Summary
I denne metoden vi bruker photopolymerization og klikk kjemi teknikker for å lage protein eller peptid mønstre på overflaten av polyetylenglykol (PEG) hydrogels, gir immobilisert bioaktive signaler for studier av mobilnettet svar i vitro .
Abstract
Det er mange biologiske stimuli som kan påvirke celle atferd og stamcelleforskningen differensiering. De generelle celle kultur tilnærminger er avhengige av løselig faktorer innen mediet til kontroll cellen atferd. Løselig tillegg kan imidlertid etterligne visse signalering motiver, som matrix-bundet vekstfaktorer, celle-celle signalisering og romlig biokjemiske bunker, som er vanlig påvirkninger på celler. Videre spille Biofysiske egenskaper av matrix, som substrat stivhet, en viktig rolle i celle skjebne, som ikke er lett manipulert med konvensjonelle cellen dyrking praksis. I denne metoden beskriver vi en enkel protokoll for å gi mønstret bioaktive proteiner på syntetiske polyetylenglykol (PEG) hydrogels med fotokjemi. Denne plattformen gir uavhengig kontroll av underlaget stivhet og romlig biokjemiske signaler. Disse hydrogels kan oppnå en rekke fysiologisk relevante stivhet verdier. I tillegg overflater av disse hydrogels kan være photopatterned med bioaktive peptider eller proteiner via thiol-ene Klikk kjemi reaksjoner. Disse metodene har blitt optimalisert for å beholde protein funksjon etter overflate immobilisering. Dette er en allsidig protokoll som kan brukes til protein eller peptid rundt å lage en rekke mønstre. Til slutt, celler seeded på overflater av disse bioaktive hydrogels kan overvåkes over tid som de reagerer romlig sender.
Introduction
Det er mange stimuli som påvirker celle atferd. Generelt, typisk celle dyrking teknikker stole på løselig faktorer å lokke fram mobilnettet svar; Det er imidlertid begrensninger på denne tilnærmingen. Disse metodene er ikke nøyaktig vise alle signalnettverk motiver vanligvis grunnlegge i vivo. Slike signalnettverk mekanismene inkluderer sequestered vekstfaktorer, celle-celle signalisering og romlig-spesifikke biokjemiske signaler. Videre substrat stivhet kan spille en viktig rolle i celle atferd og stamcelleforskningen differensiering og er ikke lett manipulert bruker vanlig celle dyrking praksis1,2. Biomateriale tilnærminger tilbyr en ny plattform for å begynne å utforske disse signalnettverk mekanismer. Spesielt er hydrogels gode kandidater for tuning substrat stivhet3,4, immobilizing proteiner og peptider5,6, og skape romlig bestemte mønstre7, 8.
Hydrogels er ofte brukt som stillaser i vev engineering på grunn av deres Biofysiske og biokjemiske fellestrekk med ekstracellulær matrix (EFM)9,10. Naturlig polymerer er vanlig valg for stillaser, som de er biokompatible og finnes i mange vev i kroppen. Begrensning av bruk av naturlige polymerer som underlag er at de mangler lett manipulert kjemiske moieties for bioconjugation. På den annen side, er syntetiske hydrogels, slik som PEG, gode plattformer for målrettet kjemikalier11,12. Dessuten PEG hydrogels framprovosere ikke en cellulær respons og derfor brukes som inert infrastruktur for oppretting av bioaktive stillaser.
Klikk kjemi reaksjoner er ansatt for å opprette bioaktive hydrogels, både photopolymerization og thiol-ene. Disse photoreactions krever en photoinitiator og en UV lyskilde. Når photoinitiators er introdusert til UV lys, bryte obligasjoner til skjemaet radikaler. Avhandlinger radikaler er nødvendig for å starte reaksjonen, men kan negativt påvirke protein bioactivity12,13. Derfor er det avgjørende å optimalisere photoinitiator og UV eksponeringstider å opprettholde protein bioactivity.
