Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

תכנים חלבונים ביו או פפטידים על הידרוג באמצעות פוטוכימיה עבור יישומים ביולוגיים

Published: September 15, 2017 doi: 10.3791/55873
Automatic Translation
1,2,3, 1,2, 4, 4, 1,2,3
1Department of Biomedical Engineering, Rensselaer Polytechnic Institute, 2Center for Biotechnology and Interdisciplinary Studies, Rensselaer Polytechnic Institute, 3Department of Bioengineering, Northeastern University, 4Department of Bioengineering, University of Texas at Arlington

Summary

בשיטה זו, אנו משתמשים photopolymerization, לחץ על כימיה טכניקות ליצירת דפוסים חלבון או פפטיד על פני השטח של hydrogels פוליאתילן גליקול (PEG), מתן מתאושש אותות ביו לצורך המחקר של תגובות הסלולר במבחנה .

Abstract

ישנם גירויים ביולוגיים רבים יכולים להשפיע על התנהגות תאית התמיינות תאי גזע. גישות התרבות התא הכללית להסתמך על גורמים מסיסים בתוך המדיום כדי לשלוט בהתנהגות התא. עם זאת, תוספות מסיסים לא יכולים לחקות מסוימים איתות מוטיבים, כגון גורמי גדילה מטריקס מכורך איתות התא-התא, רמזים הביוכימי המרחבי, אשר נפוץ השפעות על תאים. יתר על כן, מאפיינים ביופיזיקלי של המטריקס, כגון קשיחות המצע, לשחק תפקידים חשובים בגורל התא, אשר לא בקלות מטופל באמצעות תא קונבנציונאלי culturing פרקטיקות. בשיטה זו, אנו מתארים פרוטוקול ישיר לספק חלבונים ביו בדוגמת על hydrogels סינתטי פוליאתילן גליקול (PEG) באמצעות פוטוכימיה. פלטפורמה זו מאפשרת שליטה עצמאית של המצע נוקשות ועל סימנים ביוכימיים מרחבית. Hydrogels אלה ניתן להשיג מגוון רחב של ערכים נוקשות רלוונטי מבחינה פיזיולוגית. בנוסף, המשטחים של אלה hydrogels יכול להיות photopatterned עם פפטידים ביו או חלבונים באמצעות תיול-ene לחץ על תגובות כימיה. שיטות אלה מוטבו כדי לשמור על תפקוד החלבון לאחר הנייח משטח. זהו פרוטוקול צדדי ניתן להחיל על כל חלבון או פפטיד עניין כדי ליצור מגוון של תבניות. לבסוף, תאים נזרע על גבי המשטחים של אלה hydrogels ביואקטיביות ניתן לנטר לאורך זמן גם הם להגיב על אותות ספציפית במרחב.

Introduction

ישנם גירויים רבים המשפיעים בהתנהגות התא. באופן כללי, טכניקות culturing תא אופייני להסתמך על גורמים מסיסים להפיק תגובות הסלולר; עם זאת, קיימות מגבלות לגישה זו. שיטות אלה אינם מסוגלים להציג במדויק כל המוטיבים איתות מתמקמות ויוו. מנגנוני איתות כאלה כוללים גורמי גדילה מוחרמת, איתות התא-התא סימנים ביוכימיים ספציפיים במרחב. יתר על כן, קשיחות המצע יכול לשחק תפקיד חשוב התנהגות תאית התמיינות תאי גזע, לא בקלות מטופל באמצעות נפוצות תא culturing שיטות1,2. גישות biomaterial מציעים פלטפורמה חדשה להתחיל לחקור מנגנונים אלה איתות. בפרט, hydrogels הם מועמדים מצוינים עבור כוונון המצע נוקשות3,4, שיתק חלבונים ופפטידים5,6, ויצירת דפוסי במרחב מסוים7, 8.

Hydrogels משמשים בתור פיגומים בהנדסת רקמות עקב שלהם מכנה משותף biophysical וביוכימי עם מטריצה חוץ-תאית (ECM)9,10. פולימרים טבעיים הם אפשרויות נפוצות פיגומים, הם מסתיימים, נמצאים ברקמות רבות בגוף. המגבלה של שימוש פולימרים טבעיים בשם דיאלקטריים היא היעדר בקלות בעורמה moieties כימיים עבור bioconjugation. מצד שני, hydrogels סינתטי, וככזה כמו יתד, הם מצוינים פלטפורמות בדיקות, הביוכימיה יישוב11,12. בנוסף, פג hydrogels לא זכה לתגובה הסלולר, ולכן משמשים כמו עמוד השדרה אינרטי ליצירת ביו פיגומים.

