Summary
Bu yöntemde, photopolymerization kullanıyoruz ve polietilen glikol (PEG) hydrogels, sağlayan yüzeyinde protein veya peptid desen oluşturmak için tıklatın kimya teknikleri biyoaktif sinyaller hücresel yanıt vitro incelenmesi için immobilize .
Abstract
Hücre davranış ve kök hücre farklılaşması etkileyebilecek birçok biyolojik bir çekim gücü vardır. Genel hücre kültür yaklaşımlar içinde orta kontrol hücre davranış olarak çözünür faktörler güveniyor. Ancak, çözünür eklemeler belirli motifler içeren hikâyeler, matris bağlı büyüme faktörleri gibi sinyal, hücre-hücre sinyallemesi ve hücreleri üzerinde ortak etkiler vardır kayma biyokimyasal cues taklit edemez. Ayrıca, yüzey sertliği gibi Matrix biyofiziksel özellikleri geleneksel hücre kültürü çalışmalarının yöntemler kullanarak kolaylıkla yönetilebilir değil hücre kader, önemli rol oynarlar. Bu yöntemde, desenli biyoaktif proteinler sentetik polietilen glikol (PEG) hydrogels photochemistry kullanarak sağlamak için basit bir protokol tanımlayan. Bu platform yüzey sertliği ve kayma biyokimyasal cues bağımsız kontrol için sağlar. Bu hydrogels çok sayıda fizyolojik ilgili sertlik değerleri elde edebilirsiniz. Ayrıca, bu hydrogels yüzeylerin photopatterned biyoaktif peptidler ile olabilir veya proteinler thiol-KD ile kimya reaksiyonları tıklatın. Bu yöntemler protein işlevi sonra yüzey immobilizasyon korumak için optimize edilmiştir. Bu, herhangi bir protein veya peptid ilgi desenleri çeşitli oluşturmak için uygulanacak çok yönlü bir protokoldür. Son olarak, onlar dağınık şekilde belirli sinyallere yanıt olarak bu biyoaktif hydrogels yüzeyler numaralı seribaşı hücreler zamanla izlenebilir.
Introduction
Hücre davranışını etkiler birçok çekim gücü vardır. Genel olarak, tipik hücre kodlamayla teknikleri çözünür faktörler üzerinde hücresel yanıt temin için itimat; Ancak, bu yaklaşım için sınırlamalar vardır. Bu yöntemler yaygın bulunan tüm sinyal motifleri doğru görüntüleyemiyor içinde vivo. Böyle sinyal mekanizmaları münzevi büyüme faktörleri, hücre-hücre sinyallemesi ve dağınık şekilde özel biyokimyasal ipuçları içerir. Ayrıca, yüzey sertliği hücre davranış ve kök hücre farklılaşması içinde önemli bir rol oynayabilir ve kolaylıkla ortak hücre kodlamayla uygulamaları1,2kullanarak yönetilebilir değil. Biomaterial yaklaşımlar sinyal mekanizmaların keşfetmeye başlamak için yeni bir platform sunuyoruz. Özellikle, hydrogels yüzey sertliği3,4, immobilizing proteinler ve peptidler5,6, ayarlama ve dağınık şekilde belirli kalıpları7, oluşturmak için mükemmel aday olan 8.
Hydrogels doku Mühendisliği hücre dışı Matriks (ECM)9,10ile onların biyofiziksel ve biyokimyasal ortak nedeniyle iskele olarak yaygın olarak kullanılır. Biyouyumlu ve vücudun birçok dokularda bulunan doğal polimerler için iskele, ortak seçenekleri bulunmaktadır. Doğal polimerler yüzeyler kullanma sınırlaması onlar bioconjugation için kolay elde edilebilir kimyasal moieties olmaması. Öte yandan, sentetik hydrogels, bu nedenle PEG, hedeflenen kimyaları11,12mükemmel platformlar şunlardır. Ayrıca, PEG hydrogels hücresel yanıt temin değil ve bu nedenle inert omurgalarına biyoaktif iskele oluşturmak için kullanılır.
Biyoaktif hydrogels oluşturmak için kimya reaksiyonları istihdam edilmektedir photopolymerization ve thiol-KD'ı tıklatın. Bu photoreactions bir photoinitiator ve UV ışık kaynağı gerektirir. Photoinitiators UV ışığına tanıttığında, formu radikaller koparamaz. Tezler radikaller reaksiyonu başlatmak için gerekli olan ancak protein bioactivity12,13olumsuz yönde etkileyebilir. Bu nedenle, photoinitiator ve UV pozlama süreleri protein bioactivity korumak için en iyi duruma getirmek çok önemlidir.
