Summary
Detta arbete beskriver ett FACS-baserat protokoll som möjliggör enkel och samtidig isolering av typ I och typ II pericytes från skelettmuskler.
Abstract
Pericytes är perivaskulära multipotenta celler som visar heterogenitet i olika organ eller till och med inom samma vävnad. I skelettmusklerna finns det minst två perikita subpopuleringar (kallad typ I och typ II), vilka uttrycker olika molekylmarkörer och har tydliga differentieringsegenskaper. Med hjälp av NG2-DsRed och Nestin-GFP dubbel-transgena möss har typ I (NG2-DsRed + Nestin-GFP-) och typ II (NG2-DsRed + Nestin-GFP + ) pericytes isolerats framgångsrikt. Tillgängligheten av dessa dubbel-transgena möss förhindrar emellertid den utbredda användningen av denna reningsmetod. Detta arbete beskriver ett alternativt protokoll som möjliggör enkel och samtidig isolering av typ I och typ II pericytes från skelettmuskler. Detta protokoll använder den fluorescensaktiverade cellsorteringsmetoden (FACS) och riktar sig mot PDGFRβ, snarare än NG2, tillsammans med Nestin-GFP-signalen. Efter isolering, typ I och tyPe II pericytes visar olika morfologier. Dessutom är typ I och typ II-pericyter isolerade med denna nya metod, som de isolerade från de dubbel-transgena mössen, adipogena respektive myogena. Dessa resultat tyder på att detta protokoll kan användas för att isolera pericyte subpopulationer från skelettmuskler och eventuellt från andra vävnader.
Introduction
Muskeldystrofi är en muskel-degenerativ sjukdom som hittills inte har några effektiva behandlingar. Utvecklingen av terapier som främjar vävnadsregenerering har alltid varit av stort intresse. Vävnadsregenerering och reparation efter skada beror på hemma stamceller / stamceller 1 . Satellitceller är begåvade myogena precursorceller som bidrar till muskelregenerering 2 , 3 , 4 , 5 , 6 , 7 . Deras kliniska användning hindras emellertid av deras begränsade migration och låg överlevnad efter injektion, liksom av deras minskade differentieringsförmåga efter in vitro- amplifiering 8 , 9 , 10 , 11 . Förutom satellitTe-celler, skelettmuskler innehåller också många andra cellpopulationer med myogen potential 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , såsom blodplätt-härledda tillväxtfaktorreceptor-beta (PDGFRβ) -positiva interstitiella celler. Det finns bevis som visar att muskelavledda PDGFRβ + -celler kan differentiera till myogena celler och förbättra muskelpatologin och funktionen 14 , 17 , 18 , 19 , 20 . PDGFRβ övervägande märker pericytes 21 , vilka är perivaskulära celler med pluripotens 22 , 23 . Förutom PDGFRβ används också många andra markörer, inklusive Neuron-Glial 2 (NG2) och CD146, tillDentify pericytes 21 . Det bör dock noteras att ingen av dessa markörer är pericytspecifik 21 . Tidigare studier avslöjade två subtyper av muskelpericytor, kallad typ I och typ II, vilka uttrycker olika molekylmarkörer och utför separata funktioner 19 , 24 , 25 . Biokemiskt är typ I pericytor NG2 + Nestin - medan typ II pericytes är NG2 + Nestin + 19 , 24 . Funktionellt kan typ I pericytes genomgå adipogen differentiering, vilket bidrar till fettackumulering och / eller fibros, medan typ II-pericytes kan differentiera längs den myogena vägen, vilket bidrar till muskelregenerering 19 , 24 , 25 . Dessa resultat visar att: (1) typ I pericytes kan bE riktade mot behandling av fettdegenerativa störningar / fibros och (2) typ II-pericyter har stor terapeutisk potential för muskeldystrofi. Ytterligare undersökning och karakterisering av dessa populationer kräver ett isoleringsprotokoll som möjliggör separering av typ I och typ II pericytes vid en hög renhetsgrad.