כדי ליצור hydrogels ביו, הן photopolymerization והן תיול-ene לחץ על כימיה תגובות הם מועסקים. Photoreactions אלה דורשים photoinitiator של מקור אור UV. כאשר photoinitiators מוצגים בפני אור UV, חוב לבשר טופס רדיקלים. תזות רדיקלים הדרושים לאתחול התגובה אך יכול להשפיע לרעה על חלבון bioactivity12,13. לכן, זה הכרחי למטב את photoinitiator ושעות החשיפה UV כדי לשמור על חלבון bioactivity.

בשיטה זו, hydrogels הם מסונתז דרך אקרילט-אקרילט שרשרת צמיחה photopolymerization. מונומרים פג-diacrylate (PEGDA) מגיבים עם השני כדי ליצור רשתות פולימריות מסועף אחראי על המבנה של הידרוג. הריכוז של מונומרים PEGDA בתוך הפתרון קודמן ג'ל ישלוט הקשיחות המצע. עקב הקטן גודל של הידרוג הנקבוביות, ECM חלבונים כגון fibronectin ניתן לשלב בקלות בתוך הידרוג לצורך התא מצורף. לבסוף, hydrogels אלה יכול להיות בדוגמת השטח עם פפטידים ביו או חלבונים באמצעות תיול-ene לחץ על תגובות כימיה. כאן, unreacted acrylates חינם בתוך מערכת הידרוג יגיבו תיולים חינם ממוקמים חלבון או פפטיד בעת חשיפה לאור UV. לאחר חלבונים או פפטידים נמצאים ותשמרו על פני הידרוג, הידרוג ניתן לאחסן ב 4 מעלות צלזיוס למשך מספר שבועות מבלי לאבד את bioactivity. זה מציע נוחות, תכנון ניסויי גמיש, ועל האפשרות לשיתוף פעולה בין מעבדות. בסך הכל, פלטפורמה זו מאפשרת biomechanical המרחבי הביוכימי ושליטה, תלויות זו בזו, על ההזדמנות להשפיע על התנהגות הסלולר.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. הכנה של חומרים עבור הידרוג סינתזה

פתרונות מניות הכן
  1. PEGDA, phenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate סוללת ליתיום (LAP) ו fibronectin בתנאים סטריליים, המבוסס על חישובים (טבלה 1A).
    1. שוקל, מתמוסס. תרכובות באגירה פוספט תמיסת מלח (PBS). בדרך כלל, לשמור על PEGDA עובד פתרון ריכוזים בין 50 ל- 200 מ"ג/מ"ל (5-20% משקל/נפח). Pipette הפתרון PEGDA דרך מסנן מזרק 0.22-מיקרומטר עבור עיקור.
      הערה: לשמור את הפתרונות PEGDA מכוסה ברדיד גלישת כדי להגן עליהם מפני אור. להכין פתרון טריים של PEGDA (מומלץ) עבור ניסוי.
      2. אבקת
    2. לשקם fibronectin חלבון מבוסס על היצרן ' s המלצה. לשמור על הפתרון מניות fibronectin ב 1 מ"ג/מ"ל, aliquot אותו 60 – 100 µL aliquots, ואחסן אותם ב-20 ° C עד השימוש. מפשירים את aliquots ב 4 מעלות צלזיוס למשך מספר שעות או למשך הלילה לפני השימוש. אם המניה חלבון לא מסופק כבר בתנאים סטריליים, השתמש במסנן מזרק מיקרומטר 0.22 עבור עיקור.
      הערה: Fibronectin משמש עבור התא מצורף. . הרבה חלבונים אחרים ECM.
    3. שוקל את הברכיים עבור הפתרון מניות, להמיס ב- PBS; ריכוז מניות טיפוסי הוא 25 מ"ג/מ"ל. Sonicate אם יש בעיות עם המסת. עוברים את הפתרון מסנן מיקרומטר 0.22 עבור עיקור. לכסות את הברכיים עם אריזה רדיד ולשמור אותו ב 4 ° C עבור אפילו מספר חודשים.
      הערה: אירוטי הוא photoinitiator המשמש את פוטוכימיה.
  2. להכין בתבניות שקופיות זכוכית סטריליים הידרוג היווצרות.
    1. אוטוקלב פוליאסטר גיליון אחד נדרש עבור כל עובש ג'ל. משרים שתי שקופיות זכוכית, מפרידי פלסטיק 3 (בעובי 0.5 מ"מ) עבור כל עובש ג'ל ב- 70% אתנול כבר לפחות שעתיים, אך בדרך כלל מאפשרים להם להשרות למשך הלילה. להשרות חמישה סרטונים בינדר עובש ג'ל כל 70% אתנול במשך 10 דקות לפני השימוש,.
    2. למקם את שקופיות זכוכית, מפרידי וקבצי בינדר על גבי סדין בלוק קטן בשכונה התרבות התא כדי לאפשר להם לאוויר יבש למשך מספר שעות.
    3. להכין בתבניות הידרוג על-ידי הצבת מפרידי כלי פלסטיק סביב קצה זכוכית. במקום השקופית השניה זכוכית על העליונה. לאבטח קפיציות בחוזקה אחד ליד השני עם קטעי בינדר, שניים בכל צד ארוך ואחד למעלה.
      הערה: אם זה לא כראוי התכנסה, הפתרון ג'ל תדלוף החוצה.
    4. לעקר השטח העובש עם תרבית תאים הוד אולטרא סגול במשך 30 דקות לפני השימוש. באמצע, להעיף התבנית כדי לחשוף את שני המשטחים.

