Summary
Dette arbejde beskriver en FACS-baseret protokol, der muliggør nem og samtidig isolering af type I og type II pericytter fra skelets muskler.
Abstract
Pericytter er perivaskulære multipotente celler, som viser heterogenitet i forskellige organer eller endog inden for samme væv. I skelets muskler er der mindst to perikate subpopulationer (kaldet type I og type II), som udtrykker forskellige molekylære markører og har forskellige differentieringsevner. Ved brug af NG2-DsRed og Nestin-GFP dobbelt-transgene mus er type I (NG2-DsRed + Nestin-GFP - ) og type II (NG2-DsRed + Nestin-GFP + ) pericytter isoleret med succes. Tilgængeligheden af disse dobbelt-transgene mus forhindrer imidlertid udbredt anvendelse af denne oprensningsmetode. Dette værk beskriver en alternativ protokol, der muliggør enkel og samtidig isolering af type I og type II pericytter fra skelets muskler. Denne protokol anvender den fluorescensaktiverede celle sortering (FACS) teknik og mål PDGFRβ, snarere end NG2 sammen med Nestin-GFP signalet. Efter isolation, type I og tyPe II pericytter viser forskellige morfologier. Desuden er type I og type II-pericytter isoleret med denne nye metode, som dem, der er isoleret fra de dobbelt-transgene mus, henholdsvis adipogene og myogene. Disse resultater tyder på, at denne protokol kan bruges til at isolere pericyte subpopulationer fra skelets muskler og muligvis fra andre væv.
Introduction
Muskeldystrofi er en muskel-degenerativ lidelse, der ikke har effektive behandlinger hidtil. Udviklingen af terapier, der fremmer vævregenerering, har altid været af stor interesse. Vævregenerering og reparation efter skade afhænger af hjemmehørende stamceller / stamceller 1 . Satellitceller er begået myogene precursorceller, der bidrager til muskelregenerering 2 , 3 , 4 , 5 , 6 , 7 . Deres kliniske anvendelse er imidlertid hæmmet af deres begrænsede migration og lav overlevelsesrate efter injektion, såvel som deres nedsatte differentieringsevne efter in vitro- amplifikation 8 , 9 , 10 , 11 . Ud over satellitTe-celler, skeletmuskler indeholder også mange andre cellepopulationer med myogen potentiale 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , såsom blodpladeafledte vækstfaktorreceptor-beta (PDGFRβ) -positive interstitiale celler. Der er tegn på, at muskelafledte PDGFRβ + -celler er i stand til at differentiere i myogene celler og forbedre muskelpatologi og funktion 14 , 17 , 18 , 19 , 20 . PDGFRβ overvejende mærker pericytter 21 , som er perivaskulære celler med pluripotens 22 , 23 . Foruden PDGFRβ anvendes mange andre markører, herunder Neuron-Glial 2 (NG2) og CD146, også tilDentify pericytes 21 . Det skal imidlertid bemærkes, at ingen af disse markører er pericytspecifikke 21 . Nylige undersøgelser afslørede to subtyper af muskelpericytter, kaldet type I og type II, som udtrykker forskellige molekylmarkører og udfører forskellige funktioner 19 , 24 , 25 . Biokemisk er type I pericytter NG2 + Nestin - mens type II pericytter er NG2 + Nestin + 19 , 24 . Funktionelt kan type I pericytter undergå adipogen differentiering, der bidrager til fedtophopning og / eller fibrose, mens type II pericytter kan differentiere langs den myogene vej, hvilket bidrager til muskelregenerering 19 , 24 , 25 . Disse resultater viser at: (1) type I pericytter kan bE målrettet mod behandling af fedtdegenerative lidelser / fibrose, og (2) type II-pericytter har et stort terapeutisk potentiale for muskeldystrofi. Yderligere undersøgelse og karakterisering af disse populationer kræver en isolationsprotokol, der muliggør adskillelse af type I og type II pericytter på et højt niveau af renhed.
