Summary
Dette arbeidet beskriver en FACS-basert protokoll som muliggjør enkel og samtidig isolering av type I og type II perikytter fra skjelettmuskler.
Abstract
Pericytter er perivaskulære multipotente celler som viser heterogenitet i forskjellige organer eller til og med innenfor det samme vevet. I skjelettmuskler, er det minst to pericyte subpopulasjoner (kalt type I og type II), som uttrykker forskjellige molekylære markører og har tydelige differensieringsegenskaper. Ved bruk av NG2-DsRed og Nestin-GFP dobbelt-transgene mus er type I (NG2-DsRed + Nestin-GFP - ) og type II (NG2-DsRed + Nestin-GFP + ) pericytene blitt isolert. Tilstedeværelsen av disse dobbelt-transgene musene hindrer imidlertid utbredt anvendelse av denne rensemetoden. Dette arbeidet beskriver en alternativ protokoll som muliggjør enkel og samtidig isolering av type I og type II perikytter fra skjelettmuskler. Denne protokollen benytter den fluorescensaktiverte cellesorteringsteknikken (FACS) og mål PDGFRβ, i stedet for NG2, sammen med Nestin-GFP-signalet. Etter isolasjon, skriv inn I og tyPe II pericytes viser forskjellige morfologier. I tillegg er type I og type II perikytter isolert med denne nye metoden, som de isolert fra de dobbelt-transgene musene, henholdsvis adipogene og myogene. Disse resultatene antyder at denne protokollen kan brukes til å isolere pericyte subpopulasjoner fra skjelettmuskler og muligens fra andre vev.
Introduction
Muskeldystrofi er en muskel-degenerativ lidelse som ikke har effektive behandlinger så langt. Utviklingen av terapier som fremmer vevregenerering har alltid vært av stor interesse. Vevregenerering og reparasjon etter skade avhenger av hjemmehørende stamceller / stamceller 1 . Satellittceller er forpliktet myogene forløperceller som bidrar til muskelregenerering 2 , 3 , 4 , 5 , 6 , 7 . Deres kliniske bruk hindres imidlertid av deres begrensede migrasjon og lav overlevelsesrate etter injeksjon, samt av deres reduserte differensieringsevne etter in vitro amplifisering 8 , 9 , 10 , 11 . I tillegg til satellittTe-celler, skjelettmuskler inneholder også mange andre cellepopulasjoner med myogen potensial 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , slik som vekselfaktorreseptor-beta (PDGFRβ) -positive interstitiale celler. Det er bevis på at muskelavledede PDGFRβ + -celler er i stand til å skille seg i myogene celler og forbedre muskelpatologi og funksjon 14 , 17 , 18 , 19 , 20 . PDGFRβ overveiende merker pericytter 21 , som er perivaskulære celler med pluripotency 22 , 23 . I tillegg til PDGFRβ brukes mange andre markører, inkludert Neuron-Glial 2 (NG2) og CD146, også tilDentify pericytes 21 . Det skal imidlertid bemerkes at ingen av disse markørene er pericytspesifikke 21 . Nylige studier viste to subtyper av muskelperikytter, kalt type I og type II, som uttrykker forskjellige molekylmarkører og utfører forskjellige funksjoner 19 , 24 , 25 . Biokjemisk er type I perikytter NG2 + Nestin - mens type II perikytter er NG2 + Nestin + 19 , 24 . Funksjonelt, type I pericytes kan gjennomgå adipogen differensiering, bidrar til fettakkumulering og / eller fibrose, mens type II pericytene kan skille seg langs den myogene banen, noe som bidrar til muskelregenerering 19 , 24 , 25 . Disse resultatene viser at: (1) type I pericytes kan bE rettet mot behandling av fettdegenerative forstyrrelser / fibrose, og (2) type II-perikytter har stort terapeutisk potensial for muskeldystrofi. Videre undersøkelse og karakterisering av disse populasjonene krever en isolasjonsprotokoll som muliggjør separasjon av type I og type II perikytter på et høyt renhetsnivå.
For tiden avhenger isolasjonen av pericyte subpopulasjoner på NG2-DsRed og Nestin-GFP dobbelt-transgene mus 19 , 24 . Tilgjengeligheten av NG2-DsRed-mus og kvaliteten på de fleste NG2-antistoffer begrenser den utbredte bruken av denne metoden. Gitt at alle NG2 + pericytes også uttrykker PDGFRβ i skjelettmuskler 19 , 20 , 24 , antar vi at NG2 kan erstattes av PDGFRβ for isolering av pericytter og deres subpopulasjoner. Dette arbeidet beskriver en FACS-basert protokoll somBruker PDGFRβ-farging og Nestin-GFP-signalet. Denne metoden er mindre krevende for etterforskere fordi: (1) den ikke krever NG2-DsRed-bakgrunnen og (2) den bruker kommersielt tilgjengelige PDGFRβ-antistoffer, som er godt karakterisert. I tillegg muliggjør det samtidig isolering av type I og type II perikytter med høy renhet, noe som muliggjør ytterligere undersøkelse av biologiske og terapeutiske potensialet i disse pericyte subpopulasjonene. Etter rensing kan disse cellene dyrkes i kultur, og deres morfologier kan visualiseres. Dette arbeidet viser også at type I og type II perikytter isolert ved bruk av denne metoden, som de som er renset fra dobbelt-transgene mus, er henholdsvis adipogene og myogene.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Wildtype og Nestin-GFP-transgene mus ble plassert i dyreanlegget ved Universitetet i Minnesota. Alle eksperimentelle prosedyrer ble godkjent av Institutional Animal Care and Use Committee ved University of Minnesota og var i samsvar med NIH Guide for pleie og bruk av laboratoriedyr.