I denne metoden er hydrogels syntetisert gjennom acrylate-acrylate kjeden vekst photopolymerization. PEG-diacrylate (PEGDA) monomerer reagere med hverandre for å danne forgrenet polymer nettverk ansvaret for oppbygning av hydrogel. Konsentrasjonen av PEGDA monomerer i gel forløper løsningen kontrollerer substrat stivhet. På grunn av lille pore størrelse av hydrogel, ECM proteiner som fibronectin lett kan innlemmes i hydrogel for cellen vedlegg. Endelig disse hydrogels kan overflaten-mønstret med bioaktive peptider eller proteiner via thiol-ene Klikk kjemi reaksjoner. Her reagere Ureagert gratis acrylates innenfor hydrogel systemet med gratis thiols plassert på protein eller peptid utsettes for UV-lyset. Når proteiner eller peptider er immobilized på hydrogel overflaten, kan hydrogel lagres på 4 ° C i flere uker uten å miste bioactivity. Dette gir praktiske, fleksible eksperimentelle planlegging og mulighet for samarbeid mellom laboratorier. Samlet tillater denne plattformen biomekaniske og romlig biokjemiske kontroll, uavhengig av hverandre, for sjansen å påvirker mobilnettet atferd.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. forberedelse av materialer for Hydrogel syntese
- forberede lager løsninger PEGDA, litium fenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate (LAP) og fibronectin under sterile forhold og basert på beregninger (tabell 1A).
- Veie og oppløse forbindelser i fosfat-bufret saltvann (PBS). Vanligvis opprettholde PEGDA arbeider løsning konsentrasjoner mellom 50 og 200 mg/mL (5-20% vekt/volum). Pipetter PEGDA løsningen gjennom 0.22-µm sprøyte filter for sterilisering.
Merk: Holde PEGDA løsningene dekket med en folie innpakning for å beskytte dem mot lyset. Utarbeide en fersk løsning av PEGDA (anbefales) for hvert eksperiment. - Rekonstituer fibronectin protein pulver basert på produsenten ' s anbefaling. Opprettholde fibronectin lager løsningen på 1 mg/mL, aliquot den til 60 til 100 µL dele, og lagre dem på 20 ° C før bruk. Defrost dele på 4 ° C i flere timer eller over natten før bruk. Hvis protein lager ikke allerede er angitt i sterile forhold, bruke filtere 0.22 µm sprøyte for sterilisering.
Merk: Fibronectin brukes for cellen vedlegg. Andre ECM proteiner kan erstattes. - Veier ut FANGET for det lager og oppløse den i PBS, en typisk lager konsentrasjon er 25 mg/mL. Sonicate hvis det er problemer med oppløsning. Løsningen passere 0.22 µm filter for sterilisering. Dekke FANGET med en folie innpakning og holde det ved 4 ° C i opptil flere måneder.
Merk: Runde er photoinitiator brukes for fotokjemi.
- Veie og oppløse forbindelser i fosfat-bufret saltvann (PBS). Vanligvis opprettholde PEGDA arbeider løsning konsentrasjoner mellom 50 og 200 mg/mL (5-20% vekt/volum). Pipetter PEGDA løsningen gjennom 0.22-µm sprøyte filter for sterilisering.
- Forberede sterilt glass lysbilde muggsopp hydrogel formasjonen.
- Autoclave en polyester ark; kreves for hver gel mold. Suge to glass lysbilder og tre plast spacere (0,5 mm tykk) for hver gel mold i 70% etanol minst 2 h, men vanligvis tillater dem å suge over natten. Nyt fem bindemiddel klipp for hver gel mold i 70% etanol for 10 min før bruk.
- Sett på glass lysbilder, avstandsstykker og bindemiddel klipp til et lite autoklaveres ark i celle kultur panseret å tillate dem å luften tørr i flere timer.
- Forberede hydrogel formene ved å plassere plast avstandsstykker rundt kanten av et glass lysbilde. Plass den andre objektglass på. Sikre avstandsstykkene tett ved siden av hverandre med bindemiddel klipp, to på hver langsiden og øverste.
