Summary
Olfaktoriske sensoriske neuroner udtrykker et bredt udvalg af axon-sorteringsmolekyler for at etablere et passende neuralt kredsløb. Denne protokol beskriver en immunhistokemisk farvningsfremgangsmåde til visualisering af kombinatoriske udtryk for axon-sorteringsmolekyler ved axon termini af olfaktoriske sensoriske neuroner.
Abstract
Muselaktorisk system bruges ofte til at studere mekanismer for neurale kredsløbsdannelse på grund af sin enkle anatomiske struktur. En Olfactory Sensory Neuron (OSN) er en bipolar celle med en enkelt dendrit og en enkelt unbranched axon. Et OSN udtrykker kun et olfaktorisk receptor (OR) gen, OSN'er, der udtrykker en given type OR, konvergerer deres axoner til et par sæt af invariant glomeruli i Olfactory Bulb (OB). Et bemærkelsesværdigt træk ved OSN-projektion er, at de udtrykte OR'er spiller instruktive roller i aksonal projektion. OR'er regulerer ekspressionen af multiple axon-sorteringsmolekyler og genererer den kombinatoriske molekylære kode for axon-sorteringsmolekyler ved OSN axon termini. For at forstå de molekylære mekanismer i OR-specifikke axonstyringsmekanismer er det derfor afgørende at karakterisere deres ekspressionsprofiler på OSN axon termini inden for samme glomerulus. Formålet med denne artikel var at indføre metoder til indsamling af så mange glomeruli som muligtE på en enkelt OB sektion og for at udføre immunfarvning ved anvendelse af flere antistoffer. Dette ville tillade sammenligning og analyse af ekspressionsmønstrene af axonsorteringsmolekyler uden farvningsvariation mellem OB sektioner.
Introduction
Under udvikling er neuroner nøjagtigt forbundet med hinanden for at danne egnede neurale kredsløb, hvilket er kritisk for den normale hjernefunktion. Da afvigende neurale kredsløb i hjernen antages at være årsagen til psykiske lidelser som autisme og skizofreni, er forståelsen af mekanismerne for neurale kredsløbsdannelse en af de største udfordringer inden for neurovidenskab.
I det museolfaktoriske system udtrykker hver Olfactory Sensory Neuron (OSN) i Olfactory Epithelium (OE) kun ét funktionelt olfaktorisk receptor (OR) gen, og OSN'er, der udtrykker det samme OR, konvergerer deres axoner til et specifikt par glomeruli på stereotype steder i Olfactory Bulb (OB) 1 , 2 . Muselaktorisk system er et fremragende model system til at studere de molekylære mekanismer ved dannelse af neuralkredsløb, fordi forskere kan udnytte OR udtrykket til at identificere en specifik sUbtype af OSN'er og visualisere projektionsstederne for OSN-axoner som klare glomerulære strukturer. Et bemærkelsesværdigt træk ved OSN-projektion er, at OR'er spiller instruktive roller i projektion af OSN-axoner til OB 3 , 4 , 5 , 6 . Mere specifikt, når OSN-axoner styres til omtrentlige målområder, bliver de adskilt for at danne glomerulus på en OR-afhængig måde. Tidligere undersøgelser har vist, at OR-molekyler regulerer ekspressionen af axon-sorteringsmolekyler, som regulerer glomerulær segregering 7 , 8 . Desuden antyder akkumulerende beviser, at OR-molekyler genererer den neuronale identitetskode ved en unik kombination af axonsorteringsmolekyler 9 . For at forstå mekanismen for OR-afhængig glomerulær segregering er det således nødvendigt at karakterisere ekspressionsprofilerne for axon-sortering molEcules i OSN'er.