2. שינוי חלבונים עם תיול חינם

  1. להכין מלאי פתרונות באמצעות חישובים מהגיליון להמרת amine תיול-חלבונים (טבלה 1A).
    1. כדי להפוך את מאגר התגובה, להתאים את PBS ל pH 8 ולהוסיף 5 מ מ EDTA. פיפטה מאגר התגובה לתוך מזרק מיקרומטר 0.22 מסנן עבור עיקור.
      הערה: EDTA חשוב, כמו זה מגן תיולים ויוצרים קשרים דיסולפידי. קבוצות תיול חייבים להישאר בצורתם מופחת עבור התגובה להתרחש.
    2. שוקל את 2-iminothiolane (Traut ' s ריאגנט) להמיס במאגר התגובה על ריכוז פתרון מניות של 2 מ"ג/מ"ל (14 מ מ). עוברים את הפתרון 0.22-מיקרומטר מזרק מסנן עבור עיקור. לאחסן את הפתרון מניות ב 4 ° C עבור אפילו מספר חודשים.
      הערה: 2-iminothiolane הוא מולקולת מגיב עם הממס החשופים אמינים חינם על החלבונים, וממירה אותם לתוך תיולים בחינם.
    3. לשקם את החלבון במאגר התגובה-ריכוז בין 0.1 1 מ"ג/מ"ל. אלא אם כן בעבר סטרילי, pipette פתרון זה דרך מסנן מזרק 0.22-מיקרומטר עבור עיקור.
      הערה: חלבון זה הוא האות הביוכימי בדוגמת על גבי המשטח הידרוג. בנוסף, בזמן ריכוז חלבון יכול להשתנות, ריכוז גבוה הינם אידיאליים עבור תבניות חלבון חזקה יותר.
  2. להגיב החלבון עם 2-iminothiolane על ידי ערבוב שני פתרונות מניות יחד; להשתמש 1B טבלה לחישוב היחס אמצעי האחסון הנכון. בדרך כלל, משתמשים יחס טוחנת של 8:1 2-iminothiolane לחלבון.
    הערה: עבור חלבונים גדולים יותר או יותר לדלל את ריכוז, השתמש טוחנת יחס גבוה של 2-iminothiolane. להפנות ליצרן ' s פרוטוקול 15.
  3. דגירה התגובה לשעה בטמפרטורת החדר. השתמש ספין desalting מיקרו-עמודה כדי להסיר את המוצר חלבון thiolated שני המגיבים הנותרים, בעקבות היצרן ' s פרוטוקול 16.
    הערה: למגבלת אי-הכללה של שרף זה הוא 5 KDa.
  4. שימוש אלמן ' s Assay באופן כמותי מודדים את מספר תיולים חינם לכל חלבון. בצע את היצרן ' פרוטוקול s עבור ה assay 17.

3. היווצרות הידרוג

  1. יצירת הפתרון קודמן ג'ל המבוסס על ערכים מחושבים מתוך הטבלה 1C. מערבבים יחד את PEGDA fibronectin, הברכיים כרכים. Pipette הפתרון נמרצות כדי להבטיח פתרון הומוגני, אך להימנע מיצירת בועות. לשמור את הפתרון מוגן מפני אור.
  2. Pipette הפתרון קודמן ג'ל בזהירות בין שקופיות זכוכית שני התבנית ג'ל. בדרך כלל, להוסיף אמצעי בין 800 ל- 1,000 µL את העובש. לחשוף את הפתרון ג'ל ב כייר לאור UV (אורך גל: 365 ננומטר, כוח: 3-4 mW/cm 2) למשך 1-2 דקות ליצור את הידרוג-
    הערה: אינם חושפים את הידרוג לאור UV ממושך, כמו זה יגביל את החלבון השטח תכנים יכולות.
  3. להוריד את הקליפים בינדר ולהסיר בעדינות שקופיות זכוכית העליון על-ידי החלת מול הלחץ קפיציות דו צדדי.
  4. להשתמש אגרוף ביופסיה בגודל מתאים כדי לגזור את הדגימות הידרוג. אגרוף hydrogels מרובים מהמלבן ג'ל כדי לשמש משכפל ולשלוט דגימות.

