variabelt adfærdsmæssigt resultat kunne belyse den funktionelle mikroarkitektur af søvn mere generelt. Mens vi og andre har testet reaktivitet over for støjeksponering 1 , 28 , opvågning som reaktion på andre sensoriske modaliteter, overvågningstilstandsovergange 14 eller drømrapporter kan vurderes til at udvinde de tilsvarende korrelater for den foregående søvn. Desuden vil det være meget interessant at teste søvnforstyrrelsespatienter med hensyn til deres følsomhed overfor ekstern forstyrrelse og til en potentiel forstyrrelse af 0,02 Hz-svingningen. Søvnforstyrrelser kan føre til kardiovaskulær forstyrrelse, mens kardiovaskulær risiko kan føre til søvndysregulering 31 , 32 , hvilket gør undersøgelser af hjernehjertekoordinering under 0,02 Hz-svingning potentielt relevant for at forstå denne bidirektionJeg er afhængig.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer, at de ikke har nogen konkurrerende økonomisk interesse.
Acknowledgments
Vi takker alle laboratoriemedlemmer for deres bidrag til at skrive og omhyggeligt læse dette manuskript. Vi er taknemmelige for Paul Franken for at stimulere diskussioner, Dr. Gisèle Ferrand for nyttige kommentarer til den kirurgiske protokol og Dr. Jean-Yves Chatton for at levere de originale Labview-eksekverbare filer til støjeksponeringen. Finansiering blev ydet af det schweiziske nationale videnskabsstiftelse (Grants 31003A_146244 og 31003A_166318) og Etat de Vaud.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-components epoxy glue | Henkel | Loctite EA 3450 | |
| Absorbable Suturing Fiber (Prolene) | Ethicon | 5-0 FS-3 | |
| Adson Forceps | FST | 11006-12 | |
| Antiseptic swab | VWR | 149-0332 | |
| Attane Isoflurane | Piramal | Isoflurane 250mL | |
| Connectors 3 x 2-channels | ENA AG | 2.316 | Raster 2.54 x 2.54 mm; size 5 x 8 x 9 mm; pin size 5 mm; http://www.ena.ch/ |
| Dragonfly commutator | Dragonfly | Model #SL-10 | |
| EMBLA amplifier | EMBLA | A10 amplifier | |
| Fine scissors | FST | 14108-09 | |
| Flat Head Gold-plated steel screw | J.I. Morris | FF00CE125 | https://jimorrisco.com/ |
| Gold wire | CMSA | T.69 5gr | http://www.cmsa.ch/en/ |
| Hemostatic sponge | Pfizer | Gelfoam | |
| iodine-based disinfectant (Betadine) | Mundipharma | standart solution 60mL | |
| Komet drill steel 1/005PM104 | UNOR AG | 22310 | |
| Matlab Analysis Software | MathWorks | R2016b | https://ch.mathworks.com/products/matlab.html |
| Microdrill | Fine Science Tools | 96758 | |
| Mouse Gas Anesthesia Head Holder | Kopf Instruments | Model 923-B | http://kopfinstruments.com/product/model-923-b-mouse-gas-anesthesia-head-holder/ |
| Ophtalmic ointment | Pharmamedica | VITA-POS | |
| Paladur (liquid) | UNOR AG | 2260215 | for dental cement |
| Palavit (powder) | UNOR AG | 5410929 | for dental cement |
| Small Animal Stereotaxic Frame | Kopf Instruments | Model 930 | http://kopfinstruments.com/product/model-930-small-animal-stereotaxic-frame-assembly/ |
| Soldering wire | Stannol | 593072 | |
| Temperature controller - Mini rectal probe | Phymep | 4090502 | http://www.phymep.com/produit/dc-temperature-controller/ |
| Temperature controller- heating pad | Phymep | 4090205 | http://www.phymep.com/produit/dc-temperature-controller/ |
References
- Lecci, S., et al. Coordinated infra-slow neural and cardiac oscillations mark fragility and offline periods in mammalian sleep. Sci Adv. 3 (2), 1602026 (2017).
- Rechtschaffen, A., Kales, A. A manual of standardized terminology, techniques and scoring system for sleep of human subjects. U.S. Department of Health, Education, and Welfare. , Washington, DC. (1968).
- Blake, H., Gerard, R. W. Brain potentials during sleep. Am J Physiol. 119, 692-703 (1937).
- Rechtschaffen, A., Hauri, P., Zeitlin, M. Auditory awakening threshold in REM and NREM sleep stages. Percept Mot Skills. 22 (3), 927-942 (1966).
- Achermann, P., Borbély, A. A. Low-frequency (< 1 Hz) oscillations in the human sleep electroencephalogram. Neuroscience. 81 (1), 213-222 (1997).
- Aeschbach, D., Borbély, A. A. All-night dynamics of the human sleep EEG. J. Sleep Res. 2 (2), 70-81 (1993).
- Astori, S., Wimmer, R. D., Lüthi, A. Manipulating sleep spindles--expanding views on sleep, memory, and disease. Trends Neurosci. 36 (12), 738-748 (2013).
- Brown, R. E., Basheer, R., McKenna, J. T., Strecker, R. E., McCarley, R. W. Control of sleep and wakefulness. Physiol Rev. 92 (3), 1087-1187 (2012).
- Buzsáki, G., Wang, X. J. Mechanisms of gamma oscillations. Annu Rev Neurosci. 35, 203-225 (2012).
- Rasch, B., Born, J. About sleep's role in memory. Physiol Rev. 93 (2), 681-766 (2013).
- Halász, P., Bòdizs, R. Dynamic structure of NREM sleep. , Springer. (2013).
- Terzano, M. G., Parrino, L., Spaggiari, M. C. The cyclic alternating pattern sequences in the dynamic organization of sleep. Electroencephalogr Clin Neurophysiol. 69 (5), 437-447 (1988).
- Gottesmann, C. Detection of seven sleep-waking stages in the rat. Neurosci Biobehav Rev. 16 (1), 31-38 (1992).
- Benington, J. H., Kodali, S. K., Heller, H. C. Scoring transitions to REM sleep in rats based on the EEG phenomena of pre-REM sleep: an improved analysis of sleep structure. Sleep. 17 (1), 28-36 (1994).
- Sullivan, D., Mizuseki, K., Sorgi, A., Buzsáki, G. Comparison of sleep spindles and theta oscillations in the hippocampus. J Neurosci. 34 (2), 662-674 (2014).
- Vas, S., et al. Differential adaptation of REM sleep latency, intermediate stage and theta power effects of escitalopram after chronic treatment. J Neural Transm (Vienna). 120 (1), 169-176 (2013).
- Schiffelholz, T., Aldenhoff, J. B. Novel object presentation affects sleep-wake behavior in rats. Neurosci Lett. 328 (1), 41-44 (2002).
- Wimmer, R. D., et al. Sustaining sleep spindles through enhanced SK2-channel activity consolidates sleep and elevates arousal threshold. J Neurosci. 32 (40), 13917-13928 (2012).
- Fernandez, L. M. J., et al. Highly dynamic spatiotemporal organization of low-frequency activities during behavioral states in the mouse cerebral cortex. Cereb Cortex. , (2016).
- Franken, P. Long-term vs. short-term processes regulating REM sleep. J Sleep Res. 11 (1), 17-28 (2002).
- Feige, B., et al. The microstructure of sleep in primary insomnia: an overview and extension. Int J Psychophysiol. 89 (2), 171-180 (2013).
- Parrino, L., Halasz, P., Tassinari, C. A., Terzano, M. G. CAP, epilepsy and motor events during sleep: the unifying role of arousal. Sleep Med Rev. 10 (4), 267-285 (2006).
- Akinseye, O. A., et al. Sleep as a mediator in the pathway linking environmental factors to hypertension: a review of the literature. Int J Hypertens. 2015, 926414 (2015).
- Campbell, K., Muller-Gass, A. The extent of processing of near-hearing threshold stimuli during natural sleep. Sleep. 34 (9), 1243-1249 (2011).
- Nir, Y., Vyazovskiy, V. V., Cirelli, C., Banks, M. I., Tononi, G. Auditory responses and stimulus-specific adaptation in rat auditory cortex are preserved across NREM and REM sleep. Cereb Cortex. 25 (5), 1362-1378 (2015).
- Dang-Vu, T. T., et al. Interplay between spontaneous and induced brain activity during human non-rapid eye movement sleep. Proc Natl Acad Sci USA. 108 (37), 15438-15443 (2011).
- Elton, M., et al. Event-related potentials to tones in the absence and presence of sleep spindles. J Sleep Res. 6 (2), 78-83 (1997).
- McKinney, S. M., Dang-Vu, T. T., Buxton, O. M., Solet, J. M., Ellenbogen, J. M. Covert waking brain activity reveals instantaneous sleep depth. PLoS One. 6 (3), 17351 (2011).
- Mang, G. M., Franken, P. Sleep and EEG phenotyping in mice. Curr Protoc Mouse Biol. 2 (1), 55-74 (2012).
- Borbély, A. A., Tobler, I., Hanagasioglu, M. Effect of sleep deprivation on sleep and EEG power spectra in the rat. Behav Brain Res. 14 (3), 171-182 (1984).
- Jurysta, F., et al. The impact of chronic primary insomnia on the heart rate--EEG variability link. Clin Neurophysiol. 120 (6), 1054-1060 (2009).
- Silvani, A., Calandra-Buonaura, G., Benarroch, E. E., Dampney, R. A. L., Cortelli, P. Bidirectional interactions between the baroreceptor reflex and arousal: an update. Sleep Med. , (2015).
