Summary
Os neurônios sensoriais olfatórios expressam uma grande variedade de moléculas de classificação axônica para estabelecer circuitos neurais adequados. Este protocolo descreve um método de coloração imuno-histoquímica para visualizar expressões combinatórias de moléculas de ordenação axônica no terminal axônico de neurônios sensoriais olfativos.
Abstract
O sistema olfativo do mouse é freqüentemente usado para estudar mecanismos de formação de circuitos neurais devido à sua estrutura anatômica simples. Um Neurônio Sensorial Olfatório (OSN) é uma célula bipolar com um único dendrito e um único axônio não derivado. Um OSN expressa apenas um gene de receptor olfatório (OR), OSNs que expressam um determinado tipo de OR convergem seus axônios para alguns conjuntos de glomérulos invariantes no bulbo olfatório (OB). Uma característica notável da projeção de OSN é que as OU expressadas desempenham papéis instrutivos na projeção axonal. As ORs regulam a expressão de múltiplas moléculas de classificação axônica e geram o código molecular combinatório de moléculas de classificação de axônio no terminal axônico OSN. Assim, para entender os mecanismos moleculares dos mecanismos de orientação axônica OR específicos, é vital caracterizar seus perfis de expressão no terminal axônico OSN dentro do mesmo glomérulo. O objetivo deste artigo foi introduzir métodos para coletar tantos glomeruli como possiblE em uma única seção de OB e para realizar imunocoloração usando múltiplos anticorpos. Isso permitiria a comparação e análise dos padrões de expressão de moléculas de classificação de axônio sem variação de coloração entre seções de OB.
Introduction
Durante o desenvolvimento, os neurônios estão precisamente conectados uns aos outros para formar circuitos neurais adequados, o que é crítico para a função normal do cérebro. Uma vez que os circuitos neurais aberrantes no cérebro são pensados para ser a causa de transtornos mentais, como autismo e esquizofrenia, a compreensão dos mecanismos de formação de circuitos neurais é um dos principais desafios no campo da neurociência.
No sistema olfativo do mouse, cada Neurônio Sensorial Olfativo (OSN) no Epitelio Olfatório (OE) expressa apenas um gene funcional do Receptor Olfativo (OR) e OSNs expressando o mesmo OR convergem seus axônios para um par específico de glomérulos em locais estereotipados no Bulbo Olfativo (OB) 1 , 2 . O sistema olfativo do mouse é um excelente modelo de sistema para estudar os mecanismos moleculares da formação de circuitos neurais porque os pesquisadores podem utilizar a expressão OR para identificar um específico sUbtype de OSNs e visualizar os sites de projeção de axônios de OSN como estruturas glomerulares claras. Uma característica notável da projeção OSN é que as RUP desempenham papéis instrutivos na projeção de axônios OSN para o OB 3 , 4 , 5 , 6 . Mais especificamente, após os axônios do OSN serem orientados para aproximar as regiões alvo, eles são segregados para formar glomérulos de forma dependente de OR. Estudos anteriores mostraram que as moléculas de OR controlam a expressão de moléculas de triagem de axônio, que regulam a segregação glomerular 7 , 8 . Além disso, as evidências acumuladas sugerem que as moléculas de OR geram o código de identidade neuronal por uma combinação única de moléculas de classificação axônica 9 . Assim, para entender o mecanismo de segregação glomerular dependente de OR, é necessário caracterizar os perfis de expressão do mol de ordenação axônicaEcules em OSNs.
A imunocoloração fluorescente é um método comum para visualizar a expressão de genes específicos. Uma vez que as proteínas das moléculas de triagem axônica estão predominantemente localizadas em axônios OSN, os pesquisadores precisam usar seções OB para caracterizar seus padrões de expressão em OSNs. O corte coronal do OB foi rotineiramente utilizado para imunomarcação. No entanto, esta preparação perde a informação topográfica ao longo do eixo anterior-posterior na mesma seção de OB. Desta forma, desenvolvemos uma preparação parasagital do lado medial do OB, que pode montar tantos glomerulis circundantes quanto possível na mesma seção de OB. Combinado com imunomarcação com múltiplos anticorpos, esta preparação permite a comparação e análise dos padrões de expressão de moléculas de triagem de axônio sem variação de coloração entre seções de OB.
