Summary
Diese Arbeit beschreibt ein FACS-basiertes Protokoll, das eine einfache und gleichzeitige Isolierung von Typ I und Typ II Perizyten aus Skelettmuskeln ermöglicht.
Abstract
Pericytes sind perivaskuläre multipotenten Zellen, die Heterogenität in verschiedenen Organen oder sogar innerhalb desselben Gewebes zeigen. In Skelettmuskeln gibt es mindestens zwei pericyte Subpopulationen (genannt Typ I und Typ II), die unterschiedliche molekulare Marker exprimieren und unterschiedliche Differenzierungsfähigkeiten aufweisen. Unter Verwendung von NG2-DsRed- und Nestin-GFP-Doppel-transgenen Mäusen wurden Typ I (NG2-DsRed + Nestin-GFP-) und Typ-II (NG2-DsRed + Nestin-GFP + ) Perizyten erfolgreich isoliert. Die Verfügbarkeit dieser doppelt-transgenen Mäuse verhindert jedoch die weit verbreitete Anwendung dieser Reinigungsmethode. Diese Arbeit beschreibt ein alternatives Protokoll, das die einfache und gleichzeitige Isolierung von Typ I und Typ II Perizyten aus Skelettmuskeln ermöglicht. Dieses Protokoll nutzt die Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierung (FACS) -Technik und zielt auf PDGFRβ und nicht auf NG2 zusammen mit dem Nestin-GFP-Signal. Nach der Isolation geben Sie I und ty einPe II pericytes zeigen deutliche Morphologien. Darüber hinaus sind Typ I und Typ II Perizyte, die mit dieser neuen Methode isoliert wurden, wie diejenigen, die aus den doppelt-transgenen Mäusen isoliert wurden, adipogen und myogenisch. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass dieses Protokoll verwendet werden kann, um pericyte Subpopulationen aus Skelettmuskeln und möglicherweise aus anderen Geweben zu isolieren.
Introduction
Muskeldystrophie ist eine Muskel-degenerative Erkrankung, die bisher keine wirksamen Behandlungen hat. Die Entwicklung von Therapien, die die Geweberegeneration fördern, war schon immer von großem Interesse. Geweberegeneration und Reparatur nach Schädigung hängen von residenten Stammzellen / Vorläuferzellen ab 1 . Satellitenzellen sind myogene Vorläuferzellen, die zur Muskelregeneration beitragen 2 , 3 , 4 , 5 , 6 , 7 . Ihre klinische Anwendung wird jedoch durch ihre begrenzte Migration und niedrige Überlebensrate nach der Injektion sowie durch ihre verminderte Differenzierungsfähigkeit nach in vitro Verstärkung 8 , 9 , 10 , 11 behindert. Zusätzlich zu satelliTe-Zellen, Skelettmuskeln enthalten auch viele andere Zellpopulationen mit myogenem Potenzial 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , wie Plättchen-abgeleitete Wachstumsfaktor-Rezeptor-beta (PDGFRβ) -positive interstitielle Zellen. Es gibt Hinweise darauf, dass Muskel-abgeleitete PDGFRβ + -Zellen in der Lage sind, sich in myogene Zellen zu differenzieren und die Muskelpathologie und die Funktion 14 , 17 , 18 , 19 , 20 zu verbessern. PDGFRβ dominiert überwiegend Perizyten 21 , die perivaskuläre Zellen mit Pluripotenz 22 , 23 sind . Zusätzlich zu PDGFRβ werden auch viele andere Marker, darunter Neuron-Glial 2 (NG2) und CD146, verwendetZirbeln 21 Es ist jedoch zu beachten, dass keiner dieser Marker pericytspezifisch ist. Jüngste Studien zeigten zwei Subtypen von Muskelpericyten, genannt Typ I und Typ II, die unterschiedliche molekulare Marker exprimieren und unterschiedliche Funktionen ausführen 19 , 24 , 25 . Biochemisch sind Typ I Perizyten NG2 + Nestin - , während Typ II Perizyten NG2 + Nestin + 19 , 24 sind . Funktionell können Typ I Perizyten adipogene Differenzierung unterliegen, was zur Fettansammlung und / oder Fibrose beiträgt, während Typ-Periziten des Typs II entlang des myogenen Weges differenzieren können, was zur Muskelregeneration 19 , 24 , 25 beiträgt. Diese Ergebnisse zeigen, dass: (1) Typ I Perizyten kann bE in der Behandlung von fetthaltigen degenerativen Störungen / Fibrose gezielt, und (2) Typ II Perizyten haben ein großes therapeutisches Potential für die Muskeldystrophie. Eine weitere Untersuchung und Charakterisierung dieser Populationen erfordert ein Isolationsprotokoll, das die Trennung von Typ I und Typ II Perizyten auf einem hohen Reinheitsgrad ermöglicht.
