Summary
Den här metoden använder vi fotopolymerisation och klicka på kemi tekniker för att skapa protein eller peptid mönster på ytan av polyetylenglykol (PEG) hydrogels, som tillhandahåller orörlig bioaktiva signaler för studiet av cellulära svar in vitro- .
Abstract
Det finns många biologiska stimuli som kan påverka celldifferentiering beteende och stamceller. De allmänna cell kultur metoder förlitar sig på lösliga faktorer inom mediet till kontroll cell beteende. Dock efterlikna inte lösliga tillägg vissa signalering motiv, såsom matrix-bundna tillväxtfaktorer, cell-cell signalering och rumsliga biokemiska signaler, som är gemensam påverkan på celler. Dessutom spelar biofysiska egenskaper för matrisen, såsom substrat stelhet, viktiga roller i cell öde, som inte är lätt manipuleras med hjälp av konventionella cell odlingsskålar praxis. Den här metoden beskriver vi ett enkelt protokoll för att ge mönstrade bioaktiva proteiner på syntetiska polyetylenglykol (PEG) hydrogels använder fotokemi. Denna plattform möjliggör oberoende kontroll av substrat stelhet och rumsliga biokemiska signaler. Dessa hydrogels kan uppnå ett stort utbud av fysiologiskt relevanta stelhet värden. Dessutom dessa hydrogels kan vara photopatterned med bioaktiva peptider eller proteiner via thiol-ene Klicka kemi reaktioner. Dessa metoder har optimerats för att behålla proteinfunktion efter ytan immobilisering. Detta är en mångsidig protokoll som kan användas till protein eller peptid av intresse att skapa en mängd olika mönster. Slutligen kan celler seedade på ytor av dessa bioaktiva hydrogels övervakas över tid eftersom de svarar rumsligt specifika signaler.
Introduction
I området i närheten finns det många stimuli som påverkar cellen beteende. I allmänhet typiska cell odlingsskålar tekniker förlitar sig på lösliga faktorer att framkalla cellulära svar; dock finns det begränsningar för detta synsätt. Dessa metoder är inte korrekt Visa alla signalering motiv vanligt förekommande invivo. Sådana signalering mekanismer inkluderar beslagtagna tillväxtfaktorer, cell-cell signalering och rumsligt-specifika biokemiska signaler. Dessutom substrat stelhet kan spela en viktig roll i beteende och stamceller celldifferentiering och är inte lätt manipuleras med hjälp av gemensamma cell odlingsskålar praxis1,2. Biomaterial metoder erbjuder en ny plattform för att börja utforska dessa signalering mekanismer. Hydrogeler är särskilt utmärkta kandidater för tuning substrat stelhet3,4, immobilisera proteiner och peptider5,6, och skapa rumsligt särskilda mönster7, 8.
Hydrogeler används ofta som ställningar i vävnadsteknik på grund av deras biofysiska och biokemiska likheter med extracellulär matrix (ECM)9,10. Naturliga polymerer är gemensamma val för ställningar, eftersom de är biokompatibelt och finns i många vävnader i kroppen. Begränsning av använda naturliga polymerer som substrat är att de saknar lättmanipulerade kemiska beståndsdelarna för bioconjugation. Å andra är syntetiska hydrogels, som sådan som PEG, utmärkta plattformar för riktade kemier11,12. Dessutom PEG hydrogels framkalla inte en cellulär reaktion och används därför som inert stamnät för att skapa bioaktiva ställningar.
Skapa bioaktiva hydrogels, både fotopolymerisation och thiol-ene Klicka på kemi reaktioner är anställda. Dessa photoreactions kräver en photoinitiator och en UV-ljuskälla. När photoinitiators införs för UV-ljus, bryta obligationer till formuläret radikaler. Avhandlingar radikaler är nödvändiga för att inleda reaktionen men kan negativt påverka protein bioaktivitet12,13. Därför är det avgörande att optimera photoinitiator och UV exponering gånger att upprätthålla protein bioaktivitet.
