Summary
이 프로토콜은 방사형으로 이동하는 피질 뉴런의 직접 관찰에 대한 지침을 제공합니다. utero electroporation, organotypic 슬라이스 문화, 그리고 시간 경과 공 촛점 이미징은 결합 뉴런에 관심 유전자의 overexpression 또는 downregulation의 효과를 직접적이고 동적으로 연구하고 개발하는 동안 그들의 차별을 분석합니다.
Abstract
utero에서 electroporation은 마우스 배아를 개발하는 대뇌 피질의 방사형 이동 과정을 연구하는 빠르고 강력한 접근법입니다. 방사형 이동의 여러 단계를 설명하고이 과정을 제어하는 분자 메커니즘을 특성화하는 데 도움이되었습니다. 마이 그 레이션 뉴런을 직접 및 동적으로 분석하기 위해서는 시간이 지남에 따라 추적해야합니다. 이 프로토콜은 utero electroporation과 organotypic 슬라이스 문화와 시간 경과 공 촛점 이미징을 결합하여 방사형으로 이동하는 대뇌 피질 뉴런의 직접 검사와 동적 분석을 가능하게하는 워크 플로우를 설명합니다. 또한 이동 속도, 속도 프로파일, 방사형 방향 변경과 같은 이동하는 뉴런의 상세한 특성화가 가능합니다. 상기 방법은 방사성 이동하는 피질 뉴런에서 관심있는 유전자의 기능적 분석을 기능의 손실 및 획득뿐만 아니라 구조 실험에 의해 용이하게 수행 할 수있다. 저속마이 그 레이션 뉴런의 이미징은 한번 설립 된 뉴런 마이 그 레이션 장애의 마우스 모델에서 대뇌 피질의 개발을 연구하는 강력한 도구입니다 국가의 첨단 기술입니다.
Introduction
신피질은인지 기능, 감정적 기능, 감각 기능의 주요 부위입니다. 그것은 뇌의 표면에 평행 한 6 개의 수평 층으로 구성되어 있습니다. 개발 도중에 망원 뇌파의 외벽에있는 전구 세포는 돌기 표면을 향해 반경 방향으로 이동하여 층 유형별 신경 신원을 얻는 투사 뉴런을 발생시킵니다. 심실 / 뇌실 영역 (VZ / SVZ)에서 생성 된 후 이러한 뉴런은 일시적으로 다 극성이되어 이동을 느리게합니다. 중간 구역 (IZ)에서 잠시 머무른 후에 그들은 양극 형태로 전환하고, 방사상 glial 비계에 부착하고, 대뇌 피질 판 (CP)으로 반경 방향으로 이동을 계속합니다. 최종 목표 투영 뉴런에 도달하자 뉴런은 방사상 glial 프로세스에서 분리하고 레이어 고유의 신원을 획득합니다. 신경 이식의 여러 단계에 영향을 미치는 유전자의 돌연변이는 가려움증과 같은 심한 피질 기형을 유발할 수 있습니다에필 리 또는 백색질에 테로 토피아 1 , 2 .
utero에서 electroporation은 설치류 배아 3 , 4 의 개발 두뇌에서 신경 progenitor 세포를 transfect하는 빠르고 강력한 기술입니다. 이 기술을 사용하면 개발중인 뉴런에서 기능을 연구하기 위해 관심 유전자를 녹아웃 및 / 또는 과발현 할 수 있습니다. 이 방법은 형태 학적 세부 사항을 설명하고 방사상 이동 과정의 분자 메커니즘을 특성화하는 데 특히 도움이됩니다. 5 , 6 , 7 , 8 , 9 . 방사형으로 이동하는 뉴런은 시간이 지남에 따라 직접적이고 연속적인 관찰이 요구되는 이동성 방향뿐만 아니라 세포 형태, 이동 속도의 동적 변화를 겪습니다. Organotypic 슬라이스 cultuelectroporated 두뇌의 다시 및 저속 공 촛점 이미징은 시간이 지남에 마이 그 레이션 뉴런을 직접 관찰 할 수 있습니다. 이 결합 된 접근 방식을 사용하여 electroporated 두뇌의 고정 조직 섹션에서 조사 할 수없는 마이 그 레이션 뉴런의 독특한 기능을 분석하는 것이 가능합니다.
우리는 최근 electroporated 뇌의 슬라이스 배양에서 마이 그 레이션 뉴런의 저속 공 촛점 이미징을 적용하여 피질 발달 10 동안 전사 인자 B 세포 CLL / 림프종 11a (Bcl11a)의 역할을 연구했습니다. Bcl11a는 젊은 이동 피질 뉴런에서 표현되며 우리는 조건 변이 Bcl11a 대립 유전자 ( Bcl11a flox ) 11 을 사용하여 그 기능을 연구했습니다. Cre recombinase와 녹색 형광 단백질 (GFP)을 Bcl11a flox / flox 뇌의 피질 전구 세포에 일렉트로 포 레이션 ( electroporation) 하면 모자이크 돌연변이 현상이 생겼다 .그렇지 않으면 야생형 배경. 이 방법으로 Bcl11a의 세포 자율 기능을 단일 세포 수준에서 연구하는 것이 가능했습니다. 우리는 Bcl11a 돌연변이 뉴런이 마이 그 레이션 중에 속도 감소, 속도 프로파일의 변화, 무작위 적 방향 변화를 보이는 것을 발견했습니다 10 . 약술 된 프로토콜에서 우리는 마우스 뇌의 성공적인 electroporation과 슬라이스 문화 준비 12 워크 플로우뿐만 아니라 피질 슬라이스 문화의 시간 경과 공 촛점 이미징을 설명합니다.
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Protocol
모든 실험 절차는 동물 복지위원회 (Regierungspräsidium Tübingen)에 의해 승인되었으며 독일 동물 복지 법 (German Animal Welfare Act) 및 EU 지침 2010 / 63 / EU에 따라 수행되었습니다.
1. Utero Electroporation
- 미세 주입 바늘
- 박스 필라멘트 (2.5mm x 2.5mm)가있는 마이크로 피펫 풀러를 사용하여 붕규산 유리 모세관 (외경 : 1.0mm, 내경 : 0.58mm, 길이 : 100mm)을 미세 주입 바늘로 당겨 다음 프로그램 : 열처리 : 540, PULL : 125, VELOCITY : 20, DELAY : 140. RAMP 테스트 (HEAT 값 : RAMP + 25)를 수행하여 모든 개별 필라멘트의 HEAT 값을 결정합니다.
- 배아 일 (E) 13.5 이하에서 주사 할 때 팁 크기 20-30 μm를 얻기 위해 마이크로 그라인더 (microgrinder)를 사용하여 38 °의 각도로 높은 회전 속도의 중간에있는 베벨 바늘 및 구형 배아에서 주사 할 경우 30-40 μm단계. 보관을 위해서는 팁 손상을 방지하기 위해 모델링 점토로 상자 또는 페트리 접시에 바늘을 고정하십시오.
- 플라스미드 DNA 용액
- 제조 업체의 지침에 따라 endotoxin - 무료 맥시 준비 키트를 사용하여 형광 리포터 단백질 ( 예 : GFP)를 포함하는 플라스미드 DNA 구조를 준비합니다.
- 0.01 %의 최종 농도에서 패스트 그린을 함유하는 내 독소가없는 Tris-EDTA 완충액에서 1 - 2 μg / μL의 최종 농도로 플라스미드 DNA 용액을 희석한다. -20 ° C에서 나누어지는 솔루션 및 저장.
- 정균 염화 나트륨 용액
- 등용 0.9 % 염화나트륨 용액에 0.9 %의 최종 농도로 벤질 알코올을 첨가하여 정균 염화 나트륨 용액을 준비한다. 사용하기 전에 멸균 필터 솔루션.
- Carprofen 주입 솔루션
- carprofen 주입 솔루션을 준비멸균 된 등장 성 0.9 % 염화나트륨 용액에 0.5 mg / mL의 최종 농도로 카프로 펜을 첨가 하였다. 4 ° C에서 최대 28 일 동안 보관하십시오.
- 마취, DNA 주사 및 일렉트로 포 레이션
- E14.5 시간 임신 마우스의 무게를 달아 기화기에 연결된 투명한 마취 챔버에 넣고 5 % 이소 플루 란으로 포화시킵니다. 동물이 의식을 잃었을 때 37 ° C의 웜 플레이트에 부착 된 마취 마스크로 옮기고 1.8 - 2.2 % 이소 플라워로 마취를 유지하십시오.
참고 : 꼬리 핀치와 페달 반사 (발가락 핀치)의 손실로 수술 마취의 발달을 평가하십시오. - 진통제의 경우 마우스 체중 10mg (5mg / kg bodyweight) 당 carprofen 주사액 100 μL를 피하 주사하십시오. 다시 아래로 마우스를 돌려 건조에서 그들을 방지하기 위해 조심스럽게 석유 젤리로 눈을 덮으십시오.
- 부드럽게 팔다리를 펼쳐서 고정 시키십시오.외과 용 테이프가 달린 온난화 판에. 셀룰로오스 면봉을 사용하여 70 % 에탄올로 복부를 소독 한 다음 요오드 용액 (7.5 mg / mL)으로 소독합니다. 적절한 소독을 위해이 절차를 세 번 반복하십시오.
- 복부 절개를위한 밭 (직경 : 2 - 2.5cm)을 절개하기 위해 절개가 된 멸균 거즈로 복부를 덮으십시오. 세균 정 염화나트륨 용액으로 거즈를 적셔주십시오.
주의 : 페달 반사의 상실로 수술 마취의 발달을 재평가하십시오. - Micro Adson Forceps (톱니 모양, 길이 : 12cm) 및 미세한 가위 (옆으로 길게, 길이 : 9cm)를 사용하여 복부의 정중선을 따라 약 1.5cm의 피부를 자릅니다. Linea Alba를 따라 밑에있는 근육을 자릅니다.
- 링 집게 (길이 : 9cm, 외경 : 3mm, 내경 : 2.2mm)로 자궁 경적 하나를 제거하고 축축한 거즈 위에 부드럽게 놓습니다.
주의 사항 : 링 포셉으로 자궁 경적을 잡아주십시오.태반이나 공급 혈관에 혼란을주지 마십시오. 항상 세균성 염화 나트륨 용액으로 자궁을 촉촉하게 유지하십시오. - 조심스럽게 링 집게로 배아를 위치시키고 시상 부비동과 평행 한 초승달 모양의 그림자로 보이는 외측 뇌실을 찾습니다. 주사 부위는 색소 침착 된 안구와 시상 부비동의 합류점 사이의 선의 중간에 위치하며, 시상 부비동은 두 개의 횡 동맥으로 분지합니다. 자궁 벽과 측면 뇌실로 microinjection 바늘을 밀어.
참고 : 필요한 경우 바늘을 후퇴시켜 주입 깊이를 수정할 수 있습니다. - 풋 페달로 작동되는 마이크로 인젝터로 25 psi, 1 회 펄스 당 10-20 ms 및 5-10 펄스를 사용하여 1에서 2 μL의 DNA 용액을 측면 뇌실로 주입하십시오. 성공적인 주사는 심실 시스템을 채워야하는 유색의 DNA 용액으로 모니터링 할 수 있습니다.
- "양성"단자가 주입 된 뇌실과 같은면에 있고 "음극"단자가 삽입 된 뇌실과 같은면에 위치하도록 핀셋 형 전극 (E13.5 이하의 경우 직경 3mm, E14.5 이상인 경우 직경 5mm) 터미널은 배아 머리의 귀 아래에 주입 심실의 반대편에 있습니다.
- 일렉트로 포 레이션 사이트를 항균성 염화 나트륨 용액 몇 방울에 적신 다음 950ms 간격으로 50ms 지속 시간의 5 가지 전류 펄스 (E13.5 이하에서는 35V, E14.5 이상에서는 40V)를 적용하십시오.
참고 : 성공적인 electroporation을 위해서는 보통 60 ~ 90 mA의 전류로 충분합니다. 낮은 전류는 뉴런을 효율적으로 전달하지 못하지만 높은 전류는 배아의 죽음을 초래할 수 있습니다. - 자궁 경부의 모든 배아에 대해 절차 (단계 1.5.7. ~ 1.5.10.)를 반복하고 복강 내로 부드럽게 다시 넣으십시오.
- 다른 쪽에서 자궁 경적을 제거하고 proc을 반복하십시오.edure 1.5.7 단계에서 설명합니다. 1.5.11.
- 마이크로 Adson 집게, Mathieu 바늘 홀더 (텅스텐 카바이드, 길이 : 14cm) 및 비 흡수성 수술 봉합사 (3 / 8 원형, 13mm, 테이퍼 포인트)를 사용하여 피부를 봉합하기 전에 근육 층을 봉합하여 복강을 닫으십시오.
주의 : 봉합하는 동안 자궁이나 다른 장기를 포착하지 않도록주의하십시오. - 조심스럽게 요오드 용액 (7.5 mg / mL)으로 피부 봉합사를 소독하고 셀룰로오스 면봉을 사용하여 석유 젤리의 과립 과다를 부드럽게 제거합니다. 그것이 일어날 때까지 적외선 램프 아래에 마우스를 놓습니다. 다음 2 일 동안 마우스를 밀접하게 모니터하십시오. 12 ~ 24 시간 후 1.5.2 절에 설명 된대로 진통 치료를 반복합니다.
- E14.5 시간 임신 마우스의 무게를 달아 기화기에 연결된 투명한 마취 챔버에 넣고 5 % 이소 플루 란으로 포화시킵니다. 동물이 의식을 잃었을 때 37 ° C의 웜 플레이트에 부착 된 마취 마스크로 옮기고 1.8 - 2.2 % 이소 플라워로 마취를 유지하십시오.
2. Organotypic 조각 문화
- Laminin Stock Solution
- 1mg의 동결 건조 라미닌을 멸균 수에 용해시켜 1mg / mL 라미닌 스톡 용액을 얻는다. 50 μL 분취 량 준비-80 ° C에서 보관하십시오.
- 폴리 -L- 라이신 원료 솔루션
- 멸균 수에 폴리 -L- 라이신 50mg을 용해시켜 1mg / mL 폴리 -L- 라이신 스톡 용액을 얻는다. -20 ° C에서 0.5 ML aliquots과 저장을 준비합니다.
- 완벽한 행크의 균형 소금 솔루션 (완벽한 HBSS)
- 10x HBSS 용액 50mL, 1M HEPES 완충액 (pH 7.4) 1.25mL, 1M D- 글루코오스 용액 15mL, 100mM 염화칼슘 용액 5mL, 100mM 황산 마그네슘 5mL 1 M 탄산 수소 나트륨 용액 2 mL를 넣는다. 0.5L의 멸균 수를 멸균 필터에 넣고 4 ° C에서 보관하십시오.
- 슬라이스 문화 매체
- 기본 중 독수리 (BME) 35 mL, 완전한 HBSS (2.3.1 절 참조), 1M D- 글루코스 1.35 mL, 200 mM L- 글루타민 0.25 mL 및 페니실린 - 스트렙토 마이신 0.5 mL를 슬라이스 배양액 50 mL를 얻는다.매질. 무균 여과기에 말 혈청을 최종 농도가 5 %가되도록 첨가합니다. 4 ° C에서 4 주 동안 보관하십시오.
- 저 융점 (LMP) 아가로 오스 솔루션
- LMP 아가로 오스 1.5g을 50mL의 완전한 HBSS에 용해시켜 중력에서 1 ~ 2 분간 전자 렌지로 가열하여 3 % LMP 아가 로스 용액을 준비한다.
참고 : 끓는 동안 넘치지 않도록 열을주의 깊게 모니터링하십시오. - 사용할 준비가 될 때까지 38 ° C의 수조에 용액을 놓습니다. 4 ° C에서 보관하고 한 번 재사용하십시오.
- LMP 아가로 오스 1.5g을 50mL의 완전한 HBSS에 용해시켜 중력에서 1 ~ 2 분간 전자 렌지로 가열하여 3 % LMP 아가 로스 용액을 준비한다.
- 멤브레인 삽입물 코팅
- 라미닌 스톡 용액 (단계 2.1.1 참조)과 폴리 -L- 라이신 스톡 용액 (단계 2.2.1 참조)의 한 분취 량을 6 mL의 멸균 수에 첨가하여 코팅 용액을 얻습니다 (6 개 삽입에 충분 함) .
- 각 우물 바닥에 2 ML의 멸균 물이 들어있는 6 잘 접시에 멤브레인 인서트를 놓습니다. 코팅액 1 mL를 넣고(2.6.1 단계 참조)를 각 막 위에 올려 놓고 37 ° C와 5 % 이산화탄소 대기에서 밤새 배양한다.
참고 : 폴리 테트라 플루오르 에틸렌 (PTFE) 멤브레인과 같은 광학적으로 투명한 멤브레인이있는 인서트 만 사용하십시오. - 1mL의 멸균 수로 막을 3 번 씻고 건조시킨다. 같은 날에 코팅 된 멤브레인을 사용하거나 4 ℃에서 깨끗한 6-well plate에 4 주 동안 보관하십시오.
- 뇌 절개 및 삽입
- electroporation 2 일 후 기화기에 연결된 투명 챔버에 마우스를 넣고 5 % isoflurane으로 포화. 동물이 의식을 잃었을 때, 동물을 체임버에서 꺼내어 자궁 경관 탈구로 희생 시키십시오.
- 배아를 포함하는 자궁을 제거하고 얼음처럼 차가운 완전한 HBSS와 10cm 페트리 접시에 넣습니다.
참고 :이 시점부터 모든 용액, 배아 및 뇌를 얼음에 보관하십시오. - 입체 현미경을 사용하여 미세하게 기울어 진 집게 (직선,11 cm)와 한 쌍의 Vannas Tübingen Spring Scissors (각진, 길이 : 9.5 cm)로 각 배아를 자궁과 분리하고 얼음으로 찬 완전한 HBSS가 들어있는 다른 배양 접시로 옮깁니다.
- 뇌 줄기의 수준에서 절개를 만들고 시상 정중선을 따라 자릅니다. 뇌를 덮고있는 피부와 연골을 껍질을 벗기십시오. 그런 다음 뇌 반구 바로 뒤의 뇌간을 잘라 내고 두개골에서 뇌를 제거하십시오. ice-cold complete HBSS가 들어있는 12-well plate에 micro-spoon spatula (185mm x 5mm)로 뇌를 옮긴다. 12 - 웰 플레이트에있는 쓰레기에서 모든 두뇌를 수집합니다.
- 형광 현미경을 사용하여 electroporated 지역의 크기뿐만 아니라 형광 밝기에 대한 12 - 웰 플레이트의 두뇌를 검사하십시오. 추가 처리를 위해 추정 체세포 감각 피질에서 밝은 형광 신호가있는 2 ~ 4 개의 뇌를 선택하십시오.
- 38 ° C에서 3 % LMP 아가로 오스 솔루션을 부어 껍질을 벗기는 일회용 임베딩 금형에 넣으십시오. 리메이크전자 두뇌와 마이크로 숟가락 주걱으로 신중하게 티슈 페이퍼를 사용하여 뇌 주위에 과도한 완전한 HBSS를 배수구.
- 두뇌를 아가로 오스 용액에 부드럽게 넣고 금형 바닥으로 밀어 넣고 20 게이지 바늘로 조심스럽게 위치를 조정합니다. 코로나 섹션의 경우, 위쪽을 향한 후각 구근과 함께 두뇌 방향을 맞 춥니 다. 아가로 오스 용액이 고형화 될 때까지 금형을 얼음에 보관하고 두뇌를 절개하십시오.
- Vibratome 단면 및 슬라이스 문화
- 곰팡이에서 아가로 오스 블록을 제거하고 멸균 페트리 접시의 뚜껑에 놓습니다. 후각 구배 아래 약 2 ~ 3mm, 다른면의 아가로 오스 1mm를 남겨 놓은 깨끗한 면도날로 여분의 아가로 오스를 제거하십시오. 후각 구근이 시아 노 아크릴 레이트 접착제를 사용하여 시험편 스테이지 아래쪽을 가리키는 트리밍 된 아가로 오스 블록을 고정하십시오.
참고 : 70 % 에타 노 장비 및 장비 소독l 절개하기 전에. - 얼음처럼 차가운 완전한 HBSS를 포함하는 진동 블레이드 마이크로톰의 슬라이싱 챔버로 시험편 스테이지를 옮기고, 블레이드를 향해 등쪽으로 두뇌를 위치시킨다. 0.9mm의 낮은 진폭과 중간 진폭의 electroporated 영역과 0.09-0.12mm / s의 매우 느린 섹션 속도를 포함하는 250um 두께의 뇌 조각을 자르십시오. 대개 밝은 형광 신호가있는 4 ~ 6 조각이 성공적으로 일렉트로 포 레이션 된 뇌에서 얻어집니다.
- 구부러진 마이크로 숟가락 주걱과 미세 팁 집게로 주위 아가로 오스와 함께 뇌 조각을 얼음처럼 차가운 완전한 HBSS가 들어있는 6 웰 플레이트로 조심스럽게 옮깁니다.
주의 : 전달하는 동안 집게가있는 부분 주위의 아가로 오스 테두리 만 만져서 뇌 조직을 손상시키지 않도록주의하십시오. - 2.8.1 단계에서 설명한대로 선택된 모든 뇌를 처리하십시오. 2.8.3.
- 뇌 H1을 놓기 전에 멤브레인 인서트에 100 μL의 HBSS를 적 십니다슬라이스의 위치를 용이하게하기 위해 막 상에 배치된다. 1 개의 멤브레인 인서트에 최대 5 개의 슬라이스를 놓을 수 있습니다.
- 조심스럽게 구부러진 마이크로 숟가락 주걱과 미세 팁을 사용하여 막 위에 슬라이스를 옮깁니다. 부드럽게 포 퓰린으로 아가로 오스 테두리 만 만져 주걱에 슬라이스를 당겨 부드럽게 막에 주걱에서 슬라이스를 밀어. 포셉을 사용하여 슬라이스를 배치하고 나머지 슬라이스를 계속 전송하십시오. 과량의 완전한 HBSS를 피펫으로 제거하십시오.
주 : 조각을 서로 겹치지 마십시오. - 겸자의 도움으로 조심스럽게 슬라이스 배양 매체 (단계 2.4.1 참조)의 1.8 ML을 포함하는 6 잘 접시에 조각과 함께 멤브레인 인서트를 배치하고 저속까지 37 ° C와 5 % 이산화탄소 대기에서 품어 이미징.
- 곰팡이에서 아가로 오스 블록을 제거하고 멸균 페트리 접시의 뚜껑에 놓습니다. 후각 구배 아래 약 2 ~ 3mm, 다른면의 아가로 오스 1mm를 남겨 놓은 깨끗한 면도날로 여분의 아가로 오스를 제거하십시오. 후각 구근이 시아 노 아크릴 레이트 접착제를 사용하여 시험편 스테이지 아래쪽을 가리키는 트리밍 된 아가로 오스 블록을 고정하십시오.
3. 시간 경과 영상
- 현미경 설정
- 기후 챔버를 무대 위에 놓습니다.반전 공 촛점 현미경으로 37 ° C 및 5 % 이산화탄소 대기로 옮겼습니다. 하이브리드 검출기를 사용하여 레이저 강도를 줄이고 세포 생존 능력을 향상시킵니다. 자세한 분석을 위해 0.6 이상의 개구 수를 가진 40X 건식 대물 렌즈를 사용하십시오.
참고 : 현미경의 모든 구성 요소는 이미징 프로세스 중에 안정적인 초점을 제공하기 위해 이미징 전에 2 ~ 3 시간 동안 37 ° C로 예열해야합니다.
- 기후 챔버를 무대 위에 놓습니다.반전 공 촛점 현미경으로 37 ° C 및 5 % 이산화탄소 대기로 옮겼습니다. 하이브리드 검출기를 사용하여 레이저 강도를 줄이고 세포 생존 능력을 향상시킵니다. 자세한 분석을 위해 0.6 이상의 개구 수를 가진 40X 건식 대물 렌즈를 사용하십시오.
- 슬라이스 이미징
- 거꾸로 형광 현미경을 사용하여 멤브레인 인서트를 포함하는 6 - 웰 플레이트에서 이미징을위한 뇌 조각을 선택합니다.
주의 : 자외선에 대한 노출 시간을 길게하지 마십시오. 이로 인해 세포가 손상 될 수 있습니다.
참고 : 상단 SVZ의 밝은 싱글 뉴런이있는 슬라이스를 슬라이스의 pial 표면쪽으로 반경 방향으로 이동합니다. 전체 CP를 가로 지르는 방사형 glial 세포의 미세 형광 과정은 손상되지 않은 방사상 glial scaffold를 나타냅니다.d는 반경 방향으로 피질 뉴런을 이동시킨다. - 포셉의 도움으로 슬라이스 문화 매체의 2 ML을 포함하는 50mm 직경 유리 바닥 접시에 시간 저속 이미징을 위해 선택된 슬라이스와 멤브레인 삽입을 전송합니다. 공 촛점 현미경의 기후 챔버에 접시를 놓습니다.
- 해상도를 512 x 512 픽셀로 설정하고 스캔 속도를 400 Hz에서 700 Hz로 높이면 프레임 속도가 초당 약 1.4에서 약 2.5 프레임으로 증가합니다. 평균을 두 번 이상 사용하지 마십시오. 1.5 μm의 스텝 크기로 electroporated 영역 (일반적으로 400-100 μm의)을 통해 z - 스택을 정의합니다. 총체적으로,이 설정은 이미지의 충분한 해상도와 밝기를 허용하는 반면 수집 중에는 광 손상을 낮게 유지합니다. 30 분마다 z- 스택을 사용하여 저속 시리즈를 시작하십시오.
참고 : 슬라이스가 레이저 광선에 장시간 노출되면 광 손상이 생기고 세포의 생존 가능성이 감소합니다. 특급 조정이에 따라 레이저 광에 대한 충분한 시간. - ImageJ 소프트웨어 (https://imagej.nih.gov/iij/) 또는 이에 상응하는 도구를 사용하여 시간 경과 시리즈를 분석하십시오.
- 거꾸로 형광 현미경을 사용하여 멤브레인 인서트를 포함하는 6 - 웰 플레이트에서 이미징을위한 뇌 조각을 선택합니다.
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Representative Results
이전에는 자궁 전기에 의해 Bcl11a 유전자 결실 늦게 태어난 상층 뉴런 프로젝션 (10)의 반경 방향 이동을 손상시키는 것으로 나타났다. Cre 호텔-IRES-GFP DNA를 함유하는 플라스미드 벡터의 전기 효율적 flox / flox 뇌 11 조건부 Bcl11a에 Bcl11a 삭제. 우리가 electroporation 3 일 후에 E14.5 electroporated 뇌를 분석하면, 대부분의 제어 뉴런은 CP로 마이 그 레이션했지만, 많은 Bcl11a 돌연변이 뉴런은 IZ와 VZ / SVZ의 이동 경로를 따라 정지했다. 또한, 우리는 특히 편광 (10)의 결함을 제시 Bcl11a 삭제시 IZ의 바이폴라 전지의 비용 다극 세포 수의 증가를 발견 하였다.
직접적으로 동적으로 migra를 분석하려면Bcl11a 돌연변이 뉴런의 돌연변이 행동 우리는 electroporated 뇌에서 준비 organotypic 슬라이스 문화에 마이 그 레이션 뉴런의 저속 공 촛점 이미징을 사용했습니다. Numeric aperture가 0.4 인 10X 대물 렌즈를 사용하여 전체 시간 경과 시리즈가 Bcl11a 돌연변이 투영 뉴런에 방사상 이동에 결함이 있다는 결과가 확인되었습니다. 36 시간 내에 많은 조절 뉴런이 CP로 이동했지만, 단지 소수의 Bcl11a 돌연변이 뉴런 만이 IZ를 떠나 CP로 이동했다. 흥미롭게도, 많은 Bcl11α 돌연변이 뉴런은 뇌의 신경 이완 표면으로 직접 이동하지는 않았지만, 이동이 느려지고 접선 방향으로 또는 심지어 심실쪽으로 되돌아가는 것으로 보였습니다 (영화 1). 이 결과를 더 자세히 분석하기 위해 40 배의 대물 렌즈와 0.6의 개구 수를 사용하여 더 높은 배율로 시간 경과 시리즈를 만들었습니다. 우리의 데이터는 Bcl11a 돌연변이 뉴런이 효율적으로 분극화되지 않고 방사상으로 이동하는 미주이온을 CP로 주입한다. 12 시간 이내에 많은 Bcl11a 돌연변이 뉴런은 다 극성 형태에서 양극성 형태로 전환하지 못하고 대신 많은 과정을 주변 환경으로 투사하고 집어 넣었습니다 (Movie 2, 그림 1A ).
또한, 우리는 다른 시간 경과 시리즈에서 개별 뉴런의 마이 그 레이션 경로를 추적하고 마이 그 레이션 뉴런의 특정 매개 변수를 계산하는 데 사용. 우리는 Bcl11a 돌연변이 뉴런이 이동 속도와 무작위적인 방향 변화 (영화 3; 그림 1B , 빨간색 화살촉) 감소와 함께 몇 시간의 단계를 반복적으로 거친다는 것을 발견했습니다. 특히, Bcl11a 돌연변이 뉴런의 속도 프로필은 제어 뉴런 ( 그림 1C )과 비교하여 더 높은 속도 (25 μm / h)에서 더 낮은 속도 (5 μm / h)로 이동되었습니다. 이에 따라 Bcl11 의 전반적인 이동 속도돌연변이 뉴론은 대조군에서 10.34 ± 0.34 μm / h에서 6 ± 0.54 μm / h로 유의하게 감소 하였다 (p = 2.4889E-05) ( 그림 1D ). 마지막으로, 뇌의 pial 표면쪽으로 직접 이동으로부터의 편차는 대조군에서 17.15 ± 2.13 °에서 Bcl11a 돌연변이 뉴런에서 40.16 ± 4.42 °로 유의하게 증가 하였다 (p = 0.0002) ( 그림 1E ). 함께 이러한 결과는 organotypic 슬라이스 문화에 GFP electroporated 뉴런의 저속 공 촛점 이미징은 연결의 과정을 제어하는 분자 메커니즘을 연구하는 가치있는 방법임을 보여줍니다 마이 그 레이션.
영화 1 : 대뇌 피질 조각의 Bcl11a 돌연변이 뉴런과 비교하여 GFP 라벨 대조군의 이전. Bcl11a flox / flox 뇌를 일렉트로 포 레이션E14.5를 IRES-GFP (A) 또는 Cre-IRES-GFP (B)를 포함하는 플라스미드 벡터로 절단하고 슬라이스 배양 물을 E16.5에서 제조 하였다. VZ / SVZ; 심실 / 뇌실 영역; IZ, 중간 구역; CP, 피질 판. 스케일 바 = 100 μm. 영화는 5 프레임 / 초의 속도로 108 프레임으로 구성됩니다. Wiegreffe 외. 에서 증쇄 . Elsevier의 허락하에 10 . 이 비디오를 보려면 여기를 클릭하십시오. (마우스 오른쪽 버튼을 클릭하여 다운로드하십시오.)
영화 2 : 대뇌 피질 조각의 Bcl11a 돌연변이 뉴런과 비교하여 GFP 표지 컨트롤의 양극화. Bcl11a flox / flox 뇌를 E14.5에서 IRES-GFP (A) 또는 Cre-IRES-GFP (B)를 함유하는 플라스미드 벡터로 전기 천공시키고 배양 배지 E16.5에서 준비되었다. 눈금 막대 = 10 μm. 영화는 5 프레임 / 초의 속도로 25 프레임으로 구성됩니다. Wiegreffe 외. 에서 증쇄 . Elsevier의 허락하에 10 . 이 비디오를 보려면 여기를 클릭하십시오. (마우스 오른쪽 버튼을 클릭하여 다운로드하십시오.)
영화 3 : 대표적인 컨트롤과 Bcl11a 돌연변이 뉴런의 1 시간 간격 해상도 애니메이션 트레이스. 미량의 이동 뉴런은 IRES-GFP ( A ) 또는 Cre-IRES-GFP ( B )를 함유하는 플라스미드 벡터로 E14.5에서 일렉트로 포 레이션 된 Bcl11a flox / flox 뇌의 E16.5 슬라이스 배양 물의 시간 경과 시리즈로부터 얻어졌다. . 스케일 바 = 20 μm. Wiegreffe 외. 에서 증쇄 .Elsevier의 허락하에 10 세 이상. 이 비디오를 보려면 여기를 클릭하십시오. (마우스 오른쪽 버튼을 클릭하여 다운로드하십시오.)
그림 1 : Bcl11a 돌연변이 상피층 피질 뉴런의 이동 거동.
( A ) 12 시간의 총 이미징 기간 동안 Cre - IRES - GFP 또는 제어 벡터 중 하나와 E14.5에서 electroporated Bcl11a flox / flox 두뇌에서 E16.5 조각 문화에서 마이 그 레이션 GFP 양성 뉴런의 대표 이미지. ( B ) Cre - IRES - GFP 또는 총 이미징 기간 동안 제어 벡터와 E14.5에서 electroporated Bcl11a flox / flox 두뇌에서 E16.5 슬라이스 문화에서 마이 그 레이션 GFP 양성 뉴런의 1 시간 간격 해상도와 대표적인 흔적최대 22 시간. Bcl11a 돌연변이 뉴런은 빈번하게 감소 된 이동 속도 및 무작위로 변화된 배향 (빨간색 화살촉으로 표시)의 반복 단계를 거친다. ( C ) B. ( DE )에서 보인 바와 같이 미주 신경의 흔적에서 계산 된 속도 프로필 Bcl11a flox / flox의 E16.5 슬라이스 배양에서 이동하는 GFP 양성 뉴런의 속도 ( D ) 및 방사 방향에서 벗어난 각도 ( E ) Cre-IRES-GFP 또는 대조군 벡터 (n = 15)로 E14.5에서 일렉트로 포 레이션 된 뇌. 평균 ± SEM; 학생의 t 테스트; *** p <0.001. 눈금 막대 = 10 μm. Wiegreffe 외. 에서 증쇄 . Elsevier의 허락하에 10 . 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
방사상 이동은 신 코르 텍스 개발에서 중요한 과정입니다. 이 과정의 여러 단계에 영향을 미치는 유전자의 돌연변이는 열상과 백질 이형성증을 비롯한 심한 피질 기형을 유발할 수 있습니다 1 , 2 . 최근 우리는 젊은 이동 피질 투영 뉴런에서 발현되는 Bcl11a가 방사상 이동에 역할을한다는 것을 보여주었습니다. 우리는 electroporated 뇌의 급성 피질 조각에서 마이 그 레이션 뉴런의 시간 경과 공 촛점 이미징 마이 그 레이션 뉴런에 Bcl11a의 유전자 삭제 편광 및 마이 그 레이션 결함을 일으키는 직접 증명하기 위해 사용. 저속 직렬 개별 뉴런의 이동 경로를 추적하고, 뉴런 마이그레이션 속도 프로파일, 평균 이동 속도 및 방향 이동성 10 등의 특정 파라미터를 계산하는데 사용 하였다.
이 프로토콜은 분자를 연구 할 때 중요한 접근법을 설명합니다.r 반경 방향 이동 메커니즘. 짧은 hairpin RNA 또는 DNA 발현 플라스미드를 사용함으로써, 거의 모든 관심있는 유전자가 녹아웃되거나 과발현 될 수 있습니다. Cre-LoxP 시스템과 일렉트로 포 레이션을 결합하는 강력한 접근법입니다. Cre recombinase로 조건 돌연변이 ( "floxed") 마우스의 뇌를 형질 전환하면 모자이크 돌연변이 현상이 발생하고 야생형 세포로 둘러싸인 단일 돌연변이 뉴런의 선택적 분석이 가능합니다. 이러한 방식으로, 이동하는 뉴런의 세포 자율적 인 분자 메커니즘을 조사 할 수 있습니다. 또한, 기능 구조 실험이 쉽게 수행됩니다. electroporated 뇌 조각의 저속 시리즈를 준비 동적으로 고정 된 두뇌 섹션에서 얻을 수있는 것보다 훨씬 더 많은 정보를 제공하는 단일 마이 그 레이션 뉴런의 철학 행동을 분석 할 수 있습니다. utero electroporation 3 , 4 에는 초기 훈련이 필요하지만 일단 숙달되면생체 내 에서 대뇌 피질의 뉴런을 재현 가능하게 트랜 스펙 션하는 신속하고 간단한 기술. 여기에 설명 된 프로토콜에서 우리는 후기 태어난 상층 신 피질 투영 뉴런이 태어날 때 E14.5 에서 utero electroporation에 사용 했습니다 . utero electroporation 에서 조기 태어난 깊은 레이어 투사 뉴런 에 대한 연구는 초기 발달 단계 ( 예 : E12.5) 13에서 수행되어야 합니다. 원칙적으로 프로토콜은 또한 interneurons 14 및 소뇌 과립 세포 15의 마이 그 레이션을 포함한 electroporation로 transfected 수있는 뇌의 다른 연결 subpopulations의 마이 그 레이션을 연구하는 데 사용할 수 있습니다.
우리가 기술 한 슬라이스 배양 프로토콜은 Polleux와 Gosh 12 에서 적응 시켰고, 이전에 우리는 ex utero electroporation 16 , 17 에서 stu로 사용했습니다dy hippocampal development. 가장 중요한 것은 뇌 조각은 생존력을 유지하기 위해 절차 전반에 걸쳐 조심스럽게 다루어 져야한다는 것입니다. 우리는 거꾸로 현미경과 광학 품질 유리 바닥 요리를 이미지를 사용하여 세포 배양 물 삽입에 휴식 슬라이스 문화. 이 구성은 설치가 매우 쉽고 목적이 슬라이스 배양 물 또는 배지와 접촉하지 않기 때문에 무균 조건을 허용합니다. 그러나 충분히 높은 개구 수 (0.6 이상)의 긴 작업 거리 대물 렌즈 (> 2mm)가 필요합니다. 다른 연구에서는 뇌 바닥을 유리 바닥에 직접 놓은 다음 콜라겐 매트릭스 18 , 19 를 사용하여 슬라이스를 제자리에 고정 시켰습니다. 이로 인해 가능한 짧은 작동 거리의 목표를 사용할 수있게되었습니다. 그러나 세포 배양 물 삽입물을 사용하면 취급이 쉽고 재현성있는 결과를 얻을 수 있으며 연구자는 준비가 완료된 후 1 ~ 2 일 후에도 공동없이두뇌 슬라이스의 생존력을 약화시킨다 (데이터는 표시되지 않음). 또 다른 중요한 문제는 레이저 빛에 의한 조각 손상에 관한 것입니다. 우리는 고감도의 하이브리드 검출기를 사용하여 저조도 이미징을위한 충분한 형광 신호를 얻는 동시에 레이저 출력을 최소한으로 줄일 수있었습니다. 다 광자 이미징을 사용하면 광합성 현미경과 비교하여 광 손상을 더 줄일 수 있으며 조직 침투는 물론 효율적인 광 검출이 가능합니다.
뉴런의 이동을 연구하는 유용성에도 불구하고 프로토콜에는 한계가 있으며 손상되지 않은 뇌에서 뉴런을 이동시키는 상황을 완전히 보존 할 수는 없습니다. 세포 외 기질, 접착 세포 간 접촉 및 이동성 구역 내의 혈관계는 반경 방향으로 이동하는 뉴런에 동적으로 영향을 줄 수 있습니다 20 , 21 . 구체적으로, 상층 뉴런은이주 22 . 성공적인 이미징을 위해서는 GFP electroporated 방사형 glial 세포와 함께 두뇌 조각을 선택하는 것이 중요합니다 그 전체 대뇌 피질의 폭을 통해 자신의 프로세스를 확장합니다. 방사형 glial 발판이 뇌의 pial 표면에 도달하기 전에 차단 된 'Oblique slices'는 추가 분석에서 폐기해야합니다. 때로는 샘플이 더 깊은 영역으로 이미지 획득을 제한하는 두뇌 슬라이스의 공기 표면에서 세포 죽음이 발생할 수 있습니다. 배양 된 뇌 조각에서 electroporated 뉴런 은 생체 내 electroporated 뉴런 에 비해 덜 효율적으로 마이 그 레이션 수 있습니다 준비에서 불충 분한 회복으로 인해 발생할 수 있습니다. 이것은 실험 및 제어 상황 모두에 대한 여러 슬라이스 문화 분석과 대표 데이터 세트의 중요한 해석이 필요합니다. 어떤 경우에는 utero electroporation과 관련된 모욕은 배아 사망 또는 구조 alterat 발생할 수 있습니다확장 된 심실, 비대칭 적으로 얇아진 피질 또는 DNA 주입으로 인한 신경 교뇌 흉터 형성을 포함하는 뇌의 이온. 이 경우 샘플은 추가 분석에서 폐기해야합니다.
배아 기증자의 뇌 조각은 멤브레인 삽입물 23 에서 잘 살아 나지 만, 분석은 신경 세포 이동을 포함하여 초기 발생 발달에 국한되며, 수상 돌기 발달이나 시냅스 생성과 같은 이후의 사건을 연구하는 데 사용하지 않았습니다. 요약하면, 우리는 신경 발달 장애와 관련된 유전자의 기능을 쉽게 분석 할 수있는 슬라이스 배양에서 일렉트로 포 레이션 (electroporated) 뉴런의 신경 세포 이동을 직접적으로 그리고 동적으로 연구하기위한 상세한 프로토콜을 제공한다.
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없습니다.
Acknowledgments
우리는 Jacqueline Andratschke, Elena Werle, Sachi Takenaka 및 Matthias Toberer에게 훌륭한 기술 지원과 Victor Tarabykin에게 도움이되는 토론에 대해 감사드립니다. 이 연구는 도이체 Forschungsgemeinschaft의 SB (BR-2215)에 대한 지원으로 지원되었습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| isoflurane | Abbott Laboratories | 506949 | Forene |
| 6-well plate | Corning | 351146 | |
| 12-well plate | Corning | 351143 | |
| non-absorbable surgical suture | Ethicon | K890H | 3/8 circle, 13 mm, taper point |
| Micro Adson Forceps | Fine Science Tools | 11018-12 | serrated, length: 12 cm |
| fine scissors | Fine Science Tools | 14063-09 | angled to side, length: 9 cm |
| Mathieu Needle Holder | Fine Science Tools | 12510-14 | tungsten carbide, length: 14 cm |
| fine tipped forceps | Fine Science Tools | 11370-40 | straight, 11 cm |
| Vannas Tübingen Spring Scissors | Fine Science Tools | 15005-08 | angled up, 9.5 cm |
| ring forceps | Fine Science Tools | 11103-09 | OD: 3mm, ID, 2.2 mm, length: 9 cm |
| HBSS (10X) | Gibco | 14180046 | |
| L-Glutamine | Gibco | 25030081 | |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15140122 | |
| horse serum | Gibco | 26050088 | |
| BME | Gibco | 41010026 | |
| borosilicate glass capillaries | Harvard Apparatus | 30-0016 | 1.0 OD x 0.58 ID x 100 L mm |
| anesthsesia system | Harvard Apparaus | 72-6471 | |
| anesthetizing chamber | Harvard Apparaus | 34-0460 | |
| fluosorber filter canister | Harvard Apparaus | 34-0415 | |
| low melting point agarose | Invitrogen | 16520100 | |
| vibrating blade microtome | Leica | VT1200 S | |
| fluorescence stereo microscope | Leica | M205 FA | |
| stereo microscope | Leica | M125 | |
| inverted fluorescence tissue culture microscope | Leica | DM IL LED | |
| confocal laser scanning microscope | Leica | TCS SP5II | |
| hybrid detector | Leica | HyD | |
| objective, 40x/0.60 NA | Leica | 11506201 | |
| microscope temperature control system | Life Imaging Services | Cube, Brick & Box | |
| cell culture insert | Millipore | PICM0RG50 | |
| microgrinder | Narishige | EG-45 | use 38° angle for beveling |
| microinjector | Parker Hannifin | 052-0500-900 | Picospritzer III |
| carprofen | Pfizer Animal Health | NDC 61106-8507 | Rimadyl |
| emdedding mold | Polysciences | 18986-1 | |
| endotoxin-free plasmid maxi kit | Qiagen | 12362 | |
| fast green | Sigma | F7252 | |
| laminin | Sigma | L2020 | |
| poly-L-lysine | Sigma | P5899 | |
| HEPES | Sigma | H4034 | |
| D-glucose | Sigma | G6152 | |
| calcium chloride | Sigma | C7902 | |
| magensium sulfate | Sigma | M2643 | |
| sodium bicarbonate | Sigma | S6297 | |
| square wave electroporator | Sonidel | CUY21EDIT | |
| tweezers with 5 mm platinum disk electrodes | Sonidel | CUY650P5 | |
| micropipette puller | Sutter Instrument | P-97 | |
| box filament | Sutter Instrument | FB255B | 2.5 mm x 2.5 mm |
| micro-spoon spatula | VWR | 231-0191 | 185 mm x 5 mm |
| glass bottom dish, 50 mm | World Precision Instruments | FD5040-100 |
References
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