Bu yöntemde, hydrogels akrilat akrilat zinciri büyüme photopolymerization sentezlenmiş. PEG-diacrylate (PEGDA) monomerleri dallı polimer ağlar hidrojel yapısı için sorumlu oluşturmak için birbirleri ile tepki. PEGDA monomerleri jel öncü çözüm içindeki konsantrasyonu substrat sertlik kontrol edecek. Hidrojel boyutu nedeniyle küçük gözenek, ECM proteinler fibronektin gibi kolayca hidrojel hücre eki amacıyla içinde dahil edilebilir. Son olarak, bu hydrogels yüzey ile biyoaktif peptidler desenli olabilir veya proteinler thiol-KD ile kimya reaksiyonları tıklatın. Burada, unreacted ücretsiz İnceltilebilen hidrojel sistemi içinde protein veya UV ışığına maruz kaldığında peptid bulunan ücretsiz thiols ile tepki olacaktır. Proteinler veya peptidler hidrojel yüzeyinde immobilize sonra hidrojel 4 ° C'de birkaç hafta için bioactivity kaybetmeden depolanabilir. Bu kolaylık, esnek deneysel planlama ve labs arasında işbirliği imkanı sunmaktadır. Genel olarak, bu platform biyomekanik ve mekansal biyokimyasal kontrol, bağımsız birbirlerinin hücresel davranışlarını etkilemek belgili tanımlık fırsat sağlar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. hazırlık malzemeleri hidrojel sentezi için
- hazırla hisse senedi çözümler PEGDA, lityum fenil-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate (LAP) ve steril koşullarda fibronektin ve temel Hesaplamalar (tablo 1A).
- Tartmak ve fosfat tamponlu tuz çözeltisi (PBS) bileşikler geçiyoruz. Tipik olarak, çözüm konsantrasyonu 50 ve 200 mg/mL (5-%20 ağırlık/hacim) arasında çalışma PEGDA korumak. Sterilizasyon için 0,22-µm şırınga filtre aracılığıyla PEGDA çözüm pipette.
Not: gelen ışık onları korumak için kaydırma bir folyo ile kaplı PEGDA çözümleri tutun. (Her deneme için önerilir) PEGDA taze bir çözüm hazırlayın.
Üretici firmaya esaslı - reconstitute fibronektin protein toz ' s tavsiye. 1 mg/mL, aliquot, fibronektin hisse senedi çözüm korumak 60 ila 100 µL aliquots, içine ve onları kadar kullanmak-20 ° C'de depolayın. Aliquots 4 ° C'de defrost için birkaç saat veya gece kullanmadan önce. Protein hisse senedi steril koşullarda verilmediyse, sterilizasyon için 0,22 µm şırınga filtre kullanın.
Not: Fibronektin hücre eki için kullanılır. Diğer ECM proteinler yerine. - LAP stok belgili tanımlık eriyik için tartmak ve içinde PBS çözülür; 25 mg/mL tipik bir hisse senedi toplama olduğunu. Eriterek ile herhangi bir sorun olursa solüsyon içeren temizleyicide. Çözüm sterilizasyon için 0,22 µm filtre geçişi. Kapak folyo sarma ile tur ve 4 ° C'de için birkaç ay kadar devam.
Not: Photochemistry için kullanılan photoinitiator kucak mı.
- Tartmak ve fosfat tamponlu tuz çözeltisi (PBS) bileşikler geçiyoruz. Tipik olarak, çözüm konsantrasyonu 50 ve 200 mg/mL (5-%20 ağırlık/hacim) arasında çalışma PEGDA korumak. Sterilizasyon için 0,22-µm şırınga filtre aracılığıyla PEGDA çözüm pipette.
- Hidrojel oluşumu için steril cam slayt kalıpları hazırlamak.
- Otoklav bir polyester sayfası; bir her jel kalıp için gereklidir. İki cam slayt ve üç plastik çubukları (0.5 mm kalınlığında) her jel kalıp için en az 2 h için % 70 etanol içinde emmek, ancak genellikle geceleme ıslatın izin verin. % 70 etanol için kullanmadan önce 10 dk içinde beş bağlayıcı klipleri her jel kalıp için emmek.
- Hücre kültür hood hava kuru birkaç saat için izin için cam slaytlar, çubukları ve bağlayıcı klipleri bir küçük autoclaved levha üzerine koyun.