För närvarande är isoleringen av pericyte subpopuleringar beroende av NG2-DsRed och Nestin-GFP dubbel-transgena möss 19 , 24 . Tillgängligheten av NG2-DsRed-möss och kvaliteten på de flesta NG2-antikroppar begränsar den omfattande användningen av denna metod. Med tanke på att alla NG2 + pericytes också uttrycker PDGFRβ i skelettmusklerna 19 , 20 , 24 , förutser vi att NG2 kan ersättas med PDGFRβ för isoleringen av pericyter och deras subpopulationer. I det här arbetet beskrivs ett FACS-baserat protokoll somAnvänder PDGFRβ-färgning och Nestin-GFP-signalen. Denna metod är mindre krävande för utredare, eftersom: (1) den inte kräver NG2-DsRed-bakgrunden och (2) den använder kommersiellt tillgängliga PDGFRp-antikroppar, vilka är välkända. Dessutom möjliggör den samtidig isolering av typ I och typ II pericytes med hög renhet, vilket möjliggör ytterligare undersökning av biologiska och terapeutiska potentialen hos dessa pericyte subpopuleringar. Efter rening kan dessa celler odlas i odling och deras morfologier kan visualiseras. Detta arbete visar också att typ I och typ II-pericyter isolerade med användning av denna metod, som de som renats från dubbel-transgena möss, är adipogena respektive myogena.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Wildtype och Nestin-GFP-transgena möss hölls i djuranläggningen vid University of Minnesota. Alla försöksförfaranden godkändes av Institutionen för djurvård och användning vid University of Minnesota och var i överensstämmelse med NIH Guide for Care and Use of Laboratory Animals.
1. Muskeldissektion och enkelcellsisolering
- Euthanisera vuxna möss (6-10 veckor, både man och kvinna) med tribromoetanol (250 mg / kg, ip) och sterilisera bukhudet med 70% etanol.
OBS: Tribromoetanol användes här istället för ketamin för anestesi / eutanasi, eftersom ketamin är känt att interagera med NMDA-receptorerna, vilket potentiellt kan påverka studien. - Placera musen i det bakre läget och använd en skalpell för att göra ett horisontellt snitt på bukhuden. Skala av huden med hand, dra i motsatta riktningar för att exponera bakmusklerna.
- CollecT musklerna från båda bakbenen med tång och sax. Förvara dem i steril fosfatbuffrad saltlösning (PBS) kompletterad med 1% penicillin-streptomycin (P / S) på is.
- Tvätta de dissekerade hindlimb musklerna i iskall PBS kompletterad med 1% P / S två gånger och överföra dem till en steril 10 cm platta.
- Avlägsna noggrant nerver, blodkärl och bindväv från musklerna med hjälp av pincett och sax under ett dissektionsmikroskop vid 2X förstoring.
- Småhacka och hugga musklerna i små bitar (1-2 mm 3 ) med sterila saxar och blad. Om så behövs, lägg till en liten mängd Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) för att säkerställa att musklerna inte torkas ut.
- Mekaniskt bryta ner vävnaden genom pipettering upp och ner genom en 10 ml serologisk pipett 10 gånger.
- Tillsätt nyframställd digestionslösning (DMEM kompletterad med 0,2% typ 2 kollagenas) till blandningen. Inkubera vid 37 ° C under 2 timmar med gentlE omrörning vid 35 varv / min.
- Triturate med en 18 G nål för att homogenisera blandningen. Centrifugera sedan vid 500 xg i 5 min. Kassera supernatanten och sedan resuspendera pelleten i 0,25% trypsin / EDTA. Inkubera vid 37 ° C i 10 minuter. Upprepa centrifugeringssteget två gånger.
- Tillsätt 10 ml DMEM kompletterat med 20% fetalt bovint serum (FBS) till lösningen och centrifugera vid 500 xg under 5 min. Kassera supernatanten och resuspendera pelleten i lyscellsbuffert med röd blodcell (155 mM NH4CI, 10 mM KHCO3 och 0,1 mM EDTA).
- Centrifugera vid 500 xg i 5 min. Kassera supernatanten och resuspendera pelleten i sorteringsbufferten (20 mM HEPES, pH 7,0; 1 mM EDTA och 1% BSA i Ca / Mg 2+ -fri PBS, pH 7,0). Filtrera blandningen genom en 40 μm cell-sil för att erhålla en enkelcells-suspension.
