Summary
여기, 음향 자극에 수면 반응을 조절하는 생쥐의 비 REM 수면의 신경 및 심장 변수의 시간적 역학을 설명하기위한 실험 및 분석 절차를 제시합니다.
Abstract
포유 동물의 삶을 지배하는 세 가지 경계 상태 : 깨어 있음, 비 급속 안구 운동 (비 REM) 수면, 그리고 REM 수면. 자유롭게 움직이는 동물에서 행동의 신경 상관 관계가 더 많이 식별됨에 따라이 3 배 세분은 너무 단순 해집니다. 각성 (wakefulness) 동안, 전역 및 국소 피질 활동의 앙상블은 동공 직경 및 교감 신경 균형과 같은 주변 변수와 함께 다양한 정도의 각성을 정의합니다. 수면이 또한 뇌 상태의 연속체를 형성하는 정도는 불분명하며, 그 안에서 감각 자극 및 각성, 그리고 아마도 다른 수면 기능에 대한 복원력의 정도는 점진적으로 변하고 주변 생리 상태는 어떻게 변하는 지 불분명합니다. 수면 중 여러 매개 변수를 모니터링하는 방법을 발전시키고 이러한 기능적 특성의 별자리로 귀결시키는 연구는 여러 가지 유익한 효과가 있어야하는 다기능 프로세스로서 수면에 대한 이해를 개선하는 데 핵심적입니다적응. 수면 상태를 특징으로하는 새로운 매개 변수를 확인하면 수면 장애에서 새로운 진단 방법을 찾을 수 있습니다.
우리는 표준 polysomnographic 기록 기술을 사용하여 뇌파 (EEG) / electrocorticogram (ECoG), electromyogram (EMG) 및 심전도 (ECG) 신호의 결합 모니터링 및 분석을 통해 마우스 비 REM 수면 상태의 동적 변화를 설명하는 절차를 제시합니다. 이 접근법을 사용하여 우리는 마우스 비 REM 수면이 외부 자극에 대해 높고 낮은 취약성의 연속 25 초 간격을 생성하는 조정 된 신경 진동 및 심장 진동의 주기로 구성된다는 것을 발견했습니다. 따라서 중추 신경계와 자율 신경계는 통합 된 비 REM 수면 중에 행동 적으로 다른 수면 상태를 형성하도록 조정됩니다. 자유롭게 수면을 취하는 마우스에서 이러한주기를 추적하기 위해 polysomnographic ( 즉, EEG / EMG와 ECG) 모니터링을위한 수술 조작을 제시하고, quanti그들의 역 동성 및 음향 자극 프로토콜을 사용하여 깨어날 확률을 평가합니다. 우리의 접근법은 이미 인간의 수면으로 확장되었으며 포유류에서 비 REM 수면 상태의 일반적인 조직 원칙을 풀어 나갈 것을 약속합니다.
Introduction
포유류의 수면은 환경 적 자극에 대한 휴식과 회복력의 행동 상태입니다. 이 명백한 균일 성에도 불구하고, polysomnographic 및 자율 매개 변수는 다양한 시간적 및 공간적 척도 1 정성 및 양적으로 다른 신경 및 신체 상태 사이의 수면 이동을 나타냅니다. 몇 분에서 수십 분 동안 비 REM과 REM 수면 사이의 전환이 발생합니다. 비 REM 수면은 뇌파에서 큰 진폭, 저주파수 활동을 수반하며, REM 수면은 세타 밴드 (6 - 10 Hz)에서 규칙적인 뇌파 활동을 보여 주며 근육 atonia 2 . 비 REM 수면에서 인간은 빛 (S2)과 깊은 저속 수면 (SWS)을 순환합니다. 그들의 명명에서 알 수 있듯이,이 두 단계는 각각 낮고 높은 각성 문턱 값 3 , 4를 보여 주며, 주로 낮은 빈도slow wave activity (SWA; 0.75 - 4 Hz)라고 불리는 대뇌 피질의 뇌파 에너지. 비 균일 성은 시합 5 , 6 의 과정에서 SWA의 다양한 존재에 의해 광범위하게 문서화되어 있기 때문에 분과 초 2 배 시간대에 S2와 SWS의 개별 관찰을 통해 지속되지만 EEG와 현장 잠재 리듬에도 영향을 미친다. 시그마 대역 (10-15 Hz)과 감마 리듬 (80-120 Hz)에서 스핀들 파를 포함하여 더 높은 주파수 (검토를 위해 7 , 8 , 9 , 10 참조 ).
미묘한 변화보다는 인간의 수면 피질 상태를 극단적 인 스펙트럼으로 이동시킵니다. 비 REM 수면, SWA의 우위 상태에서 이러한 범위는 대략 웨이크 같은 활동들은 고주파 부품 (11)의 상당 부분을 포함하고 있기 때문
포유 동물의 비 REM 수면은 획일적이지 않습니다. 그러나 그러한 불균일성이 기능과 행동 특성이 다른 상태로 연결되는지 여부는 명확하지 않다. 수면 장애의 여러 유형에서, 지속적인 수면은 자발적 각성과 부적절한 운동 행동에 의해 방해받습니다. 더욱이, 스펙트럼 분석은 EEG 21 에서의 더 높은 주파수의 상대적 존재의 변화를 보여준다호흡 률 및 심장 박동 비율과 같은 자율 매개 변수 22 . 안정된 수면 상태의 질서있는 순서는 따라서 교란되고, 피질 및 / 또는 자율 신경 자극의 요소는 통제되지 않은 방식으로 침입한다. 그러므로 수면 상태의 연속을 이해하는 것이 질병과 관련이있을 수 있습니다. 또한, 도시 환경에서 환경 소음에 의해 수면의 동요는이 중요한 수면 23시 고조 취약점의 순간을 식별하기 위해 렌더링, 일반 건강 위험과 연관되어 있습니다.
