Summary
Dit werk beschrijft een FACS-based protocol dat het mogelijk maakt om de gelijktijdige isolatie van type I en type II pericytes uit skeletspieren mogelijk te maken.
Abstract
Pericytes zijn perivasculaire multipotente cellen die heterogeniteit in verschillende organen of zelfs in hetzelfde weefsel laten zien. In skeletspieren zijn er minstens twee pericyte subpopulaties (genaamd type I en type II), die verschillende moleculaire markers uitdrukken en onderscheidende mogelijkheden hebben. Met behulp van NG2-DsRed en Nestin-GFP dubbel transgene muizen zijn type I (NG2-DsRed + Nestin-GFP - ) en type II (NG2-DsRed + Nestin-GFP + ) pericytes succesvol geïsoleerd. De beschikbaarheid van deze dubbel-transgene muizen voorkomt echter het wijdverspreide gebruik van deze zuiveringsmethode. Dit werk beschrijft een alternatief protocol dat de eenvoudige en gelijktijdige isolatie van type I en type II pericytes van skeletspieren mogelijk maakt. Dit protocol maakt gebruik van de fluorescentie geactiveerde celsortering (FACS) techniek en richt zich op PDGFRβ, in plaats van NG2, samen met het Nestin-GFP signaal. Na isolatie, typ I en tyPe II pericytes tonen verschillende morfologieën. Daarnaast zijn type I en type II pericytes geïsoleerd met deze nieuwe werkwijze, zoals die welke zijn geïsoleerd van de dubbel-transgene muizen, respectievelijk adipogene en myogene. Deze resultaten suggereren dat dit protocol kan worden gebruikt om pericyte subpopulaties van skeletspieren en mogelijk uit andere weefsels te isoleren.
Introduction
Spierdystrofie is een spier-degeneratieve aandoening die tot nu toe geen effectieve behandelingen heeft. De ontwikkeling van therapieën die weefselregeneratie bevorderen is altijd van groot belang geweest. Weefselregeneratie en reparatie na schade is afhankelijk van ingezeten stamcellen / stamcellen 1 . Satellietcellen zijn toegewijd aan myogene precursorcellen die bijdragen aan spierregeneratie 2 , 3 , 4 , 5 , 6 , 7 . Hun klinische gebruik wordt echter belemmerd door hun beperkte migratie en een laag overlevingspercentage na injectie, evenals door hun verminderde differentiatiecapaciteit na in vitro amplificatie 8 , 9 , 10 , 11 . Naast satelliTe cellen, skeletspieren bevatten ook veel andere celpopulaties met myogenisch potentieel 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , zoals bloedplaatjes afgeleide groeifactor receptor-beta (PDGFRβ) -positieve interstitiële cellen. Er zijn aanwijzingen dat spierafgevaardigde PDGFRβ + cellen in myogene cellen kunnen differentiëren en de spierpatologie en functie 14 , 17 , 18 , 19 , 20 verbeteren. PDGFRβ overwegend labels pericytes 21 , die perivasculaire cellen zijn met pluripotentie 22 , 23 . Naast PDGFRβ worden veel andere markers, waaronder Neuron-Glial 2 (NG2) en CD146, ook gebruikt omDentify pericytes 21 . Er dient echter op te worden gewezen dat geen van deze markers percytespecifieke 21 is . Uit recente studies bleken twee subtypen van spierpericieten, genaamd type I en type II, die verschillende moleculaire markers uitdrukken en verschillende functies 19 , 24 , 25 uitvoeren. Biochemisch zijn type I pericytes NG2 + Nestin - terwijl type II pericytes NG2 + Nestin + 19 , 24 zijn . Functioneel kunnen type I pericytes adipogene differentiatie ondergaan, die bijdragen aan vetaccumulatie en / of fibrose, terwijl type II pericytes langs de myogene route kunnen differentiëren, die bijdragen tot spierregeneratie 19 , 24 , 25 . Deze resultaten tonen aan dat: (1) type I pericytes mag bE gericht op de behandeling van vetdegeneratieve stoornissen / fibrose, en (2) type II pericyten hebben een groot therapeutisch potentieel voor spierdystrofie. Verdere onderzoek en karakterisering van deze populaties vereisen een isolatieprotocol dat de afscheiding van type I en type II pericytes op een hoog niveau van zuiverheid mogelijk maakt.