I øjeblikket er isolationen af pericyte-subpopulationer afhængig af NG2-DsRed og Nestin-GFP dobbelt-transgene mus 19 , 24 . Tilgængeligheden af NG2-DsRed-mus og kvaliteten af de fleste NG2-antistoffer begrænser den udbredt anvendelse af denne metode. Da alle NG2 + pericytes også udtrykker PDGFRβ i skelets muskler 19 , 20 , 24 , antager vi, at NG2 kan erstattes af PDGFRβ til isolering af pericytter og deres subpopulationer. Dette arbejde beskriver en FACS-baseret protokol somBruger PDGFRβ farvning og Nestin-GFP signalet. Denne metode er mindre krævende for efterforskere, fordi: (1) den ikke kræver NG2-DsRed-baggrunden og (2) den bruger kommercielt tilgængelige PDGFRβ-antistoffer, som er velkarakteriserede. Derudover muliggør den samtidig isolering af type I og type II pericytter med høj renhed, hvilket muliggør yderligere undersøgelse af biologiske og terapeutiske potentialer af disse pericyte subpopulationer. Efter oprensning kan disse celler dyrkes i kultur, og deres morfologier kan visualiseres. Dette arbejde viser også, at type I og type II-pericytter isoleret ved anvendelse af denne fremgangsmåde, som dem, der oprenses fra dobbelt-transgene mus, er henholdsvis adipogene og myogene.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Wildtype- og Nestin-GFP-transgene mus blev anbragt i dyreanlægget ved University of Minnesota. Alle forsøgsprocedurer blev godkendt af Institutional Animal Care and Use Committee ved University of Minnesota og var i overensstemmelse med NIH Guide for pleje og brug af laboratoriedyr.
1. Muskeldissektion og enkeltcelleisolering
- Euthaniser voksne mus (6-10 uger, både mandlige og kvindelige) med tribromethanol (250 mg / kg, ip) og steriliser deres underlivshud med 70% ethanol.
BEMÆRK: Tribromethanol blev anvendt her i stedet for ketamin til anæstesi / eutanasi, da ketamin er kendt for at interagere med NMDA-receptorerne, hvilket potentielt kunne have indflydelse på undersøgelsen. - Placer musene i den liggende position og brug en skalpel for at gøre et vandret snit på maveskindet. Afskal huden med hånden, og træk i modsatte retninger for at afsløre bagmusklerne.
- CollecT musklerne fra begge baglimbs ved hjælp af tang og saks. Opbevar dem i sterilt fosfatbufferet saltvand (PBS) suppleret med 1% penicillin-streptomycin (P / S) på is.
- Vask de dissekerede hindlimb muskler i iskold PBS suppleret med 1% P / S to gange og overfør dem til en steril 10 cm plade.
- Nøjagtigt dissekere nerver, blodkar og bindevæv fra musklerne med tang og saks under et dissektionsmikroskop ved 2X forstørrelse.
- Finhak og hugs musklerne i små stykker (1-2 mm 3 ) ved hjælp af sterile saks og knive. Tilføj om nødvendigt en lille mængde Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) for at sikre, at musklerne ikke tørres ud.
- Mekanisk nedbryde vævet ved pipettering op og ned gennem en 10 ml serologisk pipette 10 gange.
- Tilsæt frisklavet fordøjelsesopløsning (DMEM suppleret med 0,2% type 2 kollagenase) til blandingen. Inkuber ved 37 ° C i 2 timer med gentlE omrøring ved 35 omdrejninger / min.
- Triturate ved hjælp af en 18 G nål for at homogenisere blandingen. Derefter centrifugeres ved 500 xg i 5 minutter. Kassér supernatanten og resuspender derefter pelleten i 0,25% trypsin / EDTA. Inkuber ved 37 ° C i 10 minutter. Gentag centrifugeringstrinnet to gange mere.
- Tilsæt 10 ml DMEM suppleret med 20% føtalt bovint serum (FBS) til opløsningen og centrifuger ved 500 xg i 5 minutter. Kassér supernatanten og resuspender pelleten i lysceller med rød blodcelle (155 mM NH4CI, 10 mM KHCO3 og 0,1 mM EDTA).
- Centrifuge ved 500 xg i 5 minutter. Kassér supernatanten og resuspender pelleten i sorteringsbuffer (20 mM HEPES, pH 7,0; 1 mM EDTA og 1% BSA i Ca / Mg 2+ -fri PBS, pH 7,0). Filtrer blandingen gennem en 40 μm cellefilter til opnåelse af en enkeltcellesuspension.