- Centrifugera vid 500 xg i 5 min. Kassera supernatanten och resuspendera pelleten i 1 ml sorteringsbuffert.
- RäknaCellnummer med en hemocytometer och späd upp enkelcellsuspensionen till 5 x 106 / ml i sorteringsbuffert.
2. Cellfärgning och sortering
- Förbered kontrollerna och provet enligt beskrivning i Tabell 1 . Färga enkelcellsuspensionen med respektive antikroppar på is under 30 minuter, såsom beskrivs i Tabell 1 .
- Centrifugera vid 500 xg i 5 min och tvätta pellets två gånger med sorteringsbuffert.
- Lägg till DAPI i encellslösningarna, som anges i tabell 1. Använd 5 μg / ml DAPI (slutkoncentration) för DAPI enfärgskontroll och 1 μg / ml DAPI för PDGFRβ-PE-FMO kontrollen och provet. Håll alla rör på is under hela experimentet.
- Slå på sorteraren och programvaran. Skanna och sätt in ett 100 μm sorteringschip när du blir ombedd.
- Utför automatisk inställning ( dvs chipinställning, droppkalibrering, sidokalibrering och sorteringsfördröjningskalibreringPå) genom att ladda de automatiska installationspärlorna när de blir ombedda.
- När automatisk inställning är klar, gå till fliken "Experiment", klicka på "Ny" och välj "Blank template" från "Public Templates."
- Under "Mätningsinställningar" anger du "DAPI" för "FL1", "Nestin-GFP" för "FL2" och "PDGFRβ" för "FL3." Avmarkera rutorna för "FL4" - "FL6".
- Markera rutorna för att aktivera lasrarna 405, 488 och 561 och klicka på "Skapa nytt experiment".
- Välj alternativet "Startkompensation" och följ programvaran "Kompensationsguiden" om att ställa in kompensationen.
- Ladda den obestämda kontrollen och klicka på "Start". Klicka på "Detektor & Threshold Settings" och justera sensorns förstärkning av FSC och BSC detektorerna för att placera befolkningen på skalan.
- A.dBara vinstnivåerna i FL1-FL3 fluorescenskanalerna för att placera de negativa populationerna på vänster sida av histogrammen. Klicka på "Record" -knappen för att spela in data.
- Lägg i enfärgskontroller en efter en när du blir ombedd. Klicka på "Starta och spela in" för att spela in data. Justera grindarna för de positiva populationerna på histogrammen. Klicka på "Nästa".
- Gå till "Beräkna matris" på fliken "Kompensation" och klicka på "Beräkna" i panelen "Beräkna kompensationsinställningar" för att utföra kompensationen. Klicka på "Slutför" för att lämna "Kompensationsguiden".
- Ladda PDGFRβ-PE-FMO-kontrollen och klicka på "Start". Rita en polygonggrind (Gate A) runt de intressanta cellerna under "All Events" -plotten.
- Dubbelklicka på Gate A för att skapa ett barns plot. Ändra Y-axeln till DAPI och dra en polygonport (Gate B) runt levande (DAPI låg ) celler. Dubbelklicka på iNside Gate B för att skapa ett barnplott. Ändra X-axeln till FSC-H och Y-axeln till FSC-W och dra en polygonport (Gate C) runt singlets för att eliminera dubletter.
- Dubbelklicka i Gate C för att skapa ett barns plot. Ändra X-axeln till Nestin-GFP och Y-axeln till PDGFRβ-PE. Klicka på "Record" -knappen för att spela in data.
- Ladda provet och upprepa steg 2.11-2.12. Efter inspelning, klicka på "Paus" för att bevara provet.
- Definiera gränsgränserna för PDGFRβ + och Nestin-GFP + -celler baserat på PDGFRβ-PE-FMO-kontrollen. Rita grindar för PDGFRβ + Nestin-GFP- och PDGFRβ + Nestin-GFP + -populationerna.
- Under "Sorteringsmetod" välj "Tvåvägsrör" och tilldela "PDGFRβ + Nestin-GFP" och "PDGFRβ + Nestin-GFP + " -cellerna till vänster och höger uppsamlingsrör, återaktivt. Montera sorteringsbuffertfyllda 15 ml uppsamlingsrör på uppsamlingssteget och klicka på "Ladda samling" -knappen ".