- Bir cam slayt kenarındaki plastik çubukları yerleştirerek hidrojel kalıpları hazırlama. İkinci cam slayt üstüne yerleştirin. Çubukları bağlayıcı klipleri, iki uzun her tarafı ve bir top ile yanyana sıkıca güvenli.
Not: Eğer bu düzgün monte değil, jel çözüm sızıntısı olacak. - Yüzey sterilize hücre kültürü ile kalıp kullanmadan 30 dk önce ışık UV hood. Yarım aracılığıyla, flip her iki yüzeyler maruz kalıp.
2. Proteinler ile ücretsiz Thiol değiştirme
- thiol proteinler (tablo 1A) üzerinde Amin dönüştürme için elektronik tablo hesaplamalar kullanarak hisse senedi çözümleri hazırlayın.
- Tepki tampon yapmak için PBS pH 8 için ayarlamak ve 5 mM EDTA ekleyin. Pipet tepki arabelleğe 0,22 µm şırınga filtre sterilizasyon için.
Not: disülfür bağları oluşturan thiols korur gibi EDTA, önemlidir. Thiol grupları yapılmasına tepki için azaltılmış formunda kalmalı. - Tartmak 2-iminothiolane (Traut ' s reaktif) ve 2 mg/mL (14 mM) hisse senedi çözüm konsantrasyon için tepki arabellekte geçiyoruz. Çözüm 0,22-µm şırınga filtre sterilizasyon için geçişi. 4 ° C'de için birkaç ay kadar hisse senedi çözüm mağaza.
Not: 2-iminothiolane ücretsiz aminler solvent maruz üzerinde proteinler tepki verir ve bunları ücretsiz thiols dönüştürür moleküldür. - Reaksiyon arabellek 0,1 ve 1 mg/mL arasında bir konsantrasyon, protein reconstitute. Sürece daha önce steril, sterilizasyon için 0,22-µm şırınga filtre aracılığıyla bu çözüm pipette.
Not: Bu proteinin hidrojel yüzeye desenli biyokimyasal sinyal buydu. Protein konsantrasyonları farklılık gösterebilir, Ayrıca, daha yüksek konsantrasyonlarda güçlü protein desenler için ideal iken.
- Tepki tampon yapmak için PBS pH 8 için ayarlamak ve 5 mM EDTA ekleyin. Pipet tepki arabelleğe 0,22 µm şırınga filtre sterilizasyon için.
- Her iki hisse senedi çözümleri birlikte karıştırılarak 2-iminothiolane ile protein tepki; tablo 1B doğru hacim oranı hesaplamak için kullanın. Genelde 8:1 2-iminothiolane protein molar oranını kullanırsınız.
Not: Daha büyük proteinler bir veya daha fazla konsantrasyonları sulandırmak, 2-iminothiolane daha yüksek bir molar oranını kullanın. Üreticiye başvurun ' s protokolü 15. - Oda sıcaklığında 1 h için tepki kuluçkaya. Thiolated protein ürün üretici takip kalan Reaktanları kaldırmak için desalting spin mikro-sütun kullanmak ' s protokolü 16.
Not: Dışlama bu reçine 5 KDa sınırıdır. - Kullanım Ellman ' s tahlil kantitatif ölçmek için ücretsiz thiols protein başına sayısı. Üretici takip ' s Protokolü tahlil 17.
3. Hidrojel oluşumu
- jel öncü çözüm temel alan değerleri üzerinde Oluştur Tablo 1 c hesaplanır. Mix birlikte PEGDA, fibronektin ve kucak birimleri. Şiddetle homojen bir çözüm olun ama kabarcıklar iç karışıklık yaratarak önlemek için çözüm pipette. Işıktan korunan çözüm devam.
- Jel öncü çözüm jel kalıp iki cam slayda dikkatle pipette. Tipik olarak, kalıp için 800 ile 1.000 µL arasında bir birim eklemek. Jel çözüm için UV ışık kalıp içinde maruz (dalga boyu: 365 nm, güç: 3-4 mW/cm 2) 1-2 hidrojel oluşturmak üzere min için.
Not: yetenekleri biçimlenme yüzey proteini sınırlar gibi hidrojel uzun süreli UV ışığa maruz bırakmayın. - Bağlayıcı klipleri almak ve iki yan çubukları basınç uygulayarak üst cam slayt yavaşça çıkarın.
- Bir uygun ölçekli biyopsi yumruk hidrojel örnekleri kesmek için kullanın. Birden çok hydrogels çoğaltır hizmet ve örnekleri denetlemek için jel dikdörtgenden dışarı yumruk.
