Ön analysen är en relativt ny, kostnadseffektiv analys som kan användas för att utvärdera grundläggande rörelseapparaten beteendet hos Drosophila melanogaster. Detta manuskript beskrivs algoritmer för automatisk databehandling och objektiv kvantifiering av ön test data, vilket gör detta test en känslig, hög genomströmning avläsning för stora genetiska eller farmakologiska skärmar.
Framsteg i nästa generations sekvensering teknik bidra till identifieringen av sjukdomsgener (kandidat) för rörelsestörningar och andra neurologiska sjukdomar med ökande hastighet. Men är lite känt om de molekylära mekanismer som ligger bakom dessa sjukdomar. Genetiska, molekylär och beteendemässiga verktygslådan för Drosophila melanogaster gör denna modellorganism särskilt användbart att karaktärisera nya sjukdomsgener och mekanismer på ett sätt som hög genomströmning. Dock kräver hög genomströmning skärmar effektiva och tillförlitliga analyser som helst är kostnadseffektiva och möjliggöra automatiserade kvantifiering av drag relevanta för dessa sjukdomar. Den ön-analysen är ett kostnadseffektivt och enkelt set-up metod att utvärdera Drosophila rörelseapparaten beteende. I denna analys kastas flugor på en plattform från en fast höjd. Detta framkallar en medfödd motoriska respons som gör flugorna till fly från plattformen inom sekunder. För närvarande görs kvantitativa analyser av filmade ön analyser manuellt, vilket är ett mödosamt företag, särskilt när du utför stora skärmar.
Detta manuskript beskriver ”Drosophila ön Assay” och ”ön Assay analys” algoritmer för hög genomströmning, automatisk databehandling och kvantifiering av ön assay data. I setup samlar en enkel webbkamera ansluten till en laptop en bild serie av plattformen medan analysen utförs. ”Drosophila ön Assay” algoritmen utvecklades för programvaran öppen källkod Fiji bearbetar dessa bild-serier och kvantifierar, för varje experimentella villkor, antalet flugor på plattform över tid. ”Ön Assay analys” skriptet, förenlig med den fria programvaran R, utvecklades till automatiskt bearbeta de erhållna uppgifterna och för att beräkna om behandlingar/genotyper skiljer sig statistiskt. Detta kraftigt förbättrar effektiviteten i ön analysen och gör det en kraftfull avläsning för grundläggande locomotion och flykt beteende. Det kan således tillämpas på stora skärmar undersöker flyga motorisk förmåga, Drosophila modeller av rörelsestörningar och läkemedlet effekt.
Under de senaste åren har framsteg inom nästa generations sekvensering teknik i hög grad bidragit till identifiering av gener bakom degenerativa rörelsestörningar av hjärnan (t.ex., cerebellär ataxi och Parkinson), av perifer neuronala ursprung (t.ex. amyotrofisk lateralskleros och hereditär spastisk paraplegi), och av muskulär ursprung (t.ex. Duchennes muskeldystrofi och internationellt dystrofi)1,2,3,4 . Trots detta är lite känt om de molekylära mekanismer som ligger bakom de flesta av dessa sjukdomar. En bättre förståelse av dessa mekanismer är viktigt att utveckla terapier.
Som hos människor styrs rörelse i modellorganismer, såsom flyg och förflyttning i Drosophila, av centrala hjärnan, perifera nervsystemet och musklerna. Dessutom gör snabb generationstid och genetiska uppsättning Drosophila denna modellorganism särskilt lämplig för high-throughput screening av gener involverade i rörelsestörningar och för drogtester5,6 . På grund av det betydande antalet villkor som måste testas i sådana skärmar, pålitlig, kostnadseffektiv, och relativt enkla analyser, samt verktyg för att kvantifiera produktionen resultaten på ett automatiserat sätt, är mycket önskvärda.
Schmidt m.fl. (2012) 7 beskrivs en låg kostnad test som kallas ”ön analysen” att utvärdera Drosophila rörelseapparaten beteende. Ön analysen har använts framgångsrikt i storskaliga filmvisningar för att identifiera gener med glia-specifika funktioner7, i utvärderingen av Drosophila modeller av utvecklingsstörning8och för den allmänna utvärderingen av flyga motor beteende9. Principen om utformningen av ön analysen består av en förhöjd plattform där flera flugor kastas. Detta framkallar en medfödd motoriska beteende som gör att friska flugor att fly från plattformen inom sekunder. Analysen mäter antalet flugor kvar på plattformen över tid7,8,9. Alla dessa funktioner visar att ön analysen kan vara ett kraftfullt screeningverktyg för genernas rörelsestörningar.