Derzeit besteht die Isolierung von Pericyt-Subpopulationen auf NG2-DsRed- und Nestin-GFP-Doppel-transgenen Mäusen 19 , 24 . Die Verfügbarkeit von NG2-DsRed-Mäusen und die Qualität der meisten NG2-Antikörper begrenzen die weit verbreitete Anwendung dieser Methode. Da alle NG2 + pericytes auch PDGFRβ in den Skelettmuskeln 19 , 20 , 24 exprimieren, wird vermutet, dass NG2 durch PDGFRβ zur Isolierung von Perizyten und deren Subpopulationen ersetzt werden kann. Diese Arbeit beschreibt ein FACS-basiertes Protokoll, dasVerwendet PDGFRβ-Färbung und das Nestin-GFP-Signal. Diese Methode ist weniger anspruchsvoll für die Ermittler, weil: (1) es nicht den NG2-DsRed-Hintergrund erfordert und (2) es verwendet kommerziell erhältliche PDGFRβ-Antikörper, die gut charakterisiert sind. Darüber hinaus ermöglicht es die gleichzeitige Isolierung von Typ I und Typ II Perizyten in hoher Reinheit, was eine weitere Untersuchung der biologischen und therapeutischen Potenziale dieser Pericyt-Subpopulationen ermöglicht. Nach der Reinigung können diese Zellen in Kultur gezüchtet werden, und ihre Morphologien können sichtbar gemacht werden. Diese Arbeit zeigt auch, dass Typ I und Typ II Perizyme, die nach dieser Methode isoliert wurden, wie diejenigen, die aus doppelt-transgenen Mäusen gereinigt wurden, adipogene und myogene sind.
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Protocol
Wildtype und Nestin-GFP-transgene Mäuse wurden in der Tierfabrik an der University of Minnesota untergebracht. Alle experimentellen Verfahren wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee an der University of Minnesota genehmigt und waren im Einklang mit dem NIH Guide für die Pflege und Verwendung von Labortieren.
1. Muskel-Dissektion und Einzelzell-Isolation
- Euthanisieren erwachsene Mäuse (6-10 Wochen, männlich und weiblich) mit Tribromethanol (250 mg / kg, ip) und sterilisieren ihre Bauchhaut mit 70% Ethanol.
HINWEIS: Tribromethanol wurde hier anstelle von Ketamin für Anästhesie / Euthanasie verwendet, da Ketamin bekannt ist, mit den NMDA-Rezeptoren zu interagieren, was möglicherweise Auswirkungen auf die Studie haben könnte. - Legen Sie die Mäuse in die Rückenlage und verwenden Sie ein Skalpell, um einen horizontalen Schnitt auf der Bauchhaut zu machen. Ziehen Sie die Haut von Hand ab und ziehen Sie in entgegengesetzte Richtungen, um die Hinterbeinmuskeln auszusetzen.
- CollecDie Muskeln von beiden Hinterbeinen mit Pinzette und Schere. Lagern Sie sie in steriler Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (PBS), ergänzt mit 1% Penicillin-Streptomycin (P / S) auf Eis.
- Waschen Sie die seziertes Hindlimb-Muskeln in eiskaltem PBS, das mit 1% P / S zweimal ergänzt wird, und übertragen Sie es auf eine sterile 10 cm Platte.
- Sorgfältig sezieren Nerven, Blutgefäße und Bindegewebe aus den Muskeln mit Pinzette und Schere unter einem Seziermikroskop bei 2facher Vergrößerung.
- Die Muskeln in kleine Stücke (1-2 mm 3 ) mit sterilen Scheren und Klingen fein hacken und zerkleinern. Wenn nötig, füge eine kleine Menge Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) hinzu, um sicherzustellen, dass die Muskeln nicht ausgetrocknet sind.
