Summary
Эта работа описывает протокол на основе FACS, который позволяет легко и одновременно изолировать перициты типа I и типа II от скелетных мышц.
Abstract
Перициты являются периваскулярными мультипотентными клетками, которые проявляют гетерогенность в разных органах или даже в пределах одной и той же ткани. В скелетных мышцах есть по крайней мере две субпопуляции перицитов (так называемые тип I и тип II), которые экспрессируют различные молекулярные маркеры и обладают отличными возможностями дифференциации. С использованием двойных трансгенных мышей NG2-DsRed и Nestin-GFP успешно прошли выделение перициты типа I (NG2-DsRed + Nestin-GFP - ) и типа II (NG2-DsRed + Nestin-GFP + ). Однако доступность этих двойных трансгенных мышей предотвращает широкое использование этого метода очистки. Эта работа описывает альтернативный протокол, который позволяет легко и одновременно изолировать перициты типа I и типа II от скелетных мышц. Этот протокол использует технологию сортировки с активированной флуоресценцией клеток (FACS) и нацелен на PDGFRβ, а не NG2 вместе с сигналом Nestin-GFP. После изоляции введите I и tyПерициты пе II обладают отчетливыми морфологиями. Кроме того, перициты I и II типа, выделенные этим новым методом, как, например, выделенные из двойных трансгенных мышей, являются адипогенными и миогенными соответственно. Эти результаты позволяют предположить, что этот протокол может быть использован для выделения субпопуляций перицитов из скелетных мышц и, возможно, из других тканей.
Introduction
Мышечная дистрофия - дегенеративное расстройство мышц, которое пока не имеет эффективных методов лечения. Развитие терапии, способствующей регенерации тканей, всегда вызывало большой интерес. Регенерация и восстановление тканей после повреждения зависят от резидентных стволовых клеток / клеток-предшественников 1 . Сателлитные клетки представляют собой миогенные клетки-предшественники, которые способствуют регенерации мышц 2 , 3 , 4 , 5 , 6 , 7 . Их клиническое применение, однако, затруднено их ограниченной миграцией и низкой выживаемостью после инъекции, а также их пониженной способностью к дифференцировке после амплификации in vitro 8 , 9 , 10 , 11 . В дополнение к спутникамTe клетки, скелетные мышцы также содержат много других клеточных популяций с миогенным потенциалом 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , таких как тромбоцитарные рецепторы-бета (PDGFRβ) -положительные интерстициальные клетки. Имеются данные, свидетельствующие о том, что полученные из мышцы PDGFRβ + клетки способны дифференцироваться в миогенные клетки и улучшать мышечную патологию и функцию 14 , 17 , 18 , 19 , 20 . PDGFRβ преимущественно обозначает перициты 21 , которые являются периваскулярными клетками с плюрипотентностью 22 , 23 . В дополнение к PDGFRβ, многие другие маркеры, включая Neuron-Glial 2 (NG2) и CD146, также используются для iУточнить перициты 21 . Следует отметить, однако, что ни один из этих маркеров не зависит от перицитов. 21 . Недавние исследования выявили два подтипа перицитов мышц, называемых типом I и типом II, которые экспрессируют различные молекулярные маркеры и выполняют различные функции 19 , 24 , 25 . Биохимически перициты I типа - NG2 + Nestin - , а перициты II типа - NG2 + Nestin + 19 , 24 . Функционально перициты I типа могут подвергаться адипогенной дифференцировке, способствуя накоплению жира и / или фиброзу, тогда как перициты II типа могут дифференцироваться вдоль миогенного пути, способствуя регенерации мышц 19 , 24 , 25 . Эти результаты показывают, что: (1) перициклы типа I могут bЕ, предназначенные для лечения жировых дегенеративных расстройств / фиброза, и (2) перициты II типа обладают большим терапевтическим потенциалом для мышечной дистрофии. Для дальнейшего изучения и характеристики этих популяций требуется протокол изоляции, который позволяет разделять перициты типа I и типа II с высоким уровнем чистоты.