4. Hidrojel sertlik ölçümleri
- yumruk hydrogels 8'li ile dışarı mm çap biyopsi yumruk için bir 8 mm paralel plaka rheometer. Bir hidrojel örnek rheometer yük (Tablo reçetesi görmek).
- Alt paralel plaka geometri yani 8 mm çapında yapımı kadar jel yüzeyi ile temas. Gap mesafe 0.5 mm kalınlığında hidrojel örnek için 0.5 mm.
- Gerçekleştir zaman piyango % 0.1 soy, 0.1 Hz frekans ve 37 5 min için ° C. ortalama G ' değerleri arasında her zaman süpürme. Çoğaltır her kompozisyon için bağımsız hydrogels çalışacak.
Not: G ' değer-meli var olmak kararlı zaman puan arasında; Eğer onlar are değil, yüzde süzün ve sıklığı piyango uygun seçmek için gerçekleştirilmesi 14 değerleri.
5. Protein desenlendirme
- hazırla bir bilgisayar destekli tasarım (CAD) programı kullanarak photomask için gerekli kalıbı. Photomask yüksek çözünürlüklü bir yazıcı kullanarak bir şeffaf kağıda yazdırmak. Photomask % 70 etanol için kullanmadan önce 10 dk bekletin. Hava photomask kuru bir hücre kültür başlıklı kullanmadan önce izin.
- Adımında hidrojel 2 yüzeye yüzey desenlendirme için hazırlanan thiolated protein çözüm ekleyin. 1-2 µL/cm 2 thiolated protein çözüm her boşaltma jel yüzeyine pipette.
Not: Protein birimin en aza indirmek önemlidir; Sadece hidrojel örnek tüm yüzeyine eşit olarak örtecek kadar eklemek. - Dikkatle photomask hidrojel bir yüzeye yerleştirin. Hava kabarcıkları hidrojel yüzey arasındaki photomask izin verme. Yavaşça aşağı oluşturan herhangi bir kabarcıklar kaldırmak için maskeyi basın.
- Ortaya çıkarmak için UV ışığı ikinci turunda hidrojel (dalga boyu: 365 nm, güç: 3-4 mW/cm 2) için 30-60 s.
Not: Protein fonksiyon kaybına neden olmadan güçlü bir desen oluşturmak için yeterli UV ışık desen maruz önemlidir. - Hydrogels unreacted tür kaldırmak ve her hidrojel iyi plaka içinde yerleştirmek için PBS ile yıkayın. Jeller her kuyunun içine yerleştirirken dikkatli olun; desenli yüzeyi yukarı yüz olduğundan emin olun. Jelleri PBS içinde 4 ° C'de yıkama; jelleri istikrarlı en az iki hafta 4 ° C.
6. Hydrogels hücre tohum için hazırlık
- 5-10 dk 37 ° C'de tohum önce Bazal ortamda jelleri kuluçkaya. İnsan göbek damar endotel hücreleri (HUVECs) için EGM-2 Orta büyüme faktörleri olmadan kullanın. Her eklenen orta hacmi en aza indirmek iyi hidrojel yüzen önlemek için. 48-şey plaka için orta 250 µL hacmi kullanın.
- Spin aşağı 300 x plaka g hydrogels kuyu alt kısmında bulunur ve değil yüzer emin olmak için 3 dakika için. Bunu hemen hücre tohum önce.
7. Hücre tohumlama Hydrogels üzerinde
hücre Tohumculuk- kullanımı Standart steril memeli hücre kültür yordamları ve deneysel prosedürler. HUVECs Standart hücre dekolmanı protokolleri kullanarak doku kültürü şişeler kaldırın. Steril PBS ile doku kültürü çanak yıkama ve tripsin 3-5 dk 37 ile kuluçkaya ° C.
- Trypsinized hücre süspansiyon aşırı hücre orta veya tripsin nötrleştirici çözümü ile yavaşlaması.
- Santrifüj 300 x g de hücre süspansiyon aşağı spin için 5 dk. dikkatle süpernatant kaldırmak ve hücre Pelet devam.
- Hücre Pelet Bazal EGM-2 hiçbir büyüme faktörleri ile resuspend. Bir hemasitometre Hücre sayımı için kullanın. Yavaş yavaş her de bu yüzden jelleri rahatsız etmemek için merkezi haline pipetting tarafından
- eklemek 75.000 hücreler/cm 2 her hidrojel için yüzey. Bir hücre kültür kuluçka 37 ° C'de iyi tabak yerleştirin İçin birkaç çıkarmak günler, düzenli aralıklarla yemek gözlem için.