- Mechanisch das Gewebe durch Pipettieren auf und ab durch eine 10 mL serologische Pipette 10 mal brechen.
- Fügen Sie frisch hergestellte Verdauungslösung (DMEM, ergänzt mit 0,2% Typ 2 Kollagenase) zu der Mischung hinzu. Inkubieren bei 37 ° C für 2 h mit GentlAufregung bei 35 Umdrehungen / min.
- Triturat unter Verwendung einer 18 G-Nadel, um die Mischung zu homogenisieren. Dann bei 500 xg für 5 min zentrifugieren. Den Überstand verwerfen und dann das Pellet in 0,25% Trypsin / EDTA resuspendieren. Inkubieren bei 37 ° C für 10 min. Wiederholen Sie den Zentrifugationsschritt zwei weitere Male.
- Zugabe von 10 ml DMEM, ergänzt mit 20% fötalem Rinderserum (FBS) zur Lösung und zentrifugieren bei 500 xg für 5 min. Den Überstand verwerfen und das Pellet in rotem Blutzellen-Lysepuffer (155 mM NH 4 Cl, 10 mM KHCO 3 und 0,1 mM EDTA) resuspendieren.
- Zentrifuge bei 500 xg für 5 min. Verwerfen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Pellet in Sortierpuffer (20 mM HEPES, pH 7,0, 1 mM EDTA und 1% BSA in Ca / Mg 2+ -freiem PBS, pH 7,0). Filtriere die Mischung durch einen 40 μm-Zellsieb, um eine Einzeller-Suspension zu erhalten.
- Zentrifuge bei 500 xg für 5 min. Den Überstand verwerfen und das Pellet in 1 ml Sortierpuffer resuspendieren.
- Zähle dieZellzahl mit einem Hämocytometer und verdünnen die Einzeller-Suspension auf 5 x 10 6 / ml in Sortierpuffer.
2. Zellfärbung und Sortierung
- Bereiten Sie die Kontrollen und die Probe wie in Tabelle 1 beschrieben vor. Färben Sie die Einzelzellsuspension mit den jeweiligen Antikörpern auf Eis für 30 min, wie in Tabelle 1 beschrieben.
- Bei 500 xg für 5 min zentrifugieren und die Pellets zweimal mit Sortierpuffer waschen.
- Fügen Sie DAPI zu den Einzelzelllösungen hinzu, wie in Tabelle 1 angegeben. Verwenden Sie für die DAPI-Einfarbenkontrolle 5 μg / ml DAPI (Endkonzentration) und 1 μg / ml DAPI für die PDGFRβ-PE-FMO-Kontrolle und die Probe. Halten Sie alle Röhren auf Eis während des Experiments.
- Schalten Sie den Sortierer und die Software ein. Scannen und Einfügen eines 100 μm Sortierchips, wenn Sie dazu aufgefordert werden.
- Führen Sie die automatische Einrichtung ( dh Chip-Ausrichtung, Tröpfchen-Kalibrierung, Seitenstrom-Kalibrierung und Sortierverzögerung KalibrierungOn) durch Laden der automatischen Setup-Perlen, wenn Sie dazu aufgefordert werden.
- Wenn das automatische Setup abgeschlossen ist, gehen Sie auf die Registerkarte "Experiment", klicken Sie auf "Neu" und wählen Sie die "Leere Vorlage" aus "Öffentliche Vorlagen".
- Unter "Messeinstellungen" geben Sie "DAPI" für "FL1", "Nestin-GFP" für "FL2" und "PDGFRβ" für "FL3" ein. Deaktivieren Sie die Felder für "FL4" - "FL6".
- Überprüfen Sie die Kästchen, um die 405, 488 und 561 Laser zu aktivieren und klicken Sie auf "Neues Experiment erstellen".
- Wählen Sie den "Start Compensation Wizard" -Option und folgen Sie den "Compensation Wizard" Software-Aufforderungen, um die Kompensation einzurichten.
- Laden Sie das ungefärbte Steuerelement und klicken Sie auf "Start". Klicken Sie auf "Detector & Threshold Settings" und stellen Sie die Sensorverstärkung der FSC- und BSC-Detektoren ein, um die Population auf die Waage zu stellen.