För närvarande, görs kvantitativ analys av filmade ön assay data manuellt7,8,9. För att förbättra effektiviteten i analysen, utvecklades en billig metod för att kvantifiera halvautomatiskt flykten av flugor från plattformen. Inställningen använder en enkel webbkamera ansluten till en bärbar dator att samla in bild, tid serie av plattformen, med ramar förvärvade varje 0,1 s. bildrutorna behandlas sedan med makrot ”Drosophila ön Assay” som kvantifierar antalet flugor på plattform över tid. Makrot ”Drosophila ön Assay” är uppdelad i tre oberoende sub makron: (I) ”skapa stack och projektion”, sub makro identifierar olika island experiment lagras i olika undermappar och skapar en stack och en projektion av varje tidsserier. (II) ”definiera plattform” sub makro öppnas konsekutivt alla ”Projection_image_name.tif”-filer som finns i enskilda experimentella undermappar, vid vilken punkt ombeds användaren manuellt definiera ön plattformen som regionen av intresse (ROI). (III) ”analys” kvantifierar automatiskt antalet flugor kvar på plattformen under tidsserierna. Sub makron kan köras efter varandra (i en kör) eller självständigt. För statistisk dataanalys utvecklades ett skript automatiskt bearbeta de erhållna uppgifterna och tillämpa ett statistiskt test för att avgöra om behandlingar/genotyper beter sig signifikant från varandra (figur 1). Slutligen, är det visat att denna inställning kan användas för att utvärdera och kvantifiera en Drosophila modell för ataxi-telangiektasi (AT) avvikande motorisk förmåga.
Det här protokollet beskriver makrot ”Drosophila ön Assay”, som kvantitativt bedömer Drosophila motoriska beteende under ön analysen. Makrot räknar exakt flugorna på plattformen över tid, vilket gör ön analysen mycket känsliga och lämpar sig för kvantitativa hög genomströmning utvärdering av rörelseapparaten defekter. Metoden möjliggör jämförelse av alla tillstånd, med flugor som odlas under olika genetiska och/eller miljömässiga förhållanden, inklusive läkemedelsexponering. Denna avläsning är således särskilt användbar som upptäckt verktyg när du utför stora genetiska eller farmaceutiska skärmar, när man studerar Drosophila modeller av rörelsestörningar och andra neurologiska sjukdomar eller vid prövningen av förflyttning eller flyg beteende.
Protokollet ön analys presenteras i detta manuskript har fördelar jämfört med befintliga/alternativa metoder. Video-tracking locomotion är exempelvis mycket mer tidskrävande och mindre lämplig för att testa stora urvalsstorlekar. Ön analysen är en high-throughput screeningverktyg, och i denna mening, är jämförbar med den snabba interaktiva negativa geotaxis (RING) assay16. Skillnaden mellan två är att ön analyserna möjliggör upptäckt av ett bredare spektrum av rörelseapparaten problem; flugor oförmåga att lämna plattformen kan orsakas av defekter i flykt, hoppning, eller promenader beteende orsakas av wing (muskel/neuronala) och/eller ben (muskel/neuronala) defekter. Däremot, bedömer RING analysen defekter i klättring/vandring beteende orsakas av benet (muskel/neuronala) defekter. Om användare är intresserad av flera behavioral utläsningar, kan ön analysen också lätt kombineras med andra analyser, såsom RING analysen. Dessutom lasrar krävs för optogenetik kan enkelt installeras i rutan ön assay, och installationen är så enkel att den enkelt kan flyttas till ett rum där temperatur och ljus kan kontrolleras.