- Klicka på "Fortsätt" -knappen för att hålla provet igång. Klicka på "Start sortera" för att samla PDGFRβ + Nestin-GFP - (typ I pericytes) och PDGFRβ + Nestin-GFP + (typ II pericytes) celler.
3. Post-sorteringsanalyser
- Centrifugera de sorterade cellerna vid 500 xg under 5 minuter, resuspendera pelleten i 1 ml pericyt- medium (se materialtabell ) och räkna cellens densitet med hjälp av en hemocytometer.
- Säd typ I och typ II pericytes på poly-D-lysin (PDL) -belagda täckglas vid ~ 1 x 10 4 celler / cm 2 . Växa i pericyt-medium i 3 dagar vid 37 ° C med 5% CO2.
- På dag 3 undersöker pericyte-morfologin (under faskontrast) och endogent Nestin-GFP-uttryck med hjälp av en fluorescerande mikroOmfattning (exciteringslaser: 488 nm, excitationsfilter: 470/40 nm och emissionsfilter: 515/30 nm). Ta bilder under ett 20X objektiv (0,45 NA).
- Byt pericytmediet med adipogen (mus MSC basalt medium + adipogent stimulerande tillägg) och myogen (DMEM + 2% hästserum) medium för att initiera adipogen och myogen differentiering, såsom beskrivits tidigare 20 . Byt mediet var 2-3 dagar.
- Fixera cellerna på dag 17 (14 dagar efter adipogen / myogen differentiering) i 4% paraformaldehyd (PFA) i 20 minuter vid rumstemperatur.
OBS! Varning, PFA är cancerframkallande. - Utför immuncytokemi mot perilipin (adipocytmarkör) och S-myosin (mogen myotube / myofiber-markör), såsom beskrivs i tidigare publikationer 19 , 20 .
- Tvätta de fasta cellerna 3 gånger i PBS under 10 minuter vid rumstemperatur.
- Lägg till blockeringsbuffert (PBSKompletterat med 5% åsnor serum, 3% BSA och 0,3% Triton X-100) och inkubera vid rumstemperatur i 1 h.
- Inkubera cellerna med anti-perilipin (2 pg / ml) och / eller anti-S-myosin (2 pg / ml) antikroppar vid 4 ° C över natten.
- Tvätta cellerna 3 gånger i PBS under 10 minuter vid rumstemperatur.
- Inkubera cellerna med Alexa 555 åsna anti-kanin (4 μg / ml) och / eller Alexa555 åsna anti-mus (4 μg / ml) antikroppar vid rumstemperatur i 1 timme.
- Tvätta cellerna 3 gånger i PBS under 10 minuter vid rumstemperatur.
- Montera de immunostainerade cellerna med monteringsmedium som innehåller DAPI (se materialtabellen). Undersök perilipin och S-myosinuttryck med hjälp av ett fluorescerande mikroskop (exciteringslaser: 543 nm, 540/45 nm excitation och 600/50 nm-utsläpp) och ta bilder under ett 40X-objektiv (0,60 NA).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
FACS-parametrar, inklusive laserintensitet och kanalkompensation, korrigeras baserat på resultaten av obestämd kontroll och enfärgskontroller. PDGFRβ-PE-FMO-kontrollen används för att ställa in gatingen för PDGFRβ-PE + -populationen ( Figur 1A ). Bland PDGFRβ-PE - cellerna är två populationer som representerar Nestin-GFP + och Nestin-GFP - celler tydligt åtskilda ( Figur 1A ). Gatinggränserna för PDGFRβ-PE + Nestin-GFP + och PDGFRβ-PE + Nestin-GFP - populationerna är baserade på grinden för PDGFRβ-PE + och Nestin-GFP + ( Figur 1A ). Dessa gränser används för att definiera och sortera PDGFRβ-PE + Nestin-GFP + (typ II pericytes) och PDGFRβ-PE + Nestin-GFP - (typ I pericytEs) celler från provet ( Figur IB ). Isolerade PDGFRβ-PE + Nestin-GFP- och PDGFRβ-PE + Nestin-GFP + -celler står för 9,5% och 2,1% av de totala cellerna i en-celllösningen.