1. Muskeldisseksjon og enkelcelleisolasjon
- Euthaniser voksne mus (6-10 uker, både hann og kvinne) med tribrometanol (250 mg / kg, ip) og steriliser abdomeneskinnet med 70% etanol.
MERK: Tribromoetanol ble brukt her i stedet for ketamin for anestesi / eutanasi, da ketamin er kjent for å interagere med NMDA-reseptorene, noe som potensielt kan ha innvirkning på studien. - Plasser musene i den bakre posisjonen og bruk en skalpell for å lage et horisontalt snitt på magesekken. Skal av huden for hånd, trekke i motsatt retning for å avsløre hindlimb musklene.
- CollecT musklene fra begge hindlimbs ved hjelp av pincet og saks. Oppbevar dem i sterilt fosfatbuffert saltvann (PBS) supplert med 1% penicillin-streptomycin (P / S) på is.
- Vask de dissekerte hindlimb musklene i iskall PBS supplert med 1% P / S to ganger og overfør dem til en steril 10 cm plate.
- Oppsøk nøye ut nerver, blodårer og bindevev fra musklene ved hjelp av pincet og saks under et disseksjonsmikroskop ved 2x forstørrelse.
- Finhakk og hakk musklerne i små stykker (1-2 mm 3 ) ved hjelp av sterile saks og kniver. Hvis nødvendig, legg til en liten mengde Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) for å sikre at musklene ikke tørkes ut.
- Mekanisk bryte ned vevet ved pipettering opp og ned gjennom en 10 ml serologisk pipette 10 ganger.
- Tilsett nyopprettet fordøyelsesløsning (DMEM supplert med 0,2% Type 2 kollagenase) til blandingen. Inkuber ved 37 ° C i 2 timer med gentlE agitasjon ved 35 omdreininger / min.
- Triturate ved hjelp av en 18 G nål for å homogenisere blandingen. Sentrifuger deretter ved 500 xg i 5 minutter. Kast supernatanten og resuspender deretter pelleten i 0,25% trypsin / EDTA. Inkuber ved 37 ° C i 10 minutter. Gjenta sentrifugeringstrinnet to ganger.
- Tilsett 10 ml DMEM tilsatt 20% føtalt bovint serum (FBS) til oppløsningen og sentrifuger ved 500 xg i 5 minutter. Kast supernatanten og resuspender pelleten i rød blodcellelysebuffer (155 mM NH 4 Cl, 10 mM KHCO 3 og 0,1 mM EDTA).
- Sentrifuge ved 500 xg i 5 min. Kast supernatanten og resuspender pelleten i sorteringsbufferen (20 mM HEPES, pH 7,0, 1 mM EDTA og 1% BSA i Ca / Mg 2+ -fri PBS, pH 7,0). Filtrer blandingen gjennom en 40 μm cellefilter for å oppnå en enkeltcellesuspensjon.
- Sentrifuge ved 500 xg i 5 min. Kast supernatanten og resuspender pelleten i 1 ml sorteringsbuffer.
- Count theCelle nummer med et hemocytometer og fortynne single-cellesuspensjonen til 5 x 106 / ml i sorteringsbuffer.
2. Cell-farging og sortering
- Forbered kontrollene og prøven som beskrevet i Tabell 1 . Flekk enkeltcellesuspensjonen med de respektive antistoffene på is i 30 minutter, som beskrevet i tabell 1 .
- Sentrifuger ved 500 xg i 5 minutter og vask pelletsene to ganger med sorteringsbufferen.
- Legg til DAPI i enkeltcellede løsninger, som angitt i tabell 1. Bruk 5 μg / mL DAPI (sluttkonsentrasjon) for DAPI-fargekontrollen og 1 μg / mL DAPI for PDGFRβ-PE-FMO kontrollen og prøven. Hold alle rørene på is gjennom hele forsøket.
- Slå på sorteringen og programvaren. Skann og sett inn en 100 μm sorteringsbrikke når du blir bedt om det.
- Utfør det automatiske oppsettet ( dvs. chipjustering, dråpekalibrering, sidestrømskalibrering og sorteringsforsinkelseskalibreringPå) ved å laste inn de automatiske oppsettperlene når du blir bedt om det.
- Når automatisk oppsett er fullført, gå til "Eksperiment" -fanen, klikk på "Ny", og velg "Blank mal" fra "Offentlige maler."
- Under "Måleinnstillinger", skriv inn "DAPI" for "FL1," "Nestin-GFP" for "FL2," og "PDGFRβ" for "FL3." Fjern merket for "FL4" - "FL6".