- Centrifuge ved 500 xg i 5 minutter. Kassér supernatanten og resuspender pelleten i 1 ml sorteringsbuffer.
- Tæl denCelle nummer med et hæmocytometer og fortynd enkeltcellesuspensionen til 5 x 106 / ml i sorteringsbuffer.
2. Cellefarvning og sortering
- Klargør kontrollen og prøven som beskrevet i tabel 1 . Stain enkeltcellesuspensionen med de respektive antistoffer på is i 30 minutter som beskrevet i tabel 1 .
- Centrifuge ved 500 xg i 5 minutter og vask pellets to gange med sorteringsbuffer.
- Tilføj DAPI til enkeltcellede opløsninger som angivet i tabel 1. Brug 5 μg / mL DAPI (slutkoncentration) til DAPI single-color kontrol og 1 μg / mL DAPI til PDGFRβ-PE-FMO kontrollen og prøven. Opbevar alle rør på is gennem hele eksperimentet.
- Tænd sorteringen og softwaren. Scan og indsæt en 100 μm sorteringschip, når du bliver bedt om det.
- Udfør den automatiske opsætning ( dvs. chipjustering, dråbekalibrering, sidestrømskalibrering og sorteringsforsinkelseskalibreringPå) ved at indlæse de automatiske opsætningsperler, når de bliver bedt om det.
- Når automatisk opsætning er færdig, skal du gå til fanen "Eksperiment", klikke på "Ny" og vælge "Blank skabelon" fra "Offentlige skabeloner".
- Under "Måleindstillinger" indtastes "DAPI" for "FL1", "Nestin-GFP" til "FL2" og "PDGFRβ" til "FL3." Fjern markeringen i boksene for "FL4" - "FL6".
- Markér boksene for at aktivere laserne 405, 488 og 561 og klik på "Opret nyt eksperiment".
- Vælg "Start kompensationsguide", og følg "Kompensationsguiden" -software, der beder om at oprette kompensationen.
- Indsæt den ufarvede kontrol og klik på "Start". Klik på "Detektor & Threshold Settings" og juster sensorforstærkningen for FSC og BSC detektorer for at placere befolkningen på skalaen.
- AdBare forstærkningsniveauerne i FL1-FL3 fluorescenskanalerne for at placere de negative populationer på venstre side af histogrammerne. Klik på "Record" knappen for at optage dataene.
- Indlæs enkeltfarvekontrol en efter en, når du bliver bedt om det. Klik på "Start og optag" for at optage dataene. Juster portene til de positive populationer på histogrammerne. Klik på "Næste".
- Gå til "Beregn matrix" på fanen "Kompensation" og klik på "Beregn" i panelet "Beregn kompensationsindstillinger" for at udføre kompensationen. Klik på "Udfør" for at afslutte "Kompensationsguide".
- Indlæs PDGFRβ-PE-FMO-kontrollen og klik på "Start". Tegn en polygonport (Gate A) omkring de celler af interesse under "All Events" -plottet.
- Dobbeltklik inden i Gate A for at oprette et barneplot. Skift Y-aksen til DAPI og tegne en polygonport (Gate B) omkring live (DAPI low ) celler. Dobbeltklik på iNside Gate B for at oprette et barns plot. Skift X-aksen til FSC-H og Y-aksen til FSC-W og tegne en polygonport (Gate C) omkring singlets for at eliminere dubletter.
- Dobbeltklik inde i Gate C for at oprette et børneplot. Skift X-aksen til Nestin-GFP og Y-aksen til PDGFRβ-PE. Klik på "Record" knappen for at optage dataene.
- Indlæs prøven og gentag trin 2.11-2.12. Efter optagelse skal du klikke på "Pause" for at bevare prøven.
- Definer gating grænserne for PDGFRβ + og Nestin-GFP + celler baseret på PDGFRβ-PE-FMO kontrol. Tegn porte til PDGFRβ + Nestin-GFP- og PDGFRβ + Nestin-GFP + populationerne.
- Under "Sorteringsmetode" vælges "2-vejsrør" og tildeler "PDGFRβ + Nestin-GFP" og "PDGFRβ + Nestin-GFP + " -cellerne til venstre og højre opsamlingsrørholdsvis. Monter sorteringsbufferfyldte 15 ml opsamlingsrør på opsamlingstrinnet og klik på "Load Collection" -knappen ".