Fluorescerende immunforaining er en fælles metode til at visualisere ekspressionen af specifikke gener. Da proteiner af axon-sorteringsmolekyler overvejende er lokaliseret til OSN-axoner, skal forskere bruge OB-sektioner til at karakterisere deres ekspressionsmønstre i OSN'er. Koronal snitning af OB har rutinemæssigt været anvendt til immunfarvning. Imidlertid mister dette præparat de topografiske informationer langs den anterior-posterior akse i samme OB-sektion. Vi udviklede derfor et parasagittalt præparat af OB's mediale side, som kan montere så mange omgivende glomeruli som muligt på samme OB-sektion. Kombineret med immunfarvning ved anvendelse af multiple antistoffer tillader dette præparat sammenligningen og analysen af ekspressionsmønstrene af axonsorteringsmolekyler uden farvningsvariation mellem OB-sektioner.
Endvidere er en immunohistokemisk farvningsmetode blevet præsenteret uden postfixering med PFA aNd saccharose behandling. Denne metode giver forskere mulighed for at opnå nok farvningsdata af høj kvalitet til multivariabel dataanalyse. Protokollerne, der præsenteres her, vil give detaljer om kraftige metoder til forskere, der studerer den olfaktoriske neurale kredsløbsdannelse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle eksperimentelle procedurer blev udført med godkendelse af dyreforsøgets etiske udvalg ved University of Tokyo og ifølge Tokyo-retningslinjerne for pleje og brug af forsøgsdyr.
1. Fremstilling af opløsninger
- Tilbered 0,01 M phosphatbufferet saltvand (PBS): Tilsæt 1 PBS tablet (0,14 M NaCl, 0,0027 M KCl, 0,010 M PO 4 3- , pH 7,4) til 1 liter destilleret vand og omrør ved stuetemperatur, indtil det er fuldstændigt opløst.
- Tilbered 4% paraformaldehyd (PFA) i PBS: Tilsæt 4 g PFA til 100 ml PBS. Rør opløsningen ved 60 ° C, indtil den er helt opløst.
- Efter opløsning af PFA i PBS skal du justere opløsningens pH til 7,4 med 1 N natriumhydroxid (NaOH). Derefter afkøles på is og filtreres opløsningen gennem et filterpapir for at fjerne partikler. Opbevares ved 4 ° C.
Forsigtig: Pas på omhyggeligt ved brug af disse reagenser. HåndtereMed omhu og brug handsker, sikkerhedsbriller og lab coat under en kemisk hætte.
BEMÆRK: Brug frisk 4% PFA opløsning tilberedt indenfor 2 d.
- Efter opløsning af PFA i PBS skal du justere opløsningens pH til 7,4 med 1 N natriumhydroxid (NaOH). Derefter afkøles på is og filtreres opløsningen gennem et filterpapir for at fjerne partikler. Opbevares ved 4 ° C.
- Tilbered 0,01 M PBS suppleret med 0,3% Triton X-100 (PBST): Tilsæt 3 ml Triton X-100 til 997 ml PBS. Rør opløsningen ved stuetemperatur, indtil den er helt opløst.
- Forbered 1% og 5% blokeringsopløsning: Tilsæt 10 g skummetmælk til 200 ml PBST for at forberede 5% blokeringsopløsning. Rør ved RT indtil det er helt opløst. Fortynd 5% blokeringsopløsning fem gange med PBST for at fremstille 1% blokeringsopløsning.
2. Fremstilling af parasagittale OB sektioner
- Brug dyr mellem 1-2 uger. Disse aldersgrupper er egnede til følgende eksperimenter, fordi glomeruli er tydeligt synlige, og hjernen kan skæres med kraniet.
- Bedøves dyret med en intraperitoneal injektion af pentobarbital (50 mg / kg legemsvægt). Perfuse dyret transcardially med iskold 4% PFA i PBS. Håndter forsigtigt og brug handsker, beskyttelsesbriller og lab coat under en kemisk hætte.
- Efter perfusion afskæres hovedet med en saks og fjernes huden forsigtigt. Derefter indsættes et saksblad i rummet mellem de øvre og nedre tænder og skæres vandret for at fjerne underkæbenbenet. Trim væk overskydende væv med tang og saks for at forlade det olfaktive væv, herunder OB og OE.
