Summary
يصف هذا العمل بروتوكول يستند إلى فاكس التي تسمح لعزل سهلة ومتزامنة من النوع الأول والنوع الثاني بيريسيتس من العضلات والهيكل العظمي.
Abstract
بيريسيتس هي الخلايا متعددة الأوعية المحيطة بالأوعية التي تظهر عدم التجانس في أجهزة مختلفة أو حتى داخل نفس الأنسجة. في العضلات والهيكل العظمي، وهناك ما لا يقل عن اثنين من المجموعات السكانية بيريسيت (تسمى النوع الأول والنوع الثاني)، والتي تعبر عن علامات الجزيئية المختلفة ولها قدرات التمايز متميزة. باستخدام NG2-دسرد و نستين-غفب الفئران المعدلة وراثيا مزدوجة، نوع I (NG2-دسرد + نستين-غفب) والنوع الثاني (NG2-دسرد + نستين-غفب + ) بيريسيتس تم عزلها بنجاح. ومع ذلك، فإن توافر هذه الفئران المعدلة وراثيا المزدوج يمنع الاستخدام الواسع النطاق لهذه الطريقة تنقية. يصف هذا العمل بروتوكول بديل يسمح لعزل سهلة ومتزامنة من النوع الأول والنوع الثاني بيريسيتس من العضلات والهيكل العظمي. يستخدم هذا البروتوكول تقنية الفلورسنت تنشيط الفرز (فاكس) ويستهدف PDGFRβ، بدلا من NG2، جنبا إلى جنب مع إشارة نستن غفب. بعد العزلة، اكتب الأول و تيبي بيريتسيتس الثاني تظهر مورفولوجيز متميزة. وبالإضافة إلى ذلك، النوع الأول والنوع الثاني بيريسيتس معزولة مع هذه الطريقة الجديدة، مثل تلك المعزولة من الفئران المعدلة وراثيا مزدوجة، هي أديبوجينيك و ميوجينيك، على التوالي. وتشير هذه النتائج إلى أن هذا البروتوكول يمكن أن تستخدم لعزل المجموعات السكانية بيراسيت من العضلات والهيكل العظمي وربما من أنسجة أخرى.
Introduction
ضمور العضلات هو اضطراب العضلات التنكسية التي ليس لديها علاجات فعالة حتى الآن. وقد كان تطوير العلاجات التي تعزز تجديد الأنسجة دائما ذات فائدة كبيرة. الأنسجة تجديد وإصلاح بعد الضرر تعتمد على الخلايا الجذعية المقيمين / الخلايا السلف 1 . وتلتزم الخلايا الأقمار الصناعية الخلايا السلائف عضلي التي تسهم في تجديد العضلات 2 ، 3 ، 4 ، 5 ، 6 ، 7 . إلا أن استخدامها السريري يعوقه هجرة محدودة ومعدل البقاء على قيد الحياة بعد الحقن، فضلا عن انخفاض القدرة على التمايز بعد تضخيم في المختبر 8 ، 9 ، 10 ، 11 . بالإضافة إلى ساتليالخلايا التائية، والعضلات الهيكل العظمي تحتوي أيضا على العديد من السكان الخلايا الأخرى مع إمكانات عضلية 12 ، 13 ، 14 ، 15 ، 16 ، مثل الصفائح الدموية المستمدة من عامل النمو المستقبلة بيتا (PDGFRβ) الخلايا الخلالية إيجابية. هناك أدلة تبين أن خلايا PDGFRβ + المشتقة من العضلات هي قادرة على التفريق في الخلايا العضلية وتحسين أمراض العضلات وظيفة 14 ، 17 ، 18 ، 19 ، 20 . PDGFRβ في الغالب تسميات بيريسيتس 21 ، والتي هي خلايا حول الأوعية مع تعدد القدرات 22 ، 23 . بالإضافة إلى PDGFRβ، وتستخدم أيضا العديد من علامات أخرى، بما في ذلك الخلايا العصبية 2 (NG2) و CD146، ل iدنتيفي بيريسيتس 21 . ومع ذلك، تجدر الإشارة إلى أن أيا من هذه العلامات هو بيريسيت محددة 21 . كشفت الدراسات الحديثة نوعين فرعيين من بيريسيتس العضلات، ودعا النوع الأول والنوع الثاني، والتي تعبر عن علامات الجزيئية المختلفة وتنفيذ وظائف متميزة 19 ، 24 ، 25 . بيوشيميكالي، نوع I بيريسيتس هي NG2 + نيستين - ، في حين أن النوع الثاني بيريسيتس هي NG2 + نيستين + 19 ، 24 . وظيفيا، النوع الأول بيريسيتس يمكن أن يخضع التمايز أديبوجينيك، والمساهمة في تراكم الدهون و / أو التليف، في حين أن النوع الثاني بيريسيتس يمكن التفريق على طول مسار عضلي، والمساهمة في تجديد العضلات 19 ، 24 ، 25 . وتظهر هذه النتائج ما يلي: (1) النوع الأول بيريسيتس قد به المستهدفة في علاج الاضطرابات التنكسية الدهنية / التليف، و (2) النوع الثاني بيريسيتس لديها إمكانات علاجية كبيرة لضمور العضلات. مزيد من التحقيق وتوصيف هذه المجموعات السكانية تتطلب بروتوكول العزل التي تمكن من فصل النوع الأول والنوع الثاني بيريسيتس على مستوى عال من النقاء.