- Klik på knappen "Fortsæt" for at holde prøven kørende. Klik på "Start Sort" for at indsamle PDGFRβ + Nestin-GFP - (type I pericytes) og PDGFRβ + Nestin-GFP + (type II pericytes) celler.
3. Post-sorteringsanalyser
- Centrifuger de sorterede celler ved 500 xg i 5 minutter, resuspender pelleten i 1 ml pericyt medium (se Materialetabel ), og tæl celletætheden ved hjælp af et hæmocytometer.
- Frø type I og type II pericytter på poly-D-lysin (PDL) -coated coverlips ved ~ 1 x 10 4 celler / cm 2 . Vokse i pericyte medium i 3 dage ved 37 ° C med 5% CO2.
- På dag 3 undersøges pericyte-morfologien (under fasekontrast) og endogent Nestin-GFP-udtryk ved anvendelse af en fluorescerende mikroAnvendelsesområde (excitationslaser: 488 nm, excitationsfilter: 470/40 nm og emissionsfilter: 515/30 nm). Tag billeder under et 20X objektiv (0,45 NA).
- Udskift pericyte-mediet med adipogen (mus MSC basalt medium + adipogent stimulatorisk supplement) og myogen (DMEM + 2% hesteserum) medium for at initiere adipogen og myogen differentiering henholdsvis som beskrevet tidligere 20 . Skift medie hver 2-3 dage.
- Fix cellerne på dag 17 (14 dage efter adipogen / myogen differentiering) i 4% paraformaldehyd (PFA) i 20 minutter ved stuetemperatur.
BEMÆRK: Forsigtig, PFA er kræftfremkaldende. - Udfør immuncytokemi mod perilipin (adipocytmarkør) og S-myosin (moden myotube / myofiber-markør) som beskrevet i tidligere publikationer 19 , 20 .
- Vask de faste celler 3 gange i PBS i 10 minutter ved stuetemperatur.
- Tilføj blokeringsbuffer (PBSSuppleret med 5% æseleserum, 3% BSA og 0,3% Triton X-100) og inkuberes ved stuetemperatur i 1 time.
- Inkuber cellerne med anti-perilipin (2 μg / ml) og / eller anti-S-myosin (2 μg / ml) antistoffer ved 4 ° C natten over.
- Vask cellerne 3 gange i PBS i 10 minutter ved stuetemperatur.
- Inkuber cellerne med Alexa 555 æsel-anti-kanin (4 μg / ml) og / eller Alexa555 æsel-anti-mus (4 μg / ml) antistoffer ved stuetemperatur i 1 time.
- Vask cellerne 3 gange i PBS i 10 minutter ved stuetemperatur.
- Monter de immunostainerede celler med monteringsmedium indeholdende DAPI (se materialebordet). Undersøg perilipin- og S-myosinekspression ved hjælp af et fluorescerende mikroskop (exciteringslaser: 543 nm, 540/45 nm excitation og 600/50 nm emission) og tag billeder under et 40X objektiv (0,60 NA).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
FACS-parametre, herunder laserintensitet og kanalkompensation, korrigeres baseret på resultaterne af ufarvet kontrol og enkeltfarvekontroller. PDGFRβ-PE-FMO-kontrollen anvendes til at indstille gating for PDGFRβ-PE + populationen ( Figur 1A ). Blandt PDGFRβ-PE - cellerne er to populationer repræsenteret af Nestin-GFP + og Nestin-GFP - celler klart adskilt ( Figur 1A ). Gating grænser for PDGFRβ-PE + Nestin-GFP + og PDGFRβ-PE + Nestin-GFP - populationerne er sat baseret på gating for PDGFRβ-PE + og Nestin-GFP + ( Figur 1A ). Disse grænser anvendes til at definere og sortere PDGFRβ-PE + Nestin-GFP + (type II pericytter) og PDGFRβ-PE + Nestin-GFP - (type I pericytEs) celler fra prøven ( figur 1B ). Isolerede PDGFRβ-PE + Nestin-GFP- og PDGFRβ-PE + Nestin-GFP + -celler tegner sig for henholdsvis 9,5% og 2,1% af de samlede celler i enhedsopløsningen.