Além disso, um método de coloração imuno-histoquimica foi apresentado sem pós-fixação com PFA aE tratamento de sacarose. Este método permite aos pesquisadores obter dados suficientes de coloração de alta qualidade para análise de dados multivariáveis. Os protocolos aqui apresentados fornecerão detalhes de métodos poderosos para pesquisadores que estudam a formação de circuitos neurais olfativos.
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Protocol
Todos os procedimentos experimentais foram realizados com a aprovação do comitê de ética de experimento animal na Universidade de Tóquio e de acordo com as diretrizes da Universidade de Tóquio para o cuidado e uso de animais de laboratório.
1. Preparação de soluções
- Preparar solução salina tamponada com fosfato 0,01 M (PBS): adicionar um comprimido de PBS (NaCl 0,14 M, KCl 0,0027 M, 0,010 M PO 4 3- , pH 7,4) a 1 L de água destilada e agitar à TA até dissolver completamente.
- Preparar 4% de paraformaldeído (PFA) em PBS: adicionar 4 g de PFA a 100 mL de PBS. Mexa a solução a 60 ° C até dissolver completamente.
- Depois de dissolver o PFA em PBS, ajuste o pH da solução para 7,4 com hidróxido de sódio 1 N (NaOH). Em seguida, esfrie com gelo e filtre a solução através de um papel de filtro para remover qualquer matéria em partículas. Armazenar a 4 ° C.
Cuidado: tome cuidado apropriado ao usar esses reagentes. Lidar comCom cuidado e use luvas, óculos de segurança e bata de laboratório sob um capô químico.
NOTA: Use solução fresca de 4% de PFA preparada em 2 d.
- Depois de dissolver o PFA em PBS, ajuste o pH da solução para 7,4 com hidróxido de sódio 1 N (NaOH). Em seguida, esfrie com gelo e filtre a solução através de um papel de filtro para remover qualquer matéria em partículas. Armazenar a 4 ° C.
- Preparar PBS 0,01 M suplementado com 0,3% de Triton X-100 (PBST): adicionar 3 mL de Triton X-100 a 997 mL de PBS. Agite a solução à temperatura ambiente até dissolver completamente.
- Prepare solução de bloqueio de 1% e 5%: adicione 10 g de leite desnatado a 200 mL de PBST para preparar 5% de solução de bloqueio. Mexa à TA até dissolver completamente. Diluir 5% de solução de bloqueio cinco vezes com PBST para preparar 1% de solução de bloqueio.
2. Preparação de Secções OB Parasagittal
- Use animais entre 1-2 semanas de idade. Esses grupos etários são adequados para as seguintes experiências porque os glomérulos são claramente visíveis e o cérebro pode ser cortado com o crânio.
- Anestesiar o animal com uma injeção intraperitoneal de pentobarbital (50 mg / kg de peso corporal). Perfume o animal transcardialmente com 4% de gelo geladoFA em PBS. Manuseie com cuidado e use luvas, óculos de segurança e bata de laboratório sob uma capa química.
- Após a perfusão, corte a cabeça com uma tesoura e remova cuidadosamente a pele. Em seguida, insira uma lâmina das tesouras no espaço entre os dentes superiores e inferiores e corte horizontalmente para remover a mandíbula inferior. Corte o excesso de tecido com fórceps e tesouras para deixar o tecido olfativo, incluindo OB e OE.
NOTA: Não remova o crânio em torno do OB, pois isso retém o glomeruli medial alinhado verticalmente diretamente. - Mergulhe o tecido olfativo em PBS para remover o ar na cavidade nasal. Corte a parte posterior do cérebro verticalmente e coloque o tecido olfativo na parte inferior do molde de encaixe com o corte virado para baixo. Encha o molde com o composto de temperatura de corte ideal (OCT) e, em seguida, mergulhe o molde em nitrogênio líquido.
- Depois que o tecido do composto estiver completamente congelado, incuba-o nos cryosTat a -20 ° C durante 1 h.
- Faça secções parasagittal em série (10 μm) do OB com um criostato e colecione-as, aderindo aos slides de vidro revestidos com MAS. Depois de adormecer, seque as lâminas imediatamente com um secador de cabelo.
3. Dia 1: Imunocoloração quádrupla das fatias OB
- Lave as lâminas por 5 minutos com PBS à TA. Repita 3 vezes.
- Bloqueie os locais de ligação não específicos incubando as lâminas durante 1 h com a solução de bloqueio a 5% na RT.