حاليا، ويعتمد على العزلة من المجموعات السكانية بيريسيت على NG2-دسرد و Nestin- غفب الفئران المعدلة وراثيا مزدوجة 19 ، 24 . توافر الفئران NG2-دسرد ونوعية معظم الأجسام المضادة NG2 تحد من الاستخدام الواسع النطاق لهذه الطريقة. وبالنظر إلى أن جميع NG2 + بيريسيتس أيضا التعبير عن PDGFRβ في العضلات والهيكل العظمي 19 و 20 و 24 ، ونحن نفترض أن NG2 يمكن الاستعاضة عنها PDGFRβ لعزل بيريسيتس والقطاعات السكانية الفرعية. يصف هذا العمل بروتوكول يستند إلى نظام مراقبة الأصول الميدانيةيستخدم تلطيخ PDGFR and وإشارة نيستن-غفب. هذه الطريقة أقل تطلبا للمحققين بسبب: (1) أنها لا تتطلب خلفية NG2-دسرد و (2) أنها تستخدم تجاريا PDGFR available المتاحة الأجسام المضادة، والتي تتميز جيدا. وبالإضافة إلى ذلك، فإنه يتيح العزلة في وقت واحد من النوع الأول والنوع الثاني بيريسيتس في نقاء عالية، مما يسمح لمزيد من التحقيق في البيولوجيا والإمكانات العلاجية لهذه المجموعات السكانية بيراسيت. بعد تنقية، يمكن زرع هذه الخلايا في الثقافة، ويمكن تصور مورفولوجيس بهم. ويظهر هذا العمل أيضا أن النوع الأول والنوع الثاني بيريسيتس معزولة باستخدام هذه الطريقة، مثل تلك المنقى من الفئران المعدلة وراثيا مزدوجة، هي أديبوجينيك و ميوجينيك، على التوالي.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
تم وضع ويلدتيب والفئران المعدلة وراثيا نيستين-غفب في منشأة الحيوان في جامعة مينيسوتا. تمت الموافقة على جميع الإجراءات التجريبية من قبل لجنة رعاية الحيوان واستخدام الحيوان في جامعة مينيسوتا وكانت وفقا لدليل المعاهد الوطنية للصحة لرعاية واستخدام الحيوانات المختبرية.
1. تشريح العضلات وحيدة الخلية العزلة
- الموت ببطء الفئران الكبار (6-10 أسابيع، على حد سواء الذكور والإناث) مع تريبروميثانول (250 ملغ / كلغ، والملكية الفكرية) وتعقيم الجلد البطن مع الايثانول 70٪.
ملاحظة: تم استخدام تريبروميثانول هنا بدلا من الكيتامين للتخدير / القتل الرحيم، كما هو معروف الكيتامين للتفاعل مع مستقبلات نمدا، والتي من المحتمل أن يكون لها تأثير على الدراسة. - وضع الفئران في موقف ضعيف واستخدام مشرط لجعل شق أفقي على الجلد في منطقة البطن. تقشر الجلد باليد، وسحب في الاتجاهات المعاكسة لفضح العضلات هيندليمب.
- جامعير العضلات من كلا هيندليمبس باستخدام ملقط ومقص. تخزينها في العقيمة الفوسفات مخزنة المالحة (بس) تستكمل مع 1٪ البنسلين الستربتومايسين (P / S) على الجليد.
- غسل العضلات هيندليمب تشريح في برنامج تلفزيوني الجليد الباردة تستكمل مع 1٪ P / S مرتين ونقلها إلى العقيمة لوحة 10 سم.
- تشريح بعناية من الأعصاب والأوعية الدموية، والنسيج الضام من العضلات باستخدام ملقط ومقص تحت المجهر تشريح في التكبير 2X.
- تقطيع اللحم المفروم ثم يفرخ العضلات إلى قطع صغيرة (1-2 مم 3 ) باستخدام مقص وشفرات معقمة. إذا لزم الأمر، إضافة كمية صغيرة من دولبيكو تعديل النسر المتوسطة (دمم) لضمان أن العضلات لا تجف.
- كسر ميكانيكيا الأنسجة عن طريق بيبتينغ صعودا وهبوطا من خلال 10 مل ماصة المصلية 10 مرات.
- إضافة حل الهضم الطازجة (دمم تستكمل مع 0.2٪ نوع 2 كولاجيناز) إلى الخليط. احتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 2 ساعة مع جينتله التحريض في 35 دورة / دقيقة.
- تريتورات باستخدام إبرة 18 G لتجانس الخليط. ثم، أجهزة الطرد المركزي في 500 x ج لمدة 5 دقائق. تجاهل طاف ثم ريسوسبيند بيليه في 0.25٪ التربسين / إدتا. احتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة. كرر الخطوة الطرد المركزي مرتين أكثر من مرة.