인간을 자고 행동 각성 실험 광 불 REM 수면 (단계 S2) 및 REM 수면 쇼 비교 및 하부 자극 반면 4 임계 값, SWA 지배 비 REM 수면 (단계 S3)에서 일어나 어려운는 것을 나타낸다. 짧은 소리 자극의 피질 처리는 REM sleep, S2 및 S3 24 사이에서 상당히 다르며 ,(25), 상태 별 피질 활동 패턴 감각의 제 1 프로세싱 단계를 조절하는 것을 나타낸다. 사람의 비 REM 수면의 경우 소음에 대한 반응으로 기상하는 경향은 뇌파의 존재와 EEG 26 , 27 , 28 의 알파 리듬에 따라 다릅니다. 스핀들 중 Thalamocortical 율동성 관능 처리부 (7)의 감쇠에 기여하는 것으로 생각된다 모두 시상과 피질 수준에서 향상된 시냅스 저해를 수반한다.
소음에 강하고 잠잘 수없는 잠자는 시간은 어떻게 구성되며 그 결정 요인은 무엇입니까? 생쥐와 인간 모두에서 최근에 우리는 신경 리듬에서 0.02Hz 이하의 느린 진동을 확인했습니다. 이 0.02-Hz 발진의 위상에 따라, 마우스는 외부 자극에 대한 반응성이 가변적이었으며, 깨어나거나 잠자는 동안잡음. 흥미롭게도이 진동은 심박동 수와 상관 관계가있어 자율 신경계가 외부 자극에 대한 수면의 조절에 참여한다는 것을 나타냅니다 1 . 기억과 관련된 해마 리듬도이 리듬 내에서 조직되었으며, 가장 두드러지게 그 강도는 사람의 기억력 강화의 품질과 관련이 있습니다. 0.02-Hz 발진은 환경에 대한 민감도와 내부 기억 처리를 모두 조절하는 설치류 및 인간 non-REM 수면의 조직 원리 인 것으로 보인다. 이것은 잠자기 상태에 대한 다중 매개 변수화 및 연속 평가의 필요성을 다시 한번 강조하여 잠재적 인 취약성을 식별하고 기능을 인식합니다.
여기서는 이러한 역학 파형을 추출하는 절차를 제시합니다. 여기에는 EEG / ECoG 및 EMG-ECG 측정, 감각 자극에 대한 노출,분석 루틴. 이 절차는 수면을 지속적으로 다양하지만 고도로 조직화 된 경계 상태로 보는 기본을 제공하며 그 동안 서로 다른 기본 수면 기능이 순차적으로 실행됩니다. 보다 일반적으로이 절차는 건강 상태와 질병 상태 모두에서 수면 중에 행동 결과를 선행하는 스펙트럼 및 자율 특징을 추출하는 것을 목표로하는 접근법에 적용 가능하다.
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Protocol
모든 실험 절차는 로잔 동물 관리위원회 (University of Lausanne Animal Care Committee) 및 서비스 de la Consommation et des Affaires Vétérinaires of Canton de Vaud에 따라 수행되었습니다.
1. EEG / EMG-ECG 기록을위한 수술
- 동물 주택 및 선택.
- 음식물과 물과 함께 표준 조건 (습도 40 %, 22 ° C) 하에서 12 : 12-h 어둡거나 가벼운 사이클에서 동물 (C57Bl / 6J, 7-9 주, 25-30g) 이용 가능한 광고 libitum .
- 호르몬주기가 수면에 끼치는 모든 영향을 피하기 위해 남성 과목 만 사용하십시오.
- 전극 준비.
- ~ 0.5 cm 길이의 금 와이어 (75 % Au, 13 % Ag, 12 % Cu, 직경 : 0.2 mm)를 사용하여 EG / ECoG 전극 (단계 1.3.11에서 사용)을 만들고 금 - 도금 스틸 스크류 (길이 3mm,베이스에서 1.1mm 직경, Figur 참조)e 1). 동물 당 2 개의 EEG 전극을 준비하고 70 % 에탄올로 세척하십시오.
- EMG-ECG 전극을 3 - 4cm 길이의 금선 (75 % Au, 13 % Ag, 12 % Cu, 직경 0.2mm)으로 준비하십시오. 전선을 한쪽 끝에서 90 cm 각도로 구부린 다음 다른 쪽 끝에 코일 (1 - 2 mm ø)을 준비하십시오 ( 그림 1 ). 두 끝 사이에서, 소뇌와 람다 사이의 뼈의 표면 프로필에 해당하는 작은 곡률을 만들기 위해 와이어를 굽히십시오.
- 동물 당 EMG-ECG 전극 2 개를 준비하십시오.
- 6 채널 female-to-male 헤드 커넥터 (래스터 : 2.54mm x 2.54mm, 크기 : 5mm x 8mm x 9mm, 핀 크기 : 5mm, 그림 1 참조)를 준비하십시오.
- 암수 핀 밑면의 커넥터를 테이프로 덮으십시오.
- 6 개의 수 핀 중 4 개의 팁에 소량의 납땜 와이어를 추가하여 수술 중 EEG 및 EMG-ECG 전극의 납땜을 돕습니다.(단계 1.3.16 참조).