Momenteel is de isolatie van pericyte subpopulaties afhankelijk van NG2-DsRed en Nestin-GFP dubbel-transgene muizen 19 , 24 . De beschikbaarheid van NG2-DsRed-muizen en de kwaliteit van de meeste NG2-antilichamen beperken het wijdverspreide gebruik van deze methode. Aangezien alle NG2 + pericytes ook PDGFRβ uitdrukken in de skeletspieren 19 , 20 , 24 , veronderstellen wij dat NG2 kan vervangen worden door PDGFRβ voor de isolatie van pericyten en hun subpopulaties. Dit werk beschrijft een FACS-based protocol datGebruikt PDGFRβ-kleuring en het Nestin-GFP-signaal. Deze methode is minder veeleisend voor onderzoekers omdat: (1) het NG2-DsRed-achtergrond niet vereist en (2) het commercieel beschikbare PDGFRβ-antilichamen gebruikt, die goed gekarakteriseerd zijn. Bovendien zorgt het voor gelijktijdige isolatie van type I en type II pericytes met een hoge zuiverheid, waardoor het biologisch en therapeutisch potentieel van deze pericyte subpopulaties verder kan worden onderzocht. Na zuivering kunnen deze cellen in cultuur worden gekweekt, en hun morfologieën kunnen worden gevisualiseerd. Dit werk laat ook zien dat type I en type II pericytes die geïsoleerd zijn met behulp van deze methode, zoals die welke zijn gesuiverd uit dubbel-transgene muizen, respectievelijk adipogene en myogene zijn.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Wildtype en Nestin-GFP transgene muizen werden gehuisvest in de dierenfaciliteit aan de Universiteit van Minnesota. Alle experimentele procedures werden goedgekeurd door het Institutional Animal Care and Use Committee aan de Universiteit van Minnesota en waren in overeenstemming met de NIH Guide for Care and Use of Laboratory Animals.
1. Spierdissectie en enkelcellige isolatie
- Euthanize volwassen muizen (6-10 weken, zowel mannelijk als vrouwelijk) met tribromoethanol (250 mg / kg, ip) en steriliseer hun buikhuid met 70% ethanol.
OPMERKING: Tribromoethanol werd hier gebruikt in plaats van ketamine voor verdoving / euthanasie, aangezien ketamine bekend is om te interageren met de NMDA-receptoren, die mogelijk een invloed op de studie zouden kunnen hebben. - Plaats de muizen in de rugstand en gebruik een scalpel om een horizontale incisie op de buikhuid te maken. Schil de huid met de hand af, trek tegenover elkaar om de achterste spieren te ontwijken.
- CollecT de spieren van beide achterlimmen met behulp van tang en een schaar. Bewaar ze in steriele fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) aangevuld met 1% penicilline-streptomycine (P / S) op ijs.
- Was de gedissendeerde achterpijpspieren in ijskoude PBS twee keer met 1% P / S en breng ze over op een steriele 10 cm-plaat.
- Ontleed zenuwen, bloedvaten en bindweefsel zorgvuldig uit de spieren door middel van tang en schaar onder een dissectiemicroscoop bij 2x vergroting.
- Snijd de spieren goed in kleine stukken (1-2 mm 3 ) met behulp van steriele scharen en bladen. Voeg indien nodig een kleine hoeveelheid Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) toe om ervoor te zorgen dat de spieren niet uitdrogen.
- Mechanisch breken het weefsel door pipettering omhoog en omlaag door een 10 ml serologische pipet 10 keer.
- Voeg vers gemaakte spijsvertering oplossing (DMEM aangevuld met 0,2% type 2 collagenase) aan het mengsel. Incubeer bij 37 ° C gedurende 2 uur met gentlE roering bij 35 omwentelingen / min.
- Tritureren met een 18 G-naald om het mengsel te homogeniseren. Centrifugeer vervolgens bij 500 xg gedurende 5 minuten. Gooi de supernatant weg en laat de pellet opnieuw suspenderen in 0,25% trypsine / EDTA. Incubeer bij 37 ° C gedurende 10 minuten. Herhaal de centrifugatie stap twee keer meer.
- Voeg 10 ml DMEM aangevuld met 20% foetaal runder serum (FBS) toe aan de oplossing en centrifugeer bij 500 xg gedurende 5 minuten. Verwijder de supernatant en resuspendeer de pellet in rode bloedcellysisbuffer (155 mM NH4C1, 10 mM KHCO3 en 0,1 mM EDTA).