- AnzeigeNur die Verstärkungsstufen der FL1-FL3 Fluoreszenzkanäle, um die negativen Populationen auf der linken Seite der Histogramme zu platzieren. Klicken Sie auf die Schaltfläche "Record", um die Daten aufzuzeichnen.
- Laden Sie einfarbige Kontrollen eins nach dem anderen, wenn Sie dazu aufgefordert werden. Klicken Sie auf "Start und Record", um die Daten aufzuzeichnen. Passen Sie die Tore für die positiven Populationen an den Histogrammen an. Weiter klicken."
- Gehen Sie auf "Matrix berechnen" auf der Registerkarte "Kompensation" und klicken Sie im Feld "Berechnungsberechnung berechnen" auf "Berechnen", um die Kompensation durchzuführen. Klicken Sie auf "Finish", um den "Compensation Wizard" zu verlassen.
- Laden Sie das PDGFRβ-PE-FMO-Steuerelement und klicken Sie auf "Start". Zeichnen Sie ein Polygon-Tor (Gate A) um die Zellen von Interesse unter dem "All Events" -Plot.
- Doppelklicken Sie auf Gate A, um ein Kind zu erstellen. Ändern Sie die Y-Achse in DAPI und zeichnen Sie ein Polygon-Gate (Gate B) um lebende (DAPI- low ) Zellen. Doppelklicken Sie auf iNside Gate B, um ein Kind zu erstellen. Ändern Sie die X-Achse in FSC-H und die Y-Achse in FSC-W und ziehen Sie ein Polygon-Gate (Gate C) um die Singlets, um Dubletten zu eliminieren.
- Doppelklicken Sie auf Gate C, um ein Kind zu erstellen. Ändern Sie die X-Achse zu Nestin-GFP und die Y-Achse zu PDGFRβ-PE. Klicken Sie auf die Schaltfläche "Record", um die Daten aufzuzeichnen.
- Laden Sie die Probe und wiederholen Sie die Schritte 2.11-2.12. Nach der Aufnahme klicken Sie auf "Pause", um das Sample zu behalten.
- Definieren Sie die Gating-Grenzen für PDGFRβ + und Nestin-GFP + -Zellen auf Basis der PDGFRβ-PE-FMO-Kontrolle. Zeichnen Sie Tore für die PDGFRβ + Nestin-GFP- und PDGFRβ + Nestin-GFP + Populationen.
- Unter "Sortiermethode" wählen Sie "2-Wege-Tubes" und weisen "PDGFRβ + Nestin-GFP-" - und "PDGFRβ + Nestin-GFP + " Zellen den linken und rechten Sammelröhren zuGesund Montieren Sie die Sortierpuffer-gefüllten 15 ml Sammelröhrchen auf der Sammelstufe und klicken Sie auf die Schaltfläche "Sammlung laden".
- Klicken Sie auf die Schaltfläche "Fortsetzen", um das Sample zu beenden. Klicken Sie auf "Start Sort", um PDGFRβ + Nestin-GFP - (Typ I Perizyten) und PDGFRβ + Nestin-GFP + (Typ II Perizyten) Zellen zu sammeln.
3. Nachsortierung von Analysen
- Die sortierten Zellen bei 500 xg für 5 min zentrifugieren, das Pellet in 1 ml Pericyt- Medium resuspendieren (siehe Materialtabelle ) und die Zelldichte mit einem Hämocytometer zählen.
- Samen Typ I und Typ II Perizyten auf Poly-D-Lysin (PDL) -beschichtete Deckgläser bei ~ 1 x 10 4 Zellen / cm 2 . In Perizy-Medium für 3 Tage bei 37 ° C mit 5% CO 2 wachsen.
- Am Tag 3 untersuchen Sie die Perizy-Morphologie (unter Phasenkontrast) und die endogene Nestin-GFP-Expression mit einem fluoreszierenden MikroUmfang (Anregungslaser: 488 nm, Anregungsfilter: 470/40 nm und Emissionsfilter: 515/30 nm). Nehmen Sie Bilder unter einem 20X Ziel (0.45 NA).
- Ersetzen Sie das Pericyt-Medium durch adipogene (Maus-MSC-basale Medium + adipogene stimulatorische Ergänzung) und myogenes (DMEM + 2% Pferdeserum) Medium, um adipogene und myogene Differenzierung zu initiieren, wie zuvor beschrieben 20 . Ändern Sie das Medium alle 2-3 Tage.