그림 1 . EEG 및 EMG 전극 삽입을위한 부위의 도식적 인 표시
Craniotomies # 1과 # 2는 정중선에 ~ 2mm 측면에 위치하고 ~ bregma에 ~ 2mm 주동이. Craniotomies # 3과 # 4는 람다에 ~ 2mm의 위치에 있으며, 각각 정중선의 측면 4와 2mm입니다. 금도금 스틸 스크류 (# 2와 # 4) 상단에 금선을 납땜하여 만든 두 개의 EEG 전극이 오른쪽 반구에 있습니다. 2 개의 왼쪽 나사 (# 1과 # 3)는 지지대 역할을합니다. EMG-ECG 전극은이 2 개의지지 나사와 접촉해서는 안됩니다. EMG-ECG 전극은 3 - 4cm 길이의 금선으로 꼬리 끝에 1cm 이상 90 ° 구부러지고 꼬리 끝에 코일이 감겨져 있습니다 (1 - 2mm ø). 2 개의 뇌파와 2 개의 EMG 전극s는 점선으로 표시된 것처럼 하나의 모서리가있는 핀에 하나의 와이어를 납땜하여 2 x 3 채널 헤드 커넥터에 연결됩니다. 이 전극과 이식에 대한 더 자세한 정보는 29 년 . 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
- 이식 수술.
- isoflurane 유발 챔버 (4 - 5 % isoflurane + O 2 1 - 2 L / min 3 - 4 분 이상)에서 동물을 마취. stereotaxic 고정하기 전에 챔버에서 마우스를 제거하면 intraperitoneally (IP) 5 μg / g carprofen을 주사.
- stereotaxic 장치에 마우스를 고정 표준 절차를 따르십시오. 가스 마스크 (1 L / 분 고정시 3 % 이소 플루 란 + O 2)를 통해 이소 플루 란 마취를 유지하십시오. 37 ° C에서 수술을 통해 체온 유지GA 난방 패드.
- 비타민 A 연고를 바르면서 눈이 건조하지 않도록하십시오. paw withdrawal reflex를 검사하여 동물의 수술 내성 수준을 확인하십시오.
- 그 평활와 두개골에 귀 바의 위치로 헤드를 수정 역 29 (귀 운하를 입력하지 않고)보다 오히려 그들의 팁 끝난다. 헤드의 수평을 보장하기 위해 마우스 막대를 (평소와 같이) 위치시킵니다.
참고 : 고정은 귀의 손상을 최소화합니다. 이는 음향 각성 실험에 중요합니다 (이 절차의 섹션 4 참조). - 시술 중 동물의 호흡을 모니터링하십시오. 호흡은 2 ~ 3 회 / 2 초 동안 유지되어야합니다. 필요한 경우 가스 분배기의 이소 플루 란 농도를 조정하십시오. 수술 중 고정시 3 %에서부터 수술이 끝날 때 1.0 ~ 1.5 %로 조금씩 감소해야합니다.
- 초 미세 인슐린을 사용하여 시간당 1 회 0.9 % NaCl을 100 μL 주입동물을 수분 상태로 유지하는 주사기.
- 동물의 머리가 밝은 광원에 의해 켜지는지 확인하십시오.
- 70 % EtOH 및 요오드 계 살균제로 모서리를 닦으십시오 (젖은 모피로 인해 모발이 수술 창에 들어 가지 않습니다).
- Adson 포셉으로 두개골 중앙의 피부를 들어 올리고 목의 꼭대기에서 눈높이까지 정중선을 따라 피부의 들어 올려 진 부분을 미세한 가위로 부드럽게 자릅니다. 두피를 제거하십시오 (~ 1 cm 전후, ~ 0.5 - 0.8 cm 측면).
- 두개골의 bregma와 lambda 균열을 명확하게 볼 수 있도록 창문이 충분히 커야합니다 (양쪽을 향해). 뼈에 접근 할 수 있도록 불독 세 파린으로 양측 피부를 고정하십시오.
- 메스로 조심스럽게 긁어 결막 조직 (골막)을 제거하십시오. 요오드 기반 소독제로 부위를 닦고 살균 면봉으로 두개골을 말립니다.
- 날카로운 메스 블레이드 (크기 15)를 사용하여 s를 긁습니다.깨끗하고 뼈가있는 뼈 표면을 얻을 수 있습니다. 메스 팁만을 사용하여 그루브 사이에 ~ 1-2mm의 거리를두고 격자 모양의 그루브 망을 긁으십시오.
참고 : 이것은 1.3.15 단계에서 두개골에 대한 2 액형 에폭시 접착제의 부착을 향상시킵니다. - 특정 위치의 두개골에서 4 개의 두개골 (~ 0.7 mm ø)을 수행하기 위해 1/005 드릴 크기의 미세 드릴을 사용하십시오 ( 그림 1 , 1.3.11.3 단계 참조). 파스퇴르 피펫을 사용하여 뼈 먼지를 날려 버리고 소독제로 흘린 모든 것을 닦아내십시오.
- 출혈이 발생하면, 치료를 다시 시작하기 전에 출혈이 완전히 중단되었는지 확인하십시오. 지혈 속도를 높이려면 지혈 스폰지를 사용하십시오.
- 오른쪽 반구에있는 두 개의 두개골을 사용하여 나사 전극 (craniotomy # 2와 # 4)을 삽입하십시오.
- 왼쪽 반구에 두개의 두개골을 사용하여 임플란트를 안정화시킬 고정 나사를 삽입하십시오 (craniotomies # 1과 # 3).
참고 : increa하려면안정성, 최대 4 개의 고정 나사 사용 29 .
참고 : 정확한 stereotaxic 좌표는 : bregma (craniotomies # 1과 # 2), 람다에서 2mstrostral과 정중선 (craniotomy # 3)에서 왼쪽으로 4mm 측면에서 2mm의 주전자에서 양쪽 정중선에서 중간 선에서 2mm, 람다에서 2mm, 중앙에서 2mm 측면으로 오른쪽 (craniotomy # 4). 그림 1을 참조하십시오.
