Summary
Olfaktoriske sensoriske nevroner uttrykker et bredt utvalg av akson-sorteringsmolekyler for å etablere riktig neural kretsløp. Denne protokollen beskriver en immunhistokjemisk fargemetode for å visualisere kombinatoriske uttrykk for akson-sorteringsmolekyler ved axonterminalene til olfaktoriske sensoriske nevroner.
Abstract
Muselaktiveringssystemet brukes ofte til å studere mekanismer for neurale kretsdannelser på grunn av sin enkle anatomiske struktur. En Olfactory Sensory Neuron (OSN) er en bipolar celle med en enkelt dendrit og en enkelt unbranched axon. Et OSN uttrykker bare ett Olfaktorisk Receptor (OR) -gen, OSN som uttrykker en gitt type OR, konvergerer deres axoner til et par sett med invariant glomeruli i Olfactory Bulb (OB). Et bemerkelsesverdig trekk ved OSN-projeksjon er at de uttrykte OR-er spiller lærerikt roller i aksonal projeksjon. ORer regulerer uttrykket for flere akson-sorteringsmolekyler og genererer den kombinatoriske molekylekoden for akson-sorteringsmolekyler ved OSN axon termini. For å forstå de molekylære mekanismene til OR-spesifikke axon-styringsmekanismer, er det derfor viktig å karakterisere uttrykksprofiler på OSN axon termini innenfor samme glomerulus. Formålet med denne artikkelen var å introdusere metoder for å samle så mange glomeruli som muligE på en enkelt OB-seksjon og for å utføre immunfarvning ved bruk av flere antistoffer. Dette ville tillate sammenligning og analyse av ekspressionsmønstrene av akson-sorteringsmolekyler uten fargevariasjon mellom OB-seksjoner.
Introduction
Under utvikling er nevroner nettopp forbundet med hverandre for å danne skikkelige nevrale kretser, noe som er kritisk for normal hjernefunksjon. Siden avvikende nevrale kretser i hjernen antas å være årsaken til psykiske lidelser som autisme og schizofreni, er forståelsen av mekanismer for nevralkretsdannelse en av de store utfordringene innen nevrovitenskap.
I det museolfaktoriske systemet uttrykker hver Olfactory Sensory Neuron (OSN) i Olfactory Epithelium (OE) bare ett funksjonelt olfaktorisk reseptor (OR) -gen og OSN som uttrykker det samme OR konvergerer deres axoner til et bestemt par glomeruli på stereotype steder i Olfactory Bulb (OB) 1 , 2 . Muselaktiveringssystemet er et utmerket modellsystem for å studere molekylære mekanismer for dannelsen av neural krets fordi forskere kan benytte OR uttrykket til å identifisere en bestemt sUbtype av OSN og visualisere projeksjonsstedene til OSN-axoner som klare glomerulære strukturer. Et bemerkelsesverdig trekk ved OSN-projeksjon er at ORer spiller instruerende roller i å projisere OSN-axoner til OB 3 , 4 , 5 , 6 . Nærmere bestemt, etter at OSN-axoner er veiledet til omtrentlige målområder, blir de segregert for å danne glomerulus på en OR-avhengig måte. Tidligere studier har vist at OR molekyler styrer uttrykket for akson-sorteringsmolekyler, som regulerer glomerulær segregering 7 , 8 . Videre antyder akkumulerende bevis at OR-molekyler genererer den neuronale identitetskoden ved en unik kombinasjon av akson-sorteringsmolekyler 9 . For å forstå mekanismen for OR-avhengig glomerulær segregering er det derfor nødvendig å karakterisere uttrykksprofilene for akson-sortering molEcules i OSNs.