Merk: Hvis dette ikke er riktig montert, gel løsningen vil lekke ut. - Overflate-sterilisere mold med cellekultur hette UV-lys for 30 min før bruk. Halvveis gjennom, Vend mold å avsløre både flater.
2. Endre proteiner med en gratis Thiol
- forberede lager løsninger ved hjelp av beregninger fra regnearket for å konvertere Amin til thiol på proteiner (tabell 1A).
- å gjøre reaksjon bufferen, justere PBS til pH 8 og legge til 5 mM EDTA. Pipetter reaksjon buffer i 0.22 µm sprøyte filter for sterilisering.
Merk: EDTA er viktig som den beskytter thiols dannes disulfide obligasjoner. Thiol grupper må forbli i redusert form for reaksjonen oppstår. - Veier ut 2-iminothiolane (Mo ' s reagens) og oppløse den i reaksjon buffer for en lagerløsning konsentrasjon av 2 mg/mL (14 mM). Løsningen passere 0.22-µm sprøyte filter for sterilisering. Lagre lager løsningen ved 4 ° C i opptil flere måneder.
Merk: 2-iminothiolane er i molekylet som reagerer med løsemiddel-eksponerte gratis aminer på proteiner og konverterer dem til gratis thiols. - Rekonstituer proteinet i reaksjon buffer ved en konsentrasjon mellom 0,1 og 1 mg/mL. Hvis tidligere sterilt, Pipetter denne løsningen gjennom 0.22-µm sprøyte filter for sterilisering.
Merk: Dette proteinet er biokjemisk signalet som vil være mønstrede på hydrogel overflaten. Mens protein konsentrasjoner kan variere, høyere konsentrasjoner er også ideell for sterkere protein mønstre.
- å gjøre reaksjon bufferen, justere PBS til pH 8 og legge til 5 mM EDTA. Pipetter reaksjon buffer i 0.22 µm sprøyte filter for sterilisering.
- Reagere protein med 2-iminothiolane ved å blande både lager løsninger sammen; bruke tabellen 1B til å beregne riktig Volumforholdet. Bruker vanligvis molar forholdet 8:1 2-iminothiolane til protein.
Merk: For større proteiner eller flere fortynne konsentrasjoner, bruke høyere molar forholdet 2-iminothiolane. Kontakt produsenten ' s protokollen 15. - Ruge reaksjonen 1t ved romtemperatur. Bruk en avsalting spinn mikro-kolonne for å fjerne thiolated protein produktet fra de gjenværende reaktantene, etter produsenten ' s protokollen 16.
Merk: Eksklusjon grensen for denne harpiksen er 5 KDa. - Bruk Ellman ' s analysen til kvantitativt mål antall gratis thiols per protein. Følger produsentens ' s protokoll for analysen 17.
3. Hydrogel formasjon
- opprette gel forløper løsningen basert på beregnet fra tabell 1 c. Bland sammen den PEGDA, fibronectin og LAP volumer. Pipetter løsningen kraftig for å sikre at homogen løsningen, men unngå å skape bobler. Holde løsningen beskyttet mot lyset.
- Pipetter gel forløper løsningen nøye mellom to glass lysbilder av gel mold. Vanligvis legge et volum mellom 800 og 1000 µL å mold. Utsette gel løsningen i mold å UV lys (bølgelengde: 365 nm, makt: 3-4 mW/cm 2) i 1-2 min å danne hydrogel.
Merk: Ikke utsett hydrogel langvarig UV lys, som det vil begrense overflaten protein mønstre evner. - Ta av bindemiddel klipp og forsiktig fjerne topp glass lysbilde ved å bruke overfor trykket to side avstandsstykkene.
- Bruker en passende størrelse biopsi punch for å kutte ut hydrogel prøvene. Slå ut flere hydrogels fra gel rektanglet som gjentak og kontrollere prøver.
4. Hydrogel stivhet målinger
- slag ut hydrogels med 8 mm-diameter biopsi slag for et 8 mm parallelle plate rheometer. Laste inn en hydrogel prøven i rheometer (se Tabell av materialer).