- 왼쪽 반구에서 두 개의 금도금 된 나사를 두개골을 통해지지하십시오.
- 지혈 클램프에 나사를 고정하고 craniotomy 수직으로 잡고 있습니다. 조심스럽게 craniotomy 상단에있는 나사의 바닥에 접근하십시오. 수직 위치에서 벗어나지 않도록 회전하십시오.
참고 : 1.5 회전의 하부 조직 (25)에 압력을 최소화하면서 우수한 기계적 안정성 및 높은 품질의 신호를 획득하기에 충분하다. - 오른쪽에서 사전을 조입니다.두뇌 절단술을 통해 대단히 준비된 전극 (단계 1.2.1에서 설명).
- 지혈 클램프에 나사를 고정하고 craniotomy 수직으로 잡고 있습니다. 조심스럽게 craniotomy 상단에있는 나사의 바닥에 접근하십시오. 수직 위치에서 벗어나지 않도록 회전하십시오.
- 집게발의 도움으로 조심스럽게 피부의 경계를 목 근육에서 들어 올리십시오. EMG-ECG 전선을 코일 안쪽 끝이 근육 안쪽 (왼쪽과 오른쪽)에 삽입합니다. EMG-ECG가 앞쪽 고정 나사 옆에 위치하는 동안 왼쪽 EMG-ECG가 뒤쪽 왼쪽 고정 나사 옆에 나오도록 가운데 부분을 두개골에 붙입니다.
- 수면 중에 심장에서 심전도 신호를 감지하려면 EMG-ECG 전선이 루프에서 끝까지 가능한 한 멀리 끝까지 ± 0.8-1 cm의 깊이까지 근육에 삽입되어 있는지 확인하십시오.
- 두 구성 요소 에폭시 접착제로 덮여있는 주걱을 사용하여 나사 주위와 두개골에 접착제를 바르십시오. 빛에 말려 주되 과도한 번개로부터 동물의 눈을 보호하십시오.
참고 : 나사의 받침대를 덮어야하며, 와이어 만 접근 할 수 있어야하며, 새는 from 접착제. - 접착제가 표면에서 뻗어나가는 두 개의 EMG-ECG 전극 사이의 공간을 채우므로 접착제와지지 나사 사이에 전기적인 접촉이 없어야합니다. 해골에 피부를 붙이지 않도록 세심한주의를 기울이십시오. 피부는 접착제 주위를 자유롭게 움직여야합니다.
- EEG 및 EMG-ECG 전선을 잘라내어 접착제에서 ~ 0.5 mm까지 뻗으십시오. 단계 1.2.3에서 준비한 커넥터 모서리에있는 4 개의 핀을 납땜하십시오. ( 그림 1 ).
- 임플란트 높이를 최소화하기 위해 가능한 한 커넥터 핀을 가깝게 두십시오. 커넥터의 위치를 유지하는 stereotactic holder에 부착 된 작은 crocodile clamp를 사용하십시오. 납땜 팁과의 접촉 시간을 최소화하십시오. 납땜 팁이 빠르게 가열되므로 납땜 팁과의 접촉 시간을 최소화하십시오.
- 납땜 된 부품을 덮기 위해 접착제와 커넥터 사이의 공간을 치과 용 시멘트로 채 웁니다. smoo 만들기동물에게 상처를 줄 수있는 날카로운 모서리를 피하십시오. 또한, 피부가 닿지 않도록주의하십시오. 가려움증을 유발할 수 있습니다.
- 불독 세린을 제거하십시오. 필요하다면 간단하고 중단 된 폐쇄 패턴과 두 개의 정사각형 (5-0 FS-3 바늘, 45cm 필라멘트)을 만드는 커넥터 앞뒤에 멸균 봉합사 (흡수 가능한 봉합사)를 사용하여 상처를 닫습니다.
- 완전히 깨어날 때까지 동물을 관찰하십시오. 수술 후 동물의 무게를 재기 위해 회복을 위해 집에 되돌려줍니다.
- 수술 후 관리 및 시스템 연결.
- 일주일 동안 매일 동물을 관찰하십시오. 체중 감소, 감소되거나 비정상적인 활동 및 감염 징후가 있는지 확인하십시오. 귀하의 수의 당국이 수립 한 채점 절차를 따르십시오.
- 수술 후 5-6 일 후, 기록 케이블을 동물의 머리 커넥터에 연결하여 홈 케이지에 놓습니다. 레코더가 시작되기 4 ~ 5 일 후에 추가로 기다립니다.동물이 조건에 익숙해 져서 자연스럽게 잔다.
2. 경계 상태 결정을위한 EEG / EMG-ECG 데이터의 기본 점수
- 상업용 다기능 소프트웨어 ( 예 : Somnologica, SleepSign 또는 Sirenia)를 사용하여 EEG 및 EMG-ECG 데이터를 48 시간 이상 기록하십시오. 2,000x 게인과 같은 일반적인 설정을 사용하십시오. 획득시 2,000 Hz 샘플링 속도, 획득 후 200 Hz로 샘플링 다운, EEG를위한 0.7-Hz 고역 통과 필터와 EMG-ECG를위한 10-Hz 고역 통과 필터가있다.
- ".edf"파일 형식으로 데이터를 내 보냅니다.
- awake, non-REM 수면, REM 수면 및 해당 인공물을 반자동으로 반자동으로 분류하는 맞춤 작성된 ( 예 : Matlab의) 소프트웨어로 ".edf"파일을 엽니 다.
