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Neuroscience

Time-lapse Imágenes confocales de las neuronas migratorias en la cultura organotípica en rebanadas de cerebro de ratón embrionario Published: July 25, 2017 doi: 10.3791/55886
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Institute of Molecular and Cellular Anatomy, Ulm University

Summary

Este protocolo proporciona instrucciones para la observación directa de neuronas corticales que migran radialmente. La electroporación in utero , el cultivo de corte organotípico y la formación de imágenes confocales en intervalos de tiempo se combinan para estudiar directa y dinámicamente los efectos de la sobreexpresión o regulación negativa de genes de interés en las neuronas que migran y para analizar su diferenciación durante el desarrollo.

Abstract

La electroporación in utero es un enfoque rápido y poderoso para estudiar el proceso de migración radial en la corteza cerebral de los embriones de ratón en desarrollo. Ha ayudado a describir los diferentes pasos de la migración radial y caracterizar los mecanismos moleculares que controlan este proceso. Para analizar directa y dinámicamente las neuronas migratorias tienen que ser rastreadas con el tiempo. Este protocolo describe un flujo de trabajo que combina la electroporación in utero con cultivo de corte organotípico y confocal de tiempo transcurrido, lo que permite un examen directo y análisis dinámico de las neuronas corticales que migran radialmente. Además, es posible la caracterización detallada de las neuronas migratorias, como la velocidad de migración, los perfiles de velocidad, así como los cambios de orientación radial. El método puede adaptarse fácilmente para realizar análisis funcionales de genes de interés en neuronas corticales de migración radial por pérdida y ganancia de función así como experimentos de rescate. Lapso de tiempoLa formación de imágenes de las neuronas migratorias es una técnica del estado de la técnica que una vez establecida es una potente herramienta para estudiar el desarrollo de la corteza cerebral en modelos de ratón de trastornos de migración neuronal.

Introduction

El neocórtex es el sitio principal de funciones cognitivas, emocionales y sensoriomotoras. Se compone de seis capas horizontales orientadas en paralelo a la superficie del cerebro. Durante el desarrollo, las células progenitoras en la pared lateral del telencéfalo dorsal dan lugar a neuronas de proyección que migran radialmente hacia la superficie pial y adquieren una identidad neuronal específica del tipo de capa. Después de ser generadas en las zonas ventriculares / subventriculares (VZ / SVZ) estas neuronas se vuelven transitoriamente multipolar y retardan su migración. Después de una corta estancia en la zona intermedia (IZ) cambian a una morfología bipolar, se adhieren al andamio glial radial, y continúan la migración orientada radialmente hacia la placa cortical (CP). Al alcanzar su objetivo final, las neuronas se separan de los procesos radiales de la glía y adquieren una identidad específica de la capa. Las mutaciones en los genes que afectan a diferentes etapas de la migración neuronal pueden causar malformaciones corticales graves, tales como lissencEferencia o heterotopía de la materia blanca 1 , 2 .

La electroporación in utero es una técnica rápida y potente para transfectar células progenitoras neurales en el cerebro en desarrollo de embriones de roedores 3 , 4 . Con esta técnica es posible desmontar y / o sobreexpresar genes de interés con el fin de estudiar sus funciones en el desarrollo de neuronas. Este método ha ayudado específicamente a describir los detalles morfológicos y caracterizar los mecanismos moleculares del proceso de migración radial 5 , 6 , 7 , 8 , 9 . Las neuronas que migran radialmente experimentan cambios dinámicos en la forma celular, velocidad de migración, así como la dirección migratoria, que requieren observación directa y continua a lo largo del tiempo. Organotypic slice cultuRe y time-lapse imágenes confocales de cerebros electroporados permiten observar directamente las neuronas migratorias con el tiempo. Utilizando este enfoque combinado, es posible analizar características distintas de las neuronas migratorias que no pueden ser investigadas en secciones de tejido fijas de cerebros electroporados.

Recientemente hemos aplicado imágenes confocales de lapso de tiempo de migración de neuronas en cultivos de rebanada de cerebro electroporado para estudiar el papel de la CL de células de factor B de transcripción / linfoma 11a (Bcl11a) durante el desarrollo cortical 10 . Bcl11a se expresa en jóvenes neuronas corticales migratorias y se utilizó un alelo condicional Bcl11a ( Bcl11a flox ) 11 para estudiar sus funciones. La electroporación de la recombinasa Cre junto con la proteína fluorescente verde (GFP) en los progenitores corticales de los cerebros flox / flox Bcl11a nos permitió crear una situación de mutante de mosaico, en la que sólo unas pocas células se mutan en unaDe lo contrario de tipo salvaje de fondo. De esta manera, fue posible estudiar las funciones autónomas de células de Bcl11a en el nivel de célula única. Hemos encontrado que Bcl11a mutante neuronas muestran velocidad reducida, cambios en sus perfiles de velocidad, así como al azar-como orientación cambios durante su migración [ 10] . En el protocolo descrito describimos un flujo de trabajo para la electroporación exitosa y la preparación del cultivo en rebanadas 12 de cerebros de ratón, así como imágenes confocales en intervalos de tiempo de cultivos de corte cortical.