В настоящее время выделение субпопуляций перицитов основано на двойных трансгенных мышах NG2-DsRed и Nestin-GFP 19 , 24 . Наличие мышей NG2-DsRed и качество большинства NG2-антител ограничивают широкое использование этого метода. Учитывая, что все NG2 + перициты также экспрессируют PDGFRβ в скелетных мышцах 19 , 20 , 24 , мы предполагаем, что NG2 можно заменить PDGFRβ для выделения перицитов и их субпопуляций. В этой работе описывается протокол на основе FACS, которыйИспользует окрашивание PDGFRβ и сигнал Nestin-GFP. Этот метод менее требователен для исследователей, поскольку: (1) он не требует фона NG2-DsRed и (2) он использует коммерчески доступные антитела PDGFRβ, которые хорошо охарактеризованы. Кроме того, он обеспечивает одновременную изоляцию перицитов типа I и типа II с высокой степенью чистоты, что позволяет провести дальнейшее изучение биологии и терапевтического потенциала этих субпопуляций перицитов. После очистки эти клетки можно выращивать в культуре, и их морфологии можно визуализировать. Эта работа также показывает, что перициты типа I и типа II, выделенные с использованием этого метода, подобно очищенным от двойных трансгенных мышей, являются адипогенными и миогенными соответственно.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Трансгенных мышей дикого типа и Nestin-GFP размещали на объекте для животных в Университете Миннесоты. Все экспериментальные процедуры были одобрены Институциональным комитетом по уходу и использованию животных при Университете Миннесоты и были в соответствии с Руководством по уходу и использованию лабораторных животных NIH.
1. Мышечная диссекция и одноклеточная изоляция
- Усыпите взрослых мышей (6-10 недель, мужчин и женщин) трибромоэтанолом (250 мг / кг, внутрибрюшинно) и простерилизуйте их кожу живота 70% -ным этанолом.
ПРИМЕЧАНИЕ: Трибромэтанол использовался здесь вместо кетамина для анестезии / эвтаназии, поскольку известно, что кетамин взаимодействует с NMDA-рецепторами, что потенциально может влиять на исследование. - Поместите мышей в лежачем положении и используйте скальпель, чтобы сделать горизонтальный разрез на брюшной коже. Слезьте кожу рукой, потянув в противоположных направлениях, чтобы выставить мышцы задней конечности.
- пособ• мышцы обеих задних ног с помощью щипцов и ножниц. Хранить их в стерильном фосфатно-буферном солевом растворе (PBS), дополненном 1% пенициллин-стрептомицином (P / S) на льду.
- Промойте рассеченные мускулы задней конечности в ледяном PBS, дополненном 1% P / S два раза и перенесите их на стерильную пластину 10 см.
- Тщательно рассекайте нервы, кровеносные сосуды и соединительную ткань из мышц с помощью щипцов и ножниц под рассекающим микроскопом при увеличении в 2 раза.
- Мелко нарезать и просушить мышцы на мелкие кусочки (1-2 мм 3 ), используя стерильные ножницы и лезвия. При необходимости добавьте небольшое количество модифицированной Дульбекко среды Игла (DMEM), чтобы убедиться, что мышцы не высохли.
- Механически разрушайте ткань пипетированием вверх и вниз по 10 мл серологической пипетке 10 раз.
- Добавить к смеси свежеприготовленный раствор для пищеварения (DMEM с добавлением 0,2% коллагеназы типа 2). Инкубируйте при 37 ° С в течение 2 ч с gentlE при 35 оборотах / мин.
- Растирают в порошок с использованием иглы 18 G для гомогенизации смеси. Затем центрифугируют при 500 мкг в течение 5 мин. Отбросьте супернатант, а затем ресуспендируйте осадок в 0,25% трипсина / ЭДТА. Инкубируйте при 37 ° С в течение 10 мин. Повторите операцию центрифугирования еще два раза.
- Добавить 10 мл DMEM с добавлением 20% эмбриональной бычьей сыворотки (FBS) к раствору и центрифугировать при 500 xg в течение 5 мин. Отбросьте супернатант и ресуспендируйте осадок в буфере лизиса эритроцитов (155 мМ NH 4 Cl, 10 мМ KHCO 3 и 0,1 мМ ЭДТА).
- Центрифуга при 500 мкг в течение 5 мин. Отбрасывают супернатант и ресуспендируют осадок в буфере для сортировки (20 мМ HEPES, pH 7,0, 1 мМ EDTA и 1% BSA в Ca / Mg 2+ - без PBS, pH 7,0). Фильтруют смесь через сито для клеток размером 40 мкм, чтобы получить суспензию с одной клеткой.