참고 : 또는 반자동 채점 소프트웨어를 사용할 수 있습니다. 이 절차에서는 채점을 설정하기 위해 수행해야하는 몇 가지 기본 단계를 설명합니다.여기에 사용 된 득점 소프트웨어; 다른 반자동 채점 시스템은 다른 매개 변수를 기반으로 할 수 있습니다. - 이 소프트웨어를 사용하여 4 시간 12 시간 동안 ".edf"파일을 분리하십시오.
- 뇌파 신호 또는 할당이 불가능한 행동 상태 1 , 29 에있는 EMG -ECG 활동에서 발생하는 인공물을 제거합니다.
- EEG 및 EMG-ECG 추적에서 각각 12 시간 동안의 절대 EEG ( 평균 뇌파 평균 ) 및 평균 뇌파 (EMG 평균 ) 값을 계산합니다.
- 4-epoch (EEG Epoch / EMG Epoch )의 평균 EEG / EMG 값을 확인합니다.
- EEG Epoch <EM 평균 및 EMG Epoch > EMG 평균 일 때 "Wake"로 분류하고 EEG Epoch > EEG 평균 및 EMG Epoch <EMG 평균 일 때 "Non-REM sleep"로 분류하십시오 .
- s가 아닌 신기원을 분류하십시오. 선행 및 후속 에포크에 기초한 정정 알고리즘으로 이들 기준을 만족시킨다.
- EEG Epoch <EM 평균 및 EMG Epoch <EMG 평균 인 경우 REM 수면으로 분류하십시오.
- 비 REM 수면에서 깨우기까지의 전환, REM 수면 기 본 및 비 REM 수면 중 미세 각성과 같은 중요한 포인트를 미세 조정하십시오. 시각적으로 득점을 검사하여 경계 태세를 올바르게 결정하십시오 29 , 30 .
참고 : 최종 육안 검사와 채점 확인은 항상 수행하십시오.
3. 뇌파 및 심장 박동을위한 천천히 진동의 분석
- 이 분석을 위해서는 96 초 이상 지속되는 비 REM 수면 관찰 만 선택하십시오 ( 예 : 4 초 이상 24 epoch). 그림 2를 참조하십시오.
참고 : 요청시 사용자 정의 루틴을 사용할 수 있습니다 1 .
그림 2 . 방해받지 않은 비 REM 수면 중 시그마 동력학 결정.
( A ) 한 마우스의 밝은 상 태의 처음 100 분 동안 탑, EEG (검정) 및 EMG-ECG (회색) 추적. 경계 상태는 원시 트레이스 위에 색상 막대로 표시됩니다. 연속적인 (> 96-s) non-REM sleep bout의 전형적인 중간 예. 하단, 무작위로 고른 16 초 간격으로 4 초 신분으로 세분화되어 있음을 나타냅니다. 분석의 다음 단계는이 네 개의 신기원에 대해서만 보여 지지만, 한판 승부에 포함 된 모든 신기원에 유효합니다. ( B ) A의 하단 패널에 표시된 4 초마다 4 개의 상위 FFT가 생성됩니다. 시그마 밴드 (10-15 Hz)는 빨간색으로 표시됩니다. 오른쪽 상단, 제곱 된 EMG-ECG 신호에있는 R- 파를 보여주는 마지막 에포크로부터의 1-s 삽입. 아래, 시간 코스 Σ 파워는 위의 해당 스펙트럼에서 추출됩니다. 점선은 디스플레이를 위해 선택된 4 개의 비 REM 관찰 전후의 힘 값의 연속을 나타낸다. ( C ) 수직 파선 사이에 위치한 (B)에 표시된 부분과 함께 정규화 된 시그마 파워 (적색) 및 하트 비트 (BPM) (회색) 시간 코스. 아래는 시그마 대역 (10-15 Hz)에서 필터링 된 EEG 신호입니다. ( D ) (C)에 표시된 σ 파워 시간 코스에서 계산 된 FFT 결과로 0.016 Hz에서 우세한 피크를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
- 고속 푸리에 변환 (FFT) 계산을 사용하여 4s 빈 ( 그림 2A 및 B )에서 시그마 주파수 대역 (10-15Hz) 스펙트럼 전력의 전력 값을 추출합니다."> 1.
- 비 REM 수면에 대한 각 주파수 빈의 값을 평균하여 비 REM 수면에 대한 기준 스펙트럼 전력을 계산합니다 (경계 상태 간의 이슈 및 이음새는이 평균화에서 제외됩니다). 관심있는 기간 동안 비 REM 수면 동안 시그마 밴드의 평균 파워로 각 신기원의 시그마 파워 값을 표준화하십시오. 시간에 따른 플롯 ( 그림 2 C ).
- 전원 역학의 진동 주파수 성분 (도 2 D)를 1 공개 해밍 윈도우와 시그마 전원 시간 코스의 FFT를 계산한다.
- 비 REM 수면 관찰에는 다른 지속 시간이 있기 때문에, 결과 FFT는 다른 주파수 해상도를가집니다. 해상도가 가장 긴 비 REM 수면 시합에서 얻은 가장 높은 해상도로 조정하고 모든 시합의 FFT를 평균화합니다.
- 이 분석을 계속하십시오.EEG와 ECG 신호의 동역학 사이의 위상 관계를 설명합니다.
- R 파의 피크 검출에 적합한 루틴을 사용하여 30Hz 고역 통과 필터링 후 제곱 된 EMG-ECG 신호에서 하트 비트 데이터를 추출합니다.