- Fixieren Sie die Zellen am Tag 17 (14 Tage nach adipogener / myogener Differenzierung) in 4% Paraformaldehyd (PFA) für 20 min bei Raumtemperatur.
HINWEIS: Vorsicht, PFA ist ein Karzinogen. - Führen Sie die Immunzytochemie gegen Perilipin (Adipozytenmarker) und S-Myosin (reifer Myotube / Myofaser-Marker) durch, wie in früheren Publikationen 19 , 20 beschrieben.
- Die festen Zellen 3 mal in PBS für 10 min bei Raumtemperatur waschen.
- Blockierpuffer hinzufügen (PBSErgänzt mit 5% Eselserum, 3% BSA und 0,3% Triton X-100) und bei Raumtemperatur 1 h inkubieren.
- Inkubieren Sie die Zellen mit Anti-Perilipin (2 & mgr; g / ml) und / oder Anti-S-Myosin (2 & mgr; g / ml) Antikörper bei 4 ° C über Nacht.
- Die Zellen 3 mal in PBS für 10 min bei Raumtemperatur waschen.
- Inkubieren Sie die Zellen mit Alexa 555 Esel Anti-Kaninchen (4 μg / ml) und / oder Alexa555 Esel Anti-Maus (4 μg / ml) Antikörper bei Raumtemperatur für 1 h.
- Die Zellen 3 mal in PBS für 10 min bei Raumtemperatur waschen.
- Montieren Sie die immunfärbenden Zellen mit dem DAPI enthaltenden Befestigungsmedium (siehe Tabelle der Materialien). Untersuchen Sie die Perilipin- und S-Myosin-Expression mit einem Fluoreszenzmikroskop (Anregungslaser: 543 nm, 540/45 nm Anregung und 600/50 nm Emission) und nehmen Sie Bilder unter einem 40X-Objektiv (0,60 NA) auf.
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Representative Results
FACS-Parameter, einschließlich Laserintensität und Kanalkompensation, werden auf der Grundlage der Ergebnisse der ungefärbten Steuerung und der einfarbigen Steuerung korrigiert. Die PDGFRβ-PE-FMO-Kontrolle wird verwendet, um das Gating für die PDGFRβ-PE + -Population einzustellen (Abbildung 1A ). Unter den PDGFRβ-PE - Zellen sind zwei Populationen, die Nestin-GFP + und Nestin-GFP - Zellen darstellen, klar getrennt (Abbildung 1A ). Gating-Grenzen für die PDGFRβ-PE + Nestin-GFP + und PDGFRβ-PE + Nestin-GFP - Populationen werden basierend auf dem Gating für PDGFRβ-PE + und Nestin-GFP + (Abbildung 1A ) gesetzt. Diese Grenzen werden verwendet, um PDGFRβ-PE + Nestin-GFP + (Typ II Perizyten) und PDGFRβ-PE + Nestin-GFP zu definieren und zu sortieren (Typ I pericytEs) Zellen aus der Probe ( Abbildung 1B ). Isolierte PDGFRβ-PE + Nestin-GFP- und PDGFRβ-PE + Nestin-GFP + -Zellen machen 9,5% bzw. 2,1% der gesamten Zellen in der Einzelzelllösung aus.
FACS-isolierte Typ I und Typ-II-Perizyme zeigen morphologische Unterschiede nach drei Tagen in Kultur. Typ I pericytes Anzeige der amöboiden Morphologie, mit runden Zellkörpern und kurzen Prozessen (Abbildung 2 ). Typ-II-Perizyten zeigen jedoch eine verzweigte Morphologie, die durch kleine Zellkörper und lange, dünne Prozesse gekennzeichnet ist (Abbildung 2 ). Zu diesem Zeitpunkt verbleiben die meisten Perioden des Typs II als Nestin-GFP + , während Typ I Perizyten Nestin-GFP - (Abbildung 2 ) sind.
Darüber hinaus Typ I, aber nicht Typ II, pericyTes unterscheiden sich in Perilipin-exprimierende Adipozyten nach 14 Tagen im adipogenen Medium (Abbildung 3 ). Typ II, aber nicht Typ I, differenzieren sich Perizyse nach 14 Tagen in myogenem Medium in S-Myosin-exprimierende Myotubes (Abbildung 4 ). Diese Ergebnisse zeigen stark, dass Typ I Perizyten adipogen sind, während Typ-II-Perizyten myogen sind.