4. נוקשות הידרוג מדידות

  1. אגרוף החוצה hydrogels עם 8 מ מ קוטר ביופסיה אגרוף עבור rheometer צלחת מקבילים 8 מ מ. טען דוגמא הידרוג אחת rheometer (ראה טבלה של חומרים).
  2. התחתונה הגיאומטריה צלחת מקבילים זה 8 מ"מ בקוטר עד עשיית קשר עם פני השטח של הג'ל. שמרו על פער מרחק של 0.5 מ מ עבור מדגם 0.5 מ מעבה הידרוג-
  3. בצע מטאטא זמן עבור 5 דקות ב- 0.1% זן, תדירות 0.1 Hz ו 37 ° ג ממוצע ג'י ' ערכים על-פני כל הזמן לטאטא. לרוץ עצמאית hydrogels עבור בית הרכב אחד.
    הערה: ג'י ' ערכים צריך להיות יציב לאורך זמן נקודות; אם הם לא, אחוז זן מטאטא תדירות לבצע כדי לבחור את המתאימה ערכים 14.

5. חלבון המתבנת

  1. להכין התבנית הרצויה עבור photomask באמצעות תוכנית עיצוב (CAD) באמצעות מחשב. הדפס את photomask על סדין שקוף באמצעות מדפסת המדפיסה ברזולוציה גבוהה. משרים את photomask 70% אתנול במשך 10 דקות לפני השימוש. לאפשר את photomask אוויר יבש בשכונה התרבות התא לפני השימוש.
  2. להוסיף את הפתרון חלבון thiolated מוכנים בשלב 2 אל פני השטח של הידרוג משטח המתבנת. Pipette 1-2 µL/cm 2 בפתרון חלבון thiolated אל פני השטח של ג'ל לגזור את כל.
    הערה: חשוב למזער את האחסון חלבון; להוסיף רק מספיק כדי לכסות את כל פני השטח של המדגם הידרוג באופן שווה.
  3. במקום בקפידה את photomask על פני השטח של הידרוג. אל תאפשר בועות אוויר בין photomask את פני השטח הידרוג. בעדינות לחץ כלפי מטה את המסיכה כדי להסיר את כל הבועות טופס זה.
  4. לחשוף את הידרוג לסיבוב שני של אור UV (אורך גל: 365 ננומטר, כוח: 3-4 mW/cm 2) במשך 30-60 ס
    הערה: חשוב חשיפה התבנית מספיק אור UV כדי ליצור דפוס חזק ללא גרימת ההפסד של פונקציה של חלבונים-
  5. לרחוץ את hydrogels עם PBS כדי להסיר מינים unreacted ומניחים כל הידרוג בתוך הצלחת היטב. היה זהיר בעת הצבת ג'לים של כל טוב; ודא כי הפנים את השטח סולידיות. לשטוף את ג'ל ב- PBS ב 4 ° C; ג'לים יציבים במשך שבועיים לפחות ב-4 מעלות צלזיוס

6. לקראת זריעה תא Hydrogels

  1. דגירה של ג'לים הבזליים בינוני למשך 5-10 דקות ב 37 מעלות צלזיוס לפני זריעה. לשימוש יפתור תאי אנדותל (HUVECs), EGM-2 בינוני ללא גורמי גדילה. למזער את נפח בינוני נוסף לכל גם כדי למנוע הידרוג צף. לשימוש צלחת 48-ובכן, נפח 250 µL של המדיום.
  2. ספין למטה הצלחת ב- 300 x גרם למשך 3 דקות על מנת להבטיח hydrogels ממוקמים בתחתית הבאר לא צף. תעשה את זה מייד לפני זריעה תא.

7. תא זריעת על Hydrogels

רגיל סטרילי בתרבית של תאים
  1. שימוש תרבות נהלי תא זריעה ונהלים ניסיוני. הסר HUVECs מבחנות תרביות רקמה באמצעות פרוטוקולי ניתוק התא סטנדרטי. כדי לבשל תרביות רקמה עם PBS סטרילי, דגירה עם טריפסין למשך 3-5 דקות ב- 37 מעלות צלזיוס.
  2. להרוות את המתלים תא trypsinized עם עודף תא בינוני או טריפסין מנטרל פתרון.
  3. ספין למטה התליה תא בצנטריפוגה ב 300 x g עבור 5 דק בזהירות להסיר את תגובת שיקוע ולשמור בגדר תא.
  4. Resuspend בגדר התאים הבזליים EGM-2 ללא גורמי גדילה. השתמש hemocytometer לספירת תא.
  5. 75,000 להוסיף תאים/cm 2 כדי הידרוג כל השטח על ידי pipetting לאט לתוך המרכז של כל טוב כדי לא להפריע את ג'ל. להכניס את הצלחת היטב בתוך חממה תרבות התא ב- 37 מעלות צלזיוס. במשך כמה ימים, מעת לעת להסיר את המנה להשגחה.