참고 : 두 개의 연속적인 R 파 사이의 최소 시간 간격을 80 ms로 제한하면 근육 경련으로 인해 가끔 인공적인 봉우리가 포함되는 것을 방지 할 수 있습니다 1 . - RR 간격을 측정하고 4-s 빈마다 분당 비트 수 (BPM)로 평균 심장 박동수를 계산하십시오 ( 그림 2 B 및 C ).
4. 소음에 노출
- 맞춤형 소프트웨어를 통해 잡음 (예 : 백색 잡음)을 생성하십시오. 지속 시간을 20 초로 설정하고 강도를 90dB SPL (케이지 내부에서 측정)로 설정하십시오. 표준 액티브 스피커를 통해 잡음을 재생하십시오 1 .
- 수술 후, 기록부에 습관이있는 동안딩 조건, 실험 소음을 무작위로, 여러 번 하루 동안 그리고 다른 순간에 재생합니다 1 .
- 실험 조건 (EEG / EMG / ECG 데이터 기록 중)에서는 가벼운 발증 (ZT0)에서 처음 100 분 동안 무작위로 잡음을 재생합니다. 소음을 재생하려면 다음 조건을 충족하십시오. 1 :
- 마우스가 40 초 이상 비 REM 수면 상태인지 확인하십시오.
- 이전 노출이 4 분 전에 발생했는지 확인하십시오.
참고 : 이로 인해 세션 당 ~ 15 회의 노출이 발생합니다.
- 녹음 시간의 시작과 각 노이즈 노출의 시작을 표시하십시오. 수술 중 비 REM 수면의 스펙트럼 구성에 대해 실험자를 눈이 멀게 유지하십시오.
- polysomnographic 소프트웨어 1 , 29로 모든 데이터를 습득하십시오.
5. 행동 결과에 따른 수면의 후 향적 분석소음에 노출
- 노이즈 노출 시간에 대한 지식없이 수동으로 4-s 해상도의 EEG / EMG -ECG 트레이스 스코어를 계산합니다 1 .
- 맞춤형 스크립트를 사용하여 EEG / EMG-ECG / 노이즈 노출 데이터 추출 1 .
- 노이즈 노출 ( 그림 3A ) 중에 EEG 및 EMG 신호가 변경되지 않은 채 슬립 스루로 기록됩니다. EMG-ECG 전극 ( 그림 3B )에서 감지 된 근육 활동과 함께 뇌파 진폭이 감소하고 뇌파 빈도가 증가 할 때 웨이크 업을 고려하십시오.
- 사전 자극기 또는 노이즈 노출의 처음 4 초 동안 동물이 일어난 시련을 버리십시오 ( 그림 3D ).
- 각성 성공률을 모든 포함 된 임상 시험 ( "Wake-up"및 "Sleep-through") 내에서의 임상 시험의 비율로 정의하십시오.
- 모든 포함 된 시험에서, σ 파워의 동력학을전자 사전 자극 기간 ( 그림 3 E ) 1 .
그림 3 . 소음 발병에 대한 행동 결과 : 분석에서 제외되거나 제외 된 대표 결과.
( AD ) 노이즈가 발생하기 전과 노이즈가 20 초 동안 나타나는 40 초 동안 파란색 눈부심 영역으로 표시된 EEG (검은 색) 및 해당 EMG-ECG (회색) 신호의 원시 흔적. 경계 상태는 색상 코드로 표시됩니다. 분석에 포함 된 데이터를 설명하기 위해 대표적인 "Sleep-through"( A ) 및 "Wake-up"( B ) 이벤트가 표시됩니다. 폐기 된 결과에는 REM 수면으로의 전이 ( C )와 조숙 한 "Wake-up"반응 ( D )이 포함되었습니다. 삽화는 창피를 보여준다.REM 수면에 특징적인 EEG 및 EMG-ECG 추적의 일부분을 표시합니다. ( E ) "Sleep-through"(왼쪽) 및 "Wake-up"(오른쪽) 이벤트 동안 노이즈가 발생하기 전의 40 초 창에서의 시그마 동력학의 전형적인 예입니다. 시그마 대역에 대해 밴드 패스 필터링 된 원시 EEG 추적이 위에 나와 있습니다. 파란색 영역은 노이즈가 발생 함을 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Representative Results
도 2 A (상부 패널)에 기술 된 바와 같이 전극을 통해 주입 수면 다원 기록 자발 슬립 웨이크 동작 100 분 뻗어을 나타낸다 (도 1 참조). 비 REM 수면 시작시 EEG 및 EMG 진폭의 증가 및 감소가 명확하게 표시됩니다. 간헐적 인 REM 수면은 EEG 진폭이 감소하고이 압축 된 시간 눈금에서 보이지 않는 EMG 톤이 더 감소 함으로 표시됩니다. 하나의 비 REM 수면 시합을 확대하면 뇌파의 고 진폭의 느린 파동과 EMG-ECG 트레이스에서 심박수의 RR 간격이 수직 편향으로 중첩되는 낮은 근육 활동이 나타납니다 ( 그림 2A , 중간 및 하단 패널). FFT는 모든 4s 신시기 전반에 걸쳐 SWA의 우위를 드러냅니다 ( 그림 2B ). 평균 시그널을 그려라.이 신기원들 각각에 대한 힘 (10 - 15 Hz, 붉은 그림자 막대)은 반대 방향으로 심박수의 변화와 함께 그것의 변화하는 시간 경과를 보여준다. 이 분석을 비 REM 관찰 전체에서 수행하고 평균 전력 값으로 정규화하면 평균 주위의 시그마 전력의 규칙적인 변화가 풀립니다 ( 그림 2 C ). 이 전력 시간 과정에 대한 푸리에 분석은 0.02Hz 주변의 주요 피크를 보여 주며, 50 초 간격으로 시그마 전력이 주기적으로 증가합니다 ( 그림 2D ).