Fluorescerende immunfarging er en vanlig metode for å visualisere uttrykket av bestemte gener. Siden proteiner av akson-sorteringsmolekyler overveiende er lokalisert til OSN-axoner, må forskere bruke OB-seksjoner til å karakterisere deres uttrykksmønstre i OSN-er. Koronalt snitt av OB har blitt rutinemessig brukt til immunfarging. Imidlertid mister dette preparatet den topografiske informasjonen langs den fremre og bakre akse i samme OB-seksjon. Vi utviklet derfor et parasagittalt preparat av OB-medialsiden, som kan montere så mange omgivende glomeruli som mulig på den samme OB-delen. Kombinert med immunfarging ved bruk av flere antistoffer tillater dette preparatet sammenligning og analyse av ekspressionsmønstrene av akson-sorteringsmolekyler uten farging av variasjon mellom OB-seksjoner.
Videre er en immunohistokjemisk fargemetode blitt presentert uten post-fiksering med PFA aOg sukrosebehandling. Denne metoden tillater forskere å skaffe tilstrekkelig fargedata av høy kvalitet for multivariabel dataanalyse. Protokollene som presenteres her, vil gi detaljer om kraftige metoder for forskere som studerer den olfaktoriske nevrale kretsdannelsen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle eksperimentelle prosedyrer ble utført med godkjenning av dyreforsøkets etikkomité ved universitetet i Tokyo og i henhold til retningslinjene fra Tokyo University for pleie og bruk av laboratoriedyr.
1. Fremstilling av løsninger
- Tilbered 0,01 M fosfatbuffert saltvann (PBS): Tilsett en PBS-tablett (0,14 M NaCl, 0,0027 M KCl, 0,010 M PO 4 3- , pH 7,4) til 1 L destillert vann og rør ved RT til det er fullstendig oppløst.
- Tilbered 4% paraformaldehyd (PFA) i PBS: tilsett 4 g PFA til 100 ml PBS. Rør oppløsningen ved 60 ° C til den er fullstendig oppløst.
- Etter oppløsning av PFA i PBS, juster pH av oppløsningen til 7,4 med 1 N natriumhydroksyd (NaOH). Deretter avkjøles på is og filtrerer løsningen gjennom et filterpapir for å fjerne partikler. Oppbevares ved 4 ° C.
Forsiktig: Vær forsiktig når du bruker disse reagensene. HåndtakBruk forsiktig og bruk hansker, vernebriller og labjakke under en kjemisk hette.
MERK: Bruk fersk 4% PFA-løsning tilberedt innen 2 d.
- Etter oppløsning av PFA i PBS, juster pH av oppløsningen til 7,4 med 1 N natriumhydroksyd (NaOH). Deretter avkjøles på is og filtrerer løsningen gjennom et filterpapir for å fjerne partikler. Oppbevares ved 4 ° C.
- Forbered 0,01 M PBS tilsatt 0,3% Triton X-100 (PBST): Tilsett 3 ml Triton X-100 til 997 ml PBS. Rør oppløsningen ved romtemperatur til den er fullstendig oppløst.
- Klargjør 1% og 5% blokkering: Tilsett 10 g skummet melk til 200 ml PBST for å forberede 5% blokkering. Rør ved RT til den er helt oppløst. Fortynn 5% blokkeringsløsning fem ganger med PBST for å forberede 1% blokkeringsløsning.
2. Fremstilling av parasagittale OB-seksjoner
- Bruk dyr mellom 1-2 ukers alder. Disse aldersgruppene er egnet for følgende eksperimenter fordi glomeruli er tydelig synlige og hjernen kan bli kuttet med skallen.
- Bedøv dyret med en intraperitoneal injeksjon av pentobarbital (50 mg / kg kroppsvekt). Perfuse dyret transcartielt med iskall 4% PFA i PBS. Håndter omhyggelig og bruk hansker, vernebriller og labjakke under en kjemisk hette.
- Etter perfusjon, kutt av hodet med saks og fjern huden forsiktig. Deretter setter du et saksblad inn i mellomrommet mellom de øvre og nedre tennene og kutt horisontalt for å fjerne underkjeven. Trim bort overflødig vev med tau og saks for å forlate det olfaktive vevet, inkludert OB og OE.