För att säkerställa framgång och reproducerbarhet av ön analysen beskrivs här, bör flera rekommendationer följas. Delprov och överföring flugorna på experimental prov injektionsflaskor på minst en dag innan experimentet att undvika effekterna av CO2 eller kalla anestesi. Inte överbefolka de experimentella injektionsflaskorna (Använd 10-15 flugor per injektionsflaska, är det bäst att placera alltid samma antal flugor per injektionsflaska). Hålla flugorna på färsk mat hela tiden. Om inte ännu bekant med genomför analysen, praktiken kasta flyger in på plattformen för att maximera avkastningen. Även öva snabbt Upprullningskraften handen rätt efteråt, eftersom det stör dataanalys (bildanalys och flyga räknar start först efter handen är ute ur bilden). Hålla de miljömässiga och experimentella förhållandena identiska i experiment som behöver jämföras (t.ex. kontroller kontra mutanter eller en genotyp testad vid olika åldrar). Alltid utföra experimenten vid samma tid på dagen och underhålla injektionsflaskorna under kontrollerad temperatur och luftfuktighet. För statistisk power, testa minst tre tekniska replikat per biologiska replikat.
Att säkerställa att framgångsrika på det makro som beskrivs här, Webbkamera och bildinställningarna måste justeras för att uppnå maximal kontrast: flugor som visas som svarta objekt på en vit plattform. När antalet flugor inte räknas korrekt av makrot, justera kontrastinställningarna för, om ROI är ordentligt markerad och säkerställa att storleken på flugorna på plattformen är ovan angivna minsta flyga storlek inställning (se steg 8,3 i detta protokoll). Inställningarna behöver bara definieras en gång. De är tillämpliga på alla experiment, så länge som avståndet mellan webbkameran och plattformen inte ändras. Den Circularity_min och max inställningar definierar loopkontroll av partiklarna (partiklar = räknade flugor) som kommer att beaktas för analys (flyger = räknade objekt). 1 representerar en perfekt cirkel och 0 representerar en linje17. Eftersom flugorna medför alltid en viss grad av rörlighet i båda riktningarna (en fluga inte kan visas som en rak linje), den ”Circularity_max”-inställningen är inställd på 1 och inställningen ”Circularity_min” är inställd på 0,4. Det är osannolikt att användaren behöver justera dessa inställningar.
Makrot gör ibland räkna misstag när en fluga ligger nära gränsen till plattformen. Detta kan inträffa om flugor inte kan flyga men promenad och ur den användardefinierade ROI. I de flesta fall kan förnyad markering ROI (montering det så mycket som möjligt till plattformen) enkelt lösa problemet. Dock ”ön Assay analys” skriptet är kan upptäcka och rätta felaktig data räknar orsakas av flugor som går in och ut ur ROI relativt väl. Även om resolutionen av den webbkamera som presenteras här är tillräckligt hög för att diskriminera flugor i närheten ganska väl, vi har infört ytterligare algoritmer i förfarandet bild bearbetning av ”Drosophila ön Assay” makrot, såsom den vattendelare och urholka funktion17. Dessa underlättar korrekt avgränsningen av flugor som finns i närheten på plattformen. Makrot är dessutom inte kan skilja mellan flugor som hoppade från plattformen eller flög bort från den. Det är dock allmänt observerats att friska unga flyga stammar flyga bort omedelbart när släpps på plattformen, medan äldre flugor och flugor med rörelseapparaten underskott finns kvar längre på plattformen, och kommer så småningom hoppa eller falla av plattformen. Trots dessa begränsningar ger den analys och analys ett mycket exakt mått på rörelseapparaten beteende.
För att säkerställa lyckade utförandet av skriptet ”ön Assay analys”, har användaren att se till att ange rätt sökvägar för input och output filer i skriptet rader anges i protokollet och tillhandahålla data i formatet rätt mapp (som anges i figur 2). Om användaren finner de kriterier som används för att filtrera ut opålitliga experimentella data för stränga (rad 68: det första värdet i kolumnen ”räknas” är mindre än eller lika med 5; rad 71: det första värdet i kolumnen ”antal” är högre än det totala antalet flugor kastas på plat RM + 3), Stäng av dessa filterinställningar genom att lägga till en # framför texten i rader 68 och 71 i skriptet ”ön Assay analys”. I detta fall inkluderas alla datamängder i analysen. Alternativt kan filterinställningarna ändras genom att justera värdena i raderna 68 och 71 enligt användarnas behov. Möjliga artefakter i räknas värdena i den ”resultat.txt” genereras av makrot ”Drosophila ön Assay” kan också justeras manuellt, och skriptet kan köras igen på justerade data. När användaren är intresserad bearbetning mer än 10 fps, eller mer än 10 s data, antalet ramar som bearbetas av skriptet ”ön Assay analys” börjusteras. Den statistiska analysen kan också ersättas av användardefinierade alternativ.