- Centrifugeer bij 500 xg gedurende 5 minuten. Gooi de supernatant weg en verwijder de pellet in sorteringsbuffer (20 mM HEPES, pH 7,0; 1 mM EDTA en 1% BSA in Ca / Mg 2+ -vrije PBS, pH 7,0). Filter het mengsel door een 40 μm celsuur om een enkelcelsuspensie te verkrijgen.
- Centrifugeer bij 500 xg gedurende 5 minuten. Gooi de supernatant weg en verwijder de pellet in 1 ml sorteringsbuffer.
- Tel deCelnummer met een hemocytometer en verdun de enkelcelsuspensie tot 5 x 106 / ml in sorteringsbuffer.
2. Celverf en sorteren
- Controleer de controles en het monster zoals beschreven in Tabel 1 . Vlek de enkelcelsuspensie met de respectieve antilichamen op ijs gedurende 30 minuten, zoals beschreven in Tabel 1 .
- Centrifugeer bij 500 xg gedurende 5 minuten en was de pellets twee keer met sorteringsbuffer.
- Voeg DAPI toe aan de single-cell oplossingen, zoals aangegeven in tabel 1. Gebruik 5 μg / mL DAPI (eindconcentratie) voor de DAPI single-color control en 1 μg / mL DAPI voor de PDGFRβ-PE-FMO controle en het monster. Houd alle buizen op het ijs door het experiment.
- Zet de sorter en de software aan. Scan en plaats een 100 μm sorteerchip wanneer u wordt gevraagd.
- Voer de automatische instelling uit ( dwz de uitlijning van de chip, de druppelkalibratie, de kalibratie van de zijstroom en de vertragingskalibratieAan) door de automatische setup kralen te laden wanneer u wordt gevraagd.
- Wanneer de automatische installatie is voltooid, ga naar het tabblad Experiment, klik op 'Nieuw' en selecteer de 'Blank template' van 'Public Templates'.
- Onder "Meetinstellingen", typ "DAPI" voor "FL1," "Nestin-GFP" voor "FL2" en "PDGFRβ" voor "FL3." Verwijder de vinkjes voor "FL4" - "FL6".
- Controleer de dozen om de 405, 488 en 561 lasers te activeren en klik op "Create New Experiment."
- Selecteer de optie "Compensatiewizard starten" en volg de software "Compensation Wizard" om de compensatie in te stellen.
- Laad de onbedekte controle en klik op "Start". Klik op "Detector & Threshold Settings" en pas de sensorverhoging van de FSC en BSC detectors aan om de populatie op de schaal te plaatsen.
- AdvertentieAlleen de winstniveaus van de FL1-FL3 fluorescentiekanalen om de negatieve populaties aan de linkerkant van de histogrammen te plaatsen. Klik op de knop "Opnemen" om de gegevens op te nemen.
- Controleer een kleurregeling één voor één wanneer u wordt gevraagd. Klik op "Start en opnemen" om de gegevens op te nemen. Pas de poorten aan voor de positieve populaties op de histogrammen. Klik op 'Volgende'.
- Ga naar 'Bereken Matrix' op het tabblad 'Compensatie' en klik op 'Bereken' in het paneel 'Bereken compensatie instellingen' om de compensatie uit te voeren. Klik op "Finish" om de "Compensation Wizard" te verlaten.
- Laad de PDGFRβ-PE-FMO controle en klik op "Start". Teken een polygoonpoort (Poort A) rond de cellen van belang onder het "All Events" -plot.
- Dubbelklik in Poort A om een kinderplot te maken. Verander de Y-as naar DAPI en teken een polygoonpoort (Gate B) rond live (DAPI low ) cellen. Dubbelklik op iNside Gate B om een kinderplot te maken. Wijzig de X-as naar FSC-H en de Y-as naar FSC-W en trek een polygoonpoort (Gate C) om de singlets om dubletjes te elimineren.
- Dubbelklik in Gate C om een kinderplot te maken. Verander de X-as naar Nestin-GFP en de Y-as naar PDGFRβ-PE. Klik op de knop "Opnemen" om de gegevens op te nemen.
- Laad het monster en herhaal stappen 2.11-2.12. Na het opnemen, klik op "Pauze" om het monster te behouden.
- Definieer de grenswaarden voor PDGFRβ + en Nestin-GFP + cellen op basis van de PDGFRβ-PE-FMO controle. Teken poorten voor de PDGFRβ + Nestin-GFP- en PDGFRβ + Nestin-GFP + populaties.