I denna metod syntetiseras hydrogels genom akrylat-akrylat kedja tillväxt fotopolymerisation. PEG-diacrylate (PEGDA) monomerer reagerar med varandra för att bilda förgrenad polymer networks ansvarar för strukturera av hydrogel. Koncentrationen av PEGDA monomerer inom föregångare gellösningen styr substrat styvheten. På grund av lilla porstorlek av hydrogel, ECM proteiner såsom Fibronektin kan enkelt införlivas inom hydrogel i syfte att cell fastsättning. Slutligen, dessa hydrogels kan vara yta-mönstrad med bioaktiva peptider eller proteiner via thiol-ene Klicka på kemi reaktioner. Här, reagerar oreagerad gratis akrylater inom hydrogel systemet med gratis tioler ligger på protein eller peptid när den utsätts för UV-ljus. Efter de proteiner eller peptider är orörlig på hydrogel ytan, kan hydrogel lagras vid 4 ° C i flera veckor utan att förlora bioaktivitet. Detta erbjuder bekvämlighet, flexibel experimentell planering och möjligheten för samarbete mellan labs. Sammantaget ger denna plattform biomekaniska och rumsliga biokemiska kontroll, oberoende av varandra, för möjlighet att påverka cellulära beteende.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. beredning av material för Hydrogel syntes
- Förbered stamlösningar av PEGDA, litium fenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate (varv) och Fibronektin under sterila förhållanden och utifrån beräkningar (tabell 1A).
- Väg upp och lösa upp föreningar i fosfatbuffrad saltlösning (PBS). Normalt underhåll PEGDA arbetar lösning koncentrationer mellan 50 och 200 mg/mL (5-20% vikt/volym). Pipettera PEGDA lösningen genom ett 0,22 µm spruta filter för sterilisering.
Obs: Håll de PEGDA lösningarna täckt med folie omslag för att skydda dem från ljus. Förbereda en ny lösning av PEGDA (rekommenderas) för varje experiment. - Rekonstituera Fibronektin protein pulver baserat på tillverkaren ' rekommendation. Upprätthålla Fibronektin stamlösning 1 mg/ml, alikvotens det till 60-100 µL portioner, och lagra dem vid-20 ° C fram till användning. Frosta av alikvoter vid 4 ° C för flera timmar eller över natten före användning. Om protein lager inte redan anges i sterila förhållanden, Använd ett filter med 0,22 µm i sprutan för sterilisering.
Obs: Fibronektin används för cell fastsättning. Andra ECM proteiner kan ersättas. - Väg in LAP för stamlösningen och lös upp det i PBS; en typisk lager koncentration är 25 mg/mL. Sonikera om det finns några problem med upplösning. Passera lösningen genom ett 0,22 µm filter för sterilisering. Täcka varvet med en folie omslag och hålla det vid 4 ° C i upp till flera månader.
Obs: LAP är den photoinitiator som används för fotokemi.
- Väg upp och lösa upp föreningar i fosfatbuffrad saltlösning (PBS). Normalt underhåll PEGDA arbetar lösning koncentrationer mellan 50 och 200 mg/mL (5-20% vikt/volym). Pipettera PEGDA lösningen genom ett 0,22 µm spruta filter för sterilisering.
- Förbereda sterila glas bild formar för hydrogel bildandet.
- Autoklav en polyester plåt; en behövs för varje gel mögel. Blöt två glasskivor och tre plast distanser (0,5 mm tjock) för varje gel mögel i 70% etanol för minst 2 h, men generellt tillåta dem i blöt över natten. Blötlägg fem bindemedel klipp för varje gel mögel i 70% etanol för 10 min före användning.
- Placera glasskivor, distanser och bindemedel klipp på små Ånghärdad ark i cell kultur huven till låt dem lufttorka i flera timmar.
- Förbered hydrogel formar genom att placera plast distanser runt kanten på en glasskiva. Placera den andra glasskiva på toppen. Säker distanserna tätt bredvid varandra med bindemedel klipp, två på varje långsida och en på topp.