MERK: Ikke fjern skallen som omgir OB, da dette beholder medial glomeruli rettet vertikalt rett. - Dyp det olfaktive vevet i PBS for å fjerne luften i nesehulen. Kutt av den bakre delen av hjernen loddrett og legg det olfaktive vevet på bunnen av innføyningsformen med skjæreflaten nedover. Fyll støpeformen med Optimal Cutting Temperature (OCT) -blanding og senk formen til flytende nitrogen.
- Etter at vevet i forbindelsen er helt frosset, inkuber det i kryoteneTat ved -20 ° C i 1 time.
- Lag serielle parasagittale seksjoner (10 μm) av OB med en kryostat og samle dem ved å stikke til MAS-belagte glassruter. Etter å ha stanset, tørk lysbildene umiddelbart med en tørketrommel.
3. Dag 1: Quadruple Immunostaining av OB Skiver
- Vask lysbildene i 5 minutter med PBS ved RT. Gjenta 3 ganger.
- Blokker de ikke-spesifikke bindingsstedene ved inkubering av lysbildene i 1 time med 5% blokkeringsoppløsningen ved RT.
- Inkubér lysbildene O / N med en cocktail av primære antistoffer (400 μl hvert lysbilde) i 1% blokkeringsløsningen ved RT. Bruk følgende primære antistoffer: marsvin anti-Kirrel2 antistoff (1: 1000), geit anti-semaforin-7A (Sema7A) antistoff (1: 500), rotte anti-OL-protokadherin (OLPC) antistoff (1: 500), Og anti-vesikulær glutamat-transportør2-mus (VGLUT2) antistoff (1: 500).
4. Dag 2: Firedobbelt immunforsvar av OBSlices
- Kast den primære antistoffoppløsningen og vask dysene i 5 min med PBST ved RT. Gjenta 3 ganger.
- Inkubér lysbildene i 1 time med en cocktail av sekundære antistoffer (400 μl hvert lysbilde) i PBS ved RT. Bruk følgende sekundære antistoffer: esel anti-mus Alexa Fluor 405 (1: 400), esel-anti-geit Alexa Fluor 488 (1: 400), esel anti-marsvin Alexa Fluor 555 (1: 400) og esel anti- Rotte Alexa Fluor 647 (1: 400).
MERK: Alle sekundære antistoffer skal komme fra samme vertsart. Velg en annen bølgelengde av fluorescens av sekundære antistoffer for hvert primært antistoff for å sikre ingen overlapping av bølgelengder. - Kast løsningen og vask lysbildene i 5 minutter med PBS ved RT. Gjenta 3 ganger.
- Monter dekslene på lysbildene med monteringsmediet. For dette gjelder 2 dråper med monteringsmediet på hvert lysbilde, og legg deretter en deksel ved å fjerne luftboblene.
5. Intensitet Measurements
- Hent fluorescerende bilder med et fluorescensmikroskop. Bruk følgende filterkasser: DAPI filterkube (360/40 nm excitasjon, 460/50 nm utslipp og 400 nm dikroisk speil) for Alexa Fluor 405 signaler, GFP filterkube (470/40 nm excitasjon, 525/50 nm emisjon, Og 495 nm dikroisk speil) for Alexa Fluor 488, TRITC filterkube (545/25 nm excitasjon, 605/70 nm-utslipp og 565 nm dikroisk speil) for Alexa Fluor 555 og Cy5 filterkube (620/60 nm excitasjon, 700 / 75 nm-utslipp og 600 nm dikroisk speil) for Alexa Fluor 647.
Merk: Juster eksponeringstiden for å skaffe fluorescerende signaler av bildet uten metning. - Definer den glomerulære strukturen ved immunfluorescenssignaler av VGLUT2. Mål farvningsintensiteter av akson-sorteringsmolekyler i glomeruli med ImageJ.
6. Dataanalyse
- Subtrahere bakgrunnssignaler fra flekkintensiteten til akson-sorteringsmolekyler.
- Forbered thE uttrykksdata matrisen, som har kolonner sammensatt av akson-sorteringsmolekyler og rader sammensatt av glomeruli.