BEMÆRK: Fjern ikke kraniet omkring OB, da dette bevarer de mediale glomeruli rettet lodret lige. - Dyp det olfaktive væv i PBS for at fjerne luften i næsehulen. Afskær den bageste del af hjernen lodret og læg det olfaktive væv på bunden af indlejringsformen med skærefladen nedad. Fyld støbeformen med Optimal Cutting Temperature (OCT) -forbindelse og sænk derefter støbeformen i flydende nitrogen.
- Når vævet i forbindelsen er fuldstændigt frosset, inkuberes det i kryosterneTat ved -20 ° C i 1 time.
- Lav serielle parasagittale sektioner (10 μm) af OB med en kryostat og saml dem ved at klæbe til MAS-coatede glasskinner. Efter at have klæbet tørres gliderne straks med en tørretumbler.
3. Dag 1: Firedobbelt immunforsvar af OB-skiverne
- Vask diaserne i 5 minutter med PBS ved RT. Gentag 3 gange.
- Bloker de ikke-specifikke bindingssteder ved inkubering af diasene i 1 time med 5% blokeringsopløsningen ved RT.
- Inkubér diasene O / N med en cocktail af primære antistoffer (400 μl hvert dias) i 1% blokeringsopløsningen ved stuetemperatur. Brug følgende primære antistoffer: marsvin anti-Kirrel2 antistof (1: 1000), gede anti-semaforin-7A (Sema7A) antistof (1: 500), rotte anti-OL-protocadherin (OLPC) antistof (1: 500) Og anti-vesikulært glutamat-transportør2-mus (VGLUT2) antistof (1: 500).
4. Dag 2: Firdobbelt immunforsvar af OBskiver
- Kassér den primære antistofopløsning og vask skinnerne i 5 minutter med PBST ved stuetemperatur. Gentag 3 gange.
- Inkubér diasene i 1 time med en cocktail af sekundære antistoffer (400 μl hvert dias) i PBS ved stuetemperatur. Brug følgende sekundære antistoffer: æsel-anti-mus Alexa Fluor 405 (1: 400), æsel-anti-geit Alexa Fluor 488 (1: 400), æsel-anti-marsvin Alexa Fluor 555 (1: 400) og æsel anti- Rotte Alexa Fluor 647 (1: 400).
BEMÆRK: Alle sekundære antistoffer skal komme fra samme værtsart. Vælg en anden bølgelængde af fluorescens af sekundære antistoffer for hvert primært antistof for at sikre ingen overlapning af bølgelængder. - Kassér opløsningen og vask dyserne i 5 minutter med PBS ved stuetemperatur. Gentag 3 gange.
- Monter dækslip på gliderne med monteringsmediet. Til dette anbringes 2 dråber af monteringsmediet på hvert dias, og læg derefter en dæksel ved at fjerne luftboblerne.
5. Intensitet Measurements
- Få fluorescerende billeder med et fluorescensmikroskop. Brug følgende filterkasser: DAPI filterkube (360/40 nm excitation, 460/50 nm emission og 400 nm dichroic spejl) til Alexa Fluor 405 signaler, GFP filter kube (470/40 nm excitation, 525/50 nm emission, Og 495 nm dichroisk spejl) til Alexa Fluor 488, TRITC filterkube (545/25 nm excitation, 605/70 nm emission og 565 nm dichroisk spejl) til Alexa Fluor 555 og Cy5 filterkube (620/60 nm excitation, 700 / 75 nm emission og 600 nm dichroic spejl) til Alexa Fluor 647.
Bemærk: Juster eksponeringstiden for at opnå fluorescerende signaler i billedet uden mætning. - Definer den glomerulære struktur ved hjælp af immunofluorescenssignaler af VGLUT2. Mål farvningsintensiteter af axon-sorteringsmolekyler inden for glomeruli med ImageJ.
6. Data analyse
- Subtrahere baggrundssignaler fra farvningsintensiteterne af axonsorteringsmolekyler.
- Forbered thE ekspressionsdatamatrix, som har kolonner sammensat af akson-sorteringsmolekyler og rækker sammensat af glomeruli.