- Центрифуга при 500 мкг в течение 5 мин. Отбросьте супернатант и ресуспендируйте осадок в 1 мл буфера для сортировки.
- ПодсчитайтеКлетки с гемоцитометром и развести одноячеечную суспензию до 5 × 10 6 / мл в сортировочном буфере.
2. Окрашивание и сортировка клеток
- Подготовьте элементы управления и образец, как описано в таблице 1 . Окрашивают одноклеточную суспензию соответствующими антителами на льду в течение 30 мин, как описано в таблице 1 .
- Центрифугируйте при 500 xg в течение 5 минут и дважды вымойте гранулы буфером для сортировки.
- Добавьте DAPI к однокамерным растворам, как указано в таблице 1. Используйте DAPI (конечная концентрация) 5 мкг / мл для одноцветного контроля DAPI и 1 мкг / мл DAPI для контроля PDGFRβ-PE-FMO и образца. Храните все пробирки на льду в течение всего эксперимента.
- Включите сортировщик и программное обеспечение. Сканируйте и вставьте чип для сортировки размером 100 мкм, когда появится соответствующий запрос.
- Выполните автоматическую настройку ( то есть выравнивание микросхемы, калибровку капель, калибровку бокового потока и калибровку задержки сортировкиНа), загрузив шарики автоматической настройки при появлении запроса.
- Когда автоматическая настройка завершена, перейдите на вкладку «Эксперимент», нажмите «Создать» и выберите «Пустой шаблон» из «Публичных шаблонов».
- В разделе «Настройки измерения» введите «DAPI» для «FL1», «Nestin-GFP» для «FL2» и «PDGFRβ» для «FL3». Снимите флажки для «FL4» - «FL6».
- Установите флажки для активации лазеров 405, 488 и 561 и нажмите «Создать новый эксперимент».
- Выберите «Start Compensation Wizard» и следуйте указаниям программного обеспечения «Compensation Wizard», чтобы установить компенсацию.
- Загрузите необработанный элемент управления и нажмите «Пуск». Нажмите «Настройки детектора и порога срабатывания» и настройте чувствительность датчика FSC и BSC детектора, чтобы поместить население на шкале.
- ОбъявлениеТолько уровни усиления флуоресцентных каналов FL1-FL3, чтобы поместить отрицательные популяции на левой стороне гистограмм. Нажмите кнопку «Запись», чтобы записать данные.
- Когда появится запрос, загрузите одноцветные элементы управления один за другим. Нажмите «Пуск и запись», чтобы записать данные. Отрегулируйте ворота для положительных поселений на гистограммах. Нажмите "Далее."
- Перейдите к «Вычислить матрицу» на вкладке «Компенсация» и нажмите «Рассчитать» в панели «Вычислить параметры компенсации», чтобы выполнить компенсацию. Нажмите «Готово», чтобы выйти из «Мастера компенсации».
- Загрузите элемент управления PDGFRβ-PE-FMO и нажмите «Пуск». Нарисуйте полигональный затвор (Gate A) вокруг интересующих клеток в разделе «Все события».
- Дважды щелкните внутри Gate A, чтобы создать дочерний график. Измените ось Y на DAPI и нарисуйте полигон (Gate B) вокруг живых (DAPI low ) ячеек. Дважды нажмите iNside Gate B для создания дочернего сюжета. Измените ось X на FSC-H и ось Y на FSC-W и нарисуйте полигональный затвор (Gate C) вокруг синглетов, чтобы устранить дублеты.
- Дважды щелкните внутри Gate C, чтобы создать дочерний график. Измените ось X на Nestin-GFP и ось Y на PDGFRβ-PE. Нажмите кнопку «Запись», чтобы записать данные.
- Загрузите образец и повторите шаги 2.11-2.12. После записи нажмите «Пауза», чтобы сохранить образец.
- Определить границы стробирования для клеток PDGFRβ + и Nestin-GFP + на основе контроля PDGFRβ-PE-FMO. Нарисуйте ворота для популяций PDGFRβ + Nestin-GFP - и PDGFRβ + Nestin-GFP + .