Obs: Om detta inte är korrekt monterad, gellösningen kommer att läcka ut. - Yta-sterilisera formen med cellkultur motljusskydd UV-ljus för 30 min före användning. Halvvägs igenom, flip mögel att exponera båda ytorna.
2. Modifiera proteiner med en gratis Thiol
- förbereda lager lösningar med hjälp av beräkningar från kalkylbladet för att konvertera amine till thiol på proteiner (tabell 1A).
- Att göra reaktion bufferten, justera PBS till pH 8 och lägga till 5 mM EDTA. Pipett reaktion buffert till 0,22 µm spruta filter för sterilisering.
Obs: EDTA är viktigt, eftersom det skyddar tioler från bilda disulfide obligationer. Thiol grupper måste förbli i sin reducerade form för reaktionen inträffar. - Väg upp 2-iminothiolane (Traut ' s reagens) och lös upp det i reaktion buffert för en stamlösning koncentration av 2 mg/mL (14 mM). Passera lösningen genom ett 0,22 µm spruta filter för sterilisering. Lagra stamlösning vid 4 ° C i upp till flera månader.
Obs: 2-iminothiolane är molekyl som reagerar med lösningsmedel-exponerade gratis aminer på proteiner och omvandlar dem till gratis tioler. - Beredes proteinet i reaktion buffert på en koncentration mellan 0,1 och 1 mg/mL. Om inte tidigare sterila, Pipettera lösningen genom ett 0,22 µm spruta filter för sterilisering.
Obs: Detta protein är biokemiska signalen som kommer vara mönstrade tryckytan hydrogel. Också, medan protein koncentrationerna kan variera, högre koncentrationer är idealiska för starkare protein mönster.
- Att göra reaktion bufferten, justera PBS till pH 8 och lägga till 5 mM EDTA. Pipett reaktion buffert till 0,22 µm spruta filter för sterilisering.
- Reagerar proteinet med 2-iminothiolane genom båda lager lösningar blandas; använda tabell 1B för att beräkna förhållandet rätt mängd. Vanligtvis använder en molar förhållandet av 8:1 2-iminothiolane till protein.
Obs: För större proteiner eller mer späd koncentrationer, använda en högre molar förhållandet av 2-iminothiolane. Hänvisa till tillverkaren ' s protokoll 15. - Inkubera reaktionen för 1 h i rumstemperatur. Använda en avsaltning spin mikro-kolumn ta bort thiolated proteinprodukter från återstående reaktanterna, efter tillverkaren ' s protokoll 16.
Obs: Undantag denna harts är 5 KDa. - Användning Ellman ' s Assay att kvantitativt mäta antalet gratis tioler per protein. Följ tillverkarens ' s-protokollet för assay 17.
3. Hydrogel bildandet
- skapa föregångare gellösningen baserat på värden beräknas från tabell 1 c. Blanda ihop PEGDA, Fibronektin och LAP volymer. Pipettera lösningen kraftigt för att säkerställa en homogen lösning, men undvika att skapa bubblor. Förvara lösningen skyddas från ljus.
- Pipettera föregångare gellösningen noga mellan de två objektglas av gel mögel. Vanligtvis lägger till en volym mellan 800 och 1000 µL till mögel. Exponera gellösningen i formen för UV-ljus (våglängd: 365 nm, ström: 3-4 mW/cm 2) för 1-2 min att bilda hydrogel.
Obs: Utsätt inte hydrogel för långvarig UV ljus, eftersom det kommer att begränsa ytan proteinet mönstring funktioner. - Ta bort bindemedel klipp och ta försiktigt bort övre glasskiva genom att tillämpa mittemot trycket på de två distanserna.
- Använder en lämplig storlek biopsi punch för att skära ut hydrogel proverna. Stansa ut flera hydrogels från gel rektangeln att tjäna som replikerar och kontrollprover.
4. Hydrogel stelhet mätningar
- Punch ut hydrogels med en 8 mm diameter biopsi punch för en 8 mm parallellt plattan reometer. Läsa in ett hydrogel prov i reometer (se Tabell för material).