- Nedre parallelle plate geometrien dvs 8 mm i diameter til å lage kontakt med overflaten av gel. Holde en gapet avstand på 0,5 mm et 0,5 mm tykt hydrogel eksempel.
- Utføre tid feier i 5 min på 0,1% belastning, 0,1 Hz frekvens og 37 ° C. gjennomsnitt G ' verdier over hver gangen feie. Kjøre uavhengige hydrogels for av musikkstykker.
Merk: G ' verdiene bør være stabile over tidspunkt; Hvis de er ikke, prosent belastning og frekvens feier skal utføres for å velge de aktuelle verdiene 14.
5. Protein mønstre
- forberede photomask bruke et program for dataassistert konstruksjon (CAD) ønsket mønsteret. Utskrift av photomask på et gjennomsiktig ark med en skriver med høy oppløsning. Suge photomask i 70% etanol for 10 min før bruk. Tillat photomask til luft tørr i celle kultur hette før bruk.
- Legger thiolated protein løsningen forberedt i trinn 2 på overflaten av hydrogel overflaten mønstre. Pipetter 1-2 µL/cm 2 thiolated protein løsning på overflaten av hver utskjæringen gel.
Merk: Det er viktig å minimere protein lydstyrken bare legger nok å jevnt dekke hele overflaten av hydrogel prøven. - Forsiktig plassere photomask på overflaten av hydrogel. Tillat ikke luftbobler mellom photomask og hydrogel overflaten. Trykk forsiktig ned masken fjerne bobler skjemaet.
- Avsløre hydrogel til en ny runde med UV-lys (bølgelengde: 365 nm, makt: 3-4 mW/cm 2) for 30-60 s.
Merk: Det er viktig å eksponering mønsteret nok UV-lys for å skape en sterk mønster uten å forårsake tap av protein funksjonen. - Vask hydrogels med PBS å fjerne Ureagert arter og plassere hver hydrogel i godt platen. Vær forsiktig når du plasserer geléer i hver brønn; Kontroller at mønstret overflaten er ansiktet opp. Vask geléer i PBS på 4 ° C; gels er stabile i minst to uker på 4 ° C.
6. Forbereder Hydrogels celle Seeding
- ruge geléer basale medium i 5-10 min på 37 ° C før såing. For menneskelige umbilical blodåre endotelceller (HUVECs), kan du bruke EGF-2 medium uten vekstfaktorer. Redusere volumet på medium i hver tillegg til å hindre hydrogel flytende. For en 48-vel plate, bruker et 250 µL av medium.
- Spinn ned platen på 300 x g for 3 min å sikre at hydrogels ligger på bunnen av brønnen og er ikke flytende. Gjøre dette umiddelbart før cellen seeding.
7. Celle såing på Hydrogels
- Bruk standard steril pattedyr celle kultur prosedyrer for cellen såing og eksperimentelle prosedyrer. Fjern HUVECs fra vev kultur flasker med standard celle avdeling-protokollene. Vask vev kultur parabol med sterilt PBS og ruge med trypsin i 3-5 min på 37 ° C.
- Slukke trypsinized celle suspensjon med overflødig celle middels eller trypsin neutralizer løsning.
- Nedspinning celle suspensjon i sentrifugen 300 x g for 5 min. nøye fjerne nedbryting og beholde celle pellet.
- Resuspend celle pellet i basale EGF-2 med ingen vekstfaktorer. Bruke en hemocytometer for celle opptelling.
- Legge til 75 000 celler/cm 2 til hver hydrogel overflaten av pipettering sakte i midten av hver vel for ikke å forstyrre geléer. Plassere godt platen i en celle kultur inkubator på 37 ° C. For flere dager, regelmessig fjerner parabolen for observasjon.
8. Evaluering av Bioactivity
- kultur E. coli overnatter i suspensjon i LB kjøttkraft i en orbital suspensjon på 37 ° C og 200 rpm. Nedspinning E. coli kulturen Dekanter og gjeninnføre celle pellet i minimal volum på PBS. Veier ut av lysozyme og gjeninnføre på 1 mg/mL lager løsning.