8. Bioactivity değerlendirilmesi
- kültür E. coli LB suyu 37 ° C ve 200 rpm yörünge bir süspansiyon süspansiyon geceleme. E. coli kültür spin, dikkatle boşaltmak ve PBS asgari miktar hücre Pelet sulandırmak. Lizozim tartmak ve 1 mg/mL için stok belgili tanımlık eriyik, sulandırmak.
- Küçük hacimli (25 µL) lizozim hisse senedi çözümü microcentrifuge tüpler içine pipette. KUCAK photoinitiator (0-12 mM) çeşitli düzeylerde ekleyin ve UV ışık 1 dk örnekleri ortaya çıkarmak. Ayrı bir grup tur (2 mM) aynı miktarda lizozim ekleyin ve örnekleri için değişen UV ışık kez açığa (0-4 dk). Her tedavi için çoğaltır içerir. Lizozim örnekleri için bir final lizozim protein konsantrasyonu 0.5 mg/mL
- Ekle eşit birim konsantre E. coli çözüm. Oda sıcaklığında 4 h için karma çözümler kuluçkaya.
Not: Bu süre bakteriyel hücre duvarı parçalayıcı ve proteinler çözüm içine serbest bırakmak fonksiyonel lizozim sağlar. - Tedavi edilmezse lizozim E. coli ile olumlu bir denetim için inkübe kullanın; bu % 100 biyoaktif ölçüm düşünün. PBS bir negatif kontrol yalnız ile inkübe lizozim çözüm kullanın.
- Hücre artıkları kaldırmak ve süpernatant korumak için örnekleri spin. Toplam konsantrasyonu protein içinde bakteriyel lysate miktarını ölçmek için süpernatant ölçmek için bir Bradford tahlil çalıştırın.
- Çalıştırmak üretici aşağıdaki Bradford tahlil ' s protokolü 18. Kat değiştirme protein konsantrasyon negatif denetimine göre hesaplamak.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
PEG hydrogels yüzeyinde biyoaktif desenleri oluşturmak için protokol şekil 1' de gösterilmiştir. Bir elektronik tablo birim ve konsantrasyon için her hisse senedi eriyik (tablo 1A) hesaplamak için geliştirilmiştir. Proteinler hidrojel yüzey immobilize 2-iminothiolane (şekil 1B) ile değiştirilir. Bu reaksiyon tablo 1Bbirimlerden kullanılarak gerçekleştirilir. Öncü hidrojel çözüm ile % 10 ağırlık/hacim PEGDA kucak (şekil 1A) ile hazırlanır. Çeşitli öncü PEGDA konsantrasyonları istenilen yüzey sertliği (Şekil 2A) verim için kullanılabilir. Fibronektin hücre eki amaçlar için bu öncü çözüm içinde yer alır. Ayrıntılı karıştırma sonra bu çözüm hazır kalıp içine pipetted ve UV ışığı (şekil 1C) maruz. UV ışık pozlama indirilmelidir; pozlama bir hidrojel üretmek için yeterli olmalıdır. Hidrojel örnekleri için istenen iyi plaka (şekil 1C) için uygun çap yumruk. Yüzey desenlendirme için değiştirilmiş protein çözüm bir hidrojel yüzeyine pipetted ve eşit yayılmış. Asgari miktar kullanılmalıdır; protein birim hidrojel tüm yüzeyine karşılamak için yeterli olmalıdır. Önceden tasarlanmış photomask doğrudan hidrojel yüzey yerleştirilir; Hava kabarcıkları maske ve hidrojel arasında kaçınılmalıdır. UV ışığı ikinci turunda kovalent UV maruz protein hidrojel çekimlerine kullanılır. Hidrojel örnekleri unreacted proteinler kaldırmak ve immobilize protein desen (şekil 1D) ortaya çıkarmak için durulanır.
Photoinitiator konsantrasyonu ve UV pozlama süresi ne zaman proteinler mevcuttur en aza indirmek önemlidir. Lizozim bioactivity bir göstergesi olarak kullanarak, biz tur photoinitiator konsantrasyonu daha az 2 mM (Şekil 2B) olmalıdır ve UV pozlama süresi daha az 2 bir protein korumak için min (Şekil 2C) toplam bulundu bioactivity % 80'den büyük.