- Incube as lâminas O / N com um coquetel de anticorpos primários (400 μL cada slide) na solução de bloqueio de 1% na RT. Utilize os seguintes anticorpos primários: anticorpo anti-Kirrel2 de cobaia (1: 1000), anticorpo de cabra anti-Semaporin-7A (Sema7A) (1: 500), anticorpo anti-OL-protocadherina (OLPC) de rato (1: 500) E anticorpo anti-vesicular do transportador de glutamato do mouse2 (VGLUT2) anticorpo (1: 500).
4. Dia 2: Imunocoloração quádrupla do OBFatias
- Descarte a solução primária de anticorpo e lave as lâminas por 5 min com PBST à TA. Repita 3 vezes.
- Incube as lâminas durante 1 h com um coquetel de anticorpos secundários (400 μL cada slide) em PBS à RT. Use os seguintes anticorpos secundários: Alexa Fluor 405 (1: 400) anti-mouse de burro, Alexa Fluor 488 (1: 400) e coxa de burro Alexa Fluor 555 (1: 400), burro anti-cobaya Alexa Fluor 555 (1: 400) e burro anti- Rato Alexa Fluor 647 (1: 400).
NOTA: Todos os anticorpos secundários devem vir da mesma espécie hospedeira. Escolha um comprimento de onda diferente de fluorescência de anticorpos secundários para cada anticorpo primário para garantir que não haja sobreposição de comprimentos de onda. - Descarte a solução e lave as lâminas por 5 minutos com PBS à TA. Repita 3 vezes.
- Montar lamínulas nas lâminas com o meio de montagem. Para isso, aplique 2 gotas do meio de montagem em cada slide e, em seguida, coloque uma lamínula removendo as bolhas de ar.
5. Intensity MeAsurações
- Obtenha imagens fluorescentes com um microscópio de fluorescência. Use os seguintes cubos de filtro: cubo de filtro DAPI (excitação de 360/40 nm, emissão de 460/50 nm e espelho dicroico de 400 nm) para os sinais Alexa Fluor 405, cubo de filtro GFP (470/40 nm de excitação, emissão de 525/50 nm, E espelho dicroico de 495 nm) para Alexa Fluor 488, cubo de filtro TRITC (excitação de 545/25 nm, emissão de 605/70 nm e espelho dicroico de 565 nm) para Alexa Fluor 555 e cubo de filtro Cy5 (excitação de 620/60 nm, 700 / Emissão de 75 nm e espelho dicroico de 600 nm) para Alexa Fluor 647.
Nota: Ajuste o tempo de exposição para obter sinais fluorescentes da imagem sem saturação. - Define a estrutura glomerular por sinais de imunofluorescência de VGLUT2. Medir as intensidades de coloração das moléculas de classificação axônica dentro dos glomérulos com ImageJ.
6. Análise de dados
- Subtrair os sinais de fundo das intensidades de coloração das moléculas de classificação axônica.
- Prepare thMatriz de dados de expressão e, que possui colunas compostas por moléculas e linhas de triagem de axônio compostas pelos glomérulos.
- Execute uma análise de componente principal (PCA) usando o conjunto de dados de expressão preparado. Em seguida, obtenha as pontuações PCA, os índices de contribuição e as cargas fatoriais de cada componente principal.
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Representative Results
O mapa glomerular olfatório é formado por alvos globais iniciais e subseqüente segregação glomerular dos axônios 1 , 2 do OSN. A segregação glomerular é regulada pelas interações axônicas adesivas / repulsivas mediadas por moléculas de classificação de axônio cujos níveis de expressão são determinados por moléculas OR expressas 7 . As moléculas de classificação axônica envolvidas na segregação glomerular são expressas em forma de mosaico independentemente da posição no OB 9 . Neste estudo, selecionamos os seguintes genes: Kirrel2 , Sema7A , OLPC , BIG-2 e PCDH17 . Algumas dessas moléculas de classificação axônica são expressas de maneira dependente da atividade 7 , 8 , 10 .
A imunologia quádruplaO método de avaliação mostrado aqui permitiu a visualização dos padrões de expressão de quatro moléculas simultaneamente na mesma seção. Essas moléculas de classificação axônica mostraram expressões de mosaico independentes da posição, mas seus padrões não eram idênticos ( Figuras 1A, B ). A estrutura glomerular foi definida por sinais fluorescentes de VGLUT2 ( Figura 2A ). As moléculas de triagem de Axon (Kirrel2, Sema7A, OLPC) foram diferencialmente expressas em cada glomérulo; No entanto, VGLUT2, que foi usado como marcador glomerular, foi expressamente expresso entre glomérulos ( Figuras 2B, 2C ).