- Pipetter liten volum (25 µL) av lysozyme lagerløsning i microcentrifuge rør. Legge til varierende grad av FANGET photoinitiator (0-12 mM) og vise prøvene til 1 min av UV-lyset. I en egen gruppe, legge til samme mengde LAP (2 mM) til lysozyme løsning og vise eksempler varierende UV lys ganger (0-4 min). Inkluderer gjentak for hver behandling.
- Legg til like volum av konsentrert E. coli løsning for hver lysozyme prøve for en siste lysozyme protein konsentrasjon på 0,5 mg/mL. Inkuber blandet løsningene 4 h ved romtemperatur.
Merk: Dette gir tid for funksjonell lysozyme lyse bakteriell cellen vegg og slipper proteiner i løsningen. - Bruke ubehandlet lysozyme inkubert med E. coli for en positiv kontroll, vurdere dette en 100% bioaktive måling. Bruke lysozyme løsning inkubert med PBS alene som en negativ kontroll.
- Nedspinning prøvene å fjerne celle rusk og holde nedbryting. Kjøre en Bradford analysen for å kvantifisere den totale konsentrasjonen av protein i nedbryting å måle mengden av bakteriell lysate.
- Kjører en Bradford analysen etter produsenten ' s protokollen 18. Beregne fold endre i protein konsentrasjon i forhold til kontrollen negative.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Protokollen for å lage bioaktive mønstre på overflaten av PEG hydrogels er illustrert i figur 1. Et regneark ble utviklet for å beregne volumet og konsentrasjon for hvert lager løsning (tabell 1A). Proteiner til bli immobilisert på overflaten av hydrogel endres med 2-iminothiolane (figur 1B). Denne reaksjonen utføres med volumene fra tabellen 1B. Forløperen hydrogel løsningen er forberedt med 10% vekten/volumet av PEGDA med runde (figur 1A). Ulike forløper PEGDA konsentrasjoner kan brukes å gi ønsket substratet stivhet (figur 2A). Fibronectin er inkludert i denne forløper løsningen for cellen vedlegg formål. Etter grundig blanding, er denne løsningen pipetted i forberedt mold og utsatt for UV-lys (figur 1C). UV lyseksponering bør minimaliseres; eksponering bør være akkurat nok til å produsere en hydrogel. Hydrogel prøver slo den nødvendige diameter for ønsket godt plate (figur 1C). For overflate mønstre, endret protein løsning pipetted på overflaten av en hydrogel og jevnt. Minimal volumet skal brukes; protein volumet bør være akkurat nok til å dekke hele overflaten av hydrogel. De forhåndsutformede photomask er plassert direkte på hydrogel overflaten; luftbobler mellom masken og hydrogel bør unngås. En ny runde med UV lys til å bøy covalently UV-eksponerte proteiner til hydrogel. Hydrogel prøver er skylt å fjerne Ureagert proteiner og avsløre immobilisert protein mønsteret (figur 1D).
Det er viktig å minimere photoinitiator konsentrasjon og UV eksponeringstid når proteiner er tilstede. Bruker lysozyme bioactivity som en indikator, fant vi at FANGET photoinitiator konsentrasjonen bør være mindre enn 2 mM (figur 2B) og eksponeringstid UV skal totalt mindre enn 2 min (figur 2C) for å beholde et protein bioactivity større enn 80%.
UV eksponeringstid hydrogel dannelse og protein mønstre er begge viktige parametere for å utvikle en vellykket protokoll (Figur 3). Først av alt, er minimere UV eksponering under hydrogel formasjon avgjørende for å opprettholde gratis acrylate funksjonelle grupper for påfølgende protein immobilisering reaksjoner (Figur 3A). Hydrogels utsatt for UV-lys lenger enn 2 min er ikke opprette immobilisert protein mønstre. I tillegg som UV eksponering protein mønsteret reagerer mer proteiner på overflaten (Figur 3B).