- Utfør en hovedkomponentanalyse (PCA) ved hjelp av det forberedte uttrykkdatasettet. Deretter få PCA-score, bidragsforhold og faktorbelastninger for hver hovedkomponent.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Det olfaktoriske glomerulære kartet dannes ved første globale målretting og etterfølgende glomerulær segregering av OSN-axonene 1 , 2 . Glomerulær segregering reguleres av adhesiv / repulsiv aksonal interaksjon mediert av akson-sorteringsmolekyler hvis ekspresjonsnivåer bestemmes av uttrykte OR-molekyler 7 . Axonsorteringsmolekylene som er involvert i glomerulær segregering, uttrykkes på en posisjon uavhengig mosaikk måte i OB 9 . I denne studien valgte vi følgende gener: Kirrel2 , Sema7A , OLPC , BIG-2 og PCDH17 . Noen av disse akson-sorteringsmolekylene uttrykkes på en aktivitetsavhengig måte 7 , 8 , 10 .
Den firedoble immunostiskeAining metode vist her tillot visualisering av uttrykksmønstre av fire molekyler samtidig i samme seksjon. Disse akson-sorteringsmolekylene viste posisjonuavhengige mosaikkuttrykk, men deres mønstre var ikke identiske ( figur 1A, B ). Den glomerulære strukturen ble definert av fluorescerende signaler av VGLUT2 ( figur 2A ). Axon-sorteringsmolekyler (Kirrel2, Sema7A, OLPC) ble differensielt uttrykt i hver glomerulus; VGLUT2, som ble brukt som en glomerulær markør, ble imidlertid jevnt uttrykt blant glomeruli ( figur 2B, 2C ).
En enkelt glomerulus kan betraktes som en dataenhet som er representert av flere variabler. For å analysere disse multivariate ekspressionsdataene ble hovedkomponentanalyse (PCA) utført. PCA definerer et nytt koordinatsystem, slik at den første koordinaten har de største variansdatasettene og at hver etterfølgendeKoordinat har størst residual varians. Ekspresdatasettene ble utsatt for PCA og plottet i løpet av den første og andre hovedkomponent (PC1 og PC2) ( Figur 3A ). Bidragsforholdet for hver hovedkomponent angir hvor mye prosentandel hver hovedkomponent representerer i variablernes totale tendens. Bidragstallene for PC1, PC2, PC3, PC4 og PC5 var henholdsvis 33,4%, 28,2%, 19,8%, 17,3% og 6,3% ( Figur 3B ). PCA avslørte også faktorbelastningene i hver hovedkomponent. De kvadratiske faktorbelastningene angir hvor mye prosent av variansen i en opprinnelig variabel forklares med en faktor. I PC1 ble faktorbelastningene av Sema7A, OLPC og Kirrel2 positivt lastet, mens de av BIG-2 og PCDH17 ikke var ( figur 3C ). En tidligere studie analyserte ekspresjonen av disse molekylene i de mutante musene mangelfull for den cykliske nukleoti Degated (CNG) kanalgen, som er en komponent av den olfaktoriske signaltransduksjonen 11 , og viste at mønstrene av CNG-avhengige endringer i ekspressionsnivåene ligner faktorbelastningene i PC1 9 . Disse resultatene antydet at forskjellige uttrykk for disse molekylene ble generert av CNG-kanal-mediert nevoral aktivitet.