- إضافة 10 مل من دمم تستكمل مع 20٪ مصل بقري الجنين (فبس) إلى الحل وأجهزة الطرد المركزي في 500 x ج لمدة 5 دقائق. تجاهل طاف و ريسوسبيند بيليه في الدم الحمراء خلية تحلل العازلة (155 ملي نه 4 كل ، 10 ملم خكو 3 ، و 0.1 ملي إدتا).
- أجهزة الطرد المركزي في 500 x ج لمدة 5 دقائق. تجاهل طاف و ريسوسبيند بيليه في الفرز العازلة (20 ملي هيبيس، ودرجة الحموضة 7.0، 1 ملي إدتا، و 1٪ بسا في كا / مغ 2+ خالية من برنامج تلفزيوني، ودرجة الحموضة 7.0). تصفية الخليط من خلال مصفاة الخلية 40 ميكرون للحصول على تعليق خلية واحدة.
- أجهزة الطرد المركزي في 500 x ج لمدة 5 دقائق. تجاهل طاف و ريسوسبيند بيليه في 1 مل من فرز العازلة.
- عد العدد الخلايا مع عدادة الكريات وتمييع تعليق خلية واحدة إلى 5 × 10 6 / مل في فرز العازلة.
2. تلطيخ الخلية والفرز
- إعداد الضوابط والعينة كما هو موضح في الجدول 1 . وصمة عار تعليق خلية واحدة مع الأجسام المضادة على الجليد لمدة 30 دقيقة، كما هو موضح في الجدول 1 .
- أجهزة الطرد المركزي في 500 x ج لمدة 5 دقائق وغسل الكريات مرتين مع الفرز العازلة.
- إضافة دابي إلى حلول خلية واحدة، كما هو مبين في الجدول 1. استخدام دكبي 5 ميكروغرام / مل (التركيز النهائي) للتحكم لون واحد دابي و 1 ميكروغرام / مل دابي لمراقبة PDGFRβ-بي-فمو والعينة. إبقاء جميع الأنابيب على الجليد في جميع أنحاء التجربة.
- بدوره على فارز والبرمجيات. مسح وإدراج رقاقة الفرز 100 ميكرون عند المطالبة.
- تنفيذ الإعداد التلقائي ( أي محاذاة رقاقة، معايرة قطرة، معايرة تيار الجانب، وتأخير نوع كاليبراتيعلى) عن طريق تحميل الخرز الإعداد التلقائي عند المطالبة.
- عند اكتمال الإعداد التلقائي، انتقل إلى علامة التبويب "التجربة"، وانقر على "جديد"، ثم حدد "النموذج الفارغ" من "النماذج العامة".
- ضمن "إعدادات القياس"، أدخل "دابي" ل "FL1" و "نيستن-غفب" ل "FL2" و "PDGFRβ" ل "FL3." قم بإلغاء تحديد مربعات "FL4" - "FL6".
- حدد المربعات لتنشيط أجهزة الليزر 405 و 488 و 561 وانقر على "إنشاء تجربة جديدة".
- حدد الخيار "بدء معالج التعويض" واتبع برنامج "معالج التعويض" يطالب بإعداد التعويض.
- تحميل السيطرة غير ملوثين وانقر على "ابدأ". انقر فوق "إعدادات كاشف وعتبة" وضبط كسب أجهزة الاستشعار من فسك و بسك كاشفات لوضع السكان على نطاق.
- ميلاديفقط مستويات كسب قنوات FL1-FL3 مضان لوضع السكان السلبية على الجانب الأيسر من المدرجات التكرارية. انقر على زر "تسجيل" لتسجيل البيانات.
- تحميل واحد لون الضوابط واحدا تلو الآخر عند المطالبة. انقر فوق "بدء وسجل" لتسجيل البيانات. ضبط بوابات للسكان إيجابية على الرسم البياني. انقر فوق التالي."
- انتقل إلى "حساب مصفوفة" على علامة التبويب "التعويض" وانقر على "حساب" في لوحة "حساب تعويضات" لأداء التعويض. انقر فوق "إنهاء" للخروج من "معالج التعويض".
- تحميل التحكم PDGFRβ-بي-فمو وانقر على "ابدأ". رسم بوابة المضلع (بوابة A) حول الخلايا ذات الاهتمام تحت مؤامرة "جميع الأحداث".
- انقر نقرا مزدوجا داخل البوابة A لإنشاء مؤامرة الطفل. تغيير المحور Y إلى دابي ورسم بوابة المضلع (بوابة B) حول الخلايا الحية (دابي منخفضة ). انقر نقرا مزدوجا فوق iنزيد بوابة B لخلق مؤامرة الطفل. تغيير المحور السيني إلى فسك-H و Y- محور ل فسك-W ورسم بوابة المضلع (بوابة C) حول سينغليتس للقضاء على دوبلتس.
- انقر نقرا مزدوجا داخل البوابة C لإنشاء مؤامرة الطفل. تغيير المحور السيني إلى نستين-غفب و Y- محور ل PDGFRβ-بي. انقر على زر "تسجيل" لتسجيل البيانات.
- تحميل العينة وكرر الخطوات 2.11-2.12. بعد التسجيل، انقر على "وقفة" للحفاظ على العينة.
