Summary
Ici, nous présentons des procédures expérimentales et analytiques pour décrire la dynamique temporelle des variables neuronales et cardiaques du sommeil non-REM chez la souris, qui modulent la réactivité du sommeil aux stimuli acoustiques.
Abstract
Trois états de vigilance dominent la vie des mammifères: l'éveil, le sommeil non-rapide des yeux (non-REM) et le sommeil paradoxal. Comme plus de corrélats neuronaux de comportement sont identifiés chez les animaux en mouvement libre, cette subdivision à trois fois devient trop simpliste. Au cours de l'éveil, des ensembles d'activités corticales globales et locales, ainsi que des paramètres périphériques tels que le diamètre pupillaire et l'équilibre sympathovagal, définissent différents degrés d'éveil. Il ne reste pas clair dans quelle mesure le sommeil forme également un continuum d'états du cerveau - dans lequel le degré de résilience aux stimuli sensoriels et à l'excitation, et peut-être à d'autres fonctions du sommeil, varie progressivement et comment les états physiologiques périphériques co-varient. La recherche de l'avancement des méthodes pour surveiller les paramètres multiples pendant le sommeil, ainsi que l'attribution des constellations de ces attributs fonctionnels, est essentielle pour affiner notre compréhension du sommeil en tant que processus multifonctionnel pendant lequel de nombreux effets bénéfiques doivent être exÉcouté. L'identification de nouveaux paramètres caractérisant les états du sommeil ouvrira des opportunités pour de nouvelles voies diagnostiques dans les troubles du sommeil.
Nous présentons une procédure pour décrire les variations dynamiques des états de sommeil non-REM de la souris via les signaux combinés de surveillance et d'analyse des électroencéphalogrammes (EEG) / électrocorticogramme (ECoG), électromyogramme (EMG) et électrocardiogramme (ECG) en utilisant des techniques d'enregistrement polysomnographique standard. En utilisant cette approche, nous avons constaté que le sommeil non-REM de la souris est organisé en cycles d'oscillations neuronales et cardiaques coordonnées qui génèrent des intervalles de 25 secondes successifs de fragilité élevée et faible aux stimuli externes. Par conséquent, les systèmes nerveux central et autonome sont coordonnés pour former des états de sommeil comportementalement distincts pendant le sommeil non-REM consolidé. Nous présentons des manipulations chirurgicales pour la surveillance polysomographique ( c'est-à-dire EEG / EMG combinée avec ECG) pour suivre ces cycles dans la souris librement dormante, l'analyse à quantiPar leur dynamique et les protocoles de stimulation acoustique pour évaluer leur rôle dans la probabilité de se réveiller. Notre approche a déjà été étendue au sommeil humain et promet de démêler les principes d'organisation communs des états de sommeil non-REM chez les mammifères.
Introduction
Le sommeil des mammifères est un état de repos comportemental et de résilience aux stimuli environnementaux. Malgré cette uniformité apparente, les paramètres polysomnographiques et autonomes indiquent que le sommeil se déplace entre des états neuronaux et somatiques qualitatifs et quantitativement différents sur diverses échelles temporelles et spatiales 1 . Pendant quelques minutes à plusieurs dizaines de minutes, le basculement entre le sommeil non REM et REM se produit. Le sommeil non-REM s'accompagne d'une activité de grande amplitude et de basse fréquence dans l'EEG, avec un pic spectral autour de ~ 0,5 à 4 Hz, alors que le sommeil REM montre une activité EEG régulière dans la bande theta (6-10 Hz), ainsi que Muscle atonia 2 . Dans le sommeil non-REM, les humains traversent la lumière (S2) et le sommeil lent profond (SWS). Comme leur nomination les indique, ces deux étapes présentent des seuils d'excitation inférieurs et supérieurs 3 , 4 , respectivement, et ils diffèrent principalement dans la densité de basse fréquencePuissance EEG corticale, appelée activité de l'onde lente (SWA, 0,75 - 4 Hz). La non-uniformité persiste dans les épisodes individuels de S2 et SWS à la minute à la sous-deuxième échelle, tellement documenté par la présence variable de la SWA au cours des 5 , 6 , mais aussi par l'EEG et les rythmes de potentiel de terrain au Fréquences plus élevées, y compris les ondes de broche dans la bande sigma (10-15 Hz) et les rythmes gamma (80 - 120 Hz) (pour une évaluation, voir 7 , 8 , 9 , 10 ).
Plutôt que d'être subtil, ces variations changent l'état cortical endormi chez les humains aux extrêmes du spectre. Pour le sommeil non-REM, ceux-ci vont d'une prédominance de SWA à des états qui se rapprochent d'une activité de réveil car ils contiennent une proportion importante de composants à haute fréquence 11
Le sommeil non-REM de mammifère est loin d'être uniforme. Cependant, si cette non-uniformité conduit à des états qui diffèrent en fonction et les attributs comportementaux n'est pas clair. Dans plusieurs types de troubles du sommeil, le sommeil continu est perturbé par des éveils spontanés et un comportement moteur inapproprié. En outre, les analyses spectrales montrent des altérations de la présence relative de fréquences plus élevées dans l'EEG 21Et dans les paramètres autonomes, tels que les taux de respiration et le battement cardiaque 22 . La séquence ordonnée des états de sommeil stables est donc perturbée, et les éléments de l'excitation corticale et / ou autonome s'observent de manière incontrôlée. Par conséquent, la compréhension du continuum des états du sommeil est une pertinence possible pour la maladie. En outre, la perturbation du sommeil par le bruit environnemental en milieu urbain est associée à des risques généraux pour la santé, ce qui rend crucial pour identifier les moments de vulnérabilité accrue pendant le sommeil 23 .