Um único glomérulo pode ser considerado como uma unidade de dados que é representada por múltiplas variáveis. Para analisar esses dados de expressão multivariada, a análise de componentes principais (PCA) foi realizada. O PCA define um novo sistema de coordenadas, de modo que a primeira coordenada tenha os conjuntos de dados de maior variação e que cada um deles tenha êxitoA coordenada tem a maior variação residual. Os conjuntos de dados de expressão foram submetidos a PCA e plotados no espaço do primeiro e segundo componente principal (PC1 e PC2) ( Figura 3A ). A relação de contribuição de cada componente principal indica quantos percentuais cada componente principal representa na tendência total das variáveis. As proporções de contribuição de PC1, PC2, PC3, PC4 e PC5 foram 33,4%, 28,2%, 19,8%, 17,3% e 6,3%, respectivamente ( Figura 3B ). A PCA também revelou o fator de carga em cada componente principal. As cargas de fatores quadrados indicam a porcentagem da variância em uma variável original explicada por um fator. No PC1, as cargas fatoriais de Sema7A, OLPC e Kirrel2 foram carregadas positivamente, enquanto as de BIG-2 e PCDH17 não foram ( Figura 3C ). Um estudo anterior analisou a expressão dessas moléculas nos camundongos mutantes deficiente para o nucleótido cíclico (CNG), que é um componente da transdução de sinal olfativo 11 , e mostrou que os padrões de alterações dependentes do GNC nos níveis de expressão se assemelham aos carregamentos de fatores no PC1 9 . Estes resultados sugeriram que a variedade de expressões dessas moléculas foi gerada pela atividade neural mediada por canais de GNC.
Figura 1: Imunossinção Quádrupla de uma Seção Parasagital de OB. ( A ) Diagrama esquemático do OE e OB. ( B ) Uma seção OB parasagital de um mouse de 2 semanas de idade imunossinado com anticorpos contra v GLUT2 (branco), Kirrel2 (vermelho), Sema7A (verde) e OLPC (azul). A imagem mesclada de Kirrel2 (vermelho), Sema7A (verde) e OLPC (azul) foi mostrada à direita. Barras de escala = 100 μm./files/ftp_upload/55893/55893fig1large.jpg "target =" _ blank "> Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Análise de expressão de moléculas de triagem de Axon. ( A ) Uma seção de bulbo olfativo parasagital (OB) imunossintada com anticorpos contra VGLUT2 (roxo), Kirrel2 (vermelho), Sema7A (verde) e OLPC (azul). Cada glomérulo é definido por sinais fluorescentes de VGLUT2 (marcador pré-sináptico). As estruturas glomerulares estão cercadas por linhas tracejadas. ( B ) Níveis de expressão de Kirrel2, Sema7A e OLPC em glomérulos # 1, # 3, # 4 e # 6. As intensidades de coloração das moléculas de triagem axônica foram medidas em cada glomérulo. ( C ) Níveis de expressão das moléculas de classificação axônica e VGLUT2 comparados entre os glomérulos. As intensidades de sinal dessas moléculas foram medidas em eaCh glomerulus. As barras cinza nos gráficos indicam a média do nível de expressão. Barra de escala = 100 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: PCA de Dados de Expressão de Moléculas de triagem de Axon. ( A ) Biplots de pontuação de análise de componente principal (PCA) (PC1 vs. PC2) do conjunto de dados de expressão de cinco moléculas de triagem de axônio (Kirrel2, Sema7A, OLPC, BIG-2 e PCDH17). Um total de 1799 glomérulos foram analisados. ( B ) Os índices de contribuição e os índices de contribuição cumulativa dos cinco principais componentes. As proporções de contribuição de PC1, PC2, PC3, PC4 e PC5 são 0,334, 0,282, 0,198, 0,173 e 0,063, respectivamente. ( C ) O fator de carga de Kirrel2, Sema7A, OLPC, BIG-2 e PCDH17 no PC1-3. Os valores próprios de PC1, PC2 e PC3 são 1,67, 1,16 e 0,99, respectivamente. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
A imunotinção quádrupla das seções de parasagittal OB possibilitou a visualização e quantificação dos níveis de expressão de até quatro moléculas de triagem de axônio simultaneamente em um maior número de glomérulos. Ao analisar esses dados multivariáveis com PCA, as características para a expressão dessas moléculas podem ser especuladas.