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Protocol

Todos los procedimientos experimentales fueron aprobados por el Comité de Bienestar Animal (Regierungspräsidium Tübingen) y llevados a cabo de acuerdo con la Ley alemana de Bienestar Animal y la Directiva UE 2010/63 / EU.

1. En Utero Electroporación

  1. Agujas de microinyección
    1. Tirar capilares de vidrio borosilicato (diámetro exterior: 1,0 mm, diámetro interior: 0,58 mm, longitud: 100 mm) en agujas de microinyección utilizando un extractor de micropipeta con un filamento de caja (2,5 mm x 2,5 mm) y el siguiente programa: HEAT: 540, PULL : 125, VELOCITY: 20, y DELAY: 140. Determine el valor HEAT para cada filamento individual realizando una prueba RAMP (HEAT value: RAMP + 25).
    2. Agujas biseladas en un ángulo de 38 ° y velocidad de revolución intermedia a alta con un microgrinder para obtener un tamaño de punta de 20 a 30 μm para inyección en el día embrionario (E) 13,5 o menor y de 30 a 40 μm para inyección en células embrionarias más viejasEtapas. Para el almacenamiento, fije las agujas en una caja o en una placa de Petri con arcilla de modelado para evitar daños en las puntas.
  2. Solución de ADN plasmídico
    1. Preparar una construcción de ADN plasmídico que contenga proteína reportera fluorescente ( por ejemplo GFP) usando un kit de preparación maxi sin endotoxina de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
    2. Diluir la solución de ADN plasmídico a una concentración final de 1 - 2 μg / μl en tampón Tris-EDTA libre de endotoxina que contiene Fast Green a una concentración final de 0,01%. Una solución alícuota y almacenar a -20 ° C.
  3. Solución Bacteriostatica de Cloruro de Sodio
    1. Preparar solución bacteriostática de cloruro sódico añadiendo alcohol bencílico a una concentración final de 0,9% a una solución isotónica de cloruro de sodio al 0,9%. Solución de filtro estéril inmediatamente antes de su uso.
  4. Carprofen Solución de inyección
    1. Preparar la solución de inyección de carprofenoAñadiendo carprofeno a una concentración final de 0,5 mg / ml a una solución isotónica estéril de cloruro de sodio al 0,9%. Conservar a 4 ° C durante un máximo de 28 días.
  5. Anestesia, Inyección de ADN y Electroporación
    1. Pesar un ratón E14.5 cronometrado-embarazado y colocarlo en una cámara de anestesia transparente conectado a un vaporizador y saturado con isoflurano al 5%. Cuando el animal está inconsciente, transfiéralo a una mascarilla anestesiadora unida a una placa calentadora a 37 ° C y manténgala anestesiada con 1,8-2,2% de isoflurano.
      Nota: Evalúe el desarrollo de la anestesia quirúrgica por la pérdida de pellizco de la cola y los reflejos del pedal (pinzamiento del dedo del pie).
    2. Para la analgesia, inyectar 100 μL de solución de inyección de carprofeno por cada 10 mg de peso corporal de ratón (5 mg / kg de peso corporal) por vía subcutánea. Gire el ratón con la espalda hacia abajo y cubra cuidadosamente los ojos con vaselina para evitar que se sequen.
    3. Extienda suavemente las extremidades y fíjelasA la placa de calentamiento con cinta quirúrgica. Esterilizar el abdomen con etanol al 70% seguido de solución de yodo (7,5 mg / ml) usando hisopos de celulosa. Repita este procedimiento tres veces para asegurar una desinfección adecuada.
    4. Cubra el abdomen con una gasa estéril en la que se ha cortado una incisión para recoger un campo (diámetro: 2 - 2,5 cm) para la incisión abdominal. Humedecer la gasa con solución bacteriostática de cloruro sódico.
      Precaución: Reevalúe el desarrollo de la anestesia quirúrgica mediante la pérdida del reflejo del pedal.
    5. Usando pinzas Micro Adson (dentadas, longitud: 12 cm) y tijeras finas (anguladas a la cara, longitud: 9 cm) cortar la piel aproximadamente 1,5 cm a lo largo de la línea media del abdomen. Corte el músculo subyacente a lo largo de la linea alba.
    6. Quitar un cuerno uterino con pinzas anulares (longitud: 9 cm, diámetro exterior: 3 mm, diámetro interior: 2,2 mm) y colocarlo suavemente sobre la gasa humedecida.
      Precaución: Sostener el cuerno uterino con pinzas anulares sólo entre embriones yD no perturbar las placentas o cualquier recipiente de suministro. Mantenga el útero húmedo en todo momento con solución bacteriostática de cloruro sódico.
    7. Coloque con cuidado un embrión con pinzas anulares y localice el ventrículo lateral, que se presenta como una sombra en forma de media luna paralela al seno sagital. El punto de inyección se encuentra aproximadamente en el centro de una línea entre el ojo pigmentado y la confluencia de los senos, donde el seno sagital se ramifica a dos senos transversales. Empuje la aguja de microinyección a través de la pared uterina y hacia el ventrículo lateral.
      Nota: Si es necesario, la profundidad de la inyección puede ser corregida por retracción de la aguja.
    8. Inyecte 1 a 2 μl de solución de ADN en el ventrículo lateral con un microinyector que se acciona con un pedal, utilizando los siguientes ajustes: 25 psi, 10 a 20 ms por pulso y 5 a 10 pulsos. La inyección exitosa puede ser monitorizada por la solución de ADN coloreada, que debe llenar el sistema ventricular.
    9. Coloque los electrodos tipo pinzas (3 mm de diámetro para E13.5 o menos y 5 mm de diámetro para E14.5 o mayores) de tal manera que el terminal "positivo" esté del mismo lado que el ventrículo inyectado y el terminal "negativo" Terminal está en el lado opuesto del ventrículo inyectado debajo de la oreja de la cabeza del embrión.
    10. Humedezca el sitio de electroporación con unas gotas de solución bacteriostática de cloruro de sodio y aplique 5 pulsos de corriente eléctrica (35 V para E13.5 o menos y 40 V para E14.5 o mayores) de 50 ms de duración con intervalos de 950 ms.
      Nota: Las corrientes de 60 a 90 mA son usualmente suficientes para una electroporación exitosa. Las corrientes más bajas no transfectan eficientemente las neuronas, mientras que las corrientes más altas pueden conducir a la muerte embrionaria.
    11. Repita el procedimiento (ver los pasos 1.5.7 a 1.5.10.) Para cada embrión del cuerno uterino y colóquelo suavemente en la cavidad abdominal.
    12. Quite el cuerno uterino del otro lado y repita el procesoDescrito en el paso 1.5.7. A 1,5.11.
    13. Cierre la cavidad abdominal suturando la capa muscular antes de suturar la piel usando fórceps Micro Adson, soporte de aguja Mathieu (carburo de tungsteno, longitud: 14 cm) y sutura quirúrgica no absorbible (3/8 de círculo, 13 mm).
      Precaución: Tenga cuidado de no capturar el útero u otros órganos durante la sutura.
    14. Desinfecte cuidadosamente la sutura de la piel con solución de yodo (7,5 mg / ml) y elimine suavemente el exceso periocular de vaselina usando hisopos de celulosa. Coloque el ratón debajo de una lámpara infrarroja hasta que se despierte. Vigilar de cerca el ratón durante los próximos dos días. Repita el tratamiento analgésico como se describe en el paso 1.5.2 después de 12 a 24 h.