- تحديد حدود النابضة ل PDGFRβ + وخلايا نستين-غفب + على أساس التحكم PDGFRβ-بي-فمو. رسم بوابات ل PDGFRβ + نستين-غفب - و PDGFRβ + السكان نيستين-غفب + .
- تحت "طريقة الفرز"، حدد "2-واي تيوبيس" وتعيين "PDGFRβ + نيستين-غفب - " و "PDGFRβ + نيستين-غفب + " إلى أنابيب جمع اليسار واليمين، إعادةspectively. جبل الفرز العازلة مليئة 15 مل جمع الأنابيب على مرحلة جمع وانقر على زر "تحميل جمع".
- انقر على زر "استئناف" للحفاظ على عينة تشغيل. انقر فوق "بدء فرز" لجمع PDGFRβ + نستين-غفب - (نوع I بيريسيتس) و PDGFRβ + نستين-غفب + (نوع إي بيريسيتس) الخلايا.
3. بعد فرز التحليلات
- أجهزة الطرد المركزي الخلايا فرزها في 500 x ج لمدة 5 دقائق، ريسوسبيند بيليه في 1 مل من وسط بيريسيت (انظر الجدول المواد )، والاعتماد على كثافة الخلايا باستخدام عدادة الكريات.
- نوع البذور الأول والنوع الثاني بيريسيتس على بولي-D- يسين (بدل) كوفرسليبس المغلفة في ~ 1 × 10 4 خلايا / سم 2 . تنمو في المتوسطة بيريسيت لمدة 3 أيام عند 37 درجة مئوية مع 5٪ كو 2 .
- في يوم 3، وفحص التشكل بيريسيت (تحت المرحلة النقيض) والتعبير نيستين-غفب الذاتية باستخدام الصغرى الفلورسنتنطاق (الإثارة الليزر: 488 نانومتر، مرشح الإثارة: 470/40 نانومتر، وانبعاث مرشح: 515/30 نانومتر). التقاط الصور تحت هدف 20X (0.45 نا).
- استبدال المتوسطة بيريسيت مع أديبوجينيك (الماوس مسك القاعدية المتوسطة + الملحق التحفيز أديبوجينيك) و ميوجينيك (دمم + 2٪ مصل الحصان) المتوسطة لبدء التمايز أديبوجينيك وميوجينيك، على التوالي، كما هو موضح سابقا 20 . تغيير المتوسطة كل 2-3 أيام.
- إصلاح الخلايا في يوم 17 (14 يوما بعد أديبوجينيك / ميوجينيك التمايز) في بارافورمالدهيد 4٪ (بفا) لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
ملاحظة: الحذر، بفا هو مادة مسرطنة. - أداء إمونوسيتوشيميستري ضد بيريليبين (علامة خلية شحمية) و S- ميوسين (ميوتوب ناضجة / ميوفيبر علامة)، كما هو موضح في المنشورات السابقة 19 ، 20 .
- غسل الخلايا الثابتة 3 مرات في برنامج تلفزيوني لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
- إضافة العازلة حجب (برنامج تلفزيونيتكمل مع 5٪ مصل حمار، 3٪ بسا، و 0.3٪ تريتون X-100) واحتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 ساعة.
- احتضان الخلايا مع المضادة للبيريليبين (2 ميكروغرام / مل) و / أو المضادة للميوسين (2 ميكروغرام / مل) الأجسام المضادة في 4 درجات مئوية بين عشية وضحاها.
- غسل الخلايا 3 مرات في برنامج تلفزيوني لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
- احتضان الخلايا مع اليكسا 555 حمار المضادة للأرنب (4 ميكروغرام / مل) و / أو اليكسا 555 حمار مكافحة الماوس (4 ميكروغرام / مل) الأجسام المضادة في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 ساعة.
- غسل الخلايا 3 مرات في برنامج تلفزيوني لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
- جبل الخلايا المناعية مع تصاعد المتوسطة التي تحتوي على دابي (انظر الجدول من المواد). دراسة بيريليبين و S- ميوسين التعبير باستخدام المجهر الفلورسنت (الإثارة الليزر: 543 نانومتر، 540/45 نانومتر الإثارة وانبعاث 600/50 نانومتر) والتقاط الصور تحت هدف 40X (0.60 نا).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
يتم تصحيح المعلمات فاكس، بما في ذلك كثافة الليزر وتعويض القناة، استنادا إلى نتائج التحكم غير ملوثين والضوابط لون واحد. يتم استخدام التحكم PDGFRβ-بي-فمو لضبط التباعد للسكان PDGFRβ-بي + ( الشكل 1A ). بين PDGFRβ-بي - الخلايا، وهما السكان التي تمثل نيستين غفب + و نستين-غفب - الخلايا بشكل واضح ( الشكل 1A ). يتم تعيين حدود التباعد ل PDGFRβ-بي + نستين-غفب + و PDGFRβ-بي + نستين-غفب - السكان على أساس النابضة ل PDGFRβ-بي + و نستين-غفب + ( الشكل 1A ). وتستخدم هذه الحدود لتحديد وفرز PDGFRβ-بي + نستين-غفب + (النوع الثاني بيريسيتس) و PDGFRβ-بي + نستين-غفب - (نوع I بيريسيتإس) الخلايا من العينة ( الشكل 1B ). بدغفرβ-بي + نستين-غفب - و PDGFRβ-بي + نستين-غفب + الخلايا تمثل 9.5٪ و 2.1٪ من إجمالي الخلايا في حل خلية واحدة، على التوالي.