FACS-isolerade typ I och typ II-pericyter visar morfologiska skillnader efter tre dagar i odling. Typ I pericytes visar amoeboidmorfologi, med runda cellkroppar och korta processer ( Figur 2 ). Typ II pericytes visar emellertid ramifierad morfologi, som karaktäriseras av småcelliga kroppar och långa, smala processer ( Figur 2 ). Vid denna tid kvarstår de flesta typ II-pericytterna som Nestin-GFP + , medan typ I-pericytes är Nestin-GFP - ( Figur 2 ).
Dessutom skriver du typ I, men inte typ II, pericyTes differentiera till perilipin-uttryckande adipocyter efter 14 dagar i adipogent medium ( Figur 3 ). Typ II, men inte typ I, pericytes differentierar till S-myosin-uttryckande myotubes efter 14 dagar i myogent medium ( Figur 4 ). Dessa resultat tyder starkt på att typ I pericytes är adipogena, medan typ II-pericyter är myogena.
Figur 1 : Gatinggränser och representativ sortering. ( A ) Fluorescerande plot av PDGFRβ-PE-FMO-kontrollen, som demonstrerar PDGFRP-PE + Nestin-GFP- och PDGFRβ-PE + Nestin-GFP + gränsgränserna. ( B ) Representativt fluorescerande diagram av provet som visar fördelningen av PDGFRP-PE + Nestin-GFP
Figur 2: Morfologi och Nestin-GFP uttryck i sorterade typ I och typ II pericytes. Sorterade typ I och typ II pericytes såddes på täckglas och odlades i pericyt medium i 3 dagar. Typ I pericytes visade runda cellkroppar med korta processer och ingen endogen GFP-signal under ett fluorescerande mikroskop (exciteringslaser: 488 nm, excitations- och emissionsfilter: 470/40 nm respektive 515/30 nm). Typ II-pericytes visade småcellkroppar, med långa och tunna processer och en stark endogen GFP-signal under enFluorescerande mikroskop med samma inställningar. Skala bar = 100 μm Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Adipogen differentiering av sorterade typ I och typ II pericyter. Sorterade typ I och typ II-pericyter odlades i pericyt-medium i 3 dagar. De differentierades därefter i adipogent medium i 14 dagar. Cellerna fixerades och immunostained med anti-perilipinantikropp följt av Alexa555 åsna anti-kanin antikropp. Immunocytokemi visade att typ I, men inte typ II, perikiter uttryckte adipocytmarkörperilipinen (röd) under ett fluorescerande mikroskop (exciteringslaser: 543 nm, exciterings- och emissionsfilter: 540/45 nm och 600/50 nm, respekt ively). Skala bar = 50 μm Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4 : Myogen differentiering av sorterade typ I och typ II pericyter. Sorterade typ I och typ II pericyter odlades i pericyt-medium i 3 dagar och differentierades sedan i myogent medium i 14 dagar. Cellerna fixerades och immunostained med anti-S-myosinantikropp och Alexa555 åsna anti-mus antikropp. Immunocytokemi visade att typ II, men inte typ I, perikter uttryckte den mogna myotube / myofibermarkören S-myosin (röd) under ett fluorescerande mikroskop (exciteringslaser: 543 nm, excitations- och emissionsfiltre: 540/45 nm och 600/50 nm Respektive). Skala bar = 50 μm//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55904/55904fig4large.jpg "target =" _ blank "> Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
| rör | färgning |
| Obestämd kontroll | Singelcellsuspension från vildtypsmus |
| DAPI enfärgskontroll (dödcellsuteslutning) | Singelcellsuspension från vildtypsmus + DAPI (5 | ig / ml) |
| GFP enfärgskontroll | Singelcellsuspension från Nestin-GFP-möss |
| PE enkelfärgskontroll | OneComp eBeads + PDGFRβ-PE antikropp (4 pg / ml) |
| PE-FMO-kontroll | Singelcellsuspension från Nestin-GFP-möss + DAPI (1 μg / ml) |
| Prov | Singelcellsuspension från Nestin-GFP-möss + PDGFRβ-PE-antikropp (4 μg / ml) +DAPI (1 | ig / ml) |
Tabell 1: Färgprotokoll för enkelfärgskontrollerna, PDGFRβ-PE-FMO-kontroll och muskelprov.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Pericyter är multipotenta perivaskulära celler 22 , 23 belägna på den abluminala ytan av kapillärerna 21 , 26 . I skelettmusklerna kan pericyter differentiera längs adipogena och / eller myogena vägarna 19 , 20 , 24 . Tidigare studier avslöjade två subpopulationer av pericytor, med olika marköruttryck och distinkta differentieringspotentialer 19 , 24 , 25 . Typ I (NG2 + Nestin - ) pericytes är adipogena, medan typ II (NG2 + Nestin + ) pericytes är myogena. Isoleringen av dessa subpopulationer för in vitro- studier kräver dubbel-transgen muslinje NG2-DsRed och Nestin-GFP. Beroende på denna reningProtokollet på dubbel-transgena möss begränsar signifikant dess tillämpning och därmed forskning på biologin hos pericyte-subpopulationer.