En mapp som heter ”exempel på ön Assay”, som innehåller exempel med bild tidsserier erhålls med ön analys, kan hittas på följande webbplats: https://doi.org/10.6084/m9.figshare.4309652.v1. Ladda ner mappen ”exempel på ön Assay” och följ stegen som beskrivs i detta protokoll för att snabbt bli förtrogna med strukturera av fillagring, bearbetning av bilder med makrot ”Drosophila ön assay”, och ”ön Assay analys” skriptet.
Ön analysen, kan i kombination med den utvecklade makro och analys script, användas för att utvärdera och kvantifiera avvikande rörelse beteendet hos en Drosophila modell av ataxi-telangiektasi. Eftersom analysen kan tillämpas effektivt på olika åldrar, är det väl lämpad att analysera potentiellt progressiva natur av fenotyper.
Sammanfattningsvis är ön analysen, i kombination med makrot ”Drosophila ön Assay” och ”ön Assay analys” skriptet, en kostnadseffektiv, tillförlitlig och mycket effektiv analys att objektivt analysera och kvantifiera rörelseapparaten defekter i Drosophila modeller av rörelsestörningar på ett sätt som hög genomströmning.
The authors have nothing to disclose.
Vi erkänner Vienna Drosophila Resource Center och Bloomington Drosophila lager center (NIH P40OD018537) för att tillhandahålla Drosophila stammar. Vi är tacksamma till Klämbt laboratoriet för att införa oss till ön analysen och Martijn Eidhof för att bygga den ön assay setup. Denna studie var delvis stöds av det E-sällsynta-3 gemensamma transnationella ringer bevilja ”förbereda terapier för autosomal recessiv ataxias” Förbered (NWO 9003037604), av ett TOP bidrag (912-12-109) från Nederländerna organisationen för vetenskaplig forskning (NWO), och av två DCN/Radboud University Medical Center PhD fellowships. Finansiärerna hade ingen roll i studiedesign, datainsamling och analys, beslut om att offentliggöra eller beredning av manuskriptet.
25 x 95 mm Drosophila vials | Flystuff | 32-116SB | – |
Logitech C525 HD Webcam | Logitech | – | Any webcam with USB connection is suitable. |
Stand to hold webcam | – | – | – |
Lamp | – | – | 12 V LED lights are appropriate |
Pounding pad | – | – | Any mouse pad works |
Island Assay box | – | – | Dimensions 40x35x2.5 cm. Hole 20×30 cm. Transparent. |
Island Assay bath | – | – | Dimensions 42x38x25 cm. Non white. |
Island/platform | – | – | Dimensions 42x38x25 cm. Uniform white. |
Soap | – | – | Standard dishwashing detergent is suitable. |
Computer | – | – | Scripts run both on Windows and Mac |
Image-recording software: HandiAvi® | AZcendant® | – | HandyAvi is only compatible with Windows and has been described throughout the manuscript. It can be downloaded from: http://www.azcendant.com/DownloadHandyAvi.html (version 5.0) |
Image-recording software: WebcamCapture | – | – | Fiji/ImageJ plugin that can be used on Mac alternative to HandyAvi for image-recordings and can be downloaded from: https://imagej.nih.gov/ij/plugins/webcam-capture/ When using this method, the user has to use the same folder setup and image-recording settings indicated in this manuscript, with the exception that for each experimental replicate, the captured image stack should be exported as Stack.tiff to the corresponding experimental replicate folder. Upon running the "Drosophila Island Assay" macro on this data, no text should be present in the "First frame identifier" setting. |
Fiji | – | – | Version 1.4 or higher, can be downloaded from: https://figshare.com/s/def4197ee0010b21a76f |
R studio | – | – | Can be downloaded from: https://www.rstudio.com/products/rstudio/download/ |
R | – | – | Version 3.3.2, can be downloaded from: https://cran.rstudio.com |