- Selecteer onder "Sorteermethode" de tweehoekige buizen en wijs "PDGFRβ + Nestin-GFP" en "PDGFRβ + Nestin-GFP + " cellen aan de linker en rechter verzamelpijpen, respectively. Monteer de sorteringsbuffer-gevulde 15 ml-collectorbuizen op het verzamelpad en klik op de knop 'Verzamel collectie'.
- Klik op de knop "Resume" om het monster te laten draaien. Klik op 'Start sorteren' om PDGFRβ + Nestin-GFP - (type I pericytes) en PDGFRβ + Nestin-GFP + (type II pericytes) cellen te verzamelen.
3. Post-sorteeranalyses
- Centrifugeer de gesorteerde cellen bij 500 xg gedurende 5 minuten, resusteer de pellet in 1 ml pericyte medium (zie Materialetabel ) en tel de celdichtheid aan met behulp van een hemocytometer.
- Zaad type I en type II pericytes op poly-D-lysine (PDL) -coated coverlips bij ~ 1 x 10 4 cellen / cm 2 . Vergroot in pericyte medium gedurende 3 dagen bij 37 ° C met 5% CO2.
- Op dag 3, onderzoek de pericyte morfologie (onder fase contrast) en endogene Nestin-GFP expressie met behulp van een fluorescerende microOmvang (excitatie laser: 488 nm, excitatie filter: 470/40 nm en emissie filter: 515/30 nm). Neem afbeeldingen onder een 20X-doelstelling (0,45 NA).
- Vervang het pericyte medium met adipogene medium (muis MSC basaal medium + adipogene stimulerende supplement) en myogeen (DMEM + 2% paarsserum) medium om respectievelijk adipogene en myogene differentiatie te initiëren, zoals eerder beschreven 20 . Verander het medium elke 2-3 dagen.
- Zet de cellen op dag 17 (14 dagen na adipogene / myogene differentiatie) in 4% paraformaldehyde (PFA) gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur.
OPMERKING: Let op, PFA is kankerverwekkend. - Voer immunocytochemie tegen perilipine (adipocyte marker) en S-myosine (volwassen myotube / myofiber marker) zoals beschreven in eerdere publicaties 19 , 20 .
- Was de vaste cellen 3 keer in PBS gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur.
- Voeg blokkeringsbuffer toe (PBSAangevuld met 5% ezel serum, 3% BSA en 0,3% Triton X-100) en incuberen bij kamertemperatuur gedurende 1 uur.
- Incubeer de cellen gedurende de nacht met anti-perilipine (2 μg / ml) en / of anti-S-myosine (2 μg / ml) antilichamen bij 4 ° C.
- Was de cellen 3 keer in PBS gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur.
- Incubeer de cellen met Alexa 555 ezel anti-konijn (4 μg / ml) en / of Alexa555 ezel anti-muis (4 μg / ml) antilichamen bij kamertemperatuur gedurende 1 uur.
- Was de cellen 3 keer in PBS gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur.
- Monteer de immunostained cellen met montagemedium dat DAPI bevat (zie de tabel van materialen). Examineer perilipine- en S-myosinexpressie met behulp van een fluorescerende microscoop (excitatie laser: 543 nm, 540/45 nm excitatie en 600/50 nm emissie) en neem beelden onder een 40X objectief (0,60 NA).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
FACS-parameters, inclusief laserintensiteit en kanaalcompensatie, worden gecorrigeerd op basis van de resultaten van onbeschadigde besturing en enkele kleurenbesturing. De PDGFRβ-PE-FMO controle wordt gebruikt om de poort voor de PDGFRβ-PE + populatie te bepalen ( Figuur 1A ). Onder de PDGFRβ-PE - cellen zijn twee populaties die Nestin-GFP + en Nestin-GFP - cellen vertegenwoordigen duidelijk gescheiden ( Figuur 1A ). Gaatgrenswaarden voor de PDGFRβ-PE + Nestin-GFP + en PDGFRβ-PE + Nestin-GFP - populaties zijn gebaseerd op de poort voor PDGFRβ-PE + en Nestin-GFP + ( Figuur 1A ). Deze grenzen worden gebruikt om PDGFRβ-PE + Nestin-GFP + (type II pericytes) en PDGFRβ-PE + Nestin-GFP te definiëren en te sorteren (type I pericytEs) cellen uit het monster ( figuur 1B ). Geïsoleerde PDGFRβ-PE + Nestin-GFP- en PDGFRβ-PE + Nestin-GFP + cellen vertegenwoordigen respectievelijk 9,5% en 2,1% van de totale cellen in de single-cell oplossing.