Figur 1: Quadruple Immunostaining of a Parasagittal OB Section. ( A ) Skjematisk diagram over OE & OB. ( B ) En parasagittal OB-del fra en 2 uker gammel mus, immunostained med antistoffer mot v GLUT2 (hvit), Kirrel2 (rød), Sema7A (grønn) og OLPC (blå). Det fusjonerte bildet av Kirrel2 (rødt), Sema7A (grønt) og OLPC (blått) ble vist til høyre. Skalestenger = 100 μm./files/ftp_upload/55893/55893fig1large.jpg "target =" _ blank "> Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Ekspresjonsanalyse av Axon-sorteringsmolekyler. ( A ) En parasagittal olfaktorisk pære (OB) -seksjon immunforsterket med antistoffer mot VGLUT2 (lilla), Kirrel2 (rød), Sema7A (grønn) og OLPC (blå). Hver glomerulus er definert av fluorescerende signaler av VGLUT2 (presynaptisk markør). Glomerulære strukturer er omgitt av punkterte linjer. ( B ) Ekspressionsnivåer av Kirrel2, Sema7A og OLPC i glomeruli # 1, # 3, # 4 og # 6. Staining intensiteter av axon-sortering molekyler ble målt i hver glomerulus. ( C ) Ekspressjonsnivåer av akson-sorteringsmolekylene og VGLUT2 sammenlignet mellom glomeruli. Signalintensiteter av disse molekylene ble målt i eaCh glomerulus. Gråstenger på grafene indikerer gjennomsnittet av uttrykksnivå. Skalbjelke = 100 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: PCA av uttrykksdata for akson-sorteringsmolekyler. ( A ) Principal komponentanalyse (PCA) score biplots (PC1 vs PC2) av uttrykkdatasettet av fem akson-sorteringsmolekyler (Kirrel2, Sema7A, OLPC, BIG-2 og PCDH17). I alt 1799 glomeruli ble analysert. ( B ) Bidragsforholdene og kumulative bidragsforholdene for alle fem hovedkomponentene. Bidragsforholdene for PC1, PC2, PC3, PC4 og PC5 er henholdsvis 0,344, 0,282, 0,198, 0,173 og 0,063. ( C ) Faktorbelastningen av Kirrel2, Sema7A, OLPC, BIG-2 og PCDH17 i PC1-3. Egenverdier av PC1, PC2 og PC3 er henholdsvis 1,67, 1,16 og 0,99. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Firemanns immunostaining av parasagittale OB-seksjoner aktiverte visualiseringen og kvantifiseringen av ekspressionsnivåene av så mange som fire akson-sorteringsmolekyler samtidig i et større antall glomeruli. Ved å analysere disse multivariable dataene med PCA kan egenskapene for ekspresjonen av disse molekylene spekuleres.
For vellykket farging er vevsprøvepreparatet kritisk viktig. Noen protokoller tyder på at vev skal settes fast med 4% PFA og behandles med 30% sukrose for kryobeskyttelse. Disse trinnene ble imidlertid utelatt i denne protokollen. Dette skyldes at i mange tilfeller reduserer disse trinnene fargesignalintensiteten og øker bakgrunnen. Dessuten skal seksjoner ikke tørkes ut ved noen trinn for å unngå høy bakgrunn under farging.
Den optimale fargetilstanden er forskjellig avhengig av hvilke typer vev og antistoffer som benyttes. Derfor er det nødvendigY for å bestemme de spesifikke fargingsbetingelsene for hvert eksperiment. Videre er konsentrasjonen av primære antistoffer også viktig. Når konsentrasjonen er for høy, øker den bakgrunnen. Men når konsentrasjonen er for lav, reduseres signalet. Det er derfor viktig å identifisere den aktuelle konsentrasjonen av primære antistoffer for å oppnå høye fargestoffer. En begrensning er at denne metoden er avhengig av kvaliteten på de primære antistoffene og den primære antistoffkombinasjonen med hensyn til dyrearter.
Koronale deler av OB har blitt rutinemessig brukt til immunostaining. I denne protokollen ble imidlertid parasagittale deler av OB-medialsiden brukt til å plassere flere glomeruli på en enkelt seksjon. Siden disse delene opprettholder glomeruliets topografiske rekkefølge langs dorsal-ventrale og fremre og bakre akser, kan de også brukes til å analysere distribusjonsmønstrene avAkson-veiledningsmolekyler, som bestemmer projeksjonsstedene for OSN-axoner.