2. Cultivo organístico de la rebanada

  1. Laminin Stock Solution
    1. Disolver 1 mg de laminina liofilizada en agua estéril para obtener una solución madre de laminina de 1 mg / ml. Preparar alícuotas de 50 μL aAlmacenar a -80 ° C.
  2. Solución de inventario de poli-L-lisina
    1. Disolver 50 mg de poli-L-lisina en agua estéril para obtener una solución madre de poli-L-lisina de 1 mg / ml. Preparar alícuotas de 0,5 ml y almacenar a -20 ° C.
  3. Solución completa de sal equilibrada de Hank (HBSS completo)
    1. Preparar HBSS completo combinando 50 ml de solución de HBSS 10x, 1,25 ml de tampón HEPES 1 M (pH 7,4), 15 ml de solución de D-glucosa 1 M, 5 ml de solución de cloruro de calcio 100 mM, 5 ml de sulfato de magnesio 100 mM , Y 2 ml de solución 1 M de hidrogenocarbonato de sodio. Añadir agua estéril hasta 0,5 L, filtro estéril, y almacenar a 4 ° C.
  4. Medio de cultivo de la rebanada
    1. Combine 35 ml de Eagle Basal Medium (BME), 12,9 ml de HBSS completo (ver sección 2.3.1.), 1,35 ml de D-glucosa 1 M, 0,25 ml de L-glutamina 200 mM y 0,5 ml de penicilina-estreptomicina a Obtener 50 ml de cultivo en rebanadasmedio. Filtro estéril y añadir suero de caballo a una concentración final del 5%. Conservar a 4 ° C durante un máximo de 4 semanas.
  5. Solución de Agarosa de bajo punto de fusión (LMP)
    1. Preparar solución de agarosa LMP al 3% disolviendo 1,5 g de agarosa LMP en 50 ml de HBSS completo calentando en un horno de microondas durante 1 a 2 min a potencia intermedia.
      Nota: Controle cuidadosamente el calor para evitar que se desborde durante la ebullición.
    2. Colocar la solución en un baño de agua a 38 ° C hasta que esté lista para su uso. Guarde a 4 ° C y reutilice una vez.
  6. Revestimiento de insertos de membrana
    1. Añadir una alícuota de la solución madre de laminina (véase el paso 2.1.1.) Y una alícuota de solución madre de poli-L-lisina (véase el paso 2.2.1.) A 6 ml de agua estéril para obtener una solución de revestimiento (suficiente para 6 insertos) .
    2. Coloque los insertos de membrana en una placa de 6 pocillos que contenga 2 mL de agua estéril en el fondo de cada pocillo. Añadir 1 ml de solución de revestimiento(Véase el paso 2.6.1.) Encima de cada membrana e incubar durante la noche a 37ºC y atmósfera de dióxido de carbono al 5%.
      Nota: Únicamente utilice insertos con membranas ópticamente transparentes, como la membrana de PTFE (politetrafluoroetileno).
    3. Lavar las membranas tres veces con 1 mL de agua estéril y secar. Utilizar membranas recubiertas el mismo día o almacenar en una placa limpia de 6 pocillos a 4 ° C durante un máximo de cuatro semanas.
  7. Disección cerebral e incorporación
    1. Dos días después de la electroporación colocar el ratón en una cámara transparente conectada a un vaporizador y saturada con isoflurano al 5%. Cuando el animal está inconsciente, sacarlo de la cámara y sacrificarlo por dislocación cervical.
    2. Retire el útero que contiene los embriones y colóquelo en una placa de Petri de 10 cm con HBSS completo helado.
      Nota: A partir de este momento, mantenga todas las soluciones, embriones y cerebros en hielo.
    3. Utilice un estereomicroscopio, fórceps con punta fina (recta,11 cm) y un par de tijeras Vannas Tübingen Spring (anguladas, longitud: 9,5 cm) para separar cada embrión del útero y transferirlo a otra placa de Petri que contenga HBSS completo helado.
    4. Haga una incisión a nivel del tronco cerebral y corte a lo largo de la línea media sagital. Despegue la piel y el cartílago que cubre el cerebro. Luego, corte el tronco cerebral justo detrás de los hemisferios y retire el cerebro del cráneo. Transferir el cerebro con una espátula de micro-cuchara (185 mm x 5 mm) a una placa de 12 pocillos que contenga HBSS completo helado. Recoja todos los cerebros de la litera en la placa de 12 pocillos.
    5. Utilice un estereomicroscopio fluorescente para examinar los cerebros en la placa de 12 pocillos para obtener brillo de fluorescencia así como el tamaño de la región electroporada. Seleccione de 2 a 4 cerebros con señales fluorescentes brillantes en la corteza somatosensorial presuntiva para su posterior procesamiento.
    6. Vierta la solución de agarosa LMP al 3% mantenida a 38 ° C en un molde de incrustación desechable desechable. EliminarE del cerebro de la placa de 12 pocillos con una espátula de micro-cuchara y drene cuidadosamente el exceso de HBSS completo alrededor del cerebro usando papel de seda fino.
    7. Colocar el cerebro suavemente en la solución de agarosa, empujarlo hasta el fondo del molde y ajustar cuidadosamente su posición usando una aguja de calibre 20. Para las secciones coronales, orientar el cerebro con los bulbos olfativos apuntando hacia arriba. Mantenga el molde sobre hielo hasta que la solución de agarosa se solidifique y continúe con la sección del cerebro.
  8. Sección de Vibratome y Cultura de Slice
    1. Retire el bloque de agarosa del molde y colóquelo en la tapa de una placa petri estéril. Corte el exceso de agarosa con una cuchilla de afeitar limpia dejando aproximadamente 2 a 3 mm por debajo de los bulbos olfativos y 1 mm de agarosa en los otros lados. Fijar el bloque de agarosa recortado con los bulbos olfativos apuntando hacia abajo a una etapa de muestra usando pegamento de cianoacrilato.
      Nota: Esterilizar instrumentos y equipos con un 70% de etanoL antes de cortar.
    2. Transferir la etapa de la muestra a la cámara de corte de un micrótomo de lámina vibrante que contiene HBSS completo helado y colocar el cerebro con su lado dorsal hacia la hoja. Cortar cortes cerebrales de 250 μm de grosor que contienen la región electroporada con una amplitud de baja a moderada de 0,9 mm y una velocidad de corte muy lenta de 0,09-0,12 mm / s. Usualmente se obtienen de 4 a 6 rebanadas con señal fluorescente brillante de cada cerebro con éxito electroporado.
    3. Con una espátula de cuchara micro doblada y fórceps con punta fina, transfiera cuidadosamente las rodajas de cerebro con la agarosa circundante a una placa de 6 pocillos que contenga HBSS completo helado.
      Precaución: Tenga cuidado de no dañar el tejido cerebral tocando el borde de agarosa alrededor de las secciones con la pinza durante la transferencia.
    4. Procesar todos los cerebros seleccionados como se describe en los pasos 2.8.1. A 2.8.3.
    5. Humedecer los insertos de membrana con 100 μL de HBSS completo antes de colocar el cerebro slHielo sobre las membranas para facilitar la colocación de las rebanadas. Se pueden colocar hasta 5 rebanadas en 1 inserto de membrana.
    6. Cuidadosamente transferir las rebanadas en las membranas con una espátula de cuchara micro curvada y fórceps con punta fina. Tire suavemente una rebanada en la espátula tocando solamente el borde de la agarosa con la pinza y empuje suavemente la rebanada de la espátula sobre la membrana. Coloque la rebanada con una pinza y continúe transfiriendo las rebanadas restantes. Quitar el exceso de HBSS completo con una pipeta.
      Nota: No se superponen las rebanadas entre sí.
    7. Con la ayuda de un fórceps, coloque cuidadosamente los insertos de membrana con las rebanadas en una placa de 6 pocillos que contenga 1,8 ml de medio de cultivo en lonchas (ver Paso 2.4.1) e incube a 37ºC y atmósfera de dióxido de carbono al 5% hasta un lapso de tiempo Imágenes

3. Imagen de lapso de tiempo

  1. Configuración del microscopio
    1. Coloque una cámara climática en el escenario de unaMicroscopio confocal invertido a 37 ◦ C y atmósfera de dióxido de carbono al 5%. Utilice un detector híbrido para reducir la intensidad del láser y mejorar la viabilidad celular. Para un análisis detallado, utilice una distancia de trabajo extra larga de 40X objetivo seco con una apertura numérica de 0,6 o superior.
      Nota: Todos los componentes del microscopio necesitan ser precalentados a 37 ° C durante 2 - 3 h antes de la formación de imágenes para proporcionar un enfoque estable durante el proceso de formación de imágenes.
  2. Slice Imaging
    1. Seleccione una rebanada de cerebro para obtener imágenes de la placa de 6 pocillos que contiene los insertos de membrana usando un microscopio de fluorescencia invertido.
      Precaución: Evite el tiempo prolongado de exposición a la luz ultravioleta, ya que esto puede causar fotodigasión celular.
      Nota: Seleccione una rebanada con neuronas simples brillantes en la SVZ superior que migran radialmente hacia la superficie pial de la rebanada. Los procesos fluorescentes finos de las células gliales radiales que abarcan todo el CP indican un andamio glial radial intacto, que se utilizaD por migración radial de neuronas corticales.
    2. Transferir el inserto de membrana con la rebanada, que se seleccionó para la formación de imágenes en lapso de tiempo, en una placa de fondo de vidrio de 50 mm de diámetro que contiene 2 ml de medio de cultivo de rebanada con la ayuda de fórceps. Coloque el plato en la cámara climática del microscopio confocal.
    3. Establezca la resolución a 512 por 512 píxeles y aumente la velocidad de exploración de 400 Hz a 700 Hz con el fin de aumentar la velocidad de fotogramas de aproximadamente 1,4 a aproximadamente 2,5 fotogramas por segundo, respectivamente. No utilice más de dos veces el promedio. Definir una pila z a través de la región electroporada (normalmente 400-100 μm) con un tamaño de paso de 1,5 μm. Colectivamente, estos ajustes permiten una resolución y un brillo suficientes de la imagen, manteniendo el fotodigráfico bajo durante la adquisición. Comience la serie time-lapse tomando una pila z cada 30 min.
      Nota: La exposición prolongada de la rebanada a la luz láser inducirá el fotodamado reduciendo la viabilidad de las células. Ajustar la expOsure tiempo a la luz láser en consecuencia.
    4. Analizar series de lapso de tiempo usando el software ImageJ (https://imagej.nih.gov/iij/) o equivalente.

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Representative Results

Anteriormente, hemos demostrado que la deleción genética de Bcl11a por electroporación in utero perjudica la migración radial de finales de nacido de capa superior de las neuronas de proyección [ 10] . La electroporación de un vector de plásmido de ADN que contiene Cre-IRES-GFP eliminó eficazmente Bcl11a en cerebros Bx11a flox / flox condicionales 11 . Cuando se analizaron los cerebros electroporados E14.5 tres días después de la electroporación, la mayoría de las neuronas de control habían migrado al CP, mientras que muchas neuronas Bcl11a mutantes se paralizaron a lo largo de la ruta migratoria en el IZ y VZ / SVZ. Por otra parte, encontramos un aumento en el número de células multipolar a expensas de las células bipolares específicamente en la IZ sobre Bcl11a supresión sugiriendo defectos en la polarización [ 10] .

Para analizar de forma directa y dinámica migraTórico de las neuronas Bcl11a mutante se utilizó imágenes confocales de lapso de tiempo de migración de las neuronas en organotypic corte cultivo preparado de cerebro electroporated. La serie de lapso de tiempo con un objetivo de 10X con una apertura numérica de 0.4 confirmó nuestros resultados, que las neuronas de proyección mutante Bcl11a tienen defectos en la migración radial. Dentro de 36 h muchas neuronas de control habían emigrado en el CP, mientras que sólo unas pocas neuronas Bcl11a mutante había dejado la IZ y migrado en el CP. Curiosamente, parecía que muchas neuronas Bcl11a mutante no migrar directamente hacia la superficie pial del cerebro, pero ralentizó la migración y se volvió tangencial o incluso hacia atrás hacia el ventrículo (Película 1). Para analizar más a fondo estos hallazgos generamos series de lapso de tiempo a una mayor ampliación usando un objetivo de 40x con una apertura numérica de 0.6. Nuestros datos muestran que las neuronas Bcl11a mutante no eficientemente polarizar y continuar migrat radialEn el CP. En 12 h, muchas neuronas Bcl11a mutante no cambiar de una morfología multipolar a bipolar y en su lugar proyectado y retractado muchos procesos en el entorno (Película 2, Figura 1A ].

Además, rastreamos los caminos de migración de las neuronas individuales en diferentes series de lapso de tiempo y las usamos para calcular parámetros específicos de las neuronas migratorias. Se encontró que Bcl11a mutante neuronas repetidamente someterse a fases de varias horas de duración con la reducción de la velocidad de la migración y al azar-como orientación cambios (Película 3, Figura 1B , flecha roja). En particular, el perfil de velocidad de las neuronas Bcl11a mutante se desplazó de mayor velocidad (25 μm / h) hacia la velocidad más baja (5 μm / h) en comparación con las neuronas de control ( Figura 1C ). En línea con esto, la velocidad de migración general de Bcl11Una mutante de las neuronas se redujo significativamente de 10,34 ± 0,34 μ m / h en los controles a 6 ± 0,54 μ m / h (p = 2,4889E-05) ( Figura 1D ]. Finalmente, la desviación de la migración dirigida hacia la superficie pial del cerebro se incrementó significativamente de 17,15 ± 2,13º en el control a 40,16 ± 4,42º en las neuronas mutantes Bcl11a (p = 0,0002) ( Figura 1E ). En conjunto, estos resultados demuestran que la imagen confocal de lapso de tiempo de las neuronas GFP electroporated en cultivo de corte organotípico es un valioso método para estudiar los mecanismos moleculares que controlan el proceso de migración neuronal.

Película 1
Película 1: Migración del control marcado con GFP en comparación con las neuronas mutantes Bcl11a en cortes corticales. Bcl11a flox / cerebro flox fueron electroporados enE14.5 con un vector de plásmido que contenía IRES-GFP (A) o Cre-IRES-GFP (B) y cultivos en lonchas se prepararon a E16,5. VZ / SVZ; Zonas ventriculares / subventriculares; IZ, zona intermedia; CP, placa cortical. Barra de escala = 100 μm. La película está compuesta por 108 fotogramas a una velocidad de 5 fotogramas / s. Reimpreso de Wiegreffe et al. 10 con el permiso de Elsevier. Haga clic aquí para ver este video. (Haga clic derecho para descargar.)

Película 2
Película 2: Polarización de un control marcado con GFP en comparación con las neuronas mutantes Bcl11a en cortes corticales. Los cerebros flox / flox Bcl11a se electroporaron a E14.5 con un vector plasmídico que contenía cultivos IRES-GFP (A) o Cre-IRES-GFP (B) y rebanada Se prepararon en E16,5. Barra de escala = 10 μm. La película se compone de 25 fotogramas a una velocidad de 5 fotogramas / s. Reimpreso de Wiegreffe et al. 10 con el permiso de Elsevier. Haga clic aquí para ver este video. (Haga clic derecho para descargar.)

Película 3
Película 3: Trazas Animadas con 1 h de Resolución de Intervalo de Control Representativo y Bcl11a Mutant Neurons . Se obtuvieron trazas de neuronas migratorias de series de lapso de tiempo de cultivos de rebanadas E16.5 de cerebros flox / flox Bcl11a que se electroporaron a E14.5 con un vector plasmídico que contenía IRES-GFP ( A ) o Cre-IRES-GFP ( B ) . Barra de escala = 20 μm. Reimpreso de Wiegreffe et al.> 10 con permiso de Elsevier. Haga clic aquí para ver este video. (Haga clic derecho para descargar.)

Figura 1
Figura 1: Comportamiento de la migración de Bcl11a mutante de la capa superior de neuronas corticales.
( A ) Imágenes representativas de la migración de las neuronas GFP positivas en E16.5 rebanada cultivos de Bcl11a flox / cerebro flox electroporated en E14.5 con cualquiera de Cre-IRES-GFP o un vector de control a lo largo de un período de imagen total de 12 h. ( B ) Trazas representativas con una resolución de 1 hora de intervalo de migración de las neuronas GFP positivas en E16.5 cultivos de rebanada de Bcl11a flox / cerebro flox electroporated a E14.5 con Cre-IRES-GFP o un vector de control durante total de los períodos de imagen deHasta las 22 h. Las neuronas mutantes Bcl11a frecuentemente experimentan fases repetitivas de velocidad de migración reducida y orientación cambiada al azar (marcadas por puntas de flecha rojas). (C) Perfiles de velocidad calculados a partir de las trazas de las neuronas que migran como se muestra en B. (DE) La cuantificación de la velocidad (D) y el ángulo de desviación de la orientación radial (E) de la migración de neuronas GFP positivas en cultivos de cortes de E16.5 de BCL11A flox / flox Cerebros electroporados a E14.5 con Cre-IRES-GFP o un vector de control (n = 15). Media ± sem; Prueba t de Student; *** p <0,001. Barra de escala = 10 μm. Reimpreso de Wiegreffe et al. 10 con el permiso de Elsevier. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

La migración radial es un proceso clave en el desarrollo del neocórtex. Mutaciones en los genes que afectan a diferentes etapas de este proceso puede causar graves malformaciones corticales, incluida la lissencefalia y la materia blanca heterotopia [ 1 , 2] . Recientemente demostró que Bcl11a, que se expresa en jóvenes neuronas de proyección cortical migratorias, desempeña un papel en la migración radial. Utilizamos imágenes confocales de lapso de tiempo de las neuronas migratorias en cortes corticales agudos de cerebro electroporado para demostrar directamente que la deleción genética de Bcl11a en las neuronas migratorias causa defectos de polarización y migración. Time-lapse series se utilizaron para rastrear los caminos de migración de las neuronas individuales y calcular los parámetros específicos de las neuronas migratorias, incluyendo los perfiles de velocidad, la velocidad media de migración y la dirección migratoria [ 10] .

Este protocolo describe un enfoque importante al estudiar las moléculasR en la migración radial. Utilizando plásmidos de expresión de ARN o ADN de horquilla cortos, casi cualquier gen de interés puede ser derribado o sobreexpresado, respectivamente. Es un método poderoso para combinar la electroporación con el sistema Cre-LoxP. La transfección de cerebros de ratones mutantes condicionales ("floxed") con Cre recombinasa genera una situación mutante de mosaico y permite el análisis selectivo de neuronas mutantes individuales que están rodeadas por células de tipo salvaje. De esta manera, se pueden investigar mecanismos moleculares autónomos de células en las neuronas migratorias. Además, los experimentos de rescate funcionales se realizan fácilmente. La preparación de series de lapso de tiempo de rebanadas de cerebro electroporadas permite analizar dinámicamente el comportamiento migratorio de las neuronas que migran solas, lo que proporciona mucha más información de la que se puede obtener de las secciones fijas del cerebro. La electroporación intrauterina 3 , 4 requiere entrenamiento inicial pero - una vez dominada - es unaRápida y sencilla para reproducir de forma reproducible las neuronas de la corteza cerebral in vivo . En el protocolo descrito aquí usamos en la electroporación utero en E14.5, cuando nacen las neuronas de proyección neocortical de la capa superior nacidas tardíamente. Para el estudio de la proyección en profundidad de la capa profunda de las neuronas en la electroporación en el útero tiene que ser realizado en etapa de desarrollo anterior ( es decir, E12.5) [ 13] . En principio, el protocolo también puede usarse para estudiar la migración de otras subpoblaciones neuronales en el cerebro que pueden ser transfectadas con electroporación, incluyendo la migración de interneuronas 14 y células granulares cerebelosas 15 .

El protocolo de cultivo de corte que se describe fue adaptado de Polleux y Gosh 12 y anteriormente, lo hemos utilizado para la electroporación ex utero 16 , 17 a stuDy desarrollo hipocampal. Lo más importante, las rodajas de cerebro tienen que ser manejadas con cuidado durante todo el procedimiento para mantener su viabilidad. Utilizamos un microscopio invertido y platos de fondo de cristal de calidad óptica para imitar el cultivo de la rebanada en un inserto de cultivo celular. Esta configuración es muy fácil de configurar y permite condiciones estériles, ya que el objetivo nunca se pone en contacto con el cultivo o medio de corte. Sin embargo, se requieren objetivos de larga distancia de trabajo (> 2 mm) con una apertura numérica suficientemente alta (0,6 o superior). Otros estudios han puesto la porción de cerebro directamente sobre el fondo de vidrio y han utilizado una matriz de colágeno 18 , 19 para fijar la rebanada en su lugar, lo que hace posible el uso de objetivos con una distancia de trabajo libre más corta. Sin embargo, el uso de insertos de cultivo celular proporciona un manejo sencillo, resultados reproducibles, y permite al investigador a imagen de las rodajas incluso 1 a 2 días después de su preparación sin coMpromising la viabilidad de la rebanada del cerebro (datos no mostrados). Otro problema crítico se refiere a dañar las rebanadas por luz láser. Hemos utilizado un detector híbrido de alta sensibilidad, lo que nos permitió reducir la potencia del láser al mínimo, mientras que todavía se obtienen suficientes señales fluorescentes para imágenes de lapso de tiempo. El uso de imágenes multiphoton reduciría aún más el fotodamado y permitiría una penetración de tejido más profunda, así como una detección de luz más eficiente en comparación con la microscopía confocal convencional.

A pesar de su utilidad para estudiar la migración neuronal, el protocolo tiene limitaciones y no puede preservar por completo la situación de las neuronas migratorias en el cerebro intacto. La matriz extracelular, los contactos intercelulares adhesivos y la vasculatura dentro de la zona migratoria pueden influir dinámicamente en las neuronas migratorias radialmente 20 , 21 . Específicamente, las neuronas de la capa superior dependen de procesos gliales radiales alargados paraSu migración 22 . Por lo tanto, para la obtención de imágenes exitosas, es importante seleccionar segmentos cerebrales con células gliales radiales electroporadas GFP que extienden sus procesos a través de toda la anchura cortical. Las "rodajas oblicuas", en las que el andamio glial radial ha sido cortado antes de llegar a la superficie pial del cerebro, deben ser descartadas de un análisis posterior. A veces, la muerte celular puede ocurrir en la superficie del aire de la rebanada del cerebro, que restringe la adquisición de la imagen a la región más profunda dentro de la muestra. Las neuronas electroporadas en rodajas de cerebro cultivadas pueden migrar menos eficientemente en comparación con las neuronas electroporadas in vivo , lo que puede ser causado por una recuperación insuficiente de la preparación. Esto requiere análisis de cultivos de múltiples sectores para situaciones experimentales y de control, e interpretación crítica de conjuntos de datos representativos. En algunos casos, los insultos asociados con la electroporación in utero pueden causar muerte embrionaria o alteración estructuralIones del cerebro, incluyendo ventrículos agrandados, corteza asimétricamente adelgazada, o formación de una cicatriz glial resultante de la inyección de ADN. En esos casos, la muestra debe ser descartada de un análisis posterior.

Mientras que los cortes cerebrales de donantes embrionarios sobreviven bien en los insertos de membrana 23 , los análisis se restringen a los primeros eventos de desarrollo, incluyendo la migración neuronal, y no lo hemos utilizado para estudiar eventos posteriores, como el desarrollo de dendritas o la sinaptogénesis. En resumen, proporcionamos un protocolo detallado para estudiar de forma directa y dinámica la migración neuronal de neuronas electroporadas en cultivos de rebanadas, que pueden adaptarse fácilmente para analizar funciones de genes implicados en trastornos del desarrollo neurológico.

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Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgments

Agradecemos a Jacqueline Andratschke, Elena Werle, Sachi Takenaka y Matthias Toberer por su excelente asistencia técnica, así como a Victor Tarabykin por sus útiles discusiones. Este trabajo fue apoyado por una concesión de la Deutsche Forschungsgemeinschaft a SB (BR-2215).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
isoflurane Abbott Laboratories  506949 Forene
6-well plate Corning 351146
12-well plate Corning 351143
non-absorbable surgical suture Ethicon K890H 3/8 circle, 13 mm, taper point
Micro Adson Forceps Fine Science Tools 11018-12 serrated, length: 12 cm
fine scissors Fine Science Tools 14063-09 angled to side, length: 9 cm
Mathieu Needle Holder Fine Science Tools 12510-14 tungsten carbide, length: 14 cm
fine tipped forceps Fine Science Tools 11370-40 straight, 11 cm
Vannas Tübingen Spring Scissors Fine Science Tools 15005-08 angled up, 9.5 cm
ring forceps Fine Science Tools 11103-09 OD: 3mm, ID, 2.2 mm, length: 9 cm
HBSS (10X) Gibco 14180046
L-Glutamine Gibco 25030081
Penicillin/Streptomycin Gibco 15140122
horse serum Gibco 26050088
BME Gibco 41010026
borosilicate glass capillaries Harvard Apparatus 30-0016 1.0 OD x 0.58 ID x 100 L mm
anesthsesia system Harvard Apparaus 72-6471
anesthetizing chamber Harvard Apparaus 34-0460
fluosorber filter canister Harvard Apparaus 34-0415
low melting point agarose Invitrogen 16520100
vibrating blade microtome Leica VT1200 S
fluorescence stereo microscope Leica M205 FA
stereo microscope Leica M125
inverted fluorescence tissue culture microscope Leica DM IL LED
confocal laser scanning microscope Leica TCS SP5II
hybrid detector Leica HyD
objective, 40x/0.60 NA Leica 11506201
microscope temperature control system Life Imaging Services Cube, Brick & Box
cell culture insert Millipore PICM0RG50
microgrinder Narishige EG-45 use 38° angle for beveling
microinjector Parker Hannifin  052-0500-900 Picospritzer III
carprofen Pfizer Animal Health NDC 61106-8507 Rimadyl
emdedding mold Polysciences 18986-1
endotoxin-free plasmid maxi kit Qiagen 12362
fast green Sigma F7252
laminin Sigma L2020
poly-L-lysine Sigma P5899
HEPES Sigma H4034
D-glucose Sigma G6152
calcium chloride Sigma C7902
magensium sulfate Sigma M2643
sodium bicarbonate Sigma S6297
square wave electroporator Sonidel CUY21EDIT
tweezers with 5 mm platinum disk electrodes Sonidel CUY650P5
micropipette puller Sutter Instrument P-97
box filament Sutter Instrument FB255B 2.5 mm x 2.5 mm
micro-spoon spatula VWR 231-0191 185 mm x 5 mm
glass bottom dish, 50 mm World Precision Instruments FD5040-100

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References

  1. Evsyukova, I., Plestant, C., Anton, E. S. Integrative mechanisms of oriented neuronal migration in the developing brain. Annu Rev Cell Dev Biol. 29, 299-353 (2013).
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Neurobiología Número 125, cultura de corte organotípico imágenes en lapso de tiempo migración radial neocórtex modelo de ratón trastornos de la migración neuronal
Time-lapse Imágenes confocales de las neuronas migratorias en la cultura organotípica en rebanadas de cerebro de ratón embrionario<em&gt; En Utero</em&gt; Electroporación
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Wiegreffe, C., Feldmann, S., Gaessler, S., Britsch, S. Time-lapse Confocal Imaging of Migrating Neurons in Organotypic Slice Culture of Embryonic Mouse Brain Using In Utero Electroporation. J. Vis. Exp. (125), e55886, doi:10.3791/55886 (2017).

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