FACS-geïsoleerde type I en type II pericytes tonen morfologische verschillen na drie dagen in de cultuur. Type I pericytes tonen amoebide morfologie, met ronde cellichamen en korte processen ( Figuur 2 ). Type II-pericytes tonen echter ramifieke morfologie, gekenmerkt door kleine cellichamen en lange dunne processen ( Figuur 2 ). Op dit moment blijven de meeste type II pericytes als Nestin-GFP + , terwijl type I pericytes Nestin-GFP zijn - ( Figuur 2 ).
Daarnaast typ ik, maar niet type II, pericyTes onderscheiden zich naar perilipine-expressie adipocyten na 14 dagen in adipogeen medium ( Figuur 3 ). Type II, maar niet type I, pericytes differentiëren naar S-myosine-expressie van myotubes na 14 dagen in myogeen medium ( Figuur 4 ). Deze resultaten wijzen sterk aan dat type I pericytes adipogeen zijn, terwijl type II pericytes myogeen zijn.
Figuur 1 : Gatengrenzen en representatieve sortering. ( A ) Fluorescerende plot van de PDGFRβ-PE-FMO-controle, die de PDGFRβ-PE + Nestin-GFP- en PDGFRβ-PE + Nestin-GFP + -grenzen begrijpt. ( B ) Representatieve fluorescerende grafiek van het monster dat de verdeling van de PDGFRβ-PE + Nestin-GFP toont
Figuur 2: Morfologie en Nestin-GFP expressie in gesorteerd type I en type II pericytes. Gesorteerd type I en type II pericytes werden geplant op dekglazen en gekweekt in pericyte medium gedurende 3 dagen. Type I pericytes vertoonden ronde cellichamen, met korte processen en geen endogeen GFP-signaal onder een fluorescerende microscoop (excitatie Laser: 488 nm, excitatie- en emissiefilters: respectievelijk 470/40 nm en 515/30 nm). Type II pericytes aangetoond kleine cel lichamen, met lange en dunne processen, en een sterk endogeen GFP signaal onder eenFluorescerende microscoop onder dezelfde instellingen. Schaalbalk = 100 μm Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Adipogene differentiatie van gesorteerd type I en type II pericytes. Gesorteerd type I en type II pericytes werden gedurende 3 dagen in pericyte-medium gegroeid. Zij werden vervolgens 14 dagen in adipogeen medium gedifferentieerd. De cellen werden gefixeerd en immunostained met anti-perilipine antilichaam gevolgd door Alexa555 ezel anti-konijn antilichaam. Immunocytochemie toonde aan dat type I, maar niet type II, pericytes die de adipocyte markerperilipine (rood) onder een fluorescerende microscoop uitdrukken (excitatie laser: 543 nm, excitatie- en emissiefilters: 540/45 nm en 600/50 nm, respect ively). Schaalbalk = 50 μm Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4 : Myogene differentiatie van gesorteerd type I en type II pericytes. Gesorteerde type I en type II pericytes werden gedurende 3 dagen in pericyte-medium gegroeid en vervolgens 14 dagen in myogeen medium gedifferentieerd. De cellen werden gefixeerd en immunostained met anti-S-myosine antilichaam en Alexa555 ezel anti-muis antilichaam. Immunocytochemie toonde aan dat type II, maar niet type I, pericytes de volwassen myotube / myofiber-markering S-myosine (rood) uitgedrukt onder een fluorescerende microscoop (excitatie laser: 543 nm, excitatie- en emissiefilters: 540/45 nm en 600/50 nm , Respectievelijk). Schaalbalk = 50 μm//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55904/55904fig4large.jpg "target =" _ blank "> Klik hier om een grotere versie van deze figuur te zien.