Denna videoprodukt illustrerar en alternativ metod för isolering av typ I och typ II pericytes från muskelsmuskler. Denna nya metod bygger fortfarande på en FACS-baserad teknik för cellskillnad. I stället för att använda transgen NG2-DsRed-fluorescens, riktar den emellertid den endogena PDGFRβ-signalen. Detta baseras på observationen att NG2-DsRed-uttrycket co-lokaliseras med PDGFRβ i skelettmuskel 19 . Jämfört med den ursprungliga metoden har detta protokoll flera fördelar. För det första behöver den inte den genetiska bakgrunden NG2-DsRed, även om Nestin-GFP-bakgrunden fortfarande behövs. För det andra, i stället för att rikta in NG2, använder detta protokoll PDGFRβ, en välkarakteriserad markör med validerade och kommersiellt tillgängliga antikroppar. För det tredje möjliggör den samtidig isolering av boTyp I och typ II pericytes. Exempelvis demonstrerar PDGFRP-PE + Nestin-GFP- och PDGFRβ-PE + Nestin-GFP + -cellerna som isoleras med detta protokoll tydliga differentieringsegenskaper. Specifikt skiljer sig PDGFRβ-PE + Nestin-GFP- men inte PDGFRβ-PE + Nestin-GFP + celler till adipocyter i adipogent tillstånd, medan PDGFRβ-PE + Nestin-GFP + , men inte PDGFRβ-PE + Nestin-GFP - Celler genomgår myogen differentiering under myogent tillstånd. Dessa data överensstämmer med tidigare rapporter som visar att NG2-DsRed + Nestin-GFP - celler (typ I pericytes) är adipogena och NG2-DsRed + Nestin-GFP + -celler (typ II pericytes) är myogena 19 , 24 , vilket tyder på att isolerad PDGFRβ -PE + Nestin-GFP- och PDGFRβ-PE + NEstin-GFP + -celler är faktiskt typ I respektive typ II pericyter. Tillsammans föreslår dessa resultat att detta nya protokoll möjliggör relativt lätt isolering / rening av pericyte-subpopulationer från muskelskelets muskler och eventuellt andra vävnader. Detta kommer att främja studier om percytbiologi och deras terapeutiska översättning för olika störningar.
Det bör dock noteras att det finns en begränsning av denna metod på grund av användningen PDGFRp. Det har visats i en tidigare studie att PW1 + interstitiella celler (PIC) också uttrycker PDGFRβ 20 . Därför kan isolerade PDGFRβ-PE + Nestin-GFP- och PDGFRβ-PE + Nestin-GFP + -populationer innehålla PICs. Emellertid är dessa PICs bidrag till pericyt differentiering begränsat, eftersom perikterna överstiger PIC i skelettmuskler 20 och den typen av pericytes inte genomgår minOgenesis 19 , 25 .
Med användning av denna metod erhölls typ I och typ II pericyter med utbyten av 9,5% respektive 2,1%. Dessa siffror var jämförbara med de rapporterade utbytena på 2,8% respektive 3,4% i de dubbel-transgena mössen 19 . Den lilla skillnaden kan bero på olika gatingstrategier eller matsprotokoll. Dessa resultat föreslår återigen att det föreslagna protokollet kan användas för att isolera subtyper av pericyt från skelettmuskler.