- В разделе «Метод сортировки» выберите «2-way Tubes» и назначьте ячейки «PDGFRβ + Nestin-GFP» и «PDGFRβ + Nestin-GFP + » в левой и правой собирающих трубках, повторитесоответственно. Смонтируйте заполняющие буферы сортировочного буфера объемом 15 мл на этапе сбора и нажмите кнопку «Загрузить сборку».
- Нажмите кнопку «Продолжить», чтобы запустить образец. Нажмите «Начать сортировку», чтобы собрать PDGFRβ + Nestin-GFP - (перициты типа I) и PDGFRβ + Nestin-GFP + (тип II перицитов).
3. Анализ после сортировки
- Центрифуга отсортированные клетки в 500 xg в течение 5 мин, ресуспендируют осадок в 1 мл среды перицитов (см. Таблицу материалов ), и подсчитать плотность клеток с помощью гемоцитометра.
- Перициды семенного типа I и типа II на покровных стеклах, покрытых поли-D-лизином (PDL), при ~ 1 × 10 4 клеток / см 2 . Выращивают в среде перицикла в течение 3 дней при 37 ° С с 5% CO 2 .
- На третий день исследуют морфологию перицитов (под фазовым контрастом) и эндогенную экспрессию Nestin-GFP с использованием флуоресцентного микро(Лазер возбуждения: 488 нм, фильтр возбуждения: 470/40 нм и эмиссионный фильтр: 515/30 нм). Делайте снимки под объектив 20X (0,45 NA).
- Замените перицитную среду на адипогенную (базальная среда MSC мыши + адипогенная стимулирующая добавка) и миогенную (DMEM + 2% лошадиную сыворотку) среду для инициации адипогенной и миогенной дифференцировки, соответственно, как описано ранее 20 . Меняйте среду каждые 2-3 дня.
- Зафиксируйте клетки на 17-й день (14 дней после адипогенной / миогенной дифференцировки) в 4% параформальдегиде (PFA) в течение 20 мин при комнатной температуре.
ПРИМЕЧАНИЕ: Осторожно, PFA является канцерогенным веществом. - Выполните иммуноцитохимию против перилипина (маркер адипоцита) и S-миозина (зрелый маркер myotube / myofiber), как описано в предыдущих публикациях 19 , 20 .
- Промывают фиксированные клетки 3 раза в PBS в течение 10 мин при комнатной температуре.
- Добавить блокирующий буфер (PBS)С добавлением 5% сыворотки осла, 3% BSA и 0,3% Triton X-100) и инкубируют при комнатной температуре в течение 1 часа.
- Инкубируйте клетки с антителами против перилипина (2 мкг / мл) и / или анти-S-миозина (2 мкг / мл) при 4 ° С в течение ночи.
- Промывают клетки 3 раза в PBS в течение 10 мин при комнатной температуре.
- Инкубируйте клетки с антителами Alexa 555 осла анти-кролика (4 мкг / мл) и / или Alexa555 осла против мыши (4 мкг / мл) при комнатной температуре в течение 1 часа.
- Промывают клетки 3 раза в PBS в течение 10 мин при комнатной температуре.
- Смонтируйте иммуноокрашенные клетки с помощью монтажной среды, содержащей DAPI (см. Таблицу материалов). Изучить экспрессию перилипина и S-миозина с использованием флуоресцентного микроскопа (возбуждающий лазер: 543 нм, возбуждение 540/45 нм и эмиссию 600/50 нм) и получить изображения под объектив 40X (0,60 NA).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Параметры FACS, включая интенсивность лазера и коррекцию канала, корректируются на основе результатов контроля без контроля и одноцветного управления. Управление PDGFRβ-PE-FMO используется для установки стробирования для популяции PDGFRβ-PE + ( рисунок 1A ). Среди клеток PDGFRβ-PE две популяции, представляющие клетки Nestin-GFP + и Nestin-GFP, четко разделены ( фиг. 1A ). Границы стробирования для популяций PDGFRβ-PE + Nestin-GFP + и PDGFRβ-PE + Nestin-GFP задаются на основе стробирования для PDGFRβ-PE + и Nestin-GFP + ( фигура 1A ). Эти границы используются для определения и сортировки PDGFRβ-PE + Nestin-GFP + (перициты II типа) и PDGFRβ-PE + Nestin-GFP - (перицит I типаEs) клеток из образца ( рисунок 1B ). Выделенные клетки PDGFRβ-PE + Nestin-GFP- и PDGFRβ-PE + Nestin-GFP + составляют 9,5% и 2,1% от общего количества клеток в одноклеточном растворе, соответственно.