FACS-isolerede type I og type II pericytter viser morfologiske forskelle efter tre dage i kultur. Type I pericytter viser amoeboid morfologi, med runde celler og korte processer ( Figur 2 ). Type II-pericytter viser dog forgrenet morfologi, der er kendetegnet ved småcellede kroppe og lange tynde processer ( figur 2 ). På nuværende tidspunkt forbliver de fleste type II pericytter som Nestin-GFP + , mens type I pericytter er Nestin-GFP - ( Figur 2 ).
Derudover skriver jeg type I, men ikke type II, pericyTes differentierer til perilipin-ekspressive adipocytter efter 14 dage i adipogent medium ( Figur 3 ). Type II, men ikke type I, pericytter differentierer til S-myosin-udtrykker myotubes efter 14 dage i myogent medium ( Figur 4 ). Disse resultater tyder stærkt på, at type I pericytter er adipogene, mens type II pericytter er myogene.
Figur 1 : Gating grænser og repræsentativ sortering. ( A ) Fluorescerende plot af PDGFRβ-PE-FMO-kontrollen, der demonstrerer PDGFRβ-PE + Nestin-GFP- og PDGFRβ-PE + Nestin-GFP + gatinggrænser. ( B ) Repræsentativt fluorescerende plot af prøven, der viser fordelingen af PDGFRβ-PE + Nestin-GFP
Figur 2: Morfologi og Nestin-GFP udtryk i sorterede type I og type II pericytter. Sorterede type I og type II pericytter blev podet på coverlips og dyrket i pericyte medium i 3 dage. Type I pericytter viste runde cellekroppe med korte processer og intet endogent GFP-signal under et fluorescerende mikroskop (excitationslaser: 488 nm, excitations- og emissionsfiltre: henholdsvis 470/40 nm og 515/30 nm). Type II pericytter viste småcellede kroppe med lange og tynde processer og et stærkt endogent GFP signal under enFluorescerende mikroskop under de samme indstillinger. Skalbjælke = 100 μm Klik venligst her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Adipogen differentiering af sorterede type I og type II pericytter. Sorterede type I og type II pericytter blev dyrket i pericyt medium i 3 dage. De blev derefter differentieret i adipogent medium i 14 dage. Cellerne blev fikseret og immunostainet med anti-perilipin-antistof efterfulgt af Alexa555 æsel-anti-kanin-antistof. Immunocytokemi viste, at type I, men ikke type II, pericytter udtrykte adipocytmarkørperilipinen (rød) under et fluorescerende mikroskop (excitationslaser: 543 nm, excitations- og emissionsfiltre: 540/45 nm og 600/50 nm, respekt ively). Skalbjælke = 50 μm Klik venligst her for at se en større version af denne figur.
Figur 4 : Myogen differentiering af sorterede type I og type II pericytter. Sorterede type I og type II pericytter blev dyrket i pericyt-medium i 3 dage og differentieredes derefter i myogent medium i 14 dage. Cellerne blev fikseret og immunfarvet med anti-S-myosin-antistof og Alexa555 æsel-anti-mus-antistof. Immunocytokemi viste, at type II, men ikke type I, pericytter udtrykte den modne myotube / myofiber-markør S-myosin (rød) under et fluorescerende mikroskop (excitationslaser: 543 nm, excitations- og emissionsfiltre: 540/45 nm og 600/50 nm , henholdsvis). Målestang = 50 μm//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55904/55904fig4large.jpg "target =" _ blank "> Venligst klik her for at se en større version af denne figur.