UV çekim hızı hidrojel oluşumu ve protein desenlendirme sırasında başarılı Protokolü (şekil 3) geliştirmek için her iki önemli parametre vardır. Her şeyden önce UV Işınlarına maruz kalma hidrojel oluşumu sırasında en aza indirmek ücretsiz akrilat fonksiyonel gruplar için sonraki protein immobilizasyon reaksiyonlar (şekil 3A) korumak açısından önemlidir. UV ışığı 2 dk daha uzun süre maruz Hydrogels immobilize protein desenleri oluşturmak mümkün değildir. Ayrıca, UV Işınlarına maruz kalma protein desene arttıkça, daha fazla protein yüzeye (şekil 3B) tepki.
Son olarak, hücreleri bunlar kültürlü desenli hücre davranış işlemek için hidrojel yüzeylerde. Hydrogels üzerinde immobilize desenleri potansiyelini göstermek için VEGF, endotel hücreleri için önemli bir büyüme faktörü desenli ve HUVECs Bazal EGM-2 Orta (şekil 4) kullanarak yüzeyde kültürlü. HUVECs düzgün VEGF desenli PEG hydrogels(şekil 4)yüzeyine numaralı seribaşı. Tohum sonra iki gün HUVECs immobilize VEGF (şekil 4B, C) bulunan hidrojel kayma bölgeler doğru geçirmek için tespit edildi. Bu hücre davranışlarını etkilemek için kullanılan PEG hydrogels biyoaktif protein izi bir örnektir.
Şekil 1: Hidrojel oluşumu ve protein desenlendirme şematik. (A)habercisi hidrojel çözüm PEGDA monomerleri, photoinitiator ve ekstraselüler protein ile hücre eki için hazırlamak. 2-iminothiolane ile tepki tarafından thiol grupları proteinler ile ücretsiz (B) Değiştir. (C) öncü çözüm hazır kalıp içine Pipette ve hidrojel oluşturmak için UV ışığına maruz kalmaktadır. İstediğiniz boyuta hidrojel örnekleri yumruk. (D) pipet değiştirilmiş protein çözüm hidrojel yüzeyinin bir photomask yüzeye ve UV ışığı ikinci bir tur için maruz kalmaktadır. Unreacted türler önce görüntüleme ve hücre tohum kaldırmak için jel durulayın. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Resim 2 : Sertlik ve protein bioactivity oransal. PEGDA monomerleri habercisi jel çözüm içindeki konsantrasyonu(a)değişiklikleri alter hidrojel sertlik. (B) kucak photoinitiator konsantrasyonu artan UV Işınlarına maruz kalma 1 dakika sonra protein işlevi düşürür. (C) artan UV pozlama süresi 2 mM tur işleviyle protein düşürür. Tüm hata çubuklarını temsil eden standart sapması çoğaltır. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3: Protein desenlendirme için en iyi duruma getirilmiş desen ve hidrojel UV pozlama süreleri. (A) Minimizing UV pozlama kez hidrojel oluşumu için yüzey desenlendirme sağlar. (B) artan UV pozlama süreleri yüzey desenlendirme için desen gücü artar. Ölçek çubukları 200 µm. = Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 4: Endotel hücreleri VEGF desen yanıt. (A)tek tip hydrogels üzerinde tohumlari HUVECs. (B ve C) HUVECs VEGF desen duygusu ve immobilize VEGF doğru göç. Görüntüleri (B) 4 X ve (C) 10 X büyütme tohum sonra iki gün alındı. Ölçek çubukları 500 µm. = HUVEC-DC'de (kırmızı) ve VEGF-488 desen (yeşil) 528/553 ve 465 uyarma ve emisyon filtreleri ile yakalanan edildi/495, anılan sıraya göre. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Tablo 1: stok ve jel öncü çözümler hesaplamalarını. Kırmızı bir kutu gibi molekül ağırlığı, kullanıcı tanımlı değerler istenen stok konsantrasyonları ve tartılır-out kitleler gösterir. Mavi kutu kullanıcı tanımlı değerlere göre hesaplanan değerleri temsil eder.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu iletişim kuralı biyolojik uygulamalar için biyoaktif protein desen oluşturmak için bir yöntem sağlar. Bu iletişim kuralı farklı deneyler için adapte yapılan birçok değişikliği vardır. İlk olarak, hücre ek gereksinimleri için farklı hücre türleri değişir. Zavallı hücre eki jeller için başlangıçta gözlem yapılırsa, öncü çözüm içindeki ECM protein konsantrasyonu artan tavsiye edilir. Diğer ECM protein kollajen, laminin veya bunların bir arada farklı türleri dahil olmak üzere fibronektin yerine kullanılabilir. Her yeni hücre tipi için hücre eki hidrojel desenlendirme önce optimize edilmelidir. Bu iletişim kuralı da photomasks için kullanıcı tasarlanmış sağlar. İstenen uygulama dayalı, photomasks üretilebilecek çeşitli boyut, şekil ve genel desenleri bulunmaktadır. Tek tip immobilizasyon bir photomask yokluğunda elde edilebilir.