FACS-изолированные перициты типа I и типа II демонстрируют морфологические различия после трех дней культивирования. I перициты показывают амебоидную морфологию, с круглыми телами клеток и короткими процессами ( рис. 2 ). Однако перициты II типа характеризуются разветвленной морфологией, характеризующейся небольшими клеточными телами и длинными тонкими процессами ( рис. 2 ). В это время большинство перицитов типа II остаются как Nestin-GFP + , а перициты I типа - Nestin-GFP - ( рисунок 2 ).
Кроме того, тип I, но не тип II, pericyДифференцируются в адипоциты, экспрессирующие перилипин, через 14 дней в адипогенной среде ( рис. 3 ). Тип II, но не тип I, перициты дифференцируются в миоциты, экспрессирующие S-миозин, через 14 дней в миогенной среде ( рисунок 4 ). Эти результаты убедительно показывают, что перициты I типа являются адипогенными, а перициты II типа являются миогенными.
Рисунок 1 : Границы стробирования и репрезентативная сортировка. ( A ) Флуоресцентный график контроля PDGFRβ-PE-FMO, демонстрирующий границы строения PDGFRβ-PE + Нестин-GFP и PDGFRβ-PE + Нестин-GFP + . ( B ) Репрезентативный флуоресцентный график образца, показывающий распределение PDGFRβ-PE + Nestin-GFP
Рисунок 2: Морфология и экспрессия Nestin-GFP в сортированных перицитах типа I и типа II. Сортированные перициты типа I и типа II высевали на покровные стекла и выращивали в среде перицитов в течение 3 дней. Перициды I типа демонстрировали круглые клеточные тела с короткими процессами и отсутствие эндогенного сигнала GFP при флуоресцентном микроскопе (лазер возбуждения: 488 нм, фильтры возбуждения и эмиссии: 470/40 нм и 515/30 нм, соответственно). Перициты II типа демонстрировали небольшие клеточные тела с длинными и тонкими процессами и сильным эндогенным GFP-сигналом подФлуоресцентный микроскоп при тех же настройках. Шкала шкалы = 100 мкм. Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Адипогенная дифференцировка отсортированных типов перицитов I и II типов. Сортированные перициты типа I и типа II выращивали в среде перицитов в течение 3 дней. Затем их дифференцировали в адипогенной среде в течение 14 дней. Клетки фиксировали и иммуноокрашивали анти-перилипиновым антителом, а затем антителом против кроликов Alexa555. Иммуноцитохимия показала, что перициты I типа, но не II типа, экспрессировали маркер адипоцитов перилипин (красный) под флуоресцентным микроскопом (возбуждающий лазер: 543 нм, фильтры возбуждения и эмиссии: 540/45 нм и 600/50 нм, ively). Шкала шкалы = 50 мкм. Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4 : Миогенная дифференцировка отсортированных перицитов типа I и типа II. Сортированные перициты I и II типа выращивали в среде перицитов в течение 3 дней и затем дифференцировали в миогенной среде в течение 14 дней. Клетки фиксировали и иммуноокрашивали анти-S-миозиновым антителом и Alexa555 осла-антимышиным антителом. Иммуноцитохимия показала, что перициты типа II, но не I типа, экспрессировали зрелый маркер myotube / myofiber S-myosin (красный) под флуоресцентным микроскопом (лазер возбуждения: 543 нм, фильтры возбуждения и эмиссии: 540/45 нм и 600/50 нм , Соответственно). Шкала шкалы = 50 мкм//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55904/55904fig4large.jpg "target =" _ blank "> Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
| трубы | Окрашивание |
| Нестареющее управление | Одноячеечная суспензия от мышей дикого типа |
| Одноцветный контроль DAPI (исключение мертвых клеток) | Одноячеечная суспензия из мышей дикого типа + DAPI (5 мкг / мл) |
| Одноцветное управление GFP | Одиночная суспензия клеток от мышей Nestin-GFP |
| PE одноцветный контроль | OneComp eBeads + PDGFRβ-PE (4 мкг / мл) |
| Управление PE-FMO | Одиночная суспензия клеток от мышей Nestin-GFP + DAPI (1 мкг / мл) |
| Образец | Одноячеечная суспензия из мышей Nestin-GFP + PDGFRβ-PE-антитело (4 мкг / мл) +DAPI (1 мкг / мл) |
Таблица 1: Протокол окрашивания для одноцветных контролей, контроль PDGFRβ-PE-FMO и образец мышцы.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Перициты являются мультипотентными периваскулярными клетками 22 , 23 , расположенными на абляминальной поверхности капилляров 21 , 26 . В скелетных мышцах перициты способны дифференцироваться по адипогенным и / или миогенным путям 19 , 20 , 24 . Недавние исследования выявили две субпопуляции перицитов с различной экспрессией маркеров и различными дифференцировочными потенциалами 19 , 24 , 25 . Перициты типа I (NG2 + нестин - ) являются адипогенными, а перициты II типа (NG2 + Nestin + ) являются миогенными. Выделение этих субпопуляций для исследований in vitro требует линии двойной трансгенной мыши NG2-DsRed и Nestin-GFP. Зависимость этой очисткиПротокол на двойных трансгенных мышах значительно ограничивает его применение и, следовательно, исследования по биологии субпопуляций перицитов.