| buizen | kleuring |
| Onbeschadigde controle | Enkelcelsuspensie van wildtype muizen |
| DAPI single-color control (dead cell exclusion) | Enkelcelsuspensie van wildtype muizen + DAPI (5 μg / ml) |
| GFP single-color control | Enkelvoudige cel suspensie van Nestin-GFP muizen |
| PE single-color control | OneComp eBeads + PDGFRβ-PE antilichaam (4 μg / ml) |
| PE-FMO controle | Enkelcelsuspensie van Nestin-GFP-muizen + DAPI (1 μg / ml) |
| Monster | Enkelvoudige cel suspensie van Nestin-GFP muizen + PDGFRβ-PE antilichaam (4 μg / ml) +DAPI (1 μg / ml) |
Tabel 1: Staining protocol voor de single-color controles, PDGFRβ-PE-FMO controle en spiermonster.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Pericytes zijn multipotente perivasculaire cellen 22 , 23 gelegen op het abluminale oppervlak van capillairen 21 , 26 . In skeletspieren kunnen pericytes langs de adipogene en / of myogene pathussen 19 , 20 , 24 differentiëren. Recente studies onthulde twee subpopulaties van pericytes, met verschillende markering expressie en onderscheidende differentiatiepotenties 19 , 24 , 25 . Type I (NG2 + Nestin - ) pericytes zijn adipogene, terwijl type II (NG2 + Nestin + ) pericytes myogeen zijn. De isolatie van deze subpopulaties voor in vitro studies vereist de dubbele transgene muislijn van NG2-DsRed en Nestin-GFP. De afhankelijkheid van deze zuiveringProtocol op dubbel-transgene muizen beperkt de toepassing ervan en dus onderzoek naar de biologie van pericyte subpopulaties.
Dit videoartikel illustreert een alternatieve methode voor het isoleren van type I en type II pericytes uit muskelskeletspieren. Deze nieuwe methode is nog steeds gebaseerd op een FACS-gebaseerde techniek voor celscheidingen. Echter, in plaats van transgenische NG2-DsRed-fluorescentie te gebruiken, richt het zich op het endogene PDGFRβ-signaal. Dit is gebaseerd op de waarneming dat NG2-DsRed expressie co-lokaliseert met PDGFRβ in skeletspier 19 . In vergelijking met de oorspronkelijke methode heeft dit protocol meerdere voordelen. Ten eerste heeft de genetische achtergrond NG2-DsRed niet nodig, hoewel de Nestin-GFP-achtergrond nog steeds nodig is. Ten tweede, in plaats van NG2 te richten, gebruikt dit protocol PDGFRβ, een goed gekenmerkte marker met gevalideerde en in de handel verkrijgbare antilichamen. Ten derde staat het voor de gelijktijdige isolatie van boDe type I en type II pericytes. Bijvoorbeeld, PDGFRβ-PE + Nestin-GFP- en PDGFRβ-PE + Nestin-GFP + -cellen die geïsoleerde zijn met dit protocol laten duidelijk onderscheidende mogelijkheden zien. Specifiek onderscheiden PDGFRβ-PE + Nestin-GFP-, maar niet PDGFRβ-PE + Nestin-GFP + , cellen in adipocyten in adipogene conditie, terwijl PDGFRβ-PE + Nestin-GFP + , maar niet PDGFRβ-PE + Nestin-GFP- , Cellen ondergaan myogene differentiatie onder myogene aandoening. Deze gegevens zijn consistent met eerdere rapporten die aantonen dat NG2-DsRed + Nestin-GFP - cellen (type I pericytes) adipogene zijn en NG2-DsRed + Nestin-GFP + -cellen (type II pericytes) zijn myogene 19 , 24 , die suggereren dat geïsoleerde PDGFR -PE + Nestin-GFP- en PDGFRβ-PE + NEstin-GFP + cellen zijn inderdaad respectievelijk type I en type II pericyten. Samen geven deze resultaten aan dat dit nieuwe protocol voor de relatief eenvoudige isolatie / zuivering van pericyte subpopulaties van muizenskeletspieren mogelijk maakt, en mogelijk ook andere weefsels. Dit bevordert studies over pericyte biologie en hun therapeutische vertaling voor diverse aandoeningen.
Er dient echter op te worden gewezen dat er een beperking is van deze methode door het gebruik van PDGFRβ. In een eerdere studie is gebleken dat PW1 + interstitiële cellen (PIC's) ook PDGFRβ 20 uitdrukken. Daarom kunnen geïsoleerde PDGFRβ-PE + Nestin-GFP- en PDGFRβ-PE + Nestin-GFP + populaties PIC's bevatten. Echter, de bijdrage van deze PIC's aan pericyte differentiatie is beperkt, gezien dat pericytes groter zijn dan PIC's in skeletspieren 20 en dat type I pericytes ondergaat mijnOgen 19 , 25 .