De kritiska stegen i detta protokoll inkluderar följande punkter: (1) Se till att skelettmusklerna är helt mjuka och kan enkelt passera genom en 10 ml serologisk pipett. Stora muskelblock påverkar enzymatisk uppslutning och minskar avsevärt utbytet. (2) Använd nyframställd kollagenaslösning för muskelmältning och låt mild omrörning (35 varv / min) under inkubation. (3) FörvaraKontroller och prov på is genom färgnings- och sorteringsstegen. (4) Använd FMO-kontrollerna för att ställa in grindgränser.
Förutom differentieringskapacitet visar typ I och typ II pericytor också olika morfologier. Specifikt har typ I pericytor runt cellkroppar, med korta processer och relativt stora kärnor. Typ II-pericytor har däremot vanligtvis småcelliga kroppar, med långa och tunna processer och små kärnor. De morfologiska skillnaderna tyder på att typ I och typ II pericyter är egentligen olika, vilket är förenligt med pericyternas heterogena natur 21 . Vad som orsakar / upprätthåller skillnaden mellan typ I och typ II pericytes, liksom de underliggande molekylära mekanismerna, förblir oklara och kräver ytterligare undersökning. Detta isoleringsprotokoll hjälper till att svara på dessa viktiga frågor.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Alla författare har ingen intressekonflikt att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes delvis av ett fond-A-stipendium från Myotonic Dystrophy Foundation (MDF-FF-2014-0013) och Scientific Development Grant från American Heart Association (16SDG29320001).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell Sorter | Sony | SH800 | |
| Automatic Setup Beads | Sony | LE-B3001 | |
| DMEM | Gibco | 11995 | |
| Avertin | Sigma | T48402 | |
| Pericyte Growth Medium | ScienCell | 1201 | |
| MSC Basal Medium (Mouse) | Stemcell Technologies | 5501 | |
| Adipogenic Stimulatory Supplement (Mouse) | Stemcell Technologies | 5503 | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 16000 | |
| Horse Serum | Sigma | H1270 | |
| Collagenase Type 2 | Worthington | LS004176 | |
| 0.25% Trypsin/EDTA | Gibco | 25200 | |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15140 | |
| PDL | Sigma | P6407 | |
| PDGFRβ-PE Antibody | eBioscience | 12-1402 | |
| Perilipin Antibody | Sigma | P1998 | |
| S-Myosin Antibody | DSHB | MF-20 | |
| Alexa 555-anti-rabbit antibody | ThermoFisher Scientific | A-31572 | |
| Alexa 555-anti-mouse antibody | ThermoFisher Scientific | A-31570 | |
| Mounting Medium with DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | |
| DAPI | ThermoFisher Scientific | D1306 | |
| HEPES | Gibco | 15630 | |
| EDTA | Fisher | BP120 | |
| BSA | Sigma | A2058 | |
| NH4Cl | Fisher Scientific | A661 | |
| KHCO3 | Fisher Scientific | P184 | |
| PBS | Gibco | 14190 | |
| 18 G Needles | BD | 305196 | |
| 10 mL Serological Pipette | BD | 357551 | |
| OneComp eBeads | eBioscience | 01-1111 |
References
- Rennert, R. C., Sorkin, M., Garg, R. K., Gurtner, G. C. Stem cell recruitment after injury: lessons for regenerative medicine. Regenerative medicine. 7 (6), 833-850 (2012).
- Sambasivan, R., et al. Pax7-expressing satellite cells are indispensable for adult skeletal muscle regeneration. Development. 138 (17), 3647-3656 (2011).
- Relaix, F., Zammit, P. S. Satellite cells are essential for skeletal muscle regeneration: the cell on the edge returns centre stage. Development. 139 (16), 2845-2856 (2012).
- von Maltzahn, J., Jones, A. E., Parks, R. J., Rudnicki, M. A. Pax7 is critical for the normal function of satellite cells in adult skeletal muscle. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (41), 16474-16479 (2013).
- Lepper, C., Partridge, T. A., Fan, C. M. An absolute requirement for Pax7-positive satellite cells in acute injury-induced skeletal muscle regeneration. Development. 138 (17), 3639-3646 (2011).