I denne studien ble parasagittale seksjoner av OB forberedt for å muliggjøre å plassere flere glomeruli på en enkelt seksjon. Videre kan horisontale seksjoner også være nyttige for forskere å avdekke forskjellene langs medial-lateral eller anterior-posterior akse. Med utviklingen av antistoffer som kan brukes til flere immunostainings, kan denne firedoble fargemetoden ikke bare brukes til OB, men også til andre hjerneområder.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen konkurrerende økonomiske interesser.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av Mitsubishi Foundation, Takeda Science Foundation, JST PRESTO og JSPS KAKENHI Grant Number 16H06144.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) Tablets, pH7.4 | TAKARA BIO | T9181 | |
| Skim Milk | nacalai tesque | 31149-75 | |
| goat anti-Sema7A antibody | R&D Systems | AF2068 | |
| rat anti-OLPC antibody | Merck Millipore | MABT20 | |
| mouse anti-VGLUT2 antibody | Merck Millipore | MAB5504 | |
| goat anti-BIG-2 antibody | R&D Systems | AF2205 | |
| gunea pig anti-Kirrel2 antibody | Operon Biotechnologies | Anti-Kirrel2 antibodies were generated by immunizing guinea pigs with KLH-conjugated synthetic peptides (644-673aa): CRLYRARAGYLTTPHPRAFTSYMKPTSFGP | |
| donkey anti-mouse Alexa Fluor 405 | Abcam | ab175658 | |
| donkey anti-goat Alexa Fluor 488 | Jackson ImmunoResearch | 705-545-003 | |
| donkey anti-guinea pig Alexa Fluor 555 | Thermo Fisher Scientific | A21432 | |
| donkey anti-rat Alexa Fluor 647 | Jackson ImmunoResearch | 712-605-153 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Wako | 162-16065 | |
| MAS coated slide glasses | MATSUNAMI | MAS-01 | |
| forceps | Fine Science Tools | 11253-27 | |
| Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools | 15000-00 | |
| dissecting scissors | Fine Science Tools | 14090-09 | |
| fluorescent microscope | KEYENCE | BZ-X700 | |
| DAPI filter cube | KEYENCE | OP-87762 | |
| GFP filter cube | KEYENCE | OP-87763 | |
| TRITC filter cube | KEYENCE | OP-87764 | |
| Cy5 filter cube | KEYENCE | OP-87766 | |
| filter paper | ADVANTEC | 00011185 | |
| O.C.T compound | Sakura Finetek | M71484 |
References
- Mori, K., Sakano, H. How is the olfactory map formed and interpreted in the mammalian brain? Annu Rev Neurosci. 34, 467-499 (2011).
- Takeuchi, H., Sakano, H. Neural map formation in the mouse olfactory system. Cell Mol Life Sci. 71, 3049-3057 (2014).
- Mombaerts, P., et al. Visualizing an olfactory sensory map. Cell. 87, 675-686 (1996).
- Feinstein, P., Mombaerts, P. A contextual model for axonal sorting into glomeruli in the mouse olfactory system. Cell. 117, 817-831 (2004).
- Ishii, T., et al. Monoallelic expression of the odourant receptor gene and axonal projection of olfactory sensory neurones. Genes Cell. 6, 71-78 (2001).
- Nakashima, A., et al. Agonist-independent GPCR activity regulates anterior-posterior targeting of olfactory sensory neurons. Cell. 154, 1314-1325 (2013).
- Serizawa, S., et al. A neuronal identity code for the odorant receptor-specific and activity-dependent axon sorting. Cell. 127, 1057-1069 (2006).
- Kaneko-Goto, T., Yoshihara, S., Miyazaki, H., Yoshihara, Y. BIG-2 mediates olfactory axon convergence to target glomeruli. Neuron. 57, 834-846 (2008).
- Ihara, N., Nakashima, A., Hoshina, N., Ikegaya, Y., Takeuchi, H. Differential expression of axon-sorting molecules in mouse olfactory sensory neurons. Eur J Neuro. 44, 1998-2003 (2016).
- Williams, E. O., et al. Delta Protocadherin 10 is Regulated by Activity in the Mouse Main Olfactory System. Front Neural Circuits. 5, 9 (2011).
- Brunet, L. J., Gold, G. H., Ngai, J. General anosmia caused by a targeted disruption of the mouse olfactory cyclic nucleotide-gated cation channel. Neuron. 17, 681-693 (1996).