- Udfør en hovedkomponentanalyse (PCA) ved hjælp af det forberedte ekspressionsdatasæt. Dernæst få PCA-scorerne, bidragsforholdene og faktorbelastningerne for hver hovedkomponent.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Det olfaktoriske glomerulære kort dannes ved indledende global målretning og efterfølgende glomerulær segregering af OSN-axoner 1 , 2 . Glomerulær segregering reguleres af de adhæsive / repulsive axonale interaktioner medieret af axonsorteringsmolekyler, hvis ekspressionsniveauer bestemmes af udtrykte OR-molekyler 7 . Axonsorteringsmolekylerne involveret i glomerulær segregering udtrykkes på en positionsuafhængig mosaik måde i OB 9 . I dette studie valgte vi følgende gener: Kirrel2 , Sema7A , OLPC , BIG-2 og PCDH17 . Nogle af disse axonsorteringsmolekyler udtrykkes på en aktivitetsafhængig måde 7 , 8 , 10 .
Den firdobbelte immunostAining metode vist her tilladt visualisering af ekspressionsmønstre af fire molekyler samtidigt på samme sektion. Disse axon-sorteringsmolekyler viste positionuafhængige mosaikudtryk, men deres mønstre var ikke identiske ( figur 1A, B ). Den glomerulære struktur blev defineret af fluorescerende signaler af VGLUT2 ( figur 2A ). Axonsorteringsmolekyler (Kirrel2, Sema7A, OLPC) blev differentielt udtrykt i hver glomerulus; VGLUT2, der blev anvendt som en glomerulær markør, blev imidlertid ensartet udtrykt blandt glomeruli ( figur 2B, 2C ).
En enkelt glomerulus kan betragtes som en dataenhed, der er repræsenteret af flere variabler. For at analysere disse multivariate ekspressionsdata blev hovedcomponentanalyse (PCA) udført. PCA definerer et nyt koordinatsystem, således at den første koordinat har de største variansdatasæt, og at hver efterfølgendeKoordinat har den største resterende varians. Ekspressionsdatasætene blev udsat for PCA og plottet i rummet af den første og anden hovedkomponent (PC1 og PC2) ( Figur 3A ). Bidragsniveauet for hver hovedkomponent angiver, hvor meget procentdelen hver hovedkomponent repræsenterer i variablernes samlede tendens. Bidragstallene for PC1, PC2, PC3, PC4 og PC5 var henholdsvis 33,4%, 28,2%, 19,8%, 17,3% og 6,3% ( Figur 3B ). PCA afslørede også faktorbelastningerne i hver hovedkomponent. De kvadratiske faktorbelastninger angiver, hvor meget procentdelen af variansen i en oprindelig variabel forklares med en faktor. I PC1 blev faktorbelastningerne af Sema7A, OLPC og Kirrel2 ladet positivt, mens de af BIG-2 og PCDH17 ikke var ( figur 3C ). En tidligere undersøgelse analyserede ekspressionen af disse molekyler i de mutante mus, der mangler for det cykliske nukleoti Degated (CNG) kanalgen, som er en komponent af den olfaktoriske signaltransduktion 11 og viste, at mønstrene af CNG-afhængige ændringer i ekspressionsniveauerne ligner faktorbelastningerne i PC1 9 . Disse resultater antyder, at de forskellige udtryk for disse molekyler blev genereret af CNG-kanal-medieret neural aktivitet.