فاكس معزولة من النوع الأول والنوع الثاني بيريسيتس تظهر الاختلافات المورفولوجية بعد ثلاثة أيام في الثقافة. نوع I بيريسيتس عرض التشكل الأميبايد، مع الهيئات الخلية مستديرة والعمليات القصيرة ( الشكل 2 ). النوع الثاني بيريسيتس، ومع ذلك، تظهر التشكل التشعب، وتتميز أجسام الخلايا الصغيرة وطويلة، والعمليات رقيقة ( الشكل 2 ). في هذا الوقت، تبقى معظم بيريسيتس من النوع الثاني كما نيستين-غفب + ، في حين أن النوع الأول بيريسيتس هي نيستين-غفب - ( الشكل 2 ).
وبالإضافة إلى ذلك، اكتب الأول، ولكن ليس من النوع الثاني، بيريسيتيس التفريق في الشحميات معربا عن بيريليبين بعد 14 يوما في المتوسطة أديبوجينيك ( الشكل 3 ). النوع الثاني، ولكن ليس اكتب الأول، بيريسيتس التفريق في S- ميوسين معربا عن ميوتوبيس بعد 14 يوما في المتوسطة عضلي ( الشكل 4 ). هذه النتائج تشير بقوة إلى أن النوع الأول بيريسيتس هي أديبوجينيك، في حين أن النوع الثاني بيريسيتس هي عضلي.
الشكل 1 : حدود النابضة والفرز التمثيلي. ( A ) مؤامرة الفلورسنت للسيطرة PDGFRβ-بي-فمو، مما يدل على PDGFRβ-بي + نستين-غفب - و PDGFRβ-بي + نيستين غفب + حدود الانطلاق. ( B ) مؤامرة ممثل الفلورسنت من العينة التي تبين توزيع PDGFRβ-بي + نستين-غفب
الشكل 2: مورفولوجيا والتعبير نيستن غفب في نوع الفرز الأول والنوع الثاني بيريسيتس. تم فرز النوعين الأول والثاني من نوع بيريسيتس على كوفرسليبس ونمت في وسط بيريسيت لمدة 3 أيام. نوع I بيريسيتس أظهرت أجسام الخلايا المستديرة، مع عمليات قصيرة، ولا إشارة غفب الذاتية تحت المجهر الفلورسنت (الإثارة ليزر: 488 نانومتر؛ الإثارة والانبعاثات مرشحات: 470/40 نانومتر و 515/30 نانومتر، على التوالي). النوع الثاني بيريسيتس أظهرت الهيئات خلية صغيرة، مع عمليات طويلة ورقيقة، وإشارة غفب الذاتية قوية تحتالمجهر الفلورسنت تحت نفس الإعدادات. شريط مقياس = 100 ميكرون الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: التمايز أديبوجينيك من نوع الفرز الأول والنوع الثاني بيريسيتس. تمت زراعة النوع الأول من النوع الأول والنوع الثاني بيريسيتس في وسط بيريسيت لمدة 3 أيام. ثم كانت متباينة في وسط أديبوجينيك لمدة 14 يوما. تم إصلاح الخلايا و إمونوستيند مع الأجسام المضادة المضادة بيريليبين تليها Alexa555 حمار المضادة للأرنب الأجسام المضادة. وأظهرت إمونوسيتوشيميستري أن النوع الأول، ولكن ليس من النوع الثاني، بيريتسيتس أعرب عن علامة بيليليبين (خلية حمراء) تحت المجهر الفلورسنت (الإثارة الليزر: 543 نانومتر؛ الإثارة والانبعاثات مرشحات: 540/45 نانومتر و 600/50 نانومتر، واحترام ively). مقياس شريط = 50 ميكرون الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4 : التمايز العضلي من نوع الفرز الأول والنوع الثاني بيريسيتس. تم فرز النوع الأول والنوع الثاني بيريسيتس في وسط بيريسيت لمدة 3 أيام، ثم تم التمييز في المتوسطة عضلي لمدة 14 يوما. تم إصلاح الخلايا و إمونوستيند المضادة لل S- ميوسين الأجسام المضادة و Alexa555 حمار المضادة للماوس الأجسام المضادة. وأظهرت إمونوسيتوشيميستري أن النوع الثاني، ولكن ليس اكتب الأول، أعرب بيريسيتس ناضجة ميوتوب / ميوفيبر علامة S- ميوسين (الأحمر) تحت المجهر الفلورسنت (الإثارة الليزر: 543 نانومتر؛ الإثارة والانبعاثات مرشحات: 540/45 نانومتر و 600/50 نانومتر ، على التوالي). شريط مقياس = 50 ميكرون//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55904/55904fig4large.jpg "تارجيت =" _ بلانك "> الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
| أنابيب | تلطيخ |
| السيطرة غير ملوثين | تعليق خلية واحدة من الفئران ويلديب |