Abbildung 1 : Gating-Grenzen und repräsentative Sortierung. ( A ) Fluoreszierende Auftragung der PDGFRβ-PE-FMO-Kontrolle, die die PDGFRβ-PE + Nestin-GFP- und PDGFRβ-PE + Nestin-GFP + Gating-Grenzen zeigt. ( B ) Repräsentative fluoreszierende Auftragung der Probe, die die Verteilung des PDGFRβ-PE + Nestin-GFP zeigt
Abbildung 2: Morphologie und Nestin-GFP-Expression in sortierten Typ I und Typ II Perizyten. Die sortierten Typ I und Typ II Perizyten wurden auf Deckgläschen ausgesät und für 3 Tage in Pericytiummedium gezüchtet. Typ I Perizyten zeigten runde Zellkörper mit kurzen Prozessen und kein endogenes GFP-Signal unter einem Fluoreszenzmikroskop (Anregung Laser: 488 nm, Anregungs- und Emissionsfilter: 470/40 nm bzw. 515/30 nm). Typ II Perizyten zeigten kleine Zellkörper mit langen und dünnen Prozessen und ein starkes endogenes GFP - Signal unter aFluoreszenzmikroskop unter den gleichen Einstellungen. Maßstab = 100 μm Bitte klicken Sie hier um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 3: Adipogene Differenzierung von sortierten Typ I und Typ II Perizyten. Die sortierten Typ I und Typ-II-Perizyten wurden in Pericyt-Medium für 3 Tage gezüchtet. Sie wurden dann im adipogenen Medium für 14 Tage differenziert. Die Zellen wurden fixiert und mit Anti-Perilipin-Antikörper immunostainiert, gefolgt von Alexa555-Esel-Anti-Kaninchen-Antikörper. Immunzytochemie zeigte, dass Typ I, aber nicht Typ II, Perizipen exprimiert den Adipozytenmarker Perilipin (rot) unter einem Fluoreszenzmikroskop (Anregungslaser: 543 nm, Anregungs- und Emissionsfilter: 540/45 nm und 600/50 nm, Respekt Iv) Maßstab = 50 μm Bitte klicken Sie hier um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 4 : Myogene Differenzierung von sortierten Typ I und Typ II Perizyten. Die sortierten Typ I und Typ-II-Perizyten wurden in Pericyt-Medium für 3 Tage gezüchtet und dann in myogenem Medium für 14 Tage differenziert. Die Zellen wurden fixiert und mit anti-S-Myosin-Antikörper und Alexa555-Esel-Anti-Maus-Antikörper immunostainiert. Die Immunzytochemie zeigte, dass Typ II, aber nicht Typ I, Perizyten den reifen Myotube / Myofaser Marker S-Myosin (rot) unter einem Fluoreszenzmikroskop (Anregungslaser: 543 nm, Anregungs- und Emissionsfilter: 540/45 nm und 600/50 nm) , beziehungsweise). Maßstab = 50 μm//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55904/55904fig4large.jpg "target =" _ blank "> Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
| Röhrchen | Färben |
| Ungefärbte Kontrolle | Einzelzelle Suspension von Wildtyp-Mäusen |
| DAPI-Einfarbenkontrolle (Totzelle Ausschluss) | Einzelzellsuspension aus Wildtyp-Mäusen + DAPI (5 μg / ml) |
| GFP Einfarbensteuerung | Einzelzellsuspension aus Nestin-GFP-Mäusen |
| PE einfarbige Kontrolle | OneComp eBeads + PDGFRβ-PE Antikörper (4 μg / ml) |
| PE-FMO Steuerung | Einzelzellsuspension aus Nestin-GFP-Mäusen + DAPI (1 μg / ml) |
| Sample | Einzelzellsuspension aus Nestin-GFP-Mäusen + PDGFRβ-PE-Antikörper (4 μg / ml) +DAPI (1 & mgr; g / ml) |
Tabelle 1: Färbeprotokoll für die einfarbigen Kontrollen, PDGFRβ-PE-FMO-Kontrolle und Muskelprobe
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Discussion
Perizythen sind multipotenten perivaskulären Zellen 22 , 23, die sich auf der abluminalen Oberfläche der Kapillaren 21 , 26 befinden . In Skelettmuskeln können Perizyten entlang der adipogenen und / oder myogenen Wege 19 , 20 , 24 differenzieren. Jüngste Studien zeigten zwei Subpopulationen von Perizyten mit unterschiedlicher Marker-Expression und unterschiedlichen Differenzierungspotentialen 19 , 24 , 25 . Typ I (NG2 + Nestin - ) Perizyten sind adipogen, während Typ II (NG2 + Nestin + ) Perizyten myogen sind. Die Isolierung dieser Subpopulationen für In-vitro- Studien erfordert die NG2-DsRed- und Nestin-GFP-Doppel-transgene Mauslinie. Die Abhängigkeit dieser ReinigungProtokoll über doppelt-transgene Mäuse begrenzt seine Anwendung und damit die Forschung über die Biologie der Pericyt-Subpopulationen.