arousability에서 0.02 Hz 진동의 기능을 조사하기 위해, 마우스는 수면시 90 dB의 20 초 펄스에 노출되었다. 그림 3 은 이러한 소음 노출의 실험 결과 중 일부를 보여줍니다. 소음 중에 마우스가 깨어나지 않고 뇌파 및 EMG-ECG 파형이 변경되지 않은 경우 결과는 클래스는 "슬립 연결"로 ified하게 (도 3 A). EEG 진폭이 감소하고 EMG 활동이 관찰되었을 때, 결과는 "Wake-up"으로 기록되었다 ( 그림 3B ). 때로는 마우스가 재판 중에 REM 수면으로 전환하거나 ( 그림 3 C ) 소음이 나타나기 전에 40 초 간격으로 깨어났습니다 ( 그림 3 D ). 이러한 사건은 분석에서 제외되었는데, 그 이유는 소음 노출 ( "Sleep-through"또는 "Wake-up") 결과에 앞서 통합 된 비 REM 수면의 특징을 확인하는 것이기 때문입니다. 소음 자극 이전의 40 초 기간에서 σ 파워를 계산 한 결과, "Sleep-through"가 발생했을 때 0.02-Hz 진동이 바닥에 있었지만 ( 그림 3 E , 왼쪽 패널), "Wake- 쪽으로" 이벤트 ( 그림 3 E , 오른쪽 패널). 따라서 음향 자극에 대한 다양한 행동 결과에 따라 마우스의 비 REM 수면을 소급하여 σ 파워의 0.02-Hz 진동의 위상을 잡음에 대한 가변 탄력성을 갖는 수면 상태의 특징으로 식별합니다.
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Discussion
여기서는 EEG, EMG 및 ECG 변수가 통합 된 비 REM 수면의 연속 시간 프로파일을 설정하는 방법을 보여줍니다. 이것은 마우스 수면에 대한 통합 설명을 개발하기위한 첫 번째 단계입니다. 비 수면 중 수면 중 잡음에 대한 높은 탄력성과 낮은 탄력성을 구성하는 이전에 인식 할 수 없었던 시간을 식별하는 데 도움이 될 수 있습니다 1 . 유사한 시간적 구조는 유사한 분석 (1)를 통해 인간 비 REM 수면에 기재 하였다.
여기에 제시된 절차는 두 가지 목표를 달성합니다. 첫째, 우리는 폴리 소노 그래피 기술이 쥐의 비 REM 수면 기간 동안 EEG 및 EMG-ECG 신호를 안정적으로 제공 할 수 있다는 점을 주목합니다. 심장 박동은 근육 atonia로 인해 수면 동안 EMG 흔적에서 가장 분명하고, 증가 된 근육의 음색과 가끔 근육 twitch 때문에 비 REM 수면에서 더 숨겨집니다. EMG-ECG 전극 삽입하기근육 깊숙이 깊숙히 들어가서 가능한 멀리 멀리두면 심장의 R 파의 진폭이 증가하여 배경 근육의 강장제에서 분명히 나옵니다. 피크 검출 루틴은 비 REM 수면 EMG-ECG 신호에서 심박수를 추출하고 그 변동성을 정량화합니다.
EEG / EMG 및 ECG를 동시에 모니터링하는 원격 측정 기반 기술이 점차 많이 사용되지만 철저한 스펙트럼 분석에 필요한 신호 품질은 대역폭 및 안정성면에서 열세입니다. 또한, 단일 채널 송신기조차도 상당한 크기이며, 자궁 경부 피하 영역 또는 체강 내 주입은 동물의 안녕과 수면에 영향을 줄 수 있습니다. 그럼에도 불구하고 이러한 장치를 개발하는 것이 c의 동물 모델 인 생쥐에서 방해받지 않은 수면 중에 동시에 따라갈 수있는 중앙 및 자율 매개 변수의 범위를 확장하는 데 필요합니다수면 연구에 적합. 예 1, 19, 수면 중에 multiparametric 측정은 현재 제어 된 행동 테스트와 결합 될 수 불변 스펙트럼 프로파일을 가진 마우스에서 비 REM 및 REM 수면 모두로부터 데이터의 수집을 허용 머리 받침과 같은 기술에 조합.
둘째, 여기에 제시된 분석적 접근법은 관심 분야의 특징을 생성하는 데 관련된 뇌 영역을 정의하기 위해 지역 필드 잠재력에 적용될 수 있습니다 1 . 또한, 그것은 연결 인구의 스펙트럼 행태 및 연속 ( 예 : 스펙트럼 밴드) 및 이산 ( 예 : 심박수 또는 호흡) 변수에 대해보고하기에 충분히 빠른 이미징 기술에 적용 할 수 있습니다. 시간 해상도는 경계 상태를 채점하기 위해 선택된 기간의 기간에 의해서만 제한됩니다. 본질적으로, 비 REM으로부터 유도 된 신호의 표준 분광 분석leep bouts 다음에는 모든 신기원에 대한 개별 신호의 출력 밀도 값을 정렬합니다. 그런 다음 이러한 동력학의 스펙트럼 분석을 사용하여 구조의 주기성을 정량화합니다. 마우스와 인간 모두에서 우리의 접근법은 포유류의 수면 구조에 대한 단일화 된 특징으로 그것을 증명하는 비슷한 특성 1 과 함께 0.02Hz 진동을 산출했다.