Met behulp van deze methode werden type I en type II pericytes verkregen bij respectievelijk 9,5% en 2,1% opbrengsten. Deze cijfers waren vergelijkbaar met de gerapporteerde opbrengsten van respectievelijk 2,8% en 3,4% in de dubbel-transgene muizen 19 . Het geringe verschil kan het gevolg zijn van verschillende gateway strategieën of spijsvertering protocollen. Deze resultaten suggereren opnieuw dat het voorgestelde protocol kan worden gebruikt om subtypen van pericytes van skeletspieren te isoleren.
De kritische stappen van dit protocol omvatten de volgende punten: (1) Zorg ervoor dat de skeletspieren volledig gehakt zijn en gemakkelijk door een 10 ml serologische pipet kunnen doorlopen. Grote spierblokken verstoren enzymatische vertering en verminderen de opbrengst aanzienlijk. (2) Gebruik versgemaakte collageenoplossing voor spiervertering en laat gedurende een incubatie zachte agitatie (35 omwentelingen / min) toe. (3) houd deControleert en steekproef op ijs door de kleuring en sorteringstappen. (4) Gebruik FMO-bedieningselementen om de grenzen in te stellen.
Naast de differentiatiemogelijkheid, tonen ook type I en type II pericytes verschillende morfologie. Specifiek, type I pericytes hebben ronde cellichamen, met korte processen en relatief grote kernen. Type II pericytes hebben daarentegen gewoonlijk kleine cellichamen, met lange en dunne processen en kleine kernen. De morfologische verschillen suggereren dat type I en type II pericytes eigenlijk verschillend zijn, wat in overeenstemming is met de heterogene aard van pericieten 21 . Wat het verschil tussen type I en type II pericytes veroorzaakt / onderhouden, evenals de onderliggende moleculaire mechanismen, blijft onduidelijk en vereisen verder onderzoek. Dit isolatieprotocol zal helpen om deze belangrijke vragen te beantwoorden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Alle auteurs hebben geen belangenconflict om te onthullen.
Acknowledgments
Dit werk werd gedeeltelijk ondersteund door een Fonds-A-Fellow subsidie van de Myotonic Dystrophy Foundation (MDF-FF-2014-0013) en de Scientific Development Grant van de American Heart Association (16SDG29320001).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell Sorter | Sony | SH800 | |
| Automatic Setup Beads | Sony | LE-B3001 | |
| DMEM | Gibco | 11995 | |
| Avertin | Sigma | T48402 | |
| Pericyte Growth Medium | ScienCell | 1201 | |
| MSC Basal Medium (Mouse) | Stemcell Technologies | 5501 | |
| Adipogenic Stimulatory Supplement (Mouse) | Stemcell Technologies | 5503 | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 16000 | |
| Horse Serum | Sigma | H1270 | |
| Collagenase Type 2 | Worthington | LS004176 | |
| 0.25% Trypsin/EDTA | Gibco | 25200 | |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15140 | |
| PDL | Sigma | P6407 | |
| PDGFRβ-PE Antibody | eBioscience | 12-1402 | |
| Perilipin Antibody | Sigma | P1998 | |
| S-Myosin Antibody | DSHB | MF-20 | |
| Alexa 555-anti-rabbit antibody | ThermoFisher Scientific | A-31572 | |
| Alexa 555-anti-mouse antibody | ThermoFisher Scientific | A-31570 | |
| Mounting Medium with DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | |
| DAPI | ThermoFisher Scientific | D1306 | |
| HEPES | Gibco | 15630 | |
| EDTA | Fisher | BP120 | |
| BSA | Sigma | A2058 | |
| NH4Cl | Fisher Scientific | A661 | |
| KHCO3 | Fisher Scientific | P184 | |
| PBS | Gibco | 14190 | |
| 18 G Needles | BD | 305196 | |
| 10 mL Serological Pipette | BD | 357551 | |
| OneComp eBeads | eBioscience | 01-1111 |
References
- Rennert, R. C., Sorkin, M., Garg, R. K., Gurtner, G. C. Stem cell recruitment after injury: lessons for regenerative medicine. Regenerative medicine. 7 (6), 833-850 (2012).
- Sambasivan, R., et al. Pax7-expressing satellite cells are indispensable for adult skeletal muscle regeneration. Development. 138 (17), 3647-3656 (2011).
- Relaix, F., Zammit, P. S. Satellite cells are essential for skeletal muscle regeneration: the cell on the edge returns centre stage. Development. 139 (16), 2845-2856 (2012).
- von Maltzahn, J., Jones, A. E., Parks, R. J., Rudnicki, M. A. Pax7 is critical for the normal function of satellite cells in adult skeletal muscle. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (41), 16474-16479 (2013).