Til slutt, celler kan kultivert på disse mønstrede hydrogel underlag å manipulere celle atferd. Slik viser potensialet i immobilisert mønstre på hydrogels, vi mønstret VEGF, en vekstfaktor viktig for endotelceller, og kultivert HUVECs på overflaten med basal EGF-2 middels (Figur 4). HUVECs var jevnt frø på overflaten av VEGF-mønstret PEG hydrogels (Figur 4A). To dager etter seeding, ble HUVECs observert for å migrere mot romlige regionene hydrogel som inneholdt immobilisert VEGF (Figur 4B, C). Dette er et eksempel på et bioaktive protein mønster på pinne hydrogels brukes til å påvirke celle atferd.
Figur 1: Skjematisk av hydrogel formasjon og protein mønstre. (A) forberede forløper hydrogel løsning med PEGDA monomerer, photoinitiator og ekstracellulære protein celle vedlegg. (B) endre proteiner med gratis thiol grupper som reagerer med 2-iminothiolane. (C) Pipetter forløper løsningen i forberedt mold og utsette det for UV-lys for å danne hydrogel. Slå ut hydrogel prøver av ønsket størrelse. (D) Pipette løsningen endret protein på overflaten av hydrogel, plassere en photomask på, og føre til en ny runde med UV-lys. Skyll gel for å fjerne Ureagert art før bildebehandling og celle seeding. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2 : Modulerende stivhet og protein bioactivity. (A) endringer i konsentrasjonen av PEGDA monomerer i forløperen gel løsningen endre hydrogel stivhet. (B) øker konsentrasjonen av FANGET photoinitiator senker protein funksjon etter 1 min UV eksponering. (C) øke UV eksponeringstid senker protein funksjon med 2 mM runde. Alle feilfelt representerer standardavvik av replikat. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: Mønster og hydrogel UV eksponering ganger optimalisert for protein mønstre. (A) minimering UV eksponering ganger for hydrogel formasjon gir overflaten mønstre. (B) øke UV eksponeringstider for overflate mønstre øker mønster styrke. Skalere barer = 200 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: Endotelceller å svare på et VEGF mønster. (A) Uniform HUVECs seeded på hydrogels. (B og C) HUVECs forstand VEGF mønsteret og migrere mot immobilisert VEGF. Bildene ble tatt to dager etter seeding med (B) 4 X og (C) 10 X forstørrelse. Skalere barer = 500 µm. HUVEC-anbudsforespørsler (rød) og VEGF-488 mønster (grønn) ble tatt med eksitasjon og utslipp filtre på 528/553 og 465/495, henholdsvis. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Tabell 1: beregninger for lager og gel forløper løsninger. Den røde boksen angir brukerdefinerte verdier, for eksempel molekylvekt, ønsket lager konsentrasjoner, og veide ut massene. Boksene representerer verdier som er beregnet basert på brukerdefinerte verdier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne protokollen inneholder en metode for å lage bioaktive protein mønstre for biologiske applikasjoner. Det er flere endringer som kan gjøres til å tilpasse denne protokollen for forskjellige eksperimenter. Først varierer celle vedlegg kravene for ulike celletyper. Hvis dårlig celle vedlegg til geléer er først observert, anbefales øker konsentrasjonen av ECM protein i forløperen løsningen. Andre ECM proteiner kan brukes i stedet for fibronectin, inkludert ulike typer kollagen, laminin eller en kombinasjon av disse. For hver ny cellen, skal celle vedlegg være optimalisert før hydrogel mønstre. Denne protokollen kan også brukerutviklede photomasks. Basert på ønsket program, photomasks kan produseres med har ulike størrelser, figurer og generelle mønstre. Uniform immobilisering kan oppnås i fravær av en photomask.