Les expériences d'évasion comportementale chez les personnes endormées indiquent qu'il est plus difficile de se réveiller du sommeil non-REM qui a dominé par la SWA (stade S3), tandis que le sommeil non-REM (stade S2) et le sommeil REM montrent des seuils d'excitation comparables et inférieurs 4 . Le traitement cortical des stimuli sonores courts varie considérablement entre le sommeil REM, S2 et S3 24 ,25 , indiquant que les modèles d'activité corticale spécifiques à l'état modulent les premiers stades du traitement sensoriel. Pour le sommeil non-REM chez les humains, la propension à se réveiller en réponse au bruit varie avec la présence d'ondes de broche et de rythmes alpha dans l'EEG 26 , 27 , 28 . La rythmicité thalamocortique pendant les broches s'accompagne d'une inhibition synaptique améliorée aux niveaux thalamique et cortical, ce qui est censé contribuer à l'atténuation du traitement sensoriel 7 .
Comment les périodes de sommeil résistant au bruit et les périodes de sommeil sont-elles réparties dans le temps et quels sont leurs déterminants? Chez les souris et les humains, nous avons récemment identifié une oscillation infrarouge de 0,02 Hz dans les rythmes neuronaux. Selon la phase de cette oscillation de 0,02 Hz, les souris ont montré une réactivité variable à des stimuli externes, soit en train de réveiller soit de dormirGh le bruit. Il est intéressant de noter que cette oscillation a été corrélée avec le rythme cardiaque, ce qui indique que le système nerveux autonome participe à la modulation de la vulnérabilité du sommeil aux stimuli externes 1 . Les rythmes hippocampiques liés à la mémoire ont également été organisés à ce rythme et, de manière frappante, leur force est corrélée à la qualité de la consolidation de la mémoire chez l'homme. L'oscillation de 0,02 Hz semble donc être un principe organisateur du rongeur et du sommeil humain non-REM qui module à la fois la sensibilité à l'environnement et le traitement de la mémoire interne. Cela souligne à nouveau la nécessité d'évaluations multiparamétriques et continues des états du sommeil pour reconnaître leur fonctionnalité et identifier les sites potentiellement vulnérables.
Ici, nous présentons une procédure pour extraire la forme d'onde de ces dynamiques, y compris l'implantation chirurgicale de souris pour les mesures combinées EEG / ECoG et EMG-ECG, l'exposition à des stimuli sensoriels, uneNd routines d'analyse. Cette procédure fournit une base pour regarder le sommeil comme un état de vigilance en constante évolution, mais très organisé au cours duquel différentes fonctions fondamentales du sommeil sont exécutées séquentiellement. Plus généralement, la procédure s'applique aux approches visant à extraire les caractéristiques spectrales et autonomes qui précèdent un résultat comportemental pendant le sommeil dans les états de santé et de maladie.
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Protocol
Toutes les procédures expérimentales ont été effectuées conformément au Comité de soins animaux de l'Université de Lausanne et au Service de la Consommation et des Affaires Vétérinaires du Canton de Vaud.
1. Chirurgie pour les enregistrements EEG / EMG-ECG
- Logement et sélection d'animaux.
- Conserver les animaux (C57Bl / 6J, 7-9 semaines, 25 à 30 g) dans un cycle de 12: 12 h foncé / léger, logé séparément et dans des conditions standard (40% d'humidité, 22 ° C), avec de la nourriture et de l'eau Disponible ad libitum .
- N'utiliser que des sujets masculins pour éviter toutes les influences du cycle hormonal sur le sommeil.
- Préparation des électrodes.
- Construire des électrodes EEG / ECOG (utilisées à l'étape 1.3.11) à l'aide de pièces de fil d'or de 0,5 cm de long (75% Au, 13% Ag et 12% Cu: diamètre: 0,2 mm), chacune soudée sur un or Vis en acier plaqué (3 mm de longueur, 1,1 mm de diamètre à la base, voir FigurE 1). Préparez 2 électrodes EEG par animal et nettoyez-les dans de l'éthanol à 70%.
- Préparez des électrodes EMG-ECG avec des fils d'or de 3 à 4 cm de long (75% Au, 13% Ag et 12% Cu: diamètre: 0,2 mm). Pliez les fils à un angle de 90 ° à 1 cm d'une extrémité et préparez une bobine (1 - 2 mm ø) à l'autre extrémité ( Figure 1 ). Entre les deux extrémités, pliez le fil pour créer une petite courbure qui correspond au profil de surface de l'os entre le cervelet et le lambda.
- Préparez 2 électrodes EMG-ECG par animal.
- Préparer un connecteur de tête femelle-mâle à 6 canaux (raster: 2,54 mm x 2,54 mm, taille: 5 mm x 8 mm x 9 mm, taille de broche: 5 mm, voir figure 1 ).
- Couvrez le connecteur à la base des broches femelles et mâles avec du ruban adhésif.
- Ajoutez une petite quantité de fil de soudure aux pointes de 4 des 6 broches mâles pour aider à la soudure des électrodes EEG et EMG-ECG pendant la chirurgie(Voir l'étape 1.3.16).