Эта видео статья иллюстрирует альтернативный метод для изоляции перицитов типа I и типа II от мышечных скелетных мышц. Этот новый метод по-прежнему опирается на метод FACS для разделения клеток. Однако вместо использования трансгенной флуоресценции NG2-DsRed он нацелен на эндогенный сигнал PDGFRβ. Это основано на наблюдении, что экспрессия NG2-DsRed ко-локализуется с PDGFRβ в скелетной мышце 19 . По сравнению с исходным методом этот протокол имеет ряд преимуществ. Во-первых, он не требует генетического фона NG2-DsRed, хотя фон Nestin-GFP все еще необходим. Во-вторых, вместо того, чтобы нацеливаться на NG2, этот протокол использует PDGFRβ, хорошо охарактеризованный маркер с проверенными и коммерчески доступными антителами. В-третьих, это позволяет одновременно изолировать боГо перицикла типа I и типа II. Например, клетки PDGFRβ-PE + Nestin-GFP- и PDGFRβ-PE + Nestin-GFP +, выделенные с использованием этого протокола, демонстрируют четкие возможности дифференциации. В частности, клетки PDGFRβ-PE + Nestin-GFP-, но не PDGFRβ-PE + Nestin-GFP + , дифференцируются в адипогенные состояния в адипоциты, тогда как PDGFRβ-PE + Nestin-GFP + , но не PDGFRβ- PE + Nestin-GFP - , Клетки подвергаются миогенной дифференцировке при миогенном состоянии. Эти данные согласуются с предыдущими сообщениями о том, что NG2-DsRed + Nestin-GFP - клетки (перициты I типа) являются адипогенными и NG2-DsRed + Nestin-GFP + клетками (перициты II типа) являются миогенными 19 , 24 , что указывает на то, что выделенные PDGFRβ -PE + Nestin-GFP - и PDGFRβ-PE + NEstin-GFP + являются действительно перицитами I и II типа соответственно. Вместе эти результаты показывают, что этот новый протокол позволяет относительно легко изолировать / очищать субпопуляции перицитов от скелетных мышц мыши и, возможно, других тканей. Это будет способствовать исследованиям по биологии перицитов и их терапевтическому переводу на различные нарушения.
Следует, однако, отметить, что существует ограничение этого метода из-за использования PDGFRβ. В предыдущем исследовании было показано, что PW1 + интерстициальные клетки (PICs) также экспрессируют PDGFRβ20. Таким образом, изолированные популяции PDGFRβ-PE + Nestin-GFP- и PDGFRβ-PE + Nestin-GFP + могут содержать PIC. Однако вклад этих ОСТ в дифференциацию перицитов ограничен, учитывая, что перициты превосходят ОНК в скелетных мышцах 20 и что перициты I типа не подвергаются моимOgenesis 19 , 25 .
Используя этот метод, были получены перициты типа I и типа II с выходами 9,5% и 2,1% соответственно. Эти цифры были сопоставимы с зарегистрированными урожаями 2,8% и 3,4% соответственно у двукратно трансгенных мышей 19 . Небольшое различие может быть связано с различными стратегиями стробирования или протоколами пищеварения. Эти результаты вновь свидетельствуют о том, что предложенный протокол может быть использован для выделения подтипов перицитов из скелетных мышц.