Figur 1: Quadruple Immunostaining af en Parasagittal OB Section. ( A ) Skematisk diagram over OE & OB. ( B ) En parasagittal OB sektion fra en 2 uger gammel mus immunfarvet med antistoffer mod v GLUT2 (hvid), Kirrel2 (rød), Sema7A (grøn) og OLPC (blå). Det fusionerede billede af Kirrel2 (rødt), Sema7A (grønt) og OLPC (blå) blev vist til højre. Skalestænger = 100 μm./files/ftp_upload/55893/55893fig1large.jpg "target =" _ blank "> Venligst klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Ekspressionsanalyse af Axon-sorteringsmolekyler. ( A ) En parasagittal olfaktorisk pære (OB) sektion immunfarvet med antistoffer mod VGLUT2 (lilla), Kirrel2 (rød), Sema7A (grøn) og OLPC (blå). Hver glomerulus er defineret af fluorescerende signaler af VGLUT2 (præsynaptisk markør). Glomerulære strukturer er omgivet af punkterede linjer. ( B ) Ekspressionsniveauer af Kirrel2, Sema7A og OLPC i glomeruli # 1, # 3, # 4 og # 6. Farvningsintensiteter af axonsorteringsmolekyler blev målt i hver glomerulus. ( C ) Ekspressionsniveauer for axonsorteringsmolekylerne og VGLUT2 sammenlignet mellem glomeruli. Signalintensiteterne af disse molekyler blev målt i eaCh glomerulus. Gråstænger på graferne angiver gennemsnittet af ekspressionsniveau. Målestang = 100 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: PCA af ekspressionsdata for Axon-sorteringsmolekyler. ( A ) Principal komponentanalyse (PCA) score biplots (PC1 Vs. PC2) af ekspressionsdatasættet af fem axon-sorteringsmolekyler (Kirrel2, Sema7A, OLPC, BIG-2 og PCDH17). I alt 1799 glomeruli blev analyseret. ( B ) Bidragsniveauer og kumulative bidragsniveauer for alle fem hovedkomponenter. Bidragsniveauerne for PC1, PC2, PC3, PC4 og PC5 er henholdsvis 0,334, 0,282, 0,198, 0,173 og 0,063. ( C ) Faktorbelastningen af Kirrel2, Sema7A, OLPC, BIG-2 og PCDH17 i PC1-3. Egenværdier af PC1, PC2 og PC3 er henholdsvis 1,67, 1,16 og 0,99. Klik her for at se en større version af denne figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Quadruple immunostaining af parasagittale OB sektioner muliggjorde visualisering og kvantificering af ekspressionsniveauerne på så mange som fire axon-sorteringsmolekyler samtidigt i et større antal glomeruli. Ved at analysere disse multivariable data med PCA kan egenskaberne for ekspressionen af disse molekyler spekuleres.
Til vellykket farvning er vævsprøvefremstillingen kritisk vigtig. Nogle protokoller tyder på, at væv skal efterstilles med 4% PFA og behandles med 30% saccharose til kryoprotektion. Disse trin blev dog udeladt i denne protokol. Dette skyldes, at i mange tilfælde reducerer disse trin farvningssignalintensiteten og øger baggrunden. Desuden bør sektioner ikke tørres ud ved ethvert trin for at undgå høj baggrund under farvning.
Den optimale farvningsbetingelse er forskellig afhængigt af hvilke typer væv og antistoffer der anvendes. Derfor er det nødvendigtY for at bestemme de specifikke farvningsbetingelser for hvert eksperiment. Endvidere er koncentrationen af primære antistoffer også vigtig. Når koncentrationen er for høj, øges baggrunden. Men når koncentrationen er for lav, reducerer den signalet. Det er derfor vigtigt at identificere den passende koncentration af primære antistoffer for at opnå farvningsresultater af høj kvalitet. En begrænsning er, at denne metode afhænger væsentligt af kvaliteten af de primære antistoffer og den primære antistofkombination med hensyn til dyrearter.
Koronale sektioner af OB er rutinemæssigt anvendt til immunfarvning. I denne protokol var imidlertid parasagittale sektioner af OB's mediale side brugt til at placere flere glomeruli på en enkelt sektion. Da disse sektioner bevarer glomeruliets topografiske rækkefølge langs de dorsale ventrale og anterior-posterior akser, kan de også bruges til at analysere fordelingsmønstrene afAxon-vejledningsmolekyler, som bestemmer projektionsstederne for OSN-axoner.