Figure 1 . Affichage schématique des sites pour l'implantation d'électrodes EEG et EMG sur le crâne de la souris.
Les craniotomies n ° 1 et n ° 2 sont situées ~ 2 mm latéralement à la ligne médiane et ~ 2 mm rostral à bregma. Les craniotomies n ° 3 et n ° 4 sont situées ~ 2 mm de rostral à lambda et sont, respectivement, 4 et 2 mm latérales par rapport à la ligne médiane. Les deux électrodes EEG, fabriquées à partir d'un fil d'or au dessus d'une vis en acier doré (n ° 2 et n ° 4) sont sur l'hémisphère droit. Les 2 vis gauche (# 1 et # 3) servent de support. Notez que les électrodes EMG-ECG ne doivent pas être en contact avec ces 2 vis de support. Les électrodes EMG-ECG sont des fils d'or de 3 à 4 cm de long, pliés à 90 ° d'angle sur 1 cm sur leurs extrémités rostrales et enroulés (1 - 2 mm ø) sur les extrémités caudales. L'électrode 2 EEG et 2 EMGS sont connectés au connecteur de tête de 2 x 3 canaux en soudant un fil à une broche coincée, comme le montrent les lignes pointillées. D'autres informations détaillées sur ces électrodes et leur implantation se trouvent En 29 . Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
- Opération d'implantation.
- Anesthésier l'animal dans une chambre inductrice d'isoflurane (4 à 5% d'isoflurane + O 2 à 1 - 2 L / min pendant 3 à 4 minutes). Injecter 5 μg / g de carprofène par voie intrapéritonéale (ip) lorsque vous retirez la souris de la chambre avant la fixation stéréotaxique.
- Suivez les procédures standard pour réparer la souris sur l'appareil stéréotaxique. Maintenir l'anesthésie à l'isoflurane à travers un masque à gaz (3% d'isoflurane + O 2 pendant la fixation à 1 L / min). Maintenir la température corporelle pendant toute la chirurgie à 37 ° C usinCoussin chauffant ga.
- Protégez les yeux de l'assèchement en appliquant une pommade de vitamine A. Vérifiez le niveau de tolérance chirurgicale de l'animal en testant le réflexe de retrait de la patte.
- Fixez la tête en positionnant les barres de l'oreille sur le crâne avec leurs extrémités ouvertes et inverse plutôt que leurs pointes (sans entrer dans les canaux de l'oreille) 29 . Placez la barre de bouche (comme d'habitude) pour assurer l'horizontalité de la tête.
REMARQUE: La fixation minimise les dommages aux oreilles, ce qui est important pour les expériences d'éveil acoustique (voir la section 4 de cette procédure). - Surveillez la respiration de l'animal pendant la procédure, qui devrait rester à ~ 2 - 3 respirations / 2 s. Ajuster la concentration d'isoflurane dans le distributeur de gaz si nécessaire; Il devrait diminuer peu à peu pendant la chirurgie, de 3% pendant la fixation à 1,0 - 1,5% vers la fin de la procédure.
- Injecter 100 μL de NaCl ip 0,9% une fois par heure en utilisant un insuli ultra-finN seringue pour garder l'animal hydraté.
- Assurez-vous que la tête de l'animal est allumée par une source de lumière vive.
- Nettoyez la zone avec 70% d'EtOH et de désinfectant à base d'iode (la peau humide empêche les cheveux d'entrer dans la fenêtre chirurgicale).
- Soulevez la peau au centre du crâne avec des pinces Adson et coupez délicatement la partie levée de la peau le long de la ligne médiane, du haut du cou au niveau des yeux, en utilisant des ciseaux fins. Retirer le cuir chevelu (~ 1 cm antéro-postérieur, ~ 0,5 - 0,8 cm latéral).
- Assurez-vous que la fenêtre est assez grande (vers les deux côtés) pour voir clairement les fissures de bregma et lambda du crâne. Fixez la peau des deux côtés avec des serrefines bulldog pour assurer l'accès à l'os.
- Retirez le tissu conjonctif (periosteum) en grattant soigneusement avec un scalpel. Nettoyez la zone avec un désinfectant à base d'iode et séchez le crâne avec un tampon antiseptique.
- À l'aide d'une lame de scalpel pointu (taille 15), grattez le sKull pour obtenir une surface osseuse et matelassée. En utilisant uniquement la pointe du scalpel, grattez un maillage en forme de grille de rainures, avec une distance de ~ 1 - 2 mm entre les rainures.
REMARQUE: ceci améliore la fixation de la colle époxy à deux composants au crâne à l'étape 1.3.15. - Utilisez une microdrille avec une taille de forage 1/005 pour effectuer 4 craniotomies (~ 0,7 mm ø) dans le crâne à des emplacements spécifiques ( Figure 1 , voir également l'étape 1.3.11.3.). Nettoyer la poussière d'os à l'aide d'une pipette Pasteur et nettoyer les saignements avec des écouvillons antiseptiques.
- En cas de saignement, assurez-vous qu'il soit complètement arrêté avant de reprendre le processus. Utilisez une éponge hémostatique pour accélérer l'hémostase.
- Utilisez les deux craniotomies sur l'hémisphère droit pour insérer les électrodes à vis (craniotomies n ° 2 et n ° 4).
- Utilisez les deux craniotomies sur l'hémisphère gauche pour insérer des vis d'ancrage qui stabiliseront l'implant (craniotomies n ° 1 et n ° 3).