8. הערכה של Bioactivity

  1. התרבות החיידק לילה בהשעיה בתוך מרק ליברות ההשעיה מסלולית-37 ° C ו 200 סל ד. ספין למטה התרבות e. coli, decant, לשקם בגדר תא בהיקף מינימלי של PBS. שוקל החוצה את ליזוזים, לשקם ב 1 מ"ג/מ"ל עבור הפתרון מניות.
  2. Pipette של אמצעי אחסון קטן (25 µL) של פתרון מניות ליזוזים לתוך צינורות microcentrifuge. הוסף רמות משתנות של הברכיים photoinitiator (0-12 מ מ) ולחשוף את הדוגמאות כדי 1 דקות של אור UV. בקבוצה נפרדת, להוסיף את אותה כמות של הברכיים (2 מ מ) פתרון ליזוזים ולחשוף דוגמאות משתנות פעמים אור UV (0-4 דקות). כוללים משכפל הטיפול.
  3. הוסף נפח שווה מרוכז e. coli פתרון כל מדגם ליזוזים עבור ריכוז חלבון ליזוזים הסופי של 0.5 מ"ג/מ"ל. דגירה הפתרונות מעורב במשך 4 שעות בטמפרטורת החדר.
    הערה: פעולה זו מאפשרת זמן ליזוזים פונקציונלי lyse הקיר תא החיידק ושחרור חלבונים בתוך תמיסת.
  4. השתמש ליזוזים לא מטופל מודגרות עם e. coli עבור פקד חיובית; מחשיב זאת מידה ביואקטיביות 100%. להשתמש בפתרון ליזוזים מודגרות עם PBS לבד כפקד שלילי.
  5. ספין למטה הדוגמאות כדי להסיר שאריות תאים ולשמור את תגובת שיקוע. לרוץ על שיטת ברדפורד לכמת את הריכוז של חלבון בתוך תגובת שיקוע כדי למדוד את כמות בקטריאלי lysate.
  6. לרוץ וזמינותו ברדפורד בעקבות היצרן ' s פרוטוקול 18. לחשב לקפל את השינויים בריכוז חלבון לעומת הפקד שלילי.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

הפרוטוקול ליצירת דפוסים ביו על פני השטח של פג hydrogels מודגם באיור1. גיליון אלקטרוני פותחה כדי לחשב את נפח וריכוז עבור כל הפתרונות מניות (טבלה 1 א). חלבונים כדי להיות מרותק למיטה על פני הידרוג עוברות שינוי עם 2-iminothiolane (איור 1B). התגובה הזו מתבצעת באמצעות אמצעי האחסון של הטבלה 1B. הפתרון הידרוג קודמן הינו מוכן עם 10% משקל/נפח של PEGDA עם הברכיים (איור 1א'). ריכוזים שונים של PEGDA קודמן ניתן להניב הקשיחות המצע הרצוי (איור 2א). Fibronectin נכלל במסגרת פתרון זה קודמן למטרות מצורף התא. לאחר ערבוב יסודי, פתרון זה pipetted לתבנית מוכן, חשיפה לאור UV (איור 1C). צריך להיות ממוזער חשיפה UV אור; החשיפה צריך להיות מספיק כדי לייצר את הידרוג. דוגמאות הידרוג מנוקבים עד לקוטר המתאים עבור לוח טוב הרצוי (איור 1C). על פני השטח המתבנת, חלבון ששונה פתרון pipetted על פני הידרוג, נמרח בקלות. נפח מינימלי צריך לשמש; נפח חלבון צריך להיות מספיק כדי לכסות את המשטח כולו של הידרוג. Photomask מוגדרות מראש מונחת ישירות על גבי המשטח הידרוג; יש להימנע בועות אוויר בין המסכה את הידרוג. בסיבוב השני של אור UV משמש covalently נזווג החשופים UV חלבונים הידרוג. דוגמאות הידרוג הם לשטוף כדי להסיר חלבונים unreacted ולחשוף את התבנית חלבון קיבוע (איור 1D).

חשוב למזער את ריכוז photoinitiator ואת זמן החשיפה UV כאשר קיימים חלבונים. באמצעות ליזוזים אתריים כמחוון, מצאנו כי ריכוז photoinitiator הברכיים צריך להיות פחות מ- 2 מ מ (איור 2B), זמן חשיפה UV צריכה סה כ פחות מ 2 דקות (איור 2C) כדי לשמור על חלבון bioactivity גדול מ- 80%.