| Rør | Farvning |
| Ubestemt kontrol | Single-cellesuspension fra vildtype-mus |
| DAPI enkeltfarvekontrol (udelukkelse af dødcelle) | Enkeltcellesuspension fra vildtype-mus + DAPI (5 μg / ml) |
| GFP single-color kontrol | Single-cellesuspension fra Nestin-GFP-mus |
| PE enkeltfarve kontrol | OneComp eBeads + PDGFRβ-PE antistof (4 μg / ml) |
| PE-FMO kontrol | Encellesuspension fra Nestin-GFP-mus + DAPI (1 μg / ml) |
| Prøve | Encellesuspension fra Nestin-GFP-mus + PDGFRβ-PE antistof (4 μg / ml) +DAPI (1 μg / ml) |
Tabel 1: Farveprotokol til enkeltfarvekontrol, PDGFRβ-PE-FMO-kontrol og muskelprøve.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Pericytter er multipotente perivaskulære celler 22 , 23 placeret på den abluminale overflade af kapillarerne 21 , 26 . I skelets muskler er pericytter i stand til at differentiere langs adipogene og / eller myogene veje 19 , 20 , 24 . Nylige undersøgelser afslørede to subpopulationer af pericytter med forskellige markørekspression og forskellige differentieringspotentialer 19 , 24 , 25 . Type I (NG2 + Nestin - ) pericytter er adipogene, mens type II (NG2 + Nestin + ) pericytter er myogene. Isoleringen af disse subpopulationer til in vitro- studier kræver dobbelt-transgen muselinie NG2-DsRed og Nestin-GFP. Afhængigheden af denne oprensningProtokol på dobbelt-transgene mus begrænser markant dets anvendelse og dermed forskning på biologien af pericyte subpopulationer.
Denne videoartikel illustrerer en alternativ metode til isolering af type I og type II pericytter fra museskeletmuskler. Denne nye metode er stadig afhængig af en FACS-baseret teknik til celleseparation. I stedet for at udnytte transgen NG2-DsRed fluorescens er den imidlertid målrettet mod det endogene PDGFRβ signal. Dette er baseret på den observation, at NG2-DsRed-ekspression co-lokaliseres med PDGFRβ i skeletmuskel 19 . Sammenlignet med den oprindelige metode har denne protokol flere fordele. For det første kræver det ikke den genetiske baggrund NG2-DsRed, selv om Nestin-GFP-baggrunden stadig er nødvendig. For det andet bruger denne protokol i stedet for at målrette NG2 PDGFRβ, en velkarakteriseret markør med validerede og kommercielt tilgængelige antistoffer. For det tredje tillader det samtidig isolering af boDe type I og type II pericytter. For eksempel demonstrerer PDGFRβ-PE + Nestin-GFP- og PDGFRβ-PE + Nestin-GFP + -celler, der er isoleret ved anvendelse af denne protokol, særskilte differentieringsfunktioner. Specifikt differentieres PDGFRβ-PE + Nestin-GFP-, men ikke PDGFRβ-PE + Nestin-GFP + cellerne til adipocytter i adipogen tilstand, mens PDGFRβ-PE + Nestin-GFP + , men ikke PDGFRβ-PE + Nestin-GFP - , Celler undergår myogen differentiering under myogen tilstand. Disse data er i overensstemmelse med tidligere rapporter, der viser, at NG2-DsRed + Nestin-GFP - celler (type I pericytter) er adipogene og NG2-DsRed + Nestin-GFP + -celler (type II pericytter) er myogene 19 , 24 , hvilket antyder, at isoleret PDGFRβ -PE + Nestin-GFP- og PDGFRβ-PE + NEstin-GFP + -celler er faktisk henholdsvis type I og type II pericytter. Sammen tyder disse resultater på, at denne nye protokol giver mulighed for den relativt lette isolering / rensning af pericyte subpopulationer fra muskelsmuskler og eventuelt andre væv. Dette vil fremme undersøgelser af percytbiologi og deres terapeutiske oversættelse for forskellige lidelser.
Det skal imidlertid bemærkes, at der er en begrænsning af denne metode på grund af anvendelsen PDGFRβ. Det har vist sig i et tidligere studie, at PW1 + interstitiale celler (PIC'er) også udtrykker PDGFRβ 20 . Derfor kan isolerede PDGFRβ-PE + Nestin-GFP- og PDGFRβ-PE + Nestin-GFP + -populationer indeholde PIC'er. Imidlertid er disse PIC'ers bidrag til pericyt differentiering begrænset, da pericytene overstiger PIC'er i skelets muskler 20, og den type, jeg pericytter, undergår ikke minOgenesis 19 , 25 .
Ved anvendelse af denne metode blev type I og type II pericytter opnået ved udbytter på henholdsvis 9,5% og 2,1%. Disse tal var sammenlignelige med de rapporterede udbytter på henholdsvis 2,8% og 3,4% i de dobbelt-transgene mus 19 . Den lille forskel kan skyldes forskellige gatingstrategier eller fordøjelsesprotokoller. Disse resultater antyder igen, at den foreslåede protokol kan anvendes til at isolere subtyper af pericytter fra skelets muskler.