REMARQUE: Pour augmenterStabilité, jusqu'à 4 vis d'ancrage ont été utilisés 29 .
REMARQUE: Les coordonnées stéréotaxiques précises sont: 2 mm de la ligne médiane sur les deux hémisphères et 2 mm de rostral de bregma (craniotomies n ° 1 et n ° 2), 2 mm de rostral de lambda et 4 mm latéralement gauche de la ligne médiane (craniotomie n ° 3) 2 mm de rostral de lambda et 2 mm latéralement droit de la ligne médiane (craniotomie n ° 4). Voir la figure 1 .
- Sur l'hémisphère gauche, visser deux vis plaqué or dans les craniotomies pour le soutien.
- Fixez la vis dans une pince hémostatique et maintenez-la verticalement au-dessus de la craniotomie. Approche soigneusement le fond de la vis sur la craniotomie. Faites-le pivoter tout en ne s'écartant pas de la position verticale.
REMARQUE: seulement 1,5 rotations sont suffisantes pour obtenir une bonne stabilité mécanique et des signaux de haute qualité tout en minimisant la pression sur le tissu sous-jacent 25 . - Sur la droite, visser le préÉlectrodes préparées avec soin (décrites à l'étape 1.2.1.) À travers les craniotomies.
- Fixez la vis dans une pince hémostatique et maintenez-la verticalement au-dessus de la craniotomie. Approche soigneusement le fond de la vis sur la craniotomie. Faites-le pivoter tout en ne s'écartant pas de la position verticale.
- Avec l'aide de pince, soulevez soigneusement la bordure de la peau des muscles du cou. Insérez les fils EMG-ECG, avec les extrémités enroulées à l'intérieur des muscles (gauche et droite). Collez les parties du milieu sur le crâne, de sorte que l'EMG-ECG gauche apparaisse à côté de la vis d'ancrage postérieur gauche, tandis que le bon EMG-ECG est positionné à côté de la vis d'ancrage antérieure.
- Pour détecter les signaux ECG du cœur pendant le sommeil, assurez-vous que les fils EMG-ECG sont insérés dans le muscle à une profondeur de ~ 0,8 à 1 cm, leurs boucles étant aussi éloignées que possible.
- Utilisez une spatule recouverte de colle époxy à deux composants pour appliquer la colle au crâne entre les vis et autour de celles-ci. Laissez-le sécher dans la lumière, mais protégez les yeux de l'animal contre les rayons excessifs.
REMARQUE: les bases des vis doivent être recouvertes, et seuls les fils doivent être accessibles, émergentsLa colle. - Assurez-vous que la colle remplit l'espace entre les deux électrodes EMG-ECG s'étendant de la surface, de sorte qu'il n'y a pas de contact électrique entre elles et les vis de support. Faites un soin méticuleux pour ne pas coller la peau au crâne; La peau devrait rester libre de se déplacer dans la colle.
- Couper les fils EEG et EMG-ECG de sorte qu'ils atteignent ~ 0,5 mm hors de la colle. Soudez les quatre broches au coin du connecteur préparé à l'étape 1.2.3. Aux quatre fils émergeant de la colle ( Figure 1 ).
- Essayez de placer les broches du connecteur le plus près possible pour minimiser la hauteur de l'implant; Utilisez une petite attache de crocodile attachée au support stéréotaxique qui maintient la position du connecteur. Minimisez le temps de contact avec la pointe de brasage, car cela réchauffe rapidement les vis.
- Remplissez l'espace entre la colle et le connecteur avec du ciment dentaire pour recouvrir les pièces soudées. Créer smooTh faces et éviter les arêtes vives qui pourraient nuire à l'animal. De plus, évitez de toucher la peau, car cela entraîne des démangeaisons.
- Enlever les serrefines bulldog. Si nécessaire, fermer la plaie à l'aide d'un fil de suture stérile (fibre de suture absorbable) devant et derrière le connecteur, créant des motifs de fermeture simples et interrompus et deux noeuds carrés (aiguille 5-0 FS-3, filament de 45 cm).
- Surveillez l'animal jusqu'à ce qu'il soit complètement éveillé. Pesez l'animal après la chirurgie et retournez-le dans sa cage à domicile pour récupérer.
- Soins post-opératoires et connexion au système.
- Surveillez l'animal tous les jours pendant une semaine. Rechercher une perte de poids, une activité réduite ou anormale, et des signes d'infections. Suivez la procédure de notation établie par vos autorités vétérinaires.
- 5-6 jours après la chirurgie, connectez le câble d'enregistrement au connecteur de tête de l'animal, le laissant dans sa cage à domicile. Attendez 4 à 5 jours supplémentaires avant le début de la remiseDing afin que l'animal soit habitué à la condition et dort naturellement.
2. Score de base des données EEG / EMG-ECG pour la détermination de l'état de vigilance
- Enregistrez les données EEG et EMG-ECG sur 48 h avec un logiciel commercial polysomnographique ( par exemple, Somnologica, SleepSign ou Sirenia). Utilisez des paramètres typiques, tels qu'un gain de 2,000x; Un taux d'échantillonnage de 2 000 Hz lors de l'acquisition, échantillonné jusqu'à 200 Hz après l'acquisition; Et un filtre passe-haut de 0,7 Hz pour EEG et un filtre passe-haut de 10 Hz pour EMG-ECG.
- Exportez les données dans le format de fichier ".edf".