זמן החשיפה UV במהלך היווצרות הידרוג חלבון המתבנת הם שני פרמטרים חשובים עבור פיתוח פרוטוקול מוצלח (איור 3). קודם כל, מזעור חשיפה UV במהלך היווצרות הידרוג חיוני לשמירה על קבוצות פונקציונליות חינם אקרילט לתגובות הנייח חלבון עוקבות (איור 3א). Hydrogels חשוף לאור אולטרא סגול יותר מ 2 דקות הם אפשרות ליצור חלבון קיבוע דפוסים. בנוסף, כפי מגביר החשיפה UV התבנית חלבונים, חלבונים יותר להגיב אל פני השטח (איור 3ב).

לבסוף, תאים יכולים להיות תרבותי אל אלה בדוגמת הידרוג סובסטרטים לתמרן בהתנהגות התא. ולהראות את הפוטנציאל של קיבוע דפוסים על hydrogels, בדוגמת VEGF, פקטור גדילה חשוב עבור תאי אנדותל, ואנו תרבותי HUVECs על פני השטח באמצעות EGM-2 הבזליים בינוני (איור 4). HUVECs היו נזרע בצורה אחידה על פני בדוגמת VEGF פג hydrogels (איור 4). יומיים לאחר זריעה, HUVECs נצפו לנדוד לכיוון האזורים המרחבי של הידרוג שהכיל קיבוע VEGF (איור 4ב, ג). זוהי דוגמה אחת של דפוס חלבון ביואקטיביות על פג hydrogels בשימוש כדי להשפיע בהתנהגות התא.

Figure 1
איור 1: סכמטי של הידרוג היווצרות של חלבונים המתבנת. (א) להתכונן קודמן פתרון הידרוג עם מונומרים PEGDA, photoinitiator, חלבון חוץ-תאית התא מצורף. שינוי (ב') החלבונים עם חינם קבוצות תיול על ידי מגיבים 2-iminothiolane. (ג) Pipette הפתרון קודמן לתבנית מוכן, לחשוף אותם לאור UV כדי ליצור את הידרוג. אגרוף החוצה הידרוג דגימות בגודל הרצוי. פיפטה (D) הפתרון חלבון שונה על פני הידרוג, במקום של photomask על פני השטח, לחשוף אותם בפני בסיבוב השני של אור UV. יש לשטוף את הג'ל להסיר מינים unreacted לפני הדמיה ו תא זריעה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 2
איור 2 : להתכוונן נוקשות ועל חלבון bioactivity. שינויים (א') הריכוז של מונומרים PEGDA בתוך הפתרון ג'ל קודמן לשנות הידרוג נוקשות. (B) הגדלת הריכוז של הברכיים photoinitiator מוריד וחלבון לתפקד לאחר 1 דקות של חשיפה UV. זמן החשיפה (C) Increasing UV מוריד פונקציה של חלבונים עם 2 מ מ הברכיים. כל קווי השגיאה לייצג סטיית התקן של משכפל. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 3
איור 3: דפוס ו הידרוג UV פעמים חשיפה אופטימיזציה עבור חלבון המתבנת. זמני חשיפה (א) Minimizing UV הידרוג היווצרות מאפשר המתבנת פני השטח. (B) Increasing UV פעמים חשיפה על פני השטח המתבנת מגביר כוח דפוס. גודל ברים = 200 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 4
איור 4: תאי אנדותל להגיב לתבנית VEGF. (א) HUVECs אחיד נזרע על hydrogels. (B ו- C) HUVECs לחוש את התבנית VEGF ולהעביר לכיוון VEGF קיבוע. התמונות צולמו יומיים לאחר זריעה (B) 4 X ו- (ג) 10 X הגדלה. גודל ברים = 500 מיקרומטר. HUVEC-RFPs (אדום) ותבנית VEGF-488 (ירוק) נלכדו עם עירור ומסננים פליטה 528/553, 465/495, בהתאמה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Table 1
טבלה 1: חישובים עבור המניות ופתרונות קודמן ג'ל. התיבה האדומה מציינת ערכים על-ידי המשתמש, כגון משקל מולקולרי, רצוי ריכוזים מניות וגושים שקל-אאוט. הקופסאות הכחולות מייצגות ערכים חושבו בהתבסס על ערכים על-ידי המשתמש.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

פרוטוקול זה מספק שיטה ליצירת חלבון ביואקטיביות תבניות עבור יישומים ביולוגיים. ישנם מספר שינויים שניתן להתאים פרוטוקול זה לניסויים שונים. ראשית, דרישות מצורף התא ישתנו עבור סוגי תאים שונים. אם הקובץ המצורף תא המסכן ג'לים נצפית בתחילה, הגדלת ריכוז החלבון ECM בתוך הפתרון קודמן מומלץ. לחלבונים אחרים ECM יכול לשמש במקום fibronectin, כולל סוגים שונים של קולגן, laminin או שילוב שלהם. עבור כל סוג חדש של התא, התא מצורף צריך להיות מוטבת לפני הידרוג המתבנת. פרוטוקול זה מאפשר גם מעוצב משתמש photomasks. בהתבסס על היישום הרצוי, photomasks יכול להיות מיוצר עם שונים כוללים בגדלים, צורות ותבניות הכללית. קיבעון אחידה יכולה להיות מושגת בהיעדר photomask.