- Nedre parallellt plattan geometrin som är 8 mm i diameter till att göra kontakt med ytan av gelen. Håll ett gap avstånd 0,5 mm för en 0,5 mm tjock hydrogel prov.
- Utför tiden sveper för 5 min på 0,1% stam, 0,1 Hz frekvens och 37 ° C. genomsnitt G ' värden över varje gång svep. Köra oberoende hydrogeler för replikat för varje komposition.
Obs: G ' värden bör vara stabil över tid pekar; om de inte är, procent stam och frekvens svep bör utföras markerar du lämpliga värden 14.
5. Protein Patterning
- Förbered önskat mönster för den photomasken använder ett program för datorstödd konstruktion (CAD). Skriva ut photomasken på ett transparent använder en skrivare med hög upplösning. Blötlägg photomasken i 70% etanol för 10 min före användning. Låt den photomasken luft torka i en cell kultur hood innan användning.
- Lägga till thiolated protein lösningen bereddes i steg 2 till ytan av hydrogel för surface mallning. Pipettera 1-2 µL/cm 2 thiolated protein lösning på ytan av varje utstansade gel.
Obs: Det är viktigt att minimera protein volymen; bara lägga till tillräckligt för att jämt täcka hela ytan av hydrogel provet. - Noggrant placera photomasken på ytan av hydrogel. Tillåt inte luftbubblor mellan photomasken och hydrogel yta. Tryck försiktigt ner på masken för att ta bort eventuella bubblor som bildar.
- Utsätta hydrogel till en andra omgång av UV-ljus (våglängd: 365 nm, ström: 3-4 mW/cm 2) för 30-60 s.
Obs: Det är viktigt att exponering mönstret för tillräckligt UV-ljus för att skapa ett starkt mönster utan orsakar förlust av proteinfunktion. - Tvätta hydrogels med PBS ta bort oreagerad arter och placera varje hydrogel inom väl plattan. Var försiktig när du placerar gelerna i varje brunn; Kontrollera att den mönstrade ytan är vänd uppåt. Tvätta gelerna i PBS vid 4 ° C; geler är stabila i minst två veckor vid 4 ° C.
6. Förbereda hydrogeler för Cell sådd
- Inkubera gelerna i basal medium för 5-10 min vid 37 ° C före sådd. För mänskliga navel ven endotelceller (HUVECs), Använd extra bolagsstämma-2 medium utan tillväxtfaktorer. Minimera volymen av medium tillsätts varje brunn för att förhindra hydrogel flytande. För en 48-väl plåt, Använd en 250 µL volym medium.
- Snurra ner plattan på 300 x g i 3 min så att hydrogeler är belägna längst ned i brunnen och inte flyter. Göra detta omedelbart före cellen sådd.
7. Cell Seeding på Hydrogels
- användning standard sterila däggdjursceller kultur förfaranden för cell sådd och experimentella rutiner. Ta bort HUVECs från vävnadsodling kolvar med standard cellen avlossning protokoll. Tvätta vävnadsodling skålen med steril fosfatbuffrad Koksaltlösning och inkubera med trypsin under 3-5 minuter vid 37 ° C.
- Släcka trypsinized cellsuspension med överskott cell medium eller trypsin neutralizer lösning.
- Snurra ner cellsuspensionen i centrifugen vid 300 x g för 5 min. Ta försiktigt bort supernatanten och hålla cellpelleten.
- Återsuspendera cellpelleten i basal EGM-2 med ingen tillväxtfaktorer. Använd en hemocytometer för cell inventering.
- Lägga till 75 000 celler/cm 2 till varje hydrogel yta av pipettering långsamt in i centrera av varje väl så att inte störa gelerna. Placera väl plattan i en cell kultur inkubator vid 37 ° C. För flera dagar, med jämna mellanrum ta bort skålen för observation.
8. Utvärdering av bioaktivitet
- kultur E. coli övernattning i suspension i LB buljongen i en orbital suspension vid 37 ° C och 200 rpm. Snurra ner E. coli kulturen, Dekantera och rekonstruera cellpelleten i minimal volym av PBS. Väg upp lysozym och bered på 1 mg/mL för stamlösningen.