Dieser Videoartikel veranschaulicht eine alternative Methode zur Isolierung von Typ I und Typ II Perizyten aus Mäuseskelettmuskeln. Diese neue Methode beruht immer noch auf einer FACS-basierten Technik zur Zelltrennung. Anstatt die transgene NG2-DsRed-Fluoreszenz zu verwenden, zielt sie jedoch auf das endogene PDGFRβ-Signal. Dies beruht auf der Beobachtung, dass NG2-DsRed-Expression mit PDGFRβ im Skelettmuskel 19 lokalisiert. Im Vergleich zur ursprünglichen Methode hat dieses Protokoll mehrere Vorteile. Erstens braucht es nicht den NG2-DsRed genetischen Hintergrund, obwohl der Nestin-GFP-Hintergrund noch benötigt wird. Zweitens verwendet dieses Protokoll anstelle von NG2 PDGFRβ, einen gut charakterisierten Marker mit validierten und handelsüblichen Antikörpern. Drittens erlaubt es die gleichzeitige Isolierung von boTh Typ I und Typ II Perizyten. Zum Beispiel zeigen PDGFRβ-PE + Nestin-GFP- und PDGFRβ-PE + Nestin-GFP + -Zellen, die unter Verwendung dieses Protokolls isoliert wurden, unterschiedliche Differenzierungsfähigkeiten. Speziell PDGFRβ-PE + Nestin-GFP - , aber nicht PDGFRβ-PE + Nestin-GFP + unterscheiden sich Zellen im adipogenen Zustand in Adipozyten, während PDGFRβ-PE + Nestin-GFP + , aber nicht PDGFRβ-PE + Nestin-GFP- Die Zellen unterliegen einer myogenen Differenzierung unter myogenen Bedingungen. Diese Daten stimmen mit früheren Berichten überein, die zeigen, dass NG2-DsRed + Nestin-GFP - Zellen (Typ I Perizyten) adipogen sind und NG2-DsRed + Nestin-GFP + -Zellen (Typ II Perizyten) myogene 19 , 24 sind , was darauf hindeutet, dass isoliertes PDGFRβ -PE + Nestin-GFP- und PDGFRβ-PE + NEstin-GFP + -Zellen sind tatsächlich Typ I bzw. Typ II Perizyten. Zusammen zufolge deuten diese Ergebnisse darauf hin, dass dieses neue Protokoll die relativ einfache Isolierung / Reinigung von Pericyt-Subpopulationen aus Maus-Skelettmuskeln und möglicherweise anderen Geweben ermöglicht. Dies wird die Studien über die Periziologie und ihre therapeutische Übersetzung für verschiedene Störungen fördern.
Es sollte jedoch angemerkt werden, dass es eine Beschränkung dieses Verfahrens aufgrund der Verwendung von PDGFRβ gibt. Es wurde in einer früheren Studie gezeigt, dass PW1 + interstitielle Zellen (PICs) auch PDGFR & bgr; 20 exprimieren. Daher können isolierte PDGFRβ-PE + Nestin-GFP- und PDGFRβ-PE + Nestin-GFP + -Populationen PICs enthalten. Allerdings ist der Beitrag dieser PICs zur Pericyt-Differenzierung begrenzt, da Perizyten die PICs in den Skelettmuskeln übertreffen 20 und die Typ I Perizyten nicht unterziehenOgenesis 19 , 25 .