중요한 단계는 잠자는 마우스의 소음에 대한 행동 반응성을 토대로 비 REM 수면을 후 향적으로 평가하여 관찰 된 주기성을 기능적으로 검증하는 것이 었습니다. 여기서는 다양한 행동 결과를 초래하는 소음 자극의 선택이 깨어나거나 수면을 초래하는 데 결정적인 역할을했습니다. 대부분의 노출에서 웨이크 업을 유발하는 강한 감각 자극은 웨이크 업이 모든 단계에서 시행되기 때문에 0.02Hz 진동을 풀지는 못합니다. 대조적으로, 너무 약한 자극은 0.02Hz osc에 대한 위상 관계를 일관되게 나타내지 못합니다추리. 마찬가지로, 측정 된 매개 변수 세트에서 관측 된 주기성은 변수 결과와 함께 갈 필요가 있습니다. 예를 들어, 여기에 제시된 경우, 우리는 소음 노출 동안의 깨우기 순간 또는 그 이후의 깨우기 상태의 지속 시간을 고려하지 않고 깨우기 또는 수면 - 통과 이벤트 만 구별합니다 (단, 1 참조) . 다양한 강도 24 , 25 , 28 에서 짧은 자극을 사용하면 0.02Hz 진동과 웨이크 업 사이의 정확한 위상 관계를 묘사하는 데 도움이 될 수 있습니다. 더욱이, 소리의 주파수 구성을 변화시키는 것은 최근의 수면 - 후각 행동, 성별, 네슬링의 존재, 또는 다른 형태의 최근 경험의 함수로서 각성을 조절할 수있다. 또 다른 가능성은 microarousals 또는 전체 각성의 유행이 주어진 순간 잠 상태에 달려 있는지 여부를 조사하는 것일 수 있습니다. 다양한 행동 결과에 근거한 수면 채점은보다 일반적으로 수면의 기능적 마이크로 아키텍처를 조명 할 수 있습니다. 우리와 다른 사람들은 다른 감각 양상에 대한 반응으로 소음 노출 1 , 28 , wake-up에 대한 반응성을 조사했지만, 경계 상태 전환 14 또는 꿈 보고서는 이전의 수면에 해당하는 상관 관계를 추출 할 수있었습니다. 또한 수면 장애 환자의 외란에 대한 감수성과 0.02Hz 진동의 잠재적 붕괴와 관련하여 수면 장애 환자를 테스트하는 것은 매우 흥미 롭습니다. 수면 장애는 심혈관 장애로 이어질 수 있지만 심장 혈관 위험은 수면 조절 장애를 유발할 수있다. 31 , 32 ,이 양방향성을 이해하는 데 잠재적으로 관련이있는 0.02-Hz 진동 동안 뇌 - 심장 협응에 대한 연구를 렌더링한다.나는 의존한다.
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Disclosures
저자는 경쟁적 인 금전적 이익이 없다고 선언합니다.
Acknowledgments
우리는 모든 원고가이 원고를 쓰고주의 깊게 읽는 것에 기여한 것에 대해 감사드립니다. 외과 적 프로토콜에 대한 유용한 의견을 제공하는 Gisèle Ferrand 박사와 소음 노출을위한 원래의 Labview 실행 파일을 제공 한 Dr. Jean-Yves Chatton에 대한 토론을 자극 한 Paul Franken에게 감사드립니다. 스위스 국립 과학 재단 (Grants 31003A_146244 및 31003A_166318)과 Etat de Vaud가 기금을 지원했습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-components epoxy glue | Henkel | Loctite EA 3450 | |
| Absorbable Suturing Fiber (Prolene) | Ethicon | 5-0 FS-3 | |
| Adson Forceps | FST | 11006-12 | |
| Antiseptic swab | VWR | 149-0332 | |
| Attane Isoflurane | Piramal | Isoflurane 250mL | |
| Connectors 3 x 2-channels | ENA AG | 2.316 | Raster 2.54 x 2.54 mm; size 5 x 8 x 9 mm; pin size 5 mm; http://www.ena.ch/ |
| Dragonfly commutator | Dragonfly | Model #SL-10 | |
| EMBLA amplifier | EMBLA | A10 amplifier | |
| Fine scissors | FST | 14108-09 | |
| Flat Head Gold-plated steel screw | J.I. Morris | FF00CE125 | https://jimorrisco.com/ |
| Gold wire | CMSA | T.69 5gr | http://www.cmsa.ch/en/ |
| Hemostatic sponge | Pfizer | Gelfoam | |
| iodine-based disinfectant (Betadine) | Mundipharma | standart solution 60mL | |
| Komet drill steel 1/005PM104 | UNOR AG | 22310 | |
| Matlab Analysis Software | MathWorks | R2016b | https://ch.mathworks.com/products/matlab.html |
| Microdrill | Fine Science Tools | 96758 | |
| Mouse Gas Anesthesia Head Holder | Kopf Instruments | Model 923-B | http://kopfinstruments.com/product/model-923-b-mouse-gas-anesthesia-head-holder/ |
| Ophtalmic ointment | Pharmamedica | VITA-POS | |
| Paladur (liquid) | UNOR AG | 2260215 | for dental cement |
| Palavit (powder) | UNOR AG | 5410929 | for dental cement |
| Small Animal Stereotaxic Frame | Kopf Instruments | Model 930 | http://kopfinstruments.com/product/model-930-small-animal-stereotaxic-frame-assembly/ |
| Soldering wire | Stannol | 593072 | |
| Temperature controller - Mini rectal probe | Phymep | 4090502 | http://www.phymep.com/produit/dc-temperature-controller/ |
| Temperature controller- heating pad | Phymep | 4090205 | http://www.phymep.com/produit/dc-temperature-controller/ |
References
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