פרוטוקול זה יש הגבלות מסוימות. כפי שמודגש נציג תוצאות, שיטה זו היא רגישה לכמות אור UV בכל שלב. חשיפת יתר במהלך השלב היווצרות הידרוג מגביל קבוצות אקרילט זמינים עבור bioconjugation משטח עוקבות. לכן, צעד המפתח פרוטוקול זה הוא מנוהל היטב פעמים חשיפה אור UV עבור כל שלב. בנוסף, פרוטוקול זה מחייב מניה חלבונים ריכוז גבוה המתבנת מוצלח. ריכוזים נמוכים של חלבון יגרום דפוסי משטח המסכן. בנוסף, photomasks הם גם הגבלת כי הם רק יכולים לייצר דפוסים דיסקרטית. דוגמאות מורכבות יותר ניתן להשיג באמצעות גישות דומות אך דורשים מתודולוגיה מתקדמת יותר.

פרוטוקול זה הוא משמעותי לשיטות הקיימות כפי שהיא מספקת שיטה פשוטה עבור התאמת המצע נוקשות ועל חלבון המתבנת. שימוש אקרילט כימיה היווצרות הידרוג מאפשר מגוון בסדר גודל של קשיחות המצע בטווח פיזיולוגיים. פשוט להתאים את הריכוז של PEGDA בתוך הפתרון קודמן נותן שליטה הקשיחות הידרוג. בנוסף, השימוש לחץ כימיה חלבון המתבנת מאפשר נטיה מהירה בין הידרוג המצע thiolated ששינה חלבון. זוהי תכונה עיצוב מרכזיים, שכן היא מאפשרת פרוטוקול זה להיות ישימה לכל חלבון או פפטיד עניין.

פג hydrogels הם biomaterials מבטיח זה יכול לשמש כדי לחקור את פלטפורמות חדשות להצגת סימנים ביוכימיים למערכות ביולוגיות. אם הנייח משטח אחיד או בתבניות ספציפיות במרחב, טכניקות אלה מספקים דרכים הרומן לשלוט בהתנהגות התא. . להתקדם, לקידום טכנולוגיית biomaterial לספק תובנות חדשות בהתנהגות התא, עוד יותר את היכולות שלנו רוצה להתרכז מוטיבים איתות vivo בתוך בתוך מערכות במבחנה . זה יכול להיות מועיל עבור התמיינות תאי גזע, מידול איתות התפתחותית בתוך מערכת ניסוי מבוקר.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים אין לחשוף.

Acknowledgments

מחקר זה בעיקר נתמך על ידי מענקים אמריקאי איגוד הלב המענק מדען פיתוח (12SDG12050083 לגלובל דיינמיקס), מכוני הבריאות הלאומיים (R21HL102773, R01HL118245 לגלובל דיינמיקס), הקרן הלאומית למדע (CBET-1263455, CBET-1350240 לגלובל דיינמיקס).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
PEG-diacrylate (PEGDA) Laysan Bio ACRL-PEG-ACRL-3400 Can also be synthesized or purchased through other venders. Different molecular weights can be used.
Lithium Phenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate (LAP) Synthesized in lab
Fibronectin Corning 356008 Other cell attachment proteins can be used, such as laminin, matrigel
Phosphate-buffered saline (PBS) Sigma D8537-500ML
Photomask FineLine Imaging n/a Custom prints on transparent sheets with high resolution DPI.
Binder Clips Various Vendors
Compact UV Light Source (365nm) UVP UVP-21 Other UV light sources can be used, calibration of power is required.
2-iminothiolane (Pierce Traut’s Reagent) Thermo Sci. 26101
Ellman’s Reagent: DTNB; 5,5-dithio-bis(2-nitrobenzoic acid) Thermo Sci. 22582
human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) Lonza passage number between 6- 10
EGM-2 Media Lonza CC31-56, CC-3162 EGM-2 without growth factors was used in experiments. Full EGM-2 media was used for cell maintainance
0.25% Trypsin EDTA Life Tech 25200-056
Trypsin Neutralizer Life Tech R-002-100
Centrifuge Various Venders
Hemocytometer Hausser Sci. Bright-line
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) Sigma Aldrich E6758
0.22µm filter Cell Treat 229743
1mL Syringe
Glass Microscope Slides Fisher Sci. 12-550C
Plastic spacers Various Venders 0.5mm thickness
70% Ethanol BICCA 2546.70-1
Bio-shield Bio-shield 19-150-0010
Bradford Reagent  BIO-RAD
Desalting Resin - Sephadex G-25 GE Healthcare 95016-754
Microspin Columns Thermo Sci. PI69725
AR-G2 rehometer TA Instruments