- Ouvrez les fichiers ".edf" avec un logiciel personnalisé ( par exemple, Matlab) qui classe semi-automatiquement chaque époque de 4 s comme réveillé, sommeil non-REM, sommeil REM et artefacts correspondants.
REMARQUE: Alternativement, il existe plusieurs logiciels de notation semi automatisés disponibles. Cette procédure décrit certaines des étapes de base qui doivent être faites pour configurer la notation wAvec le logiciel de notation utilisé ici; D'autres systèmes de notation semi-automatiques peuvent être basés sur d'autres paramètres. - À l'aide du logiciel, séparez les fichiers ".edf" en 4 fois 12 h d'enregistrements.
- Supprimez les artefacts qui résultent de l'activité EMG -ECG présente dans le signal EEG ou d'un état comportemental non admissible 1 , 29 .
- Calculer la moyenne des valeurs absolues de EEG (EEG mean ) et EMG (EMG mean ) sur les 12 h d'enregistrements des enregistrements EEG et EMG-ECG, respectivement.
- Identifiez les valeurs moyennes EEG / EMG de chaque époque de 4 s (EEG Epoch / EMG Epoch ).
- Classifiez les époques comme "Wake" lorsque EEG Epoch <EEG signifie et EMG Epoch > EMG signifie et "Non-REM sleep" lorsque EEG Epoch > EEG signifie et EMG Epoch <EMG signifie.
- Classifiez les époques qui ne sont pas s Satisfaisant ces critères avec un algorithme de correction basé sur les époques précédentes et ultérieures.
- Classifiez les époques en tant que sommeil REM lorsque EEG Epoch <EEG signifie et EMG Epoch <EMG signifie .
- Affinez les points critiques, tels que les transitions du sommeil non-REM pour le réveil, les périodes de sommeil REM et les micro-excitations pendant le sommeil non-REM. Inspectez visuellement le score pour assurer une bonne détermination de l'état de vigilance 29 , 30 .
REMARQUE: effectuez toujours une inspection visuelle finale et une validation de la notation.
3. Analyse de l'oscillation infaillible pour EEG et Heartbeats
- Pour cette analyse, sélectionnez uniquement des périodes de sommeil non-REM de ≥ 96 s ( c'est- à- dire au moins 24 époques de 4 s); Voir la figure 2 .
REMARQUE: Des routines personnalisées sont disponibles sur demande 1 .
Figure 2 . Déterminer la dynamique de la puissance Sigma pendant le sommeil non-perturbé non perturbé.
( A ) Top, EEG (noir) et EMG-ECG (gris) traces pendant les 100 premières minutes de la phase lumineuse en une seule souris. Les états de vigilance sont indiqués par la barre colorée au-dessus des traces brutes. Moyen, exemple typique d'un combat continu (> 96-s) non-REM. En bas, un intervalle de 16 secondes choisi au hasard et qui illustre la subdivision en quatre temps. L'étape suivante de l'analyse est présentée pour ces quatre époques seulement, mais elle est valable pour chaque période contenue dans le combat. ( B ) Top, quatre FFT successifs générés à partir des époques de 4 s montrées dans le panneau inférieur de A. La bande sigma (10-15 Hz) est ombrée en rouge. En haut à droite, l'insertion de 1-s de la dernière époque montre les ondes R présentes dans le signal EMG-ECG au carré. En bas, le temps de la Sigma power extrait du spectre correspondant ci-dessus. Les lignes pointillées illustrent la continuation des valeurs de puissance avant et après les quatre combats non-REM sélectionnés pour l'affichage. ( C ) Cours de puissance sigma normalisé (rouge) et battements cardiaques (en BPM) (gris), avec la partie illustrée en (B) située entre les lignes pointillées verticales. Ci-dessous le signal EEG filtré correspondant dans la bande sigma (10-15 Hz). ( D ) Résultat de la FFT calculé sur le temps de temps de puissance sigma indiqué en (C), démontrant un pic dominant à 0,016 Hz. Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
- Extraire les valeurs de puissance pour la puissance spectrale de la bande de fréquence sigma (10-15 Hz) dans les bacs de 4 s ( Figure 2 A et B ) en utilisant des calculs de transformées de Fourier rapides (FFT)"> 1.
- Calculez la puissance spectrale de base pour le sommeil non-REM en faisant la moyenne des valeurs dans chaque bac de fréquence pour toutes les époques de sommeil non-REM (les artefacts et les époques de transition entre les états de vigilance sont exclus de cette moyenne). Normalize les valeurs de puissance sigma de chaque époque à la puissance moyenne de la bande sigma pendant le sommeil non-REM pendant la période d'intérêt. Parcourez le temps ( figure 2 C ).
- Calculez la FFT du cours Sigma Power Time avec la fenetre Hamming pour révéler les composantes de fréquence oscillatoire de la dynamique de puissance ( Figure 2 D ) 1 .
- Notez que, puisque les crises de sommeil non-REM ont des durées différentes, les FFT résultants ont des résolutions de fréquence différentes. Interpoler pour ajuster la résolution à la plus élevée obtenue à partir du plus long combat de sommeil non-REM et en moyenne les FFT de tous les combats.
- Continuez cette analyseEs pour décrire les relations de phase entre la dynamique des signaux EEG et ECG.
- Extrayez les données des battements cardiaques à partir du signal EMG-ECG carré après un filtrage passe-haut de 30 Hz, en utilisant les routines appropriées pour la détection maximale de l'onde R.
REMARQUE: Limiter l'intervalle de temps minimum entre deux ondes R successives à 80 ms aide à éviter l'inclusion de pics artistiques occasionnels en raison de la contraction musculaire 1 . - Mesurez les intervalles RR et calculez la fréquence cardiaque moyenne en battements par minute (BPM) tous les bacs de 4 s ( Figure 2 B et C ).
4. Exposition au bruit
- Générer des bruits (c'est-à-dire un bruit blanc) grâce à un logiciel personnalisé. Réglez la durée à 20 s et l'intensité à 90 dB SPL (mesurée à l'intérieur de la cage). Jouez les bruits à travers les haut-parleurs standard 1 .
- Après la chirurgie, lors de l'accouplement au recorDing condition, jouez au hasard des bruits expérimentaux, plusieurs fois tout au long de la journée et à différents moments 1 .
- En condition expérimentale (pendant l'enregistrement des données EEG / EMG / ECG), jouez du bruit pseudo-aléatoire pendant les 100 premières minutes à l'allumage lumineux (ZT0). Pour jouer le bruit, remplissez les conditions suivantes 1 :
- Assurez-vous que la souris est en mode sommeil non-REM pendant> 40 s.
- Assurez-vous que l'exposition précédente s'est produite plus de 4 minutes avant.
REMARQUE: résulte en ~ 15 expositions par session.
- Marquez le début du temps d'enregistrement et le début de chaque exposition au bruit. Gardez l'expérimentateur aveugle à la composition spectrale du sommeil non-REM pendant la procédure.
- Acquérir toutes les données avec le logiciel polysomnographique 1 , 29 .
5. Analyse rétrospective du sommeil selon le résultat comportemental au coursExposition au bruit
- Notez manuellement les traces EEG / EMG -ECG dans une résolution de 4 s, sans connaître les temps d'exposition au bruit 1 .
- Utilisez un script personnalisé pour extraire les données d'exposition EEG / EMG -ECG / bruit 1 .
- Notez que le signal de sommeil est endommagé lorsque les signaux EEG et EMG restent inchangés lors de l'exposition au bruit ( Figure 3A ). Considérons un réveil lorsque l'amplitude EEG diminue et la fréquence EEG augmente, en combinaison avec une activité musculaire détectée sur l'électrode EMG-ECG ( Figure 3B ).
- Essayer les essais dans lesquels des animaux ont réveillé pendant la période de pré-stimulation ou dans les 4 premiers s de l'exposition au bruit ( Figure 3D ).
- Définissez le taux de réussite de l'éveil en tant que proportion des essais de réveil dans tous les essais inclus («Wake-up» et «Sleep-through»).
- Dans tous les essais inclus, examinez la dynamique de la puissance sigma pendant la périodeE période de pré-stimulation ( figure 3 E ) 1 .
Figure 3 . Résultats comportementaux en réponse à l'apparition du bruit: résultats représentatifs qui ont été retenus ou exclus de l'analyse.
( AD ) Les traces brutes de l'EEG (noir) et les signaux EMG-ECG (gris) correspondants pendant 40 s avant l'apparition du bruit et pendant les 20 s de bruit, représentés par la zone bleue-ombrée. Les états de vigilance sont indiqués dans le code de couleur. Pour illustrer les données qui ont été incluses dans l'analyse, les événements représentatifs "Sleep-through" ( A ) et "Wake-up" ( B ) sont affichés. Les résultats rejetés contiennent des transitions vers le sommeil REM ( C ) et une réponse précoce "Réveil" ( D ). L'encart montre une étendueDes traces EEG et EMG-ECG caractéristiques du sommeil REM. ( E ) Exemples typiques de la dynamique de puissance sigma dans la fenêtre de 40 s avant l'apparition du bruit pendant un événement "Sleep-through" (gauche) et "Wake-up" (droite). La bande passante EEG brute filtrée pour la bande sigma est illustrée ci-dessus. La zone bleue représente l'apparition du bruit. Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
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Representative Results
La figure 2 A (panneau supérieur) montre des étirements de 100 minutes de comportement spontané du sommeil-réveil, enregistrés par des électrodes polysomographiques utilisées comme décrit (voir la figure 1 ). Les augmentations et les diminutions de l'amplitude EEG et EMG au début du sommeil non-REM sont clairement visibles. Le sommeil REM intermittent est marqué par une diminution de l'amplitude EEG et une diminution supplémentaire de la tonalité EMG qui n'est pas visible sur cette échelle de temps comprimé. Le zoom sur un coup de sommeil non-REM révèle les ondes lentes à grande amplitude dans l'EEG et, dans la trace EMG-ECG, l'activité musculaire faible, sur laquelle les intervalles RR de la fréquence cardiaque se superposent comme des déviations verticales ( Figure 2 A , Panneaux intermédiaires et inférieurs). Une FFT révèle la domination de la SWA à travers toutes les époques de 4 s ( figure 2 B ). Tracer le symbole moyenUne puissance (10 - 15 Hz, barre ombrée rouge) pour chacune de ces époques révèle son cours variable, ainsi que des variations de fréquence cardiaque dans la direction opposée. La réalisation de cette analyse sur l'ensemble des épisodes non-REM et la normalisation des valeurs de puissance moyen dévoile les variations régulières de la puissance sigma autour de la moyenne ( Figure 2 C ). L'analyse de Fourier sur ce cours de temps de puissance montre un pic majeur d'environ 0,02 Hz, reflétant l'augmentation périodique de la puissance sigma dans les intervalles de 50 s ( Figure 2D ).
Pour sonder la fonction de l'oscillation de 0,02 Hz dans l'éveil, les souris ont été exposées à des impulsions de 20 secondes de 90 dB lors du sommeil, selon les conditions décrites. La figure 3 montre certains des résultats expérimentaux de ces expositions au bruit. Lorsque les souris ne se sont pas réveillées pendant le bruit, les formes d'ondes EEG et EMG-ECG sont demeurées inchangées, le résultat a été la classeComme "Sleep-through" ( Figure 3 A ). Lorsque l'amplitude EEG a diminué et que l'activité EMG a été observée, le résultat a été noté comme un "Wake-up" ( Figure 3 B ). Parfois, les souris ont changé de sommeil REM pendant un essai ( Figure 3 C ) ou ont réveillé dans l'intervalle de 40 secondes avant l'apparition du bruit ( Figure 3 D ). Ces événements ont été exclus de l'analyse, car notre intérêt était spécifiquement d'identifier les caractéristiques du sommeil non-REM consolidé qui précèdent le résultat de l'exposition au bruit («Sleep-through» ou «Wake-up»). Le calcul de la puissance sigma dans la période de 40 s avant la stimulation du bruit a montré que l'oscillation de 0,02 Hz était à son creux lorsque survient un "Sleep-through" ( Figure 3 E , panneau gauche), alors qu'il a atteint un sommet pour un "Wake- Up & #34; Événement ( Figure 3 E , panneau de droite). Par conséquent, la notation du sommeil non-REM d'une souris rétrospectivement, en fonction d'un résultat comportemental variable pour la stimulation acoustique, identifie la phase de l'oscillation de 0,02 Hz dans la puissance sigma comme caractéristique pour les états de sommeil avec une résilience variable au bruit.
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Discussion
Ici, nous montrons comment établir un profil temporel continu du sommeil non-REM qui intègre les variables EEG, EMG et ECG. Il s'agit d'une première étape vers le développement d'une description intégrative du sommeil de la souris, ce qui peut aider à identifier le calendrier précédemment non reconnu sur lequel la résilience élevée et faible au bruit est organisée pendant le sommeil non-REM 1 . Une structure temporelle similaire a également été décrite dans le sommeil humain non-REM par une analyse analogue 1 .
La procédure présentée ici remplit deux objectifs. Tout d'abord, nous attirons l'attention sur le fait que les techniques polysomographiques peuvent fournir à la fois des signaux EEG et EMG-ECG pendant la totalité des périodes de sommeil non-REM chez les souris. Le rythme cardiaque est plus évident dans les traces EMG pendant le sommeil paradoxal dû à l'atonie musculaire, et il devient plus caché dans le sommeil non-REM en raison de l'augmentation du tonus musculaire et des contractions musculaires occasionnelles. Insertion d'électrodes EMG-ECG plusProfondément dans le muscle et de les maintenir aussi éloignés que possible, augmente l'amplitude des ondes R du cœur, de sorte qu'elles émergent clairement du tonus du muscle d'arrière-plan. Les routines pour la détection maximale, puis extraire la fréquence cardiaque du signal EMG-ECG de sommeil non-REM et permettre la quantification de sa variabilité.
Les technologies basées sur la télémétrie pour surveiller simultanément l'EEG / EMG et ECG sont de plus en plus utilisées, mais la qualité des signaux requis pour une analyse spectrale complète reste inférieure en termes de bande passante et de stabilité. En outre, même les transmetteurs monocaténaires sont de taille considérable, et leur implantation dans la région cervicale sous-cutanée ou dans la cavité corporelle peut affecter le bien-être de l'animal et perturber le sommeil. Néanmoins, le développement de tels dispositifs est nécessaire pour étendre la gamme des paramètres centraux et autonomes qui peuvent être suivis simultanément pendant le sommeil non perturbé chez la souris, qui est le modèle animal de cHoice pour les études du sommeil. En combinaison avec des techniques telles que l'appui-tête, qui permet la collecte de données à la fois non-REM et REM chez des souris avec des profils spectraux 1 , 19 , les mesures multiparamétriques pendant le sommeil peuvent maintenant être combinées avec des tests comportementaux contrôlés.
Deuxièmement, l'approche analytique que nous présentons ici peut également être appliquée aux potentiels de terrain locaux pour définir la zone du cerveau impliquée dans la génération de la marque d'intérêt 1 . En outre, il s'applique aux techniques d'imagerie assez rapides pour faire rapport sur le comportement spectral des populations neuronales et pour les variables continues ( p. Ex., Bandes spectrales) et discrètes ( p. Ex. Fréquence cardiaque ou respiration). Son temps de résolution n'est limité que par la durée de l'époque choisie pour marquer l'état de vigilance. Essentiellement, les analyses spectrales standard des signaux dérivés de non-REMLes lésions sont suivies d'un alignement des valeurs de densité de puissance des signaux individuels pour chaque période. Ensuite, une analyse spectrale de cette dynamique de puissance est utilisée pour quantifier les périodicité dans la structure. Chez les souris et les humains, notre approche a donné une oscillation de 0,02 Hz, avec des propriétés comparables 1 , qui l'ont qualifié de marqueur unifiant pour la structure du sommeil des mammifères.