Denne protokollen har visse begrensninger. Som fremhevet i Representant resultaterer denne metoden følsomme for mengden av UV-lys på hvert trinn. Overeksponering under hydrogel formasjon trinnet begrenser tilgjengelig acrylate gruppene for påfølgende overflaten bioconjugation. Derfor er et viktig skritt i denne protokollen veldrevet UV lyseksponering ganger for hvert trinn. Også krever denne protokollen en høy konsentrasjon protein lager for vellykket mønstre. Lave konsentrasjoner av protein vil medføre dårlig overflate mønstre. I tillegg er photomasks også begrense ved at de kan bare produsere diskret mønstre. Mer komplekse mønstre kan oppnås med liknende tilnærminger, men krever en mer avansert metode.
Denne protokollen er viktig å eksisterende metoder som det gir en enkel metode for å justere substrat stivhet og protein mønstre. Bruke acrylate kjemi for hydrogel dannelsen gir en størrelsesorden rekke substrat stivhet innenfor fysiologiske området. Bare justere konsentrasjonen av PEGDA i forløperen løsningen gir kontroll over hydrogel stivhet. I tillegg, bruk av Klikk kjemi for protein mønstre tillater rask Bøyning mellom hydrogel substrat og thiolated endret protein. Dette er et viktig designelement, som det tillater denne protokollen til å være gjeldende protein eller peptid rundt.
PEG hydrogels er lovende biologisk materiale som kan brukes til å utforske nye plattformer for å vise biokjemiske signaler til biologiske systemer. Enten jevn overflate immobilisering eller romlig bestemte mønstre, disse teknikkene gi romanen måter å styre celle atferd. Fremover, vil fremme av biomateriale teknologi gi ny innsikt i cellen atferd og fremme våre evner til recapitulate i vivo signalnettverk motiver i in vitro -systemer. Dette kan være gunstig for stem celledifferensiering og modellering utviklingsmessige signalering innenfor et kontrollert eksperimentelle system.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre.
Acknowledgments
Denne studien var hovedsakelig støttes av tilskudd fra American Heart Association forsker Development Grant (12SDG12050083 til G.D.), National Institutes of Health (R21HL102773, R01HL118245 til G.D.) og National Science Foundation (CBET-1263455 og CBET-1350240 til G.D.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PEG-diacrylate (PEGDA) | Laysan Bio | ACRL-PEG-ACRL-3400 | Can also be synthesized or purchased through other venders. Different molecular weights can be used. |
| Lithium Phenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate (LAP) | Synthesized in lab | ||
| Fibronectin | Corning | 356008 | Other cell attachment proteins can be used, such as laminin, matrigel |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Sigma | D8537-500ML | |
| Photomask | FineLine Imaging | n/a | Custom prints on transparent sheets with high resolution DPI. |
| Binder Clips | Various Vendors | ||
| Compact UV Light Source (365nm) | UVP | UVP-21 | Other UV light sources can be used, calibration of power is required. |
| 2-iminothiolane (Pierce Traut’s Reagent) | Thermo Sci. | 26101 | |
| Ellman’s Reagent: DTNB; 5,5-dithio-bis(2-nitrobenzoic acid) | Thermo Sci. | 22582 | |
| human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) | Lonza | passage number between 6- 10 | |
| EGM-2 Media | Lonza | CC31-56, CC-3162 | EGM-2 without growth factors was used in experiments. Full EGM-2 media was used for cell maintainance |
| 0.25% Trypsin EDTA | Life Tech | 25200-056 | |
| Trypsin Neutralizer | Life Tech | R-002-100 | |
| Centrifuge | Various Venders | ||
| Hemocytometer | Hausser Sci. Bright-line | ||
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma Aldrich | E6758 | |
| 0.22µm filter | Cell Treat | 229743 | |
| 1mL Syringe | |||
| Glass Microscope Slides | Fisher Sci. | 12-550C | |
| Plastic spacers | Various Venders | 0.5mm thickness | |
| 70% Ethanol | BICCA | 2546.70-1 | |
| Bio-shield | Bio-shield | 19-150-0010 | |
| Bradford Reagent | BIO-RAD | ||
| Desalting Resin - Sephadex G-25 | GE Healthcare | 95016-754 | |
| Microspin Columns | Thermo Sci. | PI69725 | |
| AR-G2 rehometer | TA Instruments |
References
- Yao, S., et al. Co-effects of matrix low elasticity and aligned topography on stem cell neurogenic differentiation and rapid neurite outgrowth. Nanoscale. 8 (19), 10252-10265 (2016).