| دابي تحكم لون واحد (استبعاد الخلايا الميتة) | تعليق خلية واحدة من الفئران ويلديب + دابي (5 ميكروغرام / مل) |
| غفب التحكم لون واحد | تعليق خلية واحدة من الفئران نستين-غفب |
| بي واحد-- اللون السيطرة | أونيباد إبيدس + PDGFRβ-بي الأجسام المضادة (4 ميكروغرام / مل) |
| بي-فمو السيطرة | تعليق خلية واحدة من الفئران نيستين-غفب + دابي (1 ميكروغرام / مل) |
| عينة | تعليق خلية واحدة من الفئران نستين-غفب + PDGFRβ-بي الأجسام المضادة (4 ميكروغرام / مل) +دابي (1 ميكروغرام / مل) |
الجدول 1: بروتوكول تلطيخ للضوابط لون واحد، ومراقبة PDGFRβ-بي-فمو، وعينة العضلات.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
بيريسيتس متعددة الخلايا المحيطة بالأوعية 22 ، 23 تقع على السطح الشعري للشعيرات الدموية 21 ، 26 . في العضلات والهيكل العظمي، بيريسيتس هي قادرة على التفريق على طول مسارات أديبوجينيك و / أو عضلي 19 ، 20 ، 24 . كشفت الدراسات الحديثة اثنين من المجموعات الفرعية من بيريسيتس، مع التعبير علامة مختلفة وامتيازات متميزة التمايز 19 ، 24 ، 25 . النوع الأول (NG2 + نستين - ) بيريسيتس هي أديبوجينيك، في حين أن النوع الثاني (NG2 + نستين + ) بيريسيتس هي عضلية المنشأ. عزل هذه المجموعات السكانية في الدراسات المختبرية يتطلب NG2-دسرد و نستين-غفب خط الماوس المعدلة وراثيا مزدوجة. اعتماد هذه تنقيةبروتوكول على الفئران المعدلة وراثيا مزدوج يحد بشكل كبير من تطبيقه وبالتالي البحث في علم الأحياء من المجموعات السكانية الفرعية بيريسيت.
يوضح هذا المقال فيديو طريقة بديلة لعزل النوع الأول والنوع الثاني بيريسيتس من العضلات والهيكل العظمي الماوس. هذه الطريقة الجديدة لا تزال تعتمد على تقنية القائمة على نظام مراقبة الأصول الميدانية لفصل الخلايا. ومع ذلك، بدلا من استخدام مضان المعدلة وراثيا NG2-دسرد، فإنه يستهدف إشارة PDGFR end الذاتية. ويستند هذا على ملاحظة أن التعبير NG2-دسرد يشارك في توطين مع PDGFRβ في العضلات والهيكل العظمي 19 . وبالمقارنة مع الطريقة الأصلية، وهذا البروتوكول لديه العديد من المزايا. أولا، فإنه لا يتطلب NG2-دسرد خلفية وراثية، على الرغم من أن خلفية نستين-غفب لا تزال هناك حاجة. ثانيا، بدلا من استهداف NG2، يستخدم هذا البروتوكول PDGFRβ، علامة تتميز جيدا مع التحقق من صحة والأجسام المضادة المتاحة تجاريا. ثالثا، فإنه يسمح لعزل في وقت واحد من بومن النوع الأول والنوع الثاني بيريسيتس. على سبيل المثال، PDGFRβ-بي + نستين-غفب - و PDGFRβ-بي + نستين-غفب + الخلايا المعزولة باستخدام هذا البروتوكول إثبات قدرات التمايز متميزة. على وجه التحديد، PDGFRβ-بي + نستين-غفب - ، ولكن ليس PDGFRβ-بي + نستين-غفب + ، تفرق الخلايا في الخلايا الشحمية في حالة أديبوجينيك، في حين PDGFRβ-بي + نيستين غفب + ، ولكن ليس PDGFRβ-بي + نيستين غفب - ، والخلايا تخضع التمايز عضلي تحت شرط عضلي المنشأ. هذه البيانات تتفق مع التقارير السابقة التي تبين أن NG2-دسرد + نيستين-غفب - الخلايا (نوع I بيريسيتس) هي أديبوجينيك و NG2-دسرد + الخلايا نيستين-غفب + (نوع إي بيريسيتس) هي عضلي 19 ، 24 ، مما يشير إلى أن PDGFR isolated معزولة -PE + نيستين-غفب - و PDGFRβ-بي + Nإستين-غفب + الخلايا هي في الواقع نوع I ونوع الثاني بيريسيتس، على التوالي. معا، تشير هذه النتائج إلى أن هذا البروتوكول الجديد يسمح لعزل سهلة نسبيا / تنقية من المجموعات السكانية بيراسيت من العضلات والهيكل العظمي الماوس، وربما الأنسجة الأخرى. وهذا من شأنه تعزيز الدراسات على بيراسيت البيولوجيا والترجمة العلاجية لمختلف الاضطرابات.