Une étape critique a été la validation fonctionnelle de la périodicité observée en notant le sommeil non-REM rétrospectivement en fonction de la réactivité comportementale de la souris dormante au bruit. Ici, le choix d'un stimulus de bruit qui a conduit à un résultat comportemental variable, provoquant le réveil ou le sommeil, a été décisif. Des stimuli sensoriels forts qui provoquent un réveil dans la plupart des expositions ne démêleraient pas l'oscillation de 0,02 Hz, car le réveil serait appliqué de toutes ses phases. En revanche, un stimulus trop faible ne révélerait pas constamment la relation de phase avec l'osc de 0,02 Hzillation. De même, toute périodicité observée dans un ensemble de paramètres mesurés devrait aller de pair avec le résultat variable. Par exemple, dans le cas présenté ici, nous n'avons distingué que les événements de réveil ou de sommeil, sans considérer le moment exact du réveil pendant l'exposition au bruit ou la durée de l'état de réveil qui en a résulté (voir 1 ) . L'utilisation de stimuli courts à diverses intensités 24 , 25 , 28 pourrait aider à délimiter les relations de phase exactes entre l'oscillation de 0,02 Hz et le réveil. En outre, la variation de la composition de fréquence des sons pourrait moduler l'éveilité en fonction de l'histoire récente du comportement sommeil-réveil, du genre, de la présence de nidés ou d'autres formes d'expérience récente. Une autre possibilité pourrait consister à rechercher si la prévalence de microarous ou d'excitation complète dépend d'un état de sommeil momentané donné. Le score du sommeil basé sur un résultat comportemental variable pourrait éclairer la microarchitecture fonctionnelle du sommeil en général. Alors que nous et d'autres avons testé la réactivité à l'exposition au bruit 1 , 28 , le réveil en réponse à d'autres modalités sensorielles, les transitions d'état de vigilance 14 ou les rapports de rêve pourraient être évalués pour extraire les corrélats correspondants du sommeil précédent. En outre, il sera très intéressant de tester les patients atteints de troubles du sommeil en ce qui concerne leur sensibilité à une perturbation externe et à une perturbation potentielle de l'oscillation de 0,02 Hz. Les troubles du sommeil peuvent conduire à une perturbation cardiovasculaire, alors que le risque cardiovasculaire peut entraîner une dysrégulation du sommeil 31 , 32 , effectuer des recherches sur la coordination cerveau-cœur pendant une oscillation de 0,02 Hz potentiellement pertinente pour comprendre cette bidirectionaL dépendance.
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Disclosures
Les auteurs déclarent qu'ils n'ont pas d'intérêt financier concurrent.
Acknowledgments
Nous remercions tous les membres du laboratoire pour leur contribution à l'écriture et à la lecture attentive de ce manuscrit. Nous remercions Paul Franken de stimuler les discussions, le Dr Gisèle Ferrand pour des commentaires utiles sur le protocole chirurgical, et le Dr Jean-Yves Chatton pour avoir fourni les fichiers exécutables Labview originaux pour l'exposition au bruit. Le financement a été fourni par la Fondation nationale suisse de la science (Subventions 31003A_146244 et 31003A_166318) et l'Etat de Vaud.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-components epoxy glue | Henkel | Loctite EA 3450 | |
| Absorbable Suturing Fiber (Prolene) | Ethicon | 5-0 FS-3 | |
| Adson Forceps | FST | 11006-12 | |
| Antiseptic swab | VWR | 149-0332 | |
| Attane Isoflurane | Piramal | Isoflurane 250mL | |
| Connectors 3 x 2-channels | ENA AG | 2.316 | Raster 2.54 x 2.54 mm; size 5 x 8 x 9 mm; pin size 5 mm; http://www.ena.ch/ |
| Dragonfly commutator | Dragonfly | Model #SL-10 | |
| EMBLA amplifier | EMBLA | A10 amplifier | |
| Fine scissors | FST | 14108-09 | |
| Flat Head Gold-plated steel screw | J.I. Morris | FF00CE125 | https://jimorrisco.com/ |
| Gold wire | CMSA | T.69 5gr | http://www.cmsa.ch/en/ |
| Hemostatic sponge | Pfizer | Gelfoam | |
| iodine-based disinfectant (Betadine) | Mundipharma | standart solution 60mL | |
| Komet drill steel 1/005PM104 | UNOR AG | 22310 | |
| Matlab Analysis Software | MathWorks | R2016b | https://ch.mathworks.com/products/matlab.html |
| Microdrill | Fine Science Tools | 96758 | |
| Mouse Gas Anesthesia Head Holder | Kopf Instruments | Model 923-B | http://kopfinstruments.com/product/model-923-b-mouse-gas-anesthesia-head-holder/ |
| Ophtalmic ointment | Pharmamedica | VITA-POS | |
| Paladur (liquid) | UNOR AG | 2260215 | for dental cement |
| Palavit (powder) | UNOR AG | 5410929 | for dental cement |
| Small Animal Stereotaxic Frame | Kopf Instruments | Model 930 | http://kopfinstruments.com/product/model-930-small-animal-stereotaxic-frame-assembly/ |
| Soldering wire | Stannol | 593072 | |
| Temperature controller - Mini rectal probe | Phymep | 4090502 | http://www.phymep.com/produit/dc-temperature-controller/ |
| Temperature controller- heating pad | Phymep | 4090205 | http://www.phymep.com/produit/dc-temperature-controller/ |
References
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