- Lepper, C., Partridge, T. A., Fan, C. M. An absolute requirement for Pax7-positive satellite cells in acute injury-induced skeletal muscle regeneration. Development. 138 (17), 3639-3646 (2011).
- Kuang, S., Charge, S. B., Seale, P., Huh, M., Rudnicki, M. A. Distinct roles for Pax7 and Pax3 in adult regenerative myogenesis. J Cell Biol. 172 (1), 103-113 (2006).
- Murphy, M. M., Lawson, J. A., Mathew, S. J., Hutcheson, D. A., Kardon, G. Satellite cells, connective tissue fibroblasts and their interactions are crucial for muscle regeneration. Development. 138 (17), 3625-3637 (2011).
- Morgan, J. E., Pagel, C. N., Sherratt, T., Partridge, T. A. Long-term persistence and migration of myogenic cells injected into pre-irradiated muscles of mdx mice. J Neurol Sci. 115 (2), 191-200 (1993).
- Beauchamp, J. R., Morgan, J. E., Pagel, C. N., Partridge, T. A. Dynamics of myoblast transplantation reveal a discrete minority of precursors with stem cell-like properties as the myogenic source. J Cell Biol. 144 (6), 1113-1122 (1999).
- Partridge, T. A. Invited review: myoblast transfer: a possible therapy for inherited myopathies. Muscle Nerve. 14 (3), 197-212 (1991).
- Montarras, D., et al. Direct isolation of satellite cells for skeletal muscle regeneration. Science. 309 (5743), 2064-2067 (2005).
- Asakura, A., Seale, P., Girgis-Gabardo, A., Rudnicki, M. A. Myogenic specification of side population cells in skeletal muscle. J Cell Biol. 159 (1), 123-134 (2002).
- Tamaki, T., et al. Skeletal muscle-derived CD34+/45- and CD34-/45- stem cells are situated hierarchically upstream of Pax7+ cells. Stem Cells Dev. 17 (4), 653-667 (2008).
- Dellavalle, A., et al. Pericytes resident in postnatal skeletal muscle differentiate into muscle fibres and generate satellite cells. Nat Commun. 2, 499 (2011).
- Mitchell, K. J., et al. Identification and characterization of a non-satellite cell muscle resident progenitor during postnatal development. Nat Cell Biol. 12 (3), 257-266 (2010).
- Pannerec, A., Formicola, L., Besson, V., Marazzi, G., Sassoon, D. A. Defining skeletal muscle resident progenitors and their cell fate potentials. Development. 140 (14), 2879-2891 (2013).
- Dellavalle, A., et al. Pericytes of human skeletal muscle are myogenic precursors distinct from satellite cells. Nat Cell Biol. 9 (3), 255-267 (2007).
- Kostallari, E., et al. Pericytes in the myovascular niche promote post-natal myofiber growth and satellite cell quiescence. Development. 142 (7), 1242-1253 (2015).
- Birbrair, A., et al. Role of pericytes in skeletal muscle regeneration and fat accumulation. Stem Cells Dev. 22 (16), 2298-2314 (2013).
- Yao, Y., Norris, E. H., Mason, C. E., Strickland, S. Laminin regulates PDGFRbeta(+) cell stemness and muscle development. Nat Commun. 7, 11415 (2016).
- Armulik, A., Genove, G., Betsholtz, C. Pericytes: developmental, physiological, and pathological perspectives, problems, and promises. Dev Cell. 21 (2), 193-215 (2011).
- Dore-Duffy, P. Pericytes: pluripotent cells of the blood brain barrier. Curr Pharm Des. 14 (16), 1581-1593 (2008).
- Dore-Duffy, P., Katychev, A., Wang, X., Van Buren, E. CNS microvascular pericytes exhibit multipotential stem cell activity. J Cereb Blood Flow Metab. 26 (5), 613-624 (2006).
- Birbrair, A., et al. Skeletal muscle pericyte subtypes differ in their differentiation potential. Stem Cell Res. 10 (1), 67-84 (2013).
- Gautam, J., Nirwane, A., Yao, Y. Laminin differentially regulates the stemness of type I and type II pericytes. Stem Cell Research & Therapy. 8 (1), 28 (2017).
- Birbrair, A., et al. Pericytes: multitasking cells in the regeneration of injured, diseased, and aged skeletal muscle. Front Aging Neurosci. 6, 245 (2014).