Критические шаги этого протокола включают в себя следующие моменты: (1) Убедитесь, что скелетные мышцы полностью измельчены и могут легко пройти через серологическую пипетку объемом 10 мл. Большие мышечные блоки мешают ферментативному перевариванию и значительно снижают выход. (2) Используйте свежеприготовленный раствор коллагеназы для мышечного пищеварения и дайте мягкое перемешивание (35 оборотов в минуту) во время инкубации. (3) СохраняйтеКонтроля и пробы на льду на этапах окрашивания и сортировки. (4) Используйте FMO-элементы управления для настройки пределов стробирования.
В дополнение к возможности дифференциации, перициты типа I и типа II также имеют различную морфологию. В частности, перициты типа I имеют круглые тела клеток, с короткими процессами и относительно большими ядрами. С другой стороны, перициты II типа обычно имеют мелкие клеточные тела с длинными и тонкими процессами и небольшими ядрами. Морфологические различия предполагают, что перициты типа I и типа II по своей природе различаются, что согласуется с гетерогенностью перицитов 21 . Что вызывает / поддерживает разницу между перицитами типа I и типа II, а также лежащие в основе молекулярные механизмы, остается неясным и требует дальнейшего изучения. Этот протокол изоляции поможет ответить на эти важные вопросы.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
У всех авторов нет конфликта интересов для раскрытия.
Acknowledgments
Эта работа была частично поддержана грантом Фонда-Фонда Фонда диетологии Myotonic Dystrophy (MDF-FF-2014-0013) и гранта на развитие науки от Американской кардиологической ассоциации (16SDG29320001).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell Sorter | Sony | SH800 | |
| Automatic Setup Beads | Sony | LE-B3001 | |
| DMEM | Gibco | 11995 | |
| Avertin | Sigma | T48402 | |
| Pericyte Growth Medium | ScienCell | 1201 | |
| MSC Basal Medium (Mouse) | Stemcell Technologies | 5501 | |
| Adipogenic Stimulatory Supplement (Mouse) | Stemcell Technologies | 5503 | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 16000 | |
| Horse Serum | Sigma | H1270 | |
| Collagenase Type 2 | Worthington | LS004176 | |
| 0.25% Trypsin/EDTA | Gibco | 25200 | |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15140 | |
| PDL | Sigma | P6407 | |
| PDGFRβ-PE Antibody | eBioscience | 12-1402 | |
| Perilipin Antibody | Sigma | P1998 | |
| S-Myosin Antibody | DSHB | MF-20 | |
| Alexa 555-anti-rabbit antibody | ThermoFisher Scientific | A-31572 | |
| Alexa 555-anti-mouse antibody | ThermoFisher Scientific | A-31570 | |
| Mounting Medium with DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | |
| DAPI | ThermoFisher Scientific | D1306 | |
| HEPES | Gibco | 15630 | |
| EDTA | Fisher | BP120 | |
| BSA | Sigma | A2058 | |
| NH4Cl | Fisher Scientific | A661 | |
| KHCO3 | Fisher Scientific | P184 | |
| PBS | Gibco | 14190 | |
| 18 G Needles | BD | 305196 | |
| 10 mL Serological Pipette | BD | 357551 | |
| OneComp eBeads | eBioscience | 01-1111 |
References
- Rennert, R. C., Sorkin, M., Garg, R. K., Gurtner, G. C. Stem cell recruitment after injury: lessons for regenerative medicine. Regenerative medicine. 7 (6), 833-850 (2012).
- Sambasivan, R., et al. Pax7-expressing satellite cells are indispensable for adult skeletal muscle regeneration. Development. 138 (17), 3647-3656 (2011).
- Relaix, F., Zammit, P. S. Satellite cells are essential for skeletal muscle regeneration: the cell on the edge returns centre stage. Development. 139 (16), 2845-2856 (2012).
- von Maltzahn, J., Jones, A. E., Parks, R. J., Rudnicki, M. A. Pax7 is critical for the normal function of satellite cells in adult skeletal muscle. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (41), 16474-16479 (2013).