- Pipettera en liten volym (25 µL) av lysozym stamlösning i mikrocentrifugrör. Lägga till olika nivåer av varvet photoinitiator (0-12 mM) och exponera proverna till 1 min av UV-ljus. I en separat grupp, lägga till samma mängd LAP (2 mM) i lysozym lösning och exponera prover till varierande UV ljus gånger (0-4 min). Inkluderar replikat för varje behandling.
- Lägg till lika stor volym av koncentrerad E. coli lösning till varje lysozym prov för en sista lysozym proteinkoncentration av 0,5 mg/mL. Inkubera i blandade lösningar för 4 h i rumstemperatur.
Obs: Detta ger tid för funktionella lysozym att lysera bakteriella cellväggen och släppa proteiner i lösningen. - Använda obehandlad lysozym inkuberas med E. coli i en positiv kontroll, anser att detta är en 100% bioaktiva mätning. Använda lysozym lösning inkuberas med PBS ensam som en negativ kontroll.
- Snurra ner proverna ta bort cellfragment och hålla supernatanten. Kör en Bradford analysen för att kvantifiera den totala koncentrationen av protein inom supernatanten att mäta mängden bakteriell lysate.
- Kör en Bradford analysen efter tillverkaren ' s protokoll 18. Beräkna luckan ändra i proteinkoncentration jämfört med den negativa kontrollen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Protokollet till skapa bioaktiva mönster på ytan av PEG hydrogels illustreras i figur 1. Ett kalkylblad utvecklades för att beräkna volym och koncentration för varje stamlösning (tabell 1A). Proteiner för att vara orörlig på ytan av hydrogel är modifierad med 2-iminothiolane (figur 1B). Denna reaktion sker med hjälp av volymer från tabell 1B. Föregångaren hydrogel lösningen bereds med 10% vikt/volym av PEGDA med LAP (figur 1A). Olika föregångare PEGDA koncentrationer kan användas för att ge önskad substrat styvheten (figur 2A). Fibronektin ingår i denna föregångare lösning för cell fastsättning ändamål. Efter omsorgsfull blandning, är denna lösning pipetteras i förberedda formen och utsätts för UV ljus (figur 1C). UV-ljus exponering bör minimeras. exponeringen bör vara precis tillräckligt för att producera en hydrogel. Hydrogel prover kan stansas ut till lämplig diameter för önskad väl plåt (figur 1C). För surface mallning, är modifierat protein lösning pipetteras på ytan av en hydrogel och jämnt. Minimal volym användas; protein volym bör vara precis tillräckligt för att täcka hela ytan av hydrogel. De fördesignade fotomask är placerad direkt på hydrogel ytan; luftbubblor mellan masken och hydrogel bör undvikas. En andra omgång av UV-ljus används för kovalent konjugat UV-exponerade proteiner till hydrogel. Hydrogel prover sköljs bort oreagerad proteiner och avslöja immobiliserade protein mönstret (figur 1D).
Det är viktigt att minimera photoinitiator koncentration och exponeringstid UV när proteiner är närvarande. Med lysozym bioaktivitet som indikator, fann vi att LAP photoinitiator koncentrationen bör vara mindre än 2 mM (bild 2B) och UV exponeringstiden bör totalt mindre än 2 min (figur 2C) om du vill behålla ett protein bioaktivitet större än 80%.
UV exponeringstiden under hydrogel bildandet och protein mallning är båda viktiga parametrar för att utveckla en framgångsrik protokoll (figur 3). Först av allt, är minimera UV-exponering under hydrogel bildandet kritiska för upprätthållande gratis akrylat funktionella grupper för efterföljande protein immobilisering reaktioner (figur 3A). Hydrogeler utsätts för UV-ljus längre än 2 min förmår skapa immobiliserade protein mönster. Dessutom som UV exponering för mönstret protein ökar, reagerar mer proteiner på ytan (figur 3B).
Slutligen, celler kan vara odlade på dessa mönstrade hydrogel substrat att manipulera cell beteende. För att Visa potentialen hos immobiliserade mönster på hydrogels, vi mönstrade VEGF, en tillväxtfaktor som är viktigt för endotelceller, och odlade HUVECs på ytan med hjälp av basala EGM-2 medium (figur 4). HUVECs seedade jämnt på ytan av VEGF-mönstrad PEG hydrogels(figur 4). Två dagar efter sådd, observerades HUVECs för att migrera mot de rumsliga regionerna av den hydrogel som innehöll immobiliserade VEGF (figur 4B, C). Detta är ett exempel på en bioaktiva protein mönster på PEG hydrogeler används för att påverka cell beteende.
Figur 1: Schematisk av hydrogel bildandet och protein mallning. (A) förbereda föregångare hydrogel lösning med PEGDA monomerer, photoinitiator och extracellulära protein för cell fastsättning. (B) ändra proteinerna med gratis thiol grupper genom att reagera med 2-iminothiolane. (C) Pipettera föregångare lösningen i den förberedda formen och Utsätt det för UV-ljus att bilda hydrogel. Stansa ut hydrogel prover av önskad storlek. (D) pipett modifierat protein lösningen på ytan av hydrogel, placera en photomasken på ytan, och utsätta det för en andra omgång av UV-ljus. Skölj gelen för att ta bort oreagerad arter före imaging och cell seedning. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2 : Modulerande stelhet och protein bioaktivitet. (A) förändringar i koncentrationen av PEGDA monomerer inom föregångare gellösningen ändra hydrogel stelhet. (B) öka koncentrationen av LAP photoinitiator sänker proteinfunktion efter 1 min av UV-exponering. (C), ökad UV exponeringstid sänker proteinfunktion med 2 mM varv. Alla felstaplar representera standardavvikelsen för replikat. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Mönster och hydrogel UV exponering gånger optimerad för protein mallning. (A), minimera UV exponering gånger för hydrogel bildandet tillåter för surface mallning. (B) ökad UV exponering gånger för surface mallning ökar mönster styrka. Skala barer = 200 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Figur 4: Endothelial celler svarar på en VEGF mönster. (A) enhetliga HUVECs seedade på hydrogels. (B och C) HUVECs känna mönstret VEGF och migrera mot immobiliserade VEGF. Bilder togs två dagar efter sådd (B) 4 X och (C), 10 X förstoring. Skala barer = 500 µm. HUVEC-RFPs (röd) och VEGF-488 mönster (grön) fångades med excitation och utsläpp filter på 528/553 och 465/495, respektive.
Tabell 1: beräkningar för lager och gel föregångare lösningar. Den röda rutan visar användardefinierade värden, t ex molekylvikt, önskas lager koncentrationer, och vägde ut massorna. Blå rutor representerar värden som har beräknats baserat på användardefinierade värden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Detta protokoll ger en metod för att skapa bioaktiva protein mönster för biologiska applikationer. I området i närheten finns det flera ändringar som kan göras för att anpassa detta protokoll för olika experiment. Första varierar cellen anslutningskrav för olika celltyper. Om dålig cell fastsättning gelerna observeras initialt, rekommenderas öka koncentrationen av proteinet ECM inom föregångare lösningen. Andra ECM proteiner kan användas istället för Fibronektin, inklusive olika typer av kollagen, laminin, eller en kombination därav. För varje ny cell, bör cell fastsättning optimeras före hydrogel mallning. Detta protokoll möjliggör också användardefinierade fotomasker. Baserat på önskat program, fotomasker kan produceras med olika har storlekar, former och övergripande mönster. Enhetlig immobilisering kan uppnås i avsaknad av en fotomask.
Detta protokoll har vissa begränsningar. Så framhävde i Representativa resultatär denna metod känsliga för mängden UV-ljus vid varje steg. Överexponering under hydrogel bildandet steg begränsar de tillgängliga akrylat grupperna för efterföljande ytan bioconjugation. Därför är ett viktigt steg i detta protokoll välskött UV ljus exponering gånger för varje steg. Detta protokoll kräver också, en hög koncentration protein lager för framgångsrika mallning. Låga koncentrationer av protein kommer att resultera i dålig yta mönster. Dessutom begränsar fotomasker också i att de bara kan producera diskret mönster. Mer komplexa mönster kan uppnås med liknande synsätt men kräver en mer avancerad metod.
Detta protokoll är betydande för befintliga metoder eftersom det ger en enkel metod för att justera substrat stelhet och protein mallning. Med hjälp av akrylat kemi för hydrogel bildandet möjliggör en magnitud rad substrat stelhet inom intervallet fysiologiska. Enkelt justera koncentrationen av PEGDA inom föregångare lösningen ger kontroll över hydrogel styvheten. Dessutom, användning av Klicka kemi för protein mallning möjliggör snabb konjugation mellan hydrogel substrat och thiolated modified protein. Detta är en nyckel design funktion, eftersom det tillåter detta protokoll tillämpas på alla protein eller peptid av intresse.
PEG hydrogeler är lovande biomaterial som kan användas för att utforska nya plattformar för att Visa biokemiska signaler till biologiska system. Om enhetlig yta immobilisering eller rumsligt särskilda mönster, dessa tekniker ger nya sätt att styra cell beteende. Framåt, kommer att främjande av biomaterial teknik ge nya insikter i cell beteende och ytterligare vår förmåga att sammanfatta i vivo signalering motiv inom in vitro- system. Detta kan vara fördelaktigt för stamcellers differentiering och modellering utvecklingsmässiga signalering inom kontrollerade experimentella system.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Denna studie stöddes främst av bidrag från den amerikanska hjärtat Association vetenskapsman utveckling Grant (12SDG12050083 att G.D.), National Institutes of Health (R21HL102773, R01HL118245 att G.D.) och National Science Foundation (Fortsättningssatsningen-1263455 och CBET-1350240 att G.D.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PEG-diacrylate (PEGDA) | Laysan Bio | ACRL-PEG-ACRL-3400 | Can also be synthesized or purchased through other venders. Different molecular weights can be used. |
| Lithium Phenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate (LAP) | Synthesized in lab | ||
| Fibronectin | Corning | 356008 | Other cell attachment proteins can be used, such as laminin, matrigel |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Sigma | D8537-500ML | |
| Photomask | FineLine Imaging | n/a | Custom prints on transparent sheets with high resolution DPI. |
| Binder Clips | Various Vendors | ||
| Compact UV Light Source (365nm) | UVP | UVP-21 | Other UV light sources can be used, calibration of power is required. |
| 2-iminothiolane (Pierce Traut’s Reagent) | Thermo Sci. | 26101 | |
| Ellman’s Reagent: DTNB; 5,5-dithio-bis(2-nitrobenzoic acid) | Thermo Sci. | 22582 | |
| human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) | Lonza | passage number between 6- 10 | |
| EGM-2 Media | Lonza | CC31-56, CC-3162 | EGM-2 without growth factors was used in experiments. Full EGM-2 media was used for cell maintainance |
| 0.25% Trypsin EDTA | Life Tech | 25200-056 | |
| Trypsin Neutralizer | Life Tech | R-002-100 | |
| Centrifuge | Various Venders | ||
| Hemocytometer | Hausser Sci. Bright-line | ||
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma Aldrich | E6758 | |
| 0.22µm filter | Cell Treat | 229743 | |
| 1mL Syringe | |||
| Glass Microscope Slides | Fisher Sci. | 12-550C | |
| Plastic spacers | Various Venders | 0.5mm thickness | |
| 70% Ethanol | BICCA | 2546.70-1 | |
| Bio-shield | Bio-shield | 19-150-0010 | |
| Bradford Reagent | BIO-RAD | ||
| Desalting Resin - Sephadex G-25 | GE Healthcare | 95016-754 | |
| Microspin Columns | Thermo Sci. | PI69725 | |
| AR-G2 rehometer | TA Instruments |
References
- Yao, S., et al. Co-effects of matrix low elasticity and aligned topography on stem cell neurogenic differentiation and rapid neurite outgrowth. Nanoscale. 8 (19), 10252-10265 (2016).
- Evans, N. D., et al. Substrate stiffness affects early differentiation events in embryonic stem cells. Eur Cells Mater. 18, 1-13 (2009).
- Ye, K., et al. Matrix Stiffness and Nanoscale Spatial Organization of Cell-Adhesive Ligands Direct Stem Cell Fate. Nano Lett. 15 (7), 4720-4729 (2015).
- Discher, D. E., Janmey, P., Wang, Y. L. Tissue cells feel and respond to the stiffness of their substrate. Science. 310 (5751), 1139-1143 (2005).
- Sridhar, B. V., Doyle, N. R., Randolph, M. A., Anseth, K. S. Covalently tethered TGF-beta1 with encapsulated chondrocytes in a PEG hydrogel system enhances extracellular matrix production. J Biomed Mater Res A. 102 (12), 4464-4472 (2014).
- Salinas, C. N., Anseth, K. S. Decorin moieties tethered into PEG networks induce chondrogenesis of human mesenchymal stem cells. J Biomed Mater Res A. 90 (2), 456-464 (2009).
- Joddar, B., Guy, A. T., Kamiguchi, H., Ito, Y. Spatial gradients of chemotropic factors from immobilized patterns to guide axonal growth and regeneration. Biomaterials. 34 (37), 9593-9601 (2013).
- Wylie, R. G., Ahsan, S., Aizawa, Y., Maxwell, K. L., Morshead, C. M., Shoichet, M. S. Spatially controlled simultaneous patterning of multiple growth factors in three-dimensional hydrogels. Nat Mater. 10 (10), 799-806 (2011).
- Tibbitt, M. W., Anseth, K. S. Hydrogels as extracellular matrix mimics for 3D cell culture. Biotechnol Bioeng. 103 (4), 655-663 (2009).
- Lutolf, M. P., Hubbell, J. A. Synthetic biomaterials as instructive extracellular microenvironments for morphogenesis in tissue engineering. Nat Biotechnol. 23 (1), 47-55 (2005).
- Saik, J. E., Gould, D. J., Keswani, A. H., Dickinson, M. E., West, J. L. Biomimetic hydrogels with immobilized ephrinA1 for therapeutic angiogenesis. Biomacromolecules. 12 (7), 2715-2722 (2011).
- McCall, J. D., Anseth, K. S. Thiol-ene photopolymerizations provide a facile method to encapsulate proteins and maintain their bioactivity. Biomacromolecules. 13 (8), 2410-2417 (2012).
- Fairbanks, B. D., Schwartz, M. P., Bowman, C. N., Anseth, K. S. Photoinitiated polymerization of PEG-diacrylate with lithium phenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate: polymerization rate and cytocompatibility. Biomaterials. 29 (6), 997-1003 (2009).
- Zuidema, J. M., Rivet, C. J., Gilbert, R. J., Morrison, F. A. A protocol for rheological characterization of hydrogels for tissue engineering strategies. J Biomed Mater Res B Appl Biomater. 102 (5), 1063-1073 (2014).
- Truat's Reagent Instructions. Thermo Scientific. , Available from: https://tools.thermofisher.com/content/sfs/.../MAN0011238_Trauts_Reag_UG.pdf (2017).
- Ellman's Reagent Instructions. Thermo Scientific. , Available from: https://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/MAN0011216_Ellmans_Reag_UG.pdf (2017).
- Desalting Columns. GE Life Sciences. , Available from: https://www.gelifesciences.com/gehcls_images/GELS/Related%20Content/Files/1478781880316/litdoc52130800_2016111034421.pdf (2017).
- Quick State Bradford Reagent Protein Assay, Instruction Manual. Bio-Rad. , Available from: http://www.bio-rad.com/webroot/web/pdf/lsr/literature/4110065A.pdf (2017).