ومع ذلك، تجدر الإشارة إلى وجود قيود على هذه الطريقة بسبب استخدام PDGFRβ. وقد تبين في دراسة سابقة أن PW1 + الخلايا الخلالية (بيكس) أيضا التعبير عن PDGFRβ 20 . لذلك، قد تحتوي PDGFRβ-بي + نيستين-غفب المعزولة - و PDGFRβ-بي + نيستين-غفب + على بيكس. ومع ذلك، فإن مساهمة هذه الجزر إلى التمايز بيراسيت محدودة، نظرا لأن بيريسيتس تفوق بيكس في العضلات والهيكل العظمي 20 وأن النوع الأول بيريسيتس لا تخضع ليأوجينيسيس 19 ، 25 .
باستخدام هذه الطريقة، تم الحصول على النوع الأول والنوع الثاني بيريسيتس في عوائد 9.5٪ و 2.1٪ على التوالي. وكانت هذه الأرقام مماثلة للغلة المبلغ عنها من 2.8٪ و 3.4٪ على التوالي، في الفئران المعدلة وراثيا مزدوجة 19 . قد يكون الاختلاف طفيف بسبب استراتيجيات التباعد مختلفة أو بروتوكولات الهضم. هذه النتائج تشير مرة أخرى إلى أن البروتوكول المقترح يمكن أن تستخدم لعزل الأنواع الفرعية من بيريسيتس من العضلات والهيكل العظمي.
الخطوات الحاسمة من هذا البروتوكول تشمل النقاط التالية: (1) تأكد من أن عضلات الهيكل العظمي هي مفروم تماما وقادرة على المرور بسهولة من خلال ماصة 10 مل المصلية. كتل العضلات الكبيرة تتداخل مع الهضم الأنزيمي وتقلل إلى حد كبير الغلة. (2) استخدام حل كولاجيناز طازجة لعملية الهضم العضلات والسماح الإثارة لطيف (35 دورة / دقيقة) أثناء الحضانة. (3) الحفاظ علىالضوابط وعينة على الجليد في جميع أنحاء تلطيخ والفرز الخطوات. (4) استخدام ضوابط فمو لإعداد حدود النابضة.
بالإضافة إلى القدرة على التمايز، اكتب الأول والنوع الثاني بيريسيتس أيضا تظهر مورفولوجيا مختلفة. على وجه التحديد، النوع الأول بيريسيتس لها أجسام الخلايا المستديرة، مع عمليات قصيرة ونوى كبيرة نسبيا. النوع الثاني بيريسيتس، من ناحية أخرى، وعادة ما يكون أجسام الخلايا الصغيرة، مع عمليات طويلة ورقيقة ونوى صغيرة. الاختلافات المورفولوجية تشير إلى أن النوع الأول والنوع الثاني بيريسيتس مختلفة جوهريا، وهو ما يتفق مع طبيعة غير متجانسة من بيريسيتس 21 . ما الأسباب / يحافظ على الفرق بين النوع الأول والنوع الثاني بيريسيتس، فضلا عن الآليات الجزيئية الكامنة، لا تزال غير واضحة وتتطلب المزيد من التحقيق. هذا البروتوكول العزلة سوف تساعد على الإجابة على هذه الأسئلة الهامة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
جميع المؤلفين ليس لديهم تضارب في المصالح للكشف.
Acknowledgments
وقد حظي هذا العمل بدعم جزئي من منحة مقدمة من الصندوق من مؤسسة ميوتونيك ديستروفي (مدف-فف-2014-0013) ومنحة التنمية العلمية من جمعية القلب الأمريكية (16SDG29320001).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell Sorter | Sony | SH800 | |
| Automatic Setup Beads | Sony | LE-B3001 | |
| DMEM | Gibco | 11995 | |
| Avertin | Sigma | T48402 | |
| Pericyte Growth Medium | ScienCell | 1201 | |
| MSC Basal Medium (Mouse) | Stemcell Technologies | 5501 | |
| Adipogenic Stimulatory Supplement (Mouse) | Stemcell Technologies | 5503 | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 16000 | |
| Horse Serum | Sigma | H1270 | |
| Collagenase Type 2 | Worthington | LS004176 | |
| 0.25% Trypsin/EDTA | Gibco | 25200 | |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15140 | |
| PDL | Sigma | P6407 | |
| PDGFRβ-PE Antibody | eBioscience | 12-1402 | |
| Perilipin Antibody | Sigma | P1998 | |
| S-Myosin Antibody | DSHB | MF-20 | |
| Alexa 555-anti-rabbit antibody | ThermoFisher Scientific | A-31572 | |
| Alexa 555-anti-mouse antibody | ThermoFisher Scientific | A-31570 | |
| Mounting Medium with DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | |
| DAPI | ThermoFisher Scientific | D1306 | |
| HEPES | Gibco | 15630 | |
| EDTA | Fisher | BP120 | |
| BSA | Sigma | A2058 | |
| NH4Cl | Fisher Scientific | A661 | |
| KHCO3 | Fisher Scientific | P184 | |
| PBS | Gibco | 14190 | |
| 18 G Needles | BD | 305196 | |
| 10 mL Serological Pipette | BD | 357551 | |
| OneComp eBeads | eBioscience | 01-1111 |
References
- Rennert, R. C., Sorkin, M., Garg, R. K., Gurtner, G. C. Stem cell recruitment after injury: lessons for regenerative medicine. Regenerative medicine. 7 (6), 833-850 (2012).