Unter Verwendung dieses Verfahrens wurden Typ I und Typ-II-Perizyten in Ausbeuten von 9,5% bzw. 2,1% erhalten. Diese Zahlen waren mit den angegebenen Ausbeuten von 2,8% bzw. 3,4% in den doppelt-transgenen Mäusen vergleichbar. Der leichte Unterschied kann auf unterschiedliche Gating-Strategien oder Verdauungsprotokolle zurückzuführen sein. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass das vorgeschlagene Protokoll verwendet werden kann, um Subtypen von Perizyten aus Skelettmuskeln zu isolieren.
Die kritischen Schritte dieses Protokolls beinhalten folgende Punkte: (1) Sicherstellen, dass die Skelettmuskeln vollständig gehackt sind und leicht durch eine 10 mL serologische Pipette gelangen können. Große Muskelblöcke stören die enzymatische Verdauung und reduzieren die Ausbeute deutlich. (2) Verwenden Sie frisch hergestellte Collagenase-Lösung für die Muskelverdauung und lassen Sie bei der Inkubation ein sanftes Rühren (35 Umdrehungen / min) zu. (3) Halten Sie dieKontrollen und Probe auf Eis während der Färbung und Sortierung Schritte. (4) Verwenden Sie FMO-Steuerelemente, um Gating-Grenzen einzurichten.
Zusätzlich zur Differenzierungsfähigkeit zeigen Typ I und Typ II Perizyten auch unterschiedliche Morphologie. Speziell Typ I Perizyten haben runde Zellkörper, mit kurzen Prozessen und relativ großen Kerne. Typ II Perizyten, auf der anderen Seite haben in der Regel kleine Zellkörper, mit langen und dünnen Prozesse und kleine Kerne. Die morphologischen Differenzen deuten darauf hin, dass Typ I und Typ II Perizyten intrinsisch verschieden sind, was mit der heterogenen Natur von Perizyten übereinstimmt. Welche Ursachen / Aufrechterhaltung der Differenz zwischen Typ I und Typ II Perizyten, sowie die zugrunde liegenden molekularen Mechanismen, bleiben unklar und erfordern weitere Untersuchungen. Dieses Isolationsprotokoll wird dazu beitragen, diese wichtigen Fragen zu beantworten.
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Disclosures
Alle Autoren haben keinen Interessenkonflikt zur Offenlegung.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde teilweise von einem Fund-A-Fellow-Stipendium der Myotonic Dystrophy Foundation (MDF-FF-2014-0013) und dem Scientist Development Grant von der American Heart Association (16SDG29320001) unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell Sorter | Sony | SH800 | |
| Automatic Setup Beads | Sony | LE-B3001 | |
| DMEM | Gibco | 11995 | |
| Avertin | Sigma | T48402 | |
| Pericyte Growth Medium | ScienCell | 1201 | |
| MSC Basal Medium (Mouse) | Stemcell Technologies | 5501 | |
| Adipogenic Stimulatory Supplement (Mouse) | Stemcell Technologies | 5503 | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 16000 | |
| Horse Serum | Sigma | H1270 | |
| Collagenase Type 2 | Worthington | LS004176 | |
| 0.25% Trypsin/EDTA | Gibco | 25200 | |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15140 | |
| PDL | Sigma | P6407 | |
| PDGFRβ-PE Antibody | eBioscience | 12-1402 | |
| Perilipin Antibody | Sigma | P1998 | |
| S-Myosin Antibody | DSHB | MF-20 | |
| Alexa 555-anti-rabbit antibody | ThermoFisher Scientific | A-31572 | |
| Alexa 555-anti-mouse antibody | ThermoFisher Scientific | A-31570 | |
| Mounting Medium with DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | |
| DAPI | ThermoFisher Scientific | D1306 | |
| HEPES | Gibco | 15630 | |
| EDTA | Fisher | BP120 | |
| BSA | Sigma | A2058 | |
| NH4Cl | Fisher Scientific | A661 | |
| KHCO3 | Fisher Scientific | P184 | |
| PBS | Gibco | 14190 | |
| 18 G Needles | BD | 305196 | |
| 10 mL Serological Pipette | BD | 357551 | |
| OneComp eBeads | eBioscience | 01-1111 |
References
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