Bu iletişim kuralı belirli sınırlamaları vardır. Vurgulanmış olarak Temsilcisi sonuçları, bu yöntem her adımda UV ışık miktarını duyarlıdır. Dozun hidrojel oluşumu adım sırasında sonraki yüzey bioconjugation için kullanılabilir akrilat grupları sınırlar. Bu nedenle, bu protokolü anahtar bir adımda iyi yönetilen UV ışık pozlama süreleri her adımı için. Ayrıca, bu iletişim kuralı bir yüksek konsantrasyon protein hisse senedi için başarılı desenlendirme gerektirir. Düşük protein konsantrasyonları yoksul yüzey desenleri neden olur. Ayrıca, onlar sadece ayrı desen üretebilir o photomasks da sınırlı hale gelir. Daha karmaşık desenler benzer yaklaşımlar ile elde edilebilir ama daha gelişmiş bir metodoloji gerektirir.
Bu iletişim kuralı mevcut yöntemler için önemli olduğu yüzey sertliği ve protein desenlendirme ayarlamak için basit bir yöntem sağlar. Yüzey sertliği fizyolojik Aralık içinde bir büyüklük aralığı için akrilat kimya hidrojel oluşumu için kullanarak sağlar. Sadece PEGDA konsantrasyonu habercisi çözümünde ayarlama hidrojel sertlik üzerinde kontrol sağlar. Ayrıca, hidrojel substrat ve thiolated arasında hızlı konjugasyon için protein desenlendirme için tıklayın kimya kullanımını sağlar protein değiştirilmiş. Herhangi bir protein veya peptid ilgi uygulanabilir olması için bu iletişim kurallarını sağlar gibi bir anahtar tasarım özelliği bu.
PEG hydrogels biyolojik sistemlere biyokimyasal ipuçlarını görüntülemek için yeni platformlar keşfetmek için kullanılan umut verici Biyomalzeme vardır. İster tek tip yüzey immobilizasyon veya dağınık şekilde belirli kalıpları, bu teknikleri hücre davranışını denetlemek için yeni yollar sağlar. İleride, biomaterial teknolojinin ilerlemesi hücre davranış içine yeni anlayışlar sağlamak ve bizim yetenekleri içinde vivo sinyal motifleri vitro sistemleri içinde özetlemek için daha fazla. Bu kök hücre farklılaşma ve gelişimsel bir kontrollü deneysel sistem içinde sinyal modelleme için yararlı olabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa gerek yok.
Acknowledgments
Bu çalışmada özellikle Amerikan Kalp Derneği bilim adamı kalkınma hibe gelen hibe tarafından desteklenmiştir (G.D. 12SDG12050083), Ulusal Sağlık Enstitüleri (R21HL102773, R01HL118245 G.D. için) ve Ulusal Bilim Vakfı (CBET-1263455 ve G.D. CBET-1350240).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PEG-diacrylate (PEGDA) | Laysan Bio | ACRL-PEG-ACRL-3400 | Can also be synthesized or purchased through other venders. Different molecular weights can be used. |
| Lithium Phenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate (LAP) | Synthesized in lab | ||
| Fibronectin | Corning | 356008 | Other cell attachment proteins can be used, such as laminin, matrigel |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Sigma | D8537-500ML | |
| Photomask | FineLine Imaging | n/a | Custom prints on transparent sheets with high resolution DPI. |
| Binder Clips | Various Vendors | ||
| Compact UV Light Source (365nm) | UVP | UVP-21 | Other UV light sources can be used, calibration of power is required. |
| 2-iminothiolane (Pierce Traut’s Reagent) | Thermo Sci. | 26101 | |
| Ellman’s Reagent: DTNB; 5,5-dithio-bis(2-nitrobenzoic acid) | Thermo Sci. | 22582 | |
| human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) | Lonza | passage number between 6- 10 | |
| EGM-2 Media | Lonza | CC31-56, CC-3162 | EGM-2 without growth factors was used in experiments. Full EGM-2 media was used for cell maintainance |
| 0.25% Trypsin EDTA | Life Tech | 25200-056 | |
| Trypsin Neutralizer | Life Tech | R-002-100 | |
| Centrifuge | Various Venders | ||
| Hemocytometer | Hausser Sci. Bright-line | ||
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma Aldrich | E6758 | |
| 0.22µm filter | Cell Treat | 229743 | |
| 1mL Syringe | |||
| Glass Microscope Slides | Fisher Sci. | 12-550C | |
| Plastic spacers | Various Venders | 0.5mm thickness | |
| 70% Ethanol | BICCA | 2546.70-1 | |
| Bio-shield | Bio-shield | 19-150-0010 | |
| Bradford Reagent | BIO-RAD | ||
| Desalting Resin - Sephadex G-25 | GE Healthcare | 95016-754 | |
| Microspin Columns | Thermo Sci. | PI69725 | |
| AR-G2 rehometer | TA Instruments |
References
- Yao, S., et al. Co-effects of matrix low elasticity and aligned topography on stem cell neurogenic differentiation and rapid neurite outgrowth. Nanoscale. 8 (19), 10252-10265 (2016).