- Sambasivan, R., et al. Pax7-expressing satellite cells are indispensable for adult skeletal muscle regeneration. Development. 138 (17), 3647-3656 (2011).
- Relaix, F., Zammit, P. S. Satellite cells are essential for skeletal muscle regeneration: the cell on the edge returns centre stage. Development. 139 (16), 2845-2856 (2012).
- von Maltzahn, J., Jones, A. E., Parks, R. J., Rudnicki, M. A. Pax7 is critical for the normal function of satellite cells in adult skeletal muscle. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (41), 16474-16479 (2013).
- Lepper, C., Partridge, T. A., Fan, C. M. An absolute requirement for Pax7-positive satellite cells in acute injury-induced skeletal muscle regeneration. Development. 138 (17), 3639-3646 (2011).
- Kuang, S., Charge, S. B., Seale, P., Huh, M., Rudnicki, M. A. Distinct roles for Pax7 and Pax3 in adult regenerative myogenesis. J Cell Biol. 172 (1), 103-113 (2006).
- Murphy, M. M., Lawson, J. A., Mathew, S. J., Hutcheson, D. A., Kardon, G. Satellite cells, connective tissue fibroblasts and their interactions are crucial for muscle regeneration. Development. 138 (17), 3625-3637 (2011).
- Morgan, J. E., Pagel, C. N., Sherratt, T., Partridge, T. A. Long-term persistence and migration of myogenic cells injected into pre-irradiated muscles of mdx mice. J Neurol Sci. 115 (2), 191-200 (1993).
- Beauchamp, J. R., Morgan, J. E., Pagel, C. N., Partridge, T. A. Dynamics of myoblast transplantation reveal a discrete minority of precursors with stem cell-like properties as the myogenic source. J Cell Biol. 144 (6), 1113-1122 (1999).
- Partridge, T. A. Invited review: myoblast transfer: a possible therapy for inherited myopathies. Muscle Nerve. 14 (3), 197-212 (1991).
- Montarras, D., et al. Direct isolation of satellite cells for skeletal muscle regeneration. Science. 309 (5743), 2064-2067 (2005).
- Asakura, A., Seale, P., Girgis-Gabardo, A., Rudnicki, M. A. Myogenic specification of side population cells in skeletal muscle. J Cell Biol. 159 (1), 123-134 (2002).
- Tamaki, T., et al. Skeletal muscle-derived CD34+/45- and CD34-/45- stem cells are situated hierarchically upstream of Pax7+ cells. Stem Cells Dev. 17 (4), 653-667 (2008).
- Dellavalle, A., et al. Pericytes resident in postnatal skeletal muscle differentiate into muscle fibres and generate satellite cells. Nat Commun. 2, 499 (2011).
- Mitchell, K. J., et al. Identification and characterization of a non-satellite cell muscle resident progenitor during postnatal development. Nat Cell Biol. 12 (3), 257-266 (2010).
- Pannerec, A., Formicola, L., Besson, V., Marazzi, G., Sassoon, D. A. Defining skeletal muscle resident progenitors and their cell fate potentials. Development. 140 (14), 2879-2891 (2013).
- Dellavalle, A., et al. Pericytes of human skeletal muscle are myogenic precursors distinct from satellite cells. Nat Cell Biol. 9 (3), 255-267 (2007).
- Kostallari, E., et al. Pericytes in the myovascular niche promote post-natal myofiber growth and satellite cell quiescence. Development. 142 (7), 1242-1253 (2015).
- Birbrair, A., et al. Role of pericytes in skeletal muscle regeneration and fat accumulation. Stem Cells Dev. 22 (16), 2298-2314 (2013).
- Yao, Y., Norris, E. H., Mason, C. E., Strickland, S. Laminin regulates PDGFRbeta(+) cell stemness and muscle development. Nat Commun. 7, 11415 (2016).
- Armulik, A., Genove, G., Betsholtz, C. Pericytes: developmental, physiological, and pathological perspectives, problems, and promises. Dev Cell. 21 (2), 193-215 (2011).
- Dore-Duffy, P. Pericytes: pluripotent cells of the blood brain barrier. Curr Pharm Des. 14 (16), 1581-1593 (2008).
- Dore-Duffy, P., Katychev, A., Wang, X., Van Buren, E. CNS microvascular pericytes exhibit multipotential stem cell activity. J Cereb Blood Flow Metab. 26 (5), 613-624 (2006).
- Birbrair, A., et al. Skeletal muscle pericyte subtypes differ in their differentiation potential. Stem Cell Res. 10 (1), 67-84 (2013).
- Gautam, J., Nirwane, A., Yao, Y. Laminin differentially regulates the stemness of type I and type II pericytes. Stem Cell Research & Therapy. 8 (1), 28 (2017).
- Birbrair, A., et al. Pericytes: multitasking cells in the regeneration of injured, diseased, and aged skeletal muscle. Front Aging Neurosci. 6, 245 (2014).