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Yao, S., et al. Co-effects of matrix low elasticity and aligned topography on stem cell neurogenic differentiation and rapid neurite outgrowth. Nanoscale. 8 (19), 10252-10265 (2016).
  2. Evans, N. D., et al. Substrate stiffness affects early differentiation events in embryonic stem cells. Eur Cells Mater. 18, 1-13 (2009).
  3. Ye, K., et al. Matrix Stiffness and Nanoscale Spatial Organization of Cell-Adhesive Ligands Direct Stem Cell Fate. Nano Lett. 15 (7), 4720-4729 (2015).
  4. Discher, D. E., Janmey, P., Wang, Y. L. Tissue cells feel and respond to the stiffness of their substrate. Science. 310 (5751), 1139-1143 (2005).
  5. Sridhar, B. V., Doyle, N. R., Randolph, M. A., Anseth, K. S. Covalently tethered TGF-beta1 with encapsulated chondrocytes in a PEG hydrogel system enhances extracellular matrix production. J Biomed Mater Res A. 102 (12), 4464-4472 (2014).
  6. Salinas, C. N., Anseth, K. S. Decorin moieties tethered into PEG networks induce chondrogenesis of human mesenchymal stem cells. J Biomed Mater Res A. 90 (2), 456-464 (2009).
  7. Joddar, B., Guy, A. T., Kamiguchi, H., Ito, Y. Spatial gradients of chemotropic factors from immobilized patterns to guide axonal growth and regeneration. Biomaterials. 34 (37), 9593-9601 (2013).
  8. Wylie, R. G., Ahsan, S., Aizawa, Y., Maxwell, K. L., Morshead, C. M., Shoichet, M. S. Spatially controlled simultaneous patterning of multiple growth factors in three-dimensional hydrogels. Nat Mater. 10 (10), 799-806 (2011).
  9. Tibbitt, M. W., Anseth, K. S. Hydrogels as extracellular matrix mimics for 3D cell culture. Biotechnol Bioeng. 103 (4), 655-663 (2009).
  10. Lutolf, M. P., Hubbell, J. A. Synthetic biomaterials as instructive extracellular microenvironments for morphogenesis in tissue engineering. Nat Biotechnol. 23 (1), 47-55 (2005).
  11. Saik, J. E., Gould, D. J., Keswani, A. H., Dickinson, M. E., West, J. L. Biomimetic hydrogels with immobilized ephrinA1 for therapeutic angiogenesis. Biomacromolecules. 12 (7), 2715-2722 (2011).
  12. McCall, J. D., Anseth, K. S. Thiol-ene photopolymerizations provide a facile method to encapsulate proteins and maintain their bioactivity. Biomacromolecules. 13 (8), 2410-2417 (2012).
  13. Fairbanks, B. D., Schwartz, M. P., Bowman, C. N., Anseth, K. S. Photoinitiated polymerization of PEG-diacrylate with lithium phenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate: polymerization rate and cytocompatibility. Biomaterials. 29 (6), 997-1003 (2009).
  14. Zuidema, J. M., Rivet, C. J., Gilbert, R. J., Morrison, F. A. A protocol for rheological characterization of hydrogels for tissue engineering strategies. J Biomed Mater Res B Appl Biomater. 102 (5), 1063-1073 (2014).
  15. Truat's Reagent Instructions. Thermo Scientific. , Available from: https://tools.thermofisher.com/content/sfs/.../MAN0011238_Trauts_Reag_UG.pdf (2017).
  16. Ellman's Reagent Instructions. Thermo Scientific. , Available from: https://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/MAN0011216_Ellmans_Reag_UG.pdf (2017).
  17. Desalting Columns. GE Life Sciences. , Available from: https://www.gelifesciences.com/gehcls_images/GELS/Related%20Content/Files/1478781880316/litdoc52130800_2016111034421.pdf (2017).
  18. Quick State Bradford Reagent Protein Assay, Instruction Manual. Bio-Rad. , Available from: http://www.bio-rad.com/webroot/web/pdf/lsr/literature/4110065A.pdf (2017).

Tags

Bioengineering גיליון 127 Biomaterials תא תרבות לגרדום photopatterning הידרוג ביו תיול-ene bioconjugation הידרוג
תכנים חלבונים ביו או פפטידים על הידרוג באמצעות פוטוכימיה עבור יישומים ביולוגיים
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Dorsey, T. B., Grath, A., Xu, C.,… More

Dorsey, T. B., Grath, A., Xu, C., Hong, Y., Dai, G. Patterning Bioactive Proteins or Peptides on Hydrogel Using Photochemistry for Biological Applications. J. Vis. Exp. (127), e55873, doi:10.3791/55873 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter