Ø-analysen er en relativt ny, omkostningseffektive assay, der kan bruges til at evaluere grundlæggende bevægeapparatet funktionsmåden for Drosophila melanogaster. Dette manuskript beskriver algoritmer til automatisk databehandling og objektiv kvantificering af øen assay data, hvilket gør dette assay en følsom, høj overførselshastighed udlæsning til store genetiske eller farmakologiske skærme.
Fremskridt i næste generation sequencing teknologier bidrager til identifikation af (kandidat) sygdomsgener for bevægelsesforstyrrelser og andre neurologiske sygdomme med en øget hastighed. Dog er lidt kendt om de molekylære mekanismer, der ligger til grund for disse lidelser. Genetiske, molekylære og adfærdsmæssige værktøjskassen af Drosophila melanogaster gør denne model organisme især nyttigt at karakterisere nye sygdomsgener og mekanismer på en måde, høj overførselshastighed. Ikke desto mindre, høj overførselshastighed skærme kræver effektive og pålidelige assays, der ideelt set er omkostningseffektive og giver mulighed for automatiseret kvantificering af træk relevante for disse lidelser. Ø-analysen er en omkostningseffektiv og let set-up metode til at evaluere Drosophila bevægeapparatet adfærd. I denne analyse, er fluer kastet på en platform fra en fast højde. Dette fremkalder en medfødte motoriske svar, der muliggør fluer til at flygte fra platformen inden for få sekunder. I øjeblikket, er kvantitative analyser af filmet ø assays udført manuelt, som er en omstændelig virksomhed, navnlig når du udfører store skærme.
Dette manuskript beskriver de“Drosophila ø analyse” og “Ø Assay analyse” algoritmer for høj overførselshastighed, edb og kvantificering af øen assay data. I opsætningen indsamler en simpel webcam tilsluttet en laptop en billed serie af platformen mens analysen udføres. “Drosophila ø Assay” algoritme udviklet til open source-software Fiji behandler disse billede serie og kvantificerer antallet af fluer på platform over tid for hver eksperimentelle betingelse. “Øen Assay analyse” script, kompatibel med den gratis software R, blev udviklet til automatisk behandle de fremkomne data og til at beregne, om behandlinger/genotyper er statistisk forskellig. Dette væsentligt forbedrer effektiviteten af øen analysen og gør det en kraftfuld udlæsning til grundlæggende bevægelse og flight adfærd. Det kan således anvendes til store skærme undersøger flyve bevægeapparatet evne, Drosophila modeller af bevægelsesforstyrrelser, og medicin effektivitet.
I de seneste år, fremskridt i næste generation sequencing teknologier har i høj grad bidraget til identifikation af gener underliggende degenerative bevægelsesforstyrrelser af hjernen (fx cerebellare ataksi og Parkinsons), af perifere neuronal oprindelse (fx, Amyotrofisk lateral sklerose og arvelig spastisk paraplegi), og af muskulære oprindelse (fx, Duchenne muskeldystrofi og født dystrofi)1,2,3,4 . På trods af dette, er lidt kendt om de molekylære mekanismer, der ligger bag de fleste af disse lidelser. En bedre forståelse af disse mekanismer er afgørende for at udvikle behandlingsformer.
Som mennesker, er bevægelse i modelorganismer, såsom fly og bevægelse i Drosophila, kontrolleret af central hjerne, perifere nervesystem og muskler. Derudover gør hurtig generationstid og genetiske værktøjskasse af Drosophila denne model organisme særligt velegnet til high throughput screening af gener involveret i bevægelsesforstyrrelser og for drug test5,6 . På grund af det betydelige antal betingelser, der skal afprøves i sådanne skærme, pålidelige, omkostningseffektive, og relativ simpel assays, samt værktøjer til at kvantificere outputresultater i en automatiseret måde, er særdeles ønskværdige.
Schmidt et al. (2012) 7 beskrevet en billig test kaldet “island assay” at evaluere Drosophila bevægeapparatet adfærd. Øen analysen har været anvendt med succes i storstilet screeninger til at identificere gener med glia-specifikke funktioner7, i evalueringen af Drosophila modeller af intellektuelle handicap8, og for den generelle evaluering af flyve motor adfærd9. Princippet om design af øen analysen består af en ophøjet platform, som flere fluer er kastet. Dette fremkalder en medfødte motoriske adfærd, der gør det sunde fluer til at flygte fra platformen inden for få sekunder. Analysen måler antallet af fluer resterende på platformen over tid7,8,9. Alle disse funktioner viser, at øen analysen kan være en kraftfuld screeningsværktøj for gener involveret i bevægelsesforstyrrelser.
I øjeblikket, er kvantitativ analyse af filmet ø assay data udført manuelt7,8,9. For at forbedre effektiviteten af analysen, blev en low-cost-metoden udviklet til semi-automatisk kvantificere udslip af fluer fra platformen. Opsætningen bruger en simpel webcam tilsluttet en laptop til at indsamle billede tid serie af platformen, med rammer erhvervet hver 0,1 s. rammer behandles derefter med makroen“Drosophila ø Assay”, der kvantificerer antallet af fluer på platformen over tid. Makroen“Drosophila ø Assay” er opdelt i tre uafhængige sub makroer: (I) “Opret stak og projektion,” sub makro identificerer forskellige ø eksperimenter gemt i forskellige undermapper og skaber en stak og en projektion af hver tidsserier. (II) den “Definere Platform” sub makro åbnes fortløbende alle “Projection_image_name.tif” filer placeret i de enkelte eksperimentelle undermapper, hvorefter brugeren anmodes om at definere manuelt ø-perron som region af interesse (ROI). (III) “analyse” kvantificerer automatisk antallet af fluer resterende på platformen i løbet af tidsserien. Sub makroerne kan køres efter hinanden (i en køre) eller selvstændigt. For statistisk dataanalyse, blev et script udviklet til at automatisk behandle de fremkomne data og anvende en statistisk test for at afgøre, om behandlinger/genotyper opfører sig væsentligt forskellige fra hinanden (figur 1). Endelig er det påvist, at denne opsætning kan bruges til at evaluere og kvantificere afvigende bevægeapparatet evne til Drosophila model for ataksi telangiectasia (AT).
Denne protokol beskriver makroen“Drosophila ø Assay”, der kvantitativt vurderer Drosophila motor adfærd under øen assay. Makroen tæller præcist fluer på platformen over tid, hvilket gør øen assay meget følsomt og egnet til kvantitative høj overførselshastighed evaluering af bevægeapparatet defekter. Metoden giver mulighed for sammenligning af enhver tilstand med fluer dyrkes under forskellige genetiske og/eller miljømæssige forhold, herunder narkotika eksponering. Denne udlæsning er således især nyttige som opdagelse værktøj, når du udfører store genetiske eller farmaceutiske skærme, når man studerer Drosophila modeller af bevægelsesforstyrrelser og andre neurologiske sygdomme, eller ved behandlingen af bevægelse eller fly adfærd.
Øen assay protokollen præsenteret i dette håndskrift giver fordele i forhold til eksisterende/alternative metoder. For eksempel, er video-tracking bevægelse langt mere tidskrævende og mindre egnet til at teste store stikprøvestørrelser. Øen assay er en høj overførselshastighed screeningsværktøj, og i denne forstand, kan sammenlignes med hurtige interaktive negative geotaxis (RING) assay16. Forskellen mellem to er, at øen assays giver mulighed for påvisning af en bredere vifte af bevægeapparatet problemer; fluer manglende evne til at forlade platformen kan være forårsaget af defekter i flugt, hoppe, eller gå adfærd forårsaget af wing (muskel/neuronal) og/eller ben (muskel/neuronal) mangler. På den anden side vurderer RING assay defekter i klatring/gående adfærd forårsaget af ben (muskel/neuronal) mangler. I tilfælde af brugere er interesseret i flere adfærdsmæssige udlæsninger, kombineres øen analysen også nemt med andre assays, såsom RING assay. Derudover lasere kræves til optogenetics kan nemt installeres i boksen ø assay, og opsætningen er så simpel, at det nemt kan flyttes til et værelse, hvor temperatur og lys kan reguleres.
For at sikre succes og reproducerbarhed af øen analysen beskrives her, bør flere henstillinger følges. Alikvot og overførsel fluer til den eksperimentelle test hætteglas på mindst én dag før forsøget at undgå virkningerne af CO2 eller kolde anæstesi. Må ikke overcrowd de eksperimentelle hætteglas (brug 10-15 fluer pr hætteglas, det er bedste for altid at placere det samme antal fluer pr hætteglas). Holde fluerne på frisk mad på alle tidspunkter. Hvis ikke endnu kender gennemfører analysen, praksis kaste flyver ind på platformen til at maksimere udbyttet. Også praksis hurtigt tilbagetrækningskraften hånden lige bagefter, da det forstyrrer dataanalyse (billedanalyse og flyve tælle start kun efter hånden er ude af billedet). Holde de miljømæssige og eksperimentelle betingelser identiske i eksperimenter, der skal sammenlignes (fx kontrol versus mutanter eller en genotype testet på forskellige alderstrin). Altid udføre eksperimenter på samme tid af dagen og vedligeholde hætteglas med kontrolleret temperatur og luftfugtighed vilkår. Statistisk power, test mindst tre tekniske replikater pr. biologiske replikeres.
For at sikre vellykket udførelsen af makroen beskrevet her, webcam og billede indstillinger skal ændres for at opnå maksimal kontrast: flyver vises som sorte objekter på en hvid platform. Når antallet af fluer ikke er korrekt optalt af makroen, justere indstillingerne kontrast, tjekke om ROI markeres korrekt og sikre, at størrelsen af fluer på platformen er ovenfor angivne minimum flyve størrelse indstilling (Se trin 8.3 i denne protokol). Indstillingerne skal kun defineres én gang. De er gældende for alle eksperimenter, så længe afstand mellem webcam og platformen ikke er ændret. Circularity_min og max indstillinger definerer cirkularitet af partikler (partikler = optalte fluer) der vil blive taget hensyn til analyse (flyver = optalte objekter). 1 repræsenterer en perfekt cirkel, og 0 repræsenterer en linje17. Da flyver altid til stede en vis grad af cirkularitet (en flue ikke kan vises som en lige linje), “Circularity_max”-indstilling er sat til 1 og indstillingen “Circularity_min” er indstillet på 0,4. Det er usandsynligt, at brugeren skal justere disse indstillinger.
Makroen gør lejlighedsvis tælle fejl, når en flue ligger tæt på grænsen til platformen. Dette kan forekomme, hvis fluerne ikke kan flyve men gang og ud af den brugerdefinerede ROI. I de fleste tilfælde kan vælge igen ROI (montering det så meget som muligt til platformen) nemt løse problemet. Men “Øen Assay analyse” scriptet er købedygtig opdager og korrekte forkert data tæller forårsaget af fluer gå ind og ud af ROI relativt godt. Selv om løsningen af webcam præsenteres her er høj nok til at diskriminere fluer i umiddelbar nærhed af temmelig godt, vi har gennemført yderligere algoritmer i billedet forædling af makroen“Drosophila ø Assay” som den vandskel og erodere funktion17. Disse lette den korrekte afgrænsning af fluer, der er i umiddelbar nærhed på platformen. Derudover makroen er ude af stand til at skelne mellem fluer, der sprang fra platformen eller fløj væk fra det. Ikke desto mindre, det generelt bemærkes, at sunde unge flyve stammer flyve væk straks når slippes på platformen, der henviser til, at ældre fluer og fluer med bevægeapparatet underskud forbliver længere på platformen og vil til sidst hoppe eller falde af platformen. På trods af disse begrænsninger giver analyse og analyse en meget nøjagtig måling af bevægeapparatet adfærd.
For at sikre vellykket udførelsen af scriptet “Øen Assay analyse”, har brugeren til at sørge for at angive de korrekte stier for input og output filer i script rækker angivet i protokollen og til at levere data i den korrekte mappe format (som angivet i figur 2). Hvis brugeren finder de kriterier, der bruges til at bortfiltrere upålidelige forsøgsdata for strenge (række 68: den første værdi i kolonnen “Tæller” er mindre end eller lig med 5, og række 71: den første værdi i kolonnen “Tæller” er højere end det samlede antal fluer smidt på platfor RM + 3), slukke disse filterindstillinger ved at tilføje en # foran teksten i rækker 68 og 71 i scriptet “Øen Assay analyse”. I dette tilfælde medtages alle datasæt i analysen. Alternativt, filterindstillinger kan ændres ved at justere værdierne i rækker, 68 og 71 efter brugernes behov. Muligt artefakter i Tæl værdier i “results.txt” genereret af makroen“Drosophila ø Assay” kan også justeres manuelt og køre scriptet igen på den justerede data. Når brugeren er interesseret i mere end 10 fps, eller mere end 10 s data, antallet af rammer, der behandles af scriptet “Øen Assay analyse” børjusteres. Den statistiske analyse kan også erstattes af brugerdefinerede alternativer.
En mappe kaldet “Eksempler på øen Assay,” indeholdende eksempler med billede tidsserier fremstillet ved hjælp af øen assay, kan findes på følgende websted: https://doi.org/10.6084/m9.figshare.4309652.v1. Download mappen “Eksempler på øen Assay” og følg de trin, der beskrives i denne protokol til hurtigt blive fortrolig med strukturen af fil opbevaring, forarbejdning af billederne med makroen “Drosophila ø analyse” og “Ø Assay analyse” script.
Øen assay, kan i kombination med den udviklede makro og analyse script, bruges til at evaluere og kvantificere den afvigende bevægelse opførsel af en Drosophila model af ataksi Telangiectasia. Eftersom analysen kan anvendes effektivt til forskellige aldre, er det velegnet til at analysere den potentielt progressive karakter af fænotyper.
I Resumé er ø-analysen i kombination med“Drosophila ø Assay” makro og scriptet “Øen Assay analyse” en omkostningseffektiv, pålidelig og yderst effektive assay til objektivt at analysere og kvantificere bevægeapparatet defekter af Drosophila modeller af bevægelsesforstyrrelser i en høj overførselshastighed måde.
The authors have nothing to disclose.
Vi anerkender Vienna Drosophila Resource Center og Bloomington Drosophila stock center (NIH P40OD018537) for at give Drosophila stammer. Vi er taknemmelige for Klämbt laboratoriet for at indføre os til øen analysen og Martijn Eidhof til opbygning af øen assay setup. Denne undersøgelse var i en del understøttes af E-sjælden-3 fælles tværnationale kalder give, “Forberede autosomal recessiv ataxias terapier” Forbered (NWO 9003037604), af en TOP tilskud (912-12-109) fra den nederlandske organisation for videnskabelig forskning (NWO), og af to DCN/Radboud University Medical Center ph.d.-stipendier. Finansieringskilderne spillede ingen rolle i undersøgelse design, dataindsamling og analyse, beslutningen om at offentliggøre eller forberedelse af manuskriptet.
25 x 95 mm Drosophila vials | Flystuff | 32-116SB | – |
Logitech C525 HD Webcam | Logitech | – | Any webcam with USB connection is suitable. |
Stand to hold webcam | – | – | – |
Lamp | – | – | 12 V LED lights are appropriate |
Pounding pad | – | – | Any mouse pad works |
Island Assay box | – | – | Dimensions 40x35x2.5 cm. Hole 20×30 cm. Transparent. |
Island Assay bath | – | – | Dimensions 42x38x25 cm. Non white. |
Island/platform | – | – | Dimensions 42x38x25 cm. Uniform white. |
Soap | – | – | Standard dishwashing detergent is suitable. |
Computer | – | – | Scripts run both on Windows and Mac |
Image-recording software: HandiAvi® | AZcendant® | – | HandyAvi is only compatible with Windows and has been described throughout the manuscript. It can be downloaded from: http://www.azcendant.com/DownloadHandyAvi.html (version 5.0) |
Image-recording software: WebcamCapture | – | – | Fiji/ImageJ plugin that can be used on Mac alternative to HandyAvi for image-recordings and can be downloaded from: https://imagej.nih.gov/ij/plugins/webcam-capture/ When using this method, the user has to use the same folder setup and image-recording settings indicated in this manuscript, with the exception that for each experimental replicate, the captured image stack should be exported as Stack.tiff to the corresponding experimental replicate folder. Upon running the "Drosophila Island Assay" macro on this data, no text should be present in the "First frame identifier" setting. |
Fiji | – | – | Version 1.4 or higher, can be downloaded from: https://figshare.com/s/def4197ee0010b21a76f |
R studio | – | – | Can be downloaded from: https://www.rstudio.com/products/rstudio/download/ |
R | – | – | Version 3.3.2, can be downloaded from: https://cran.rstudio.com |