De kritiske trin i denne protokol omfatter følgende punkter: (1) Sørg for, at skeletmusklerne er fuldt hakket og i stand til nemt at passere gennem en 10 ml serologisk pipette. Store muskelblokke forstyrrer enzymatisk fordøjelse og reducerer udbyttet betydeligt. (2) Brug frisklavet kollagenaseopløsning til muskelfordøjelse og lad mild omrøring (35 omdrejninger / min) under inkubation. (3) hold denKontroller og prøve på is gennem farvning og sorteringstrin. (4) Brug FMO-kontroller til at indstille gittergrænser.
Ud over differentieringsevne viser type I og type II pericytter også forskellige morfologier. Specifikt har type I pericytter runde cellelegemer med korte processer og relativt store kerner. Type II pericytter har derimod normalt småcellede kroppe med lange og tynde processer og små kerne. De morfologiske forskelle tyder på, at type I og type II pericytter er iboende forskellige, hvilket er i overensstemmelse med den heterogene karakter af pericytter 21 . Hvad der forårsager / opretholder forskellen mellem type I og type II pericytter, samt de underliggende molekylære mekanismer, forbliver uklare og kræver yderligere undersøgelse. Denne isolationsprotokol hjælper med at besvare disse vigtige spørgsmål.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Alle forfattere har ingen interessekonflikt at afsløre.
Acknowledgments
Dette arbejde blev delvist støttet af et fond-a-stipendium fra Myotonic Dystrophy Foundation (MDF-FF-2014-0013) og Scientific Development Grant fra American Heart Association (16SDG29320001).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell Sorter | Sony | SH800 | |
| Automatic Setup Beads | Sony | LE-B3001 | |
| DMEM | Gibco | 11995 | |
| Avertin | Sigma | T48402 | |
| Pericyte Growth Medium | ScienCell | 1201 | |
| MSC Basal Medium (Mouse) | Stemcell Technologies | 5501 | |
| Adipogenic Stimulatory Supplement (Mouse) | Stemcell Technologies | 5503 | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 16000 | |
| Horse Serum | Sigma | H1270 | |
| Collagenase Type 2 | Worthington | LS004176 | |
| 0.25% Trypsin/EDTA | Gibco | 25200 | |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15140 | |
| PDL | Sigma | P6407 | |
| PDGFRβ-PE Antibody | eBioscience | 12-1402 | |
| Perilipin Antibody | Sigma | P1998 | |
| S-Myosin Antibody | DSHB | MF-20 | |
| Alexa 555-anti-rabbit antibody | ThermoFisher Scientific | A-31572 | |
| Alexa 555-anti-mouse antibody | ThermoFisher Scientific | A-31570 | |
| Mounting Medium with DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | |
| DAPI | ThermoFisher Scientific | D1306 | |
| HEPES | Gibco | 15630 | |
| EDTA | Fisher | BP120 | |
| BSA | Sigma | A2058 | |
| NH4Cl | Fisher Scientific | A661 | |
| KHCO3 | Fisher Scientific | P184 | |
| PBS | Gibco | 14190 | |
| 18 G Needles | BD | 305196 | |
| 10 mL Serological Pipette | BD | 357551 | |
| OneComp eBeads | eBioscience | 01-1111 |
References
- Rennert, R. C., Sorkin, M., Garg, R. K., Gurtner, G. C. Stem cell recruitment after injury: lessons for regenerative medicine. Regenerative medicine. 7 (6), 833-850 (2012).
- Sambasivan, R., et al. Pax7-expressing satellite cells are indispensable for adult skeletal muscle regeneration. Development. 138 (17), 3647-3656 (2011).
- Relaix, F., Zammit, P. S. Satellite cells are essential for skeletal muscle regeneration: the cell on the edge returns centre stage. Development. 139 (16), 2845-2856 (2012).
- von Maltzahn, J., Jones, A. E., Parks, R. J., Rudnicki, M. A. Pax7 is critical for the normal function of satellite cells in adult skeletal muscle. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (41), 16474-16479 (2013).
- Lepper, C., Partridge, T. A., Fan, C. M. An absolute requirement for Pax7-positive satellite cells in acute injury-induced skeletal muscle regeneration. Development. 138 (17), 3639-3646 (2011).