- Kuang, S., Charge, S. B., Seale, P., Huh, M., Rudnicki, M. A. Distinct roles for Pax7 and Pax3 in adult regenerative myogenesis. J Cell Biol. 172 (1), 103-113 (2006).
- Murphy, M. M., Lawson, J. A., Mathew, S. J., Hutcheson, D. A., Kardon, G. Satellite cells, connective tissue fibroblasts and their interactions are crucial for muscle regeneration. Development. 138 (17), 3625-3637 (2011).
- Morgan, J. E., Pagel, C. N., Sherratt, T., Partridge, T. A. Long-term persistence and migration of myogenic cells injected into pre-irradiated muscles of mdx mice. J Neurol Sci. 115 (2), 191-200 (1993).
- Beauchamp, J. R., Morgan, J. E., Pagel, C. N., Partridge, T. A. Dynamics of myoblast transplantation reveal a discrete minority of precursors with stem cell-like properties as the myogenic source. J Cell Biol. 144 (6), 1113-1122 (1999).
- Partridge, T. A. Invited review: myoblast transfer: a possible therapy for inherited myopathies. Muscle Nerve. 14 (3), 197-212 (1991).
- Montarras, D., et al. Direct isolation of satellite cells for skeletal muscle regeneration. Science. 309 (5743), 2064-2067 (2005).
- Asakura, A., Seale, P., Girgis-Gabardo, A., Rudnicki, M. A. Myogenic specification of side population cells in skeletal muscle. J Cell Biol. 159 (1), 123-134 (2002).
- Tamaki, T., et al. Skeletal muscle-derived CD34+/45- and CD34-/45- stem cells are situated hierarchically upstream of Pax7+ cells. Stem Cells Dev. 17 (4), 653-667 (2008).
- Dellavalle, A., et al. Pericytes resident in postnatal skeletal muscle differentiate into muscle fibres and generate satellite cells. Nat Commun. 2, 499 (2011).
- Mitchell, K. J., et al. Identification and characterization of a non-satellite cell muscle resident progenitor during postnatal development. Nat Cell Biol. 12 (3), 257-266 (2010).
- Pannerec, A., Formicola, L., Besson, V., Marazzi, G., Sassoon, D. A. Defining skeletal muscle resident progenitors and their cell fate potentials. Development. 140 (14), 2879-2891 (2013).
- Dellavalle, A., et al. Pericytes of human skeletal muscle are myogenic precursors distinct from satellite cells. Nat Cell Biol. 9 (3), 255-267 (2007).
- Kostallari, E., et al. Pericytes in the myovascular niche promote post-natal myofiber growth and satellite cell quiescence. Development. 142 (7), 1242-1253 (2015).
- Birbrair, A., et al. Role of pericytes in skeletal muscle regeneration and fat accumulation. Stem Cells Dev. 22 (16), 2298-2314 (2013).
- Yao, Y., Norris, E. H., Mason, C. E., Strickland, S. Laminin regulates PDGFRbeta(+) cell stemness and muscle development. Nat Commun. 7, 11415 (2016).
- Armulik, A., Genove, G., Betsholtz, C. Pericytes: developmental, physiological, and pathological perspectives, problems, and promises. Dev Cell. 21 (2), 193-215 (2011).
- Dore-Duffy, P. Pericytes: pluripotent cells of the blood brain barrier. Curr Pharm Des. 14 (16), 1581-1593 (2008).
- Dore-Duffy, P., Katychev, A., Wang, X., Van Buren, E. CNS microvascular pericytes exhibit multipotential stem cell activity. J Cereb Blood Flow Metab. 26 (5), 613-624 (2006).
- Birbrair, A., et al. Skeletal muscle pericyte subtypes differ in their differentiation potential. Stem Cell Res. 10 (1), 67-84 (2013).
- Gautam, J., Nirwane, A., Yao, Y. Laminin differentially regulates the stemness of type I and type II pericytes. Stem Cell Research & Therapy. 8 (1), 28 (2017).
- Birbrair, A., et al. Pericytes: multitasking cells in the regeneration of injured, diseased, and aged skeletal muscle. Front Aging Neurosci. 6, 245 (2014).