- Lepper, C., Partridge, T. A., Fan, C. M. An absolute requirement for Pax7-positive satellite cells in acute injury-induced skeletal muscle regeneration. Development. 138 (17), 3639-3646 (2011).
- Kuang, S., Charge, S. B., Seale, P., Huh, M., Rudnicki, M. A. Distinct roles for Pax7 and Pax3 in adult regenerative myogenesis. J Cell Biol. 172 (1), 103-113 (2006).
- Murphy, M. M., Lawson, J. A., Mathew, S. J., Hutcheson, D. A., Kardon, G. Satellite cells, connective tissue fibroblasts and their interactions are crucial for muscle regeneration. Development. 138 (17), 3625-3637 (2011).
- Morgan, J. E., Pagel, C. N., Sherratt, T., Partridge, T. A. Long-term persistence and migration of myogenic cells injected into pre-irradiated muscles of mdx mice. J Neurol Sci. 115 (2), 191-200 (1993).
- Beauchamp, J. R., Morgan, J. E., Pagel, C. N., Partridge, T. A. Dynamics of myoblast transplantation reveal a discrete minority of precursors with stem cell-like properties as the myogenic source. J Cell Biol. 144 (6), 1113-1122 (1999).
- Partridge, T. A. Invited review: myoblast transfer: a possible therapy for inherited myopathies. Muscle Nerve. 14 (3), 197-212 (1991).
- Montarras, D., et al. Direct isolation of satellite cells for skeletal muscle regeneration. Science. 309 (5743), 2064-2067 (2005).
- Asakura, A., Seale, P., Girgis-Gabardo, A., Rudnicki, M. A. Myogenic specification of side population cells in skeletal muscle. J Cell Biol. 159 (1), 123-134 (2002).
- Tamaki, T., et al. Skeletal muscle-derived CD34+/45- and CD34-/45- stem cells are situated hierarchically upstream of Pax7+ cells. Stem Cells Dev. 17 (4), 653-667 (2008).
- Dellavalle, A., et al. Pericytes resident in postnatal skeletal muscle differentiate into muscle fibres and generate satellite cells. Nat Commun. 2, 499 (2011).
- Mitchell, K. J., et al. Identification and characterization of a non-satellite cell muscle resident progenitor during postnatal development. Nat Cell Biol. 12 (3), 257-266 (2010).
- Pannerec, A., Formicola, L., Besson, V., Marazzi, G., Sassoon, D. A. Defining skeletal muscle resident progenitors and their cell fate potentials. Development. 140 (14), 2879-2891 (2013).
- Dellavalle, A., et al. Pericytes of human skeletal muscle are myogenic precursors distinct from satellite cells. Nat Cell Biol. 9 (3), 255-267 (2007).
- Kostallari, E., et al. Pericytes in the myovascular niche promote post-natal myofiber growth and satellite cell quiescence. Development. 142 (7), 1242-1253 (2015).
- Birbrair, A., et al. Role of pericytes in skeletal muscle regeneration and fat accumulation. Stem Cells Dev. 22 (16), 2298-2314 (2013).
- Yao, Y., Norris, E. H., Mason, C. E., Strickland, S. Laminin regulates PDGFRbeta(+) cell stemness and muscle development. Nat Commun. 7, 11415 (2016).
- Armulik, A., Genove, G., Betsholtz, C. Pericytes: developmental, physiological, and pathological perspectives, problems, and promises. Dev Cell. 21 (2), 193-215 (2011).
- Dore-Duffy, P. Pericytes: pluripotent cells of the blood brain barrier. Curr Pharm Des. 14 (16), 1581-1593 (2008).
- Dore-Duffy, P., Katychev, A., Wang, X., Van Buren, E. CNS microvascular pericytes exhibit multipotential stem cell activity. J Cereb Blood Flow Metab. 26 (5), 613-624 (2006).
- Birbrair, A., et al. Skeletal muscle pericyte subtypes differ in their differentiation potential. Stem Cell Res. 10 (1), 67-84 (2013).
- Gautam, J., Nirwane, A., Yao, Y. Laminin differentially regulates the stemness of type I and type II pericytes. Stem Cell Research & Therapy. 8 (1), 28 (2017).
- Birbrair, A., et al. Pericytes: multitasking cells in the regeneration of injured, diseased, and aged skeletal muscle. Front Aging Neurosci. 6, 245 (2014).