- Kuang, S., Charge, S. B., Seale, P., Huh, M., Rudnicki, M. A. Distinct roles for Pax7 and Pax3 in adult regenerative myogenesis. J Cell Biol. 172 (1), 103-113 (2006).
- Murphy, M. M., Lawson, J. A., Mathew, S. J., Hutcheson, D. A., Kardon, G. Satellite cells, connective tissue fibroblasts and their interactions are crucial for muscle regeneration. Development. 138 (17), 3625-3637 (2011).
- Morgan, J. E., Pagel, C. N., Sherratt, T., Partridge, T. A. Long-term persistence and migration of myogenic cells injected into pre-irradiated muscles of mdx mice. J Neurol Sci. 115 (2), 191-200 (1993).
- Beauchamp, J. R., Morgan, J. E., Pagel, C. N., Partridge, T. A. Dynamics of myoblast transplantation reveal a discrete minority of precursors with stem cell-like properties as the myogenic source. J Cell Biol. 144 (6), 1113-1122 (1999).
- Partridge, T. A. Invited review: myoblast transfer: a possible therapy for inherited myopathies. Muscle Nerve. 14 (3), 197-212 (1991).
- Montarras, D., et al. Direct isolation of satellite cells for skeletal muscle regeneration. Science. 309 (5743), 2064-2067 (2005).
- Asakura, A., Seale, P., Girgis-Gabardo, A., Rudnicki, M. A. Myogenic specification of side population cells in skeletal muscle. J Cell Biol. 159 (1), 123-134 (2002).
- Tamaki, T., et al. Skeletal muscle-derived CD34+/45- and CD34-/45- stem cells are situated hierarchically upstream of Pax7+ cells. Stem Cells Dev. 17 (4), 653-667 (2008).
- Dellavalle, A., et al. Pericytes resident in postnatal skeletal muscle differentiate into muscle fibres and generate satellite cells. Nat Commun. 2, 499 (2011).
- Mitchell, K. J., et al. Identification and characterization of a non-satellite cell muscle resident progenitor during postnatal development. Nat Cell Biol. 12 (3), 257-266 (2010).
- Pannerec, A., Formicola, L., Besson, V., Marazzi, G., Sassoon, D. A. Defining skeletal muscle resident progenitors and their cell fate potentials. Development. 140 (14), 2879-2891 (2013).
- Dellavalle, A., et al. Pericytes of human skeletal muscle are myogenic precursors distinct from satellite cells. Nat Cell Biol. 9 (3), 255-267 (2007).
- Kostallari, E., et al. Pericytes in the myovascular niche promote post-natal myofiber growth and satellite cell quiescence. Development. 142 (7), 1242-1253 (2015).
- Birbrair, A., et al. Role of pericytes in skeletal muscle regeneration and fat accumulation. Stem Cells Dev. 22 (16), 2298-2314 (2013).
- Yao, Y., Norris, E. H., Mason, C. E., Strickland, S. Laminin regulates PDGFRbeta(+) cell stemness and muscle development. Nat Commun. 7, 11415 (2016).
- Armulik, A., Genove, G., Betsholtz, C. Pericytes: developmental, physiological, and pathological perspectives, problems, and promises. Dev Cell. 21 (2), 193-215 (2011).
- Dore-Duffy, P. Pericytes: pluripotent cells of the blood brain barrier. Curr Pharm Des. 14 (16), 1581-1593 (2008).
- Dore-Duffy, P., Katychev, A., Wang, X., Van Buren, E. CNS microvascular pericytes exhibit multipotential stem cell activity. J Cereb Blood Flow Metab. 26 (5), 613-624 (2006).
- Birbrair, A., et al. Skeletal muscle pericyte subtypes differ in their differentiation potential. Stem Cell Res. 10 (1), 67-84 (2013).
- Gautam, J., Nirwane, A., Yao, Y. Laminin differentially regulates the stemness of type I and type II pericytes. Stem Cell Research & Therapy. 8 (1), 28 (2017).
- Birbrair, A., et al. Pericytes: multitasking cells in the regeneration of injured, diseased, and aged skeletal muscle. Front Aging Neurosci. 6, 245 (2014).