Para a coloração bem sucedida, a preparação da amostra de tecido é extremamente importante. Alguns protocolos sugerem que os tecidos devem ser post-fixados com 4% de PFA e tratados com 30% de sacarose para crioproteção. No entanto, essas etapas foram omitidas neste protocolo. Isso ocorre porque, em muitos casos, esses passos reduzem a intensidade do sinal de coloração e aumentam o plano de fundo. Além disso, as seções não devem ser secas em nenhuma etapa para evitar alto fundo durante a coloração.
A condição de coloração ideal é diferente dependendo dos tipos de tecidos e anticorpos utilizados. Portanto, é necessárioY para determinar as condições de coloração específicas para cada experiência. Além disso, a concentração de anticorpos primários também é importante. Quando a concentração é muito alta, aumenta o plano de fundo. No entanto, quando a concentração é muito baixa, reduz o sinal. É, portanto, importante identificar a concentração apropriada de anticorpos primários para obter resultados de coloração de alta qualidade. Uma limitação é que este método depende significativamente da qualidade dos anticorpos primários e da combinação de anticorpos primários em relação às espécies animais.
As seções coronais do OB foram rotineiramente usadas para imunomarcação. No entanto, neste protocolo, as seções parasagittal do lado medial do OB foram usadas para colocar mais glomérulos em uma única seção. Uma vez que estas seções mantêm a ordem topográfica dos glomérulos ao longo dos eixos dorsal-ventral e anterior-posterior, elas também podem ser usadas para analisar os padrões de distribuição deMoléculas de orientação do axônio, que determinam os locais de projeção dos axônios OSN.
Neste estudo, as seções parasagitais do OB foram preparadas para permitir a colocação de mais glomeruli em uma única seção. Além disso, as seções horizontais também podem ser úteis para que os pesquisadores revelem as diferenças ao longo do eixo medial-lateral ou anterior-posterior. Com o desenvolvimento de anticorpos que podem ser utilizados para imunossintas múltiplas, este método de coloração quádrupla pode ser aplicado não só ao OB, mas também a outras áreas do cérebro.
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Disclosures
Os autores declaram não haver interesses financeiros concorrentes.
Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado pela Fundação Mitsubishi, a Takeda Science Foundation, JST PRESTO e JSPS KAKENHI Grant Number 16H06144.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) Tablets, pH7.4 | TAKARA BIO | T9181 | |
| Skim Milk | nacalai tesque | 31149-75 | |
| goat anti-Sema7A antibody | R&D Systems | AF2068 | |
| rat anti-OLPC antibody | Merck Millipore | MABT20 | |
| mouse anti-VGLUT2 antibody | Merck Millipore | MAB5504 | |
| goat anti-BIG-2 antibody | R&D Systems | AF2205 | |
| gunea pig anti-Kirrel2 antibody | Operon Biotechnologies | Anti-Kirrel2 antibodies were generated by immunizing guinea pigs with KLH-conjugated synthetic peptides (644-673aa): CRLYRARAGYLTTPHPRAFTSYMKPTSFGP | |
| donkey anti-mouse Alexa Fluor 405 | Abcam | ab175658 | |
| donkey anti-goat Alexa Fluor 488 | Jackson ImmunoResearch | 705-545-003 | |
| donkey anti-guinea pig Alexa Fluor 555 | Thermo Fisher Scientific | A21432 | |
| donkey anti-rat Alexa Fluor 647 | Jackson ImmunoResearch | 712-605-153 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Wako | 162-16065 | |
| MAS coated slide glasses | MATSUNAMI | MAS-01 | |
| forceps | Fine Science Tools | 11253-27 | |
| Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools | 15000-00 | |
| dissecting scissors | Fine Science Tools | 14090-09 | |
| fluorescent microscope | KEYENCE | BZ-X700 | |
| DAPI filter cube | KEYENCE | OP-87762 | |
| GFP filter cube | KEYENCE | OP-87763 | |
| TRITC filter cube | KEYENCE | OP-87764 | |
| Cy5 filter cube | KEYENCE | OP-87766 | |
| filter paper | ADVANTEC | 00011185 | |
| O.C.T compound | Sakura Finetek | M71484 |
References
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