- Evans, N. D., et al. Substrate stiffness affects early differentiation events in embryonic stem cells. Eur Cells Mater. 18, 1-13 (2009).
- Ye, K., et al. Matrix Stiffness and Nanoscale Spatial Organization of Cell-Adhesive Ligands Direct Stem Cell Fate. Nano Lett. 15 (7), 4720-4729 (2015).
- Discher, D. E., Janmey, P., Wang, Y. L. Tissue cells feel and respond to the stiffness of their substrate. Science. 310 (5751), 1139-1143 (2005).
- Sridhar, B. V., Doyle, N. R., Randolph, M. A., Anseth, K. S. Covalently tethered TGF-beta1 with encapsulated chondrocytes in a PEG hydrogel system enhances extracellular matrix production. J Biomed Mater Res A. 102 (12), 4464-4472 (2014).
- Salinas, C. N., Anseth, K. S. Decorin moieties tethered into PEG networks induce chondrogenesis of human mesenchymal stem cells. J Biomed Mater Res A. 90 (2), 456-464 (2009).
- Joddar, B., Guy, A. T., Kamiguchi, H., Ito, Y. Spatial gradients of chemotropic factors from immobilized patterns to guide axonal growth and regeneration. Biomaterials. 34 (37), 9593-9601 (2013).
- Wylie, R. G., Ahsan, S., Aizawa, Y., Maxwell, K. L., Morshead, C. M., Shoichet, M. S. Spatially controlled simultaneous patterning of multiple growth factors in three-dimensional hydrogels. Nat Mater. 10 (10), 799-806 (2011).
- Tibbitt, M. W., Anseth, K. S. Hydrogels as extracellular matrix mimics for 3D cell culture. Biotechnol Bioeng. 103 (4), 655-663 (2009).
- Lutolf, M. P., Hubbell, J. A. Synthetic biomaterials as instructive extracellular microenvironments for morphogenesis in tissue engineering. Nat Biotechnol. 23 (1), 47-55 (2005).
- Saik, J. E., Gould, D. J., Keswani, A. H., Dickinson, M. E., West, J. L. Biomimetic hydrogels with immobilized ephrinA1 for therapeutic angiogenesis. Biomacromolecules. 12 (7), 2715-2722 (2011).
- McCall, J. D., Anseth, K. S. Thiol-ene photopolymerizations provide a facile method to encapsulate proteins and maintain their bioactivity. Biomacromolecules. 13 (8), 2410-2417 (2012).
- Fairbanks, B. D., Schwartz, M. P., Bowman, C. N., Anseth, K. S. Photoinitiated polymerization of PEG-diacrylate with lithium phenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate: polymerization rate and cytocompatibility. Biomaterials. 29 (6), 997-1003 (2009).
- Zuidema, J. M., Rivet, C. J., Gilbert, R. J., Morrison, F. A. A protocol for rheological characterization of hydrogels for tissue engineering strategies. J Biomed Mater Res B Appl Biomater. 102 (5), 1063-1073 (2014).
- Truat's Reagent Instructions. Thermo Scientific. , Available from: https://tools.thermofisher.com/content/sfs/.../MAN0011238_Trauts_Reag_UG.pdf (2017).
- Ellman's Reagent Instructions. Thermo Scientific. , Available from: https://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/MAN0011216_Ellmans_Reag_UG.pdf (2017).
- Desalting Columns. GE Life Sciences. , Available from: https://www.gelifesciences.com/gehcls_images/GELS/Related%20Content/Files/1478781880316/litdoc52130800_2016111034421.pdf (2017).
- Quick State Bradford Reagent Protein Assay, Instruction Manual. Bio-Rad. , Available from: http://www.bio-rad.com/webroot/web/pdf/lsr/literature/4110065A.pdf (2017).