I denne undersøgelse blev parasagittale sektioner af OB forberedt til at muliggøre placering af flere glomeruli på en enkelt sektion. Desuden kan vandrette sektioner også være nyttige for forskere at afsløre forskellene langs medial-lateral eller for-posterioraksen. Med udviklingen af antistoffer, som kan anvendes til flere immunforainings, kan denne firdobbelte farvningsmetode anvendes ikke kun til OB men også til andre hjerneområder.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen konkurrerende finansielle interesser.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af Mitsubishi Foundation, Takeda Science Foundation, JST PRESTO og JSPS KAKENHI Grant nummer 16H06144.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) Tablets, pH7.4 | TAKARA BIO | T9181 | |
| Skim Milk | nacalai tesque | 31149-75 | |
| goat anti-Sema7A antibody | R&D Systems | AF2068 | |
| rat anti-OLPC antibody | Merck Millipore | MABT20 | |
| mouse anti-VGLUT2 antibody | Merck Millipore | MAB5504 | |
| goat anti-BIG-2 antibody | R&D Systems | AF2205 | |
| gunea pig anti-Kirrel2 antibody | Operon Biotechnologies | Anti-Kirrel2 antibodies were generated by immunizing guinea pigs with KLH-conjugated synthetic peptides (644-673aa): CRLYRARAGYLTTPHPRAFTSYMKPTSFGP | |
| donkey anti-mouse Alexa Fluor 405 | Abcam | ab175658 | |
| donkey anti-goat Alexa Fluor 488 | Jackson ImmunoResearch | 705-545-003 | |
| donkey anti-guinea pig Alexa Fluor 555 | Thermo Fisher Scientific | A21432 | |
| donkey anti-rat Alexa Fluor 647 | Jackson ImmunoResearch | 712-605-153 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Wako | 162-16065 | |
| MAS coated slide glasses | MATSUNAMI | MAS-01 | |
| forceps | Fine Science Tools | 11253-27 | |
| Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools | 15000-00 | |
| dissecting scissors | Fine Science Tools | 14090-09 | |
| fluorescent microscope | KEYENCE | BZ-X700 | |
| DAPI filter cube | KEYENCE | OP-87762 | |
| GFP filter cube | KEYENCE | OP-87763 | |
| TRITC filter cube | KEYENCE | OP-87764 | |
| Cy5 filter cube | KEYENCE | OP-87766 | |
| filter paper | ADVANTEC | 00011185 | |
| O.C.T compound | Sakura Finetek | M71484 |
References
- Mori, K., Sakano, H. How is the olfactory map formed and interpreted in the mammalian brain? Annu Rev Neurosci. 34, 467-499 (2011).
- Takeuchi, H., Sakano, H. Neural map formation in the mouse olfactory system. Cell Mol Life Sci. 71, 3049-3057 (2014).
- Mombaerts, P., et al. Visualizing an olfactory sensory map. Cell. 87, 675-686 (1996).
- Feinstein, P., Mombaerts, P. A contextual model for axonal sorting into glomeruli in the mouse olfactory system. Cell. 117, 817-831 (2004).
- Ishii, T., et al. Monoallelic expression of the odourant receptor gene and axonal projection of olfactory sensory neurones. Genes Cell. 6, 71-78 (2001).
- Nakashima, A., et al. Agonist-independent GPCR activity regulates anterior-posterior targeting of olfactory sensory neurons. Cell. 154, 1314-1325 (2013).
- Serizawa, S., et al. A neuronal identity code for the odorant receptor-specific and activity-dependent axon sorting. Cell. 127, 1057-1069 (2006).
- Kaneko-Goto, T., Yoshihara, S., Miyazaki, H., Yoshihara, Y. BIG-2 mediates olfactory axon convergence to target glomeruli. Neuron. 57, 834-846 (2008).
- Ihara, N., Nakashima, A., Hoshina, N., Ikegaya, Y., Takeuchi, H. Differential expression of axon-sorting molecules in mouse olfactory sensory neurons. Eur J Neuro. 44, 1998-2003 (2016).
- Williams, E. O., et al. Delta Protocadherin 10 is Regulated by Activity in the Mouse Main Olfactory System. Front Neural Circuits. 5, 9 (2011).
- Brunet, L. J., Gold, G. H., Ngai, J. General anosmia caused by a targeted disruption of the mouse olfactory cyclic nucleotide-gated cation channel. Neuron. 17, 681-693 (1996).