- Evans, N. D., et al. Substrate stiffness affects early differentiation events in embryonic stem cells. Eur Cells Mater. 18, 1-13 (2009).
- Ye, K., et al. Matrix Stiffness and Nanoscale Spatial Organization of Cell-Adhesive Ligands Direct Stem Cell Fate. Nano Lett. 15 (7), 4720-4729 (2015).
- Discher, D. E., Janmey, P., Wang, Y. L. Tissue cells feel and respond to the stiffness of their substrate. Science. 310 (5751), 1139-1143 (2005).
- Sridhar, B. V., Doyle, N. R., Randolph, M. A., Anseth, K. S. Covalently tethered TGF-beta1 with encapsulated chondrocytes in a PEG hydrogel system enhances extracellular matrix production. J Biomed Mater Res A. 102 (12), 4464-4472 (2014).
- Salinas, C. N., Anseth, K. S. Decorin moieties tethered into PEG networks induce chondrogenesis of human mesenchymal stem cells. J Biomed Mater Res A. 90 (2), 456-464 (2009).
- Joddar, B., Guy, A. T., Kamiguchi, H., Ito, Y. Spatial gradients of chemotropic factors from immobilized patterns to guide axonal growth and regeneration. Biomaterials. 34 (37), 9593-9601 (2013).
- Wylie, R. G., Ahsan, S., Aizawa, Y., Maxwell, K. L., Morshead, C. M., Shoichet, M. S. Spatially controlled simultaneous patterning of multiple growth factors in three-dimensional hydrogels. Nat Mater. 10 (10), 799-806 (2011).
- Tibbitt, M. W., Anseth, K. S. Hydrogels as extracellular matrix mimics for 3D cell culture. Biotechnol Bioeng. 103 (4), 655-663 (2009).
- Lutolf, M. P., Hubbell, J. A. Synthetic biomaterials as instructive extracellular microenvironments for morphogenesis in tissue engineering. Nat Biotechnol. 23 (1), 47-55 (2005).
- Saik, J. E., Gould, D. J., Keswani, A. H., Dickinson, M. E., West, J. L. Biomimetic hydrogels with immobilized ephrinA1 for therapeutic angiogenesis. Biomacromolecules. 12 (7), 2715-2722 (2011).
- McCall, J. D., Anseth, K. S. Thiol-ene photopolymerizations provide a facile method to encapsulate proteins and maintain their bioactivity. Biomacromolecules. 13 (8), 2410-2417 (2012).
- Fairbanks, B. D., Schwartz, M. P., Bowman, C. N., Anseth, K. S. Photoinitiated polymerization of PEG-diacrylate with lithium phenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate: polymerization rate and cytocompatibility. Biomaterials. 29 (6), 997-1003 (2009).
- Zuidema, J. M., Rivet, C. J., Gilbert, R. J., Morrison, F. A. A protocol for rheological characterization of hydrogels for tissue engineering strategies. J Biomed Mater Res B Appl Biomater. 102 (5), 1063-1073 (2014).
- Truat's Reagent Instructions. Thermo Scientific. , Available from: https://tools.thermofisher.com/content/sfs/.../MAN0011238_Trauts_Reag_UG.pdf (2017).
- Ellman's Reagent Instructions. Thermo Scientific. , Available from: https://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/MAN0011216_Ellmans_Reag_UG.pdf (2017).
- Desalting Columns. GE Life Sciences. , Available from: https://www.gelifesciences.com/gehcls_images/GELS/Related%20Content/Files/1478781880316/litdoc52130800_2016111034421.pdf (2017).
- Quick State Bradford Reagent Protein Assay, Instruction Manual. Bio-Rad. , Available from: http://www.bio-rad.com/webroot/web/pdf/lsr/literature/4110065A.pdf (2017).