- Merk av i boksene for å aktivere lasene 405, 488 og 561 og klikk på "Opprett nytt eksperiment."
- Velg "Startkompensasjonsveiviser" og følg "Kompensasjonsveiviser" -programvaren om å sette opp kompensasjonen.
- Legg den ufarvede kontrollen og klikk på "Start". Klikk på "Detektor og Terskelinnstillinger" og juster sensorgjenvinningen av FSC og BSC detektorer for å plassere befolkningen på skalaen.
- annonseBare gevinstnivåene i FL1-FL3 fluorescenskanaler for å plassere negative populasjoner på venstre side av histogrammene. Klikk på "Record" -knappen for å registrere dataene.
- Legg inn enkeltfargekontroller en etter en når du blir bedt om det. Klikk på "Start og Record" for å registrere dataene. Juster portene for de positive populasjonene på histogrammene. Klikk på "Neste".
- Gå til "Calculate Matrix" på "Compensation" -fanen og klikk "Calculate" i "Calculate Compensation Settings" panelet for å utføre kompensasjonen. Klikk på "Fullfør" for å avslutte "Kompensasjonsveiviseren."
- Legg inn PDGFRβ-PE-FMO-kontrollen og klikk på "Start". Tegn en polygonport (Gate A) rundt cellene av interesse under "All Events" -plottet.
- Dobbeltklikk i Gate A for å opprette et barnplott. Endre Y-aksen til DAPI og tegne en polygon gate (Gate B) rundt live (DAPI low ) celler. Dobbeltklikk på iNside Gate B for å lage et barns plot. Bytt X-aksen til FSC-H og Y-aksen til FSC-W og tegne en polygonport (Gate C) rundt singlene for å eliminere dubletter.
- Dobbeltklikk i Gate C for å opprette et barnplott. Endre X-aksen til Nestin-GFP og Y-aksen til PDGFRβ-PE. Klikk på "Record" -knappen for å registrere dataene.
- Legg inn prøven og gjenta trinn 2.11-2.12. Etter opptak, klikk på "Pause" for å bevare prøven.
- Definer gatinggrensene for PDGFRβ + og Nestin-GFP + -celler basert på PDGFRβ-PE-FMO-kontrollen. Tegn porter for PDGFRβ + Nestin-GFP- og PDGFRβ + Nestin-GFP + -populasjonene.
- Under "Sorteringsmetode" velger du "2-veisrør" og tilordner "PDGFRβ + Nestin-GFP" og "PDGFRβ + Nestin-GFP + " -cellene til venstre og høyre samlingsrør, rehenholsvis. Monter sorteringsbufferfylte 15 ml oppsamlingsrør på oppsamlingsstrinnet og klikk på "Load Collection" -knappen ".
- Klikk på "Fortsett" -knappen for å holde prøven i gang. Klikk på "Start Sorter" for å samle PDGFRβ + Nestin-GFP - (type I pericytes) og PDGFRβ + Nestin-GFP + (type II pericytes) celler.
3. Post-sorteringsanalyser
- Sentrifuger de sorterte cellene ved 500 xg i 5 minutter, resuspender pelleten i 1 ml pericyt medium (se Materialetabell ), og telle celletettheten ved hjelp av et hemocytometer.
- Seed type I og type II pericytes på poly-D-lysin (PDL) -belagte deksel på ~ 1 x 10 4 celler / cm 2 . Vokse i pericyte medium i 3 dager ved 37 ° C med 5% CO2.
- På dag 3, undersøk pericyte-morfologien (under fasekontrast) og endogen Nestin-GFP-uttrykk ved hjelp av en fluorescerende mikroOmfang (eksitasjonslaser: 488 nm, eksitasjonsfilter: 470/40 nm og utslippsfilter: 515/30 nm). Ta bilder under et 20X objektiv (0,45 NA).
- Erstatt pericytmediet med adipogen (mus MSC basalt medium + adipogent stimulatorisk supplement) og myogen (DMEM + 2% hesteserum) medium for å initiere adipogen og myogen differensiering, henholdsvis som beskrevet tidligere 20 . Bytt mediet hver 2-3 dager.
- Fiks cellene på dag 17 (14 dager etter adipogen / myogen differensiering) i 4% paraformaldehyd (PFA) i 20 minutter ved romtemperatur.
MERK: Forsiktig, PFA er et kreftfremkallende middel. - Utfør immuncytokjemi mot perilipin (adipocytmarkør) og S-myosin (moden myotube / myofiber-markør), som beskrevet i tidligere publikasjoner 19 , 20 .
- Vask faste celler 3 ganger i PBS i 10 minutter ved romtemperatur.
- Legg til blokkeringsbuffer (PBSSupplert med 5% eselserum, 3% BSA og 0,3% Triton X-100) og inkuberes ved romtemperatur i 1 time.
- Inkuber cellene med anti-perilipin (2 μg / ml) og / eller anti-S-myosin (2 μg / ml) antistoffer ved 4 ° C over natten.
- Vask cellene 3 ganger i PBS i 10 minutter ved romtemperatur.
- Inkubér cellene med Alexa 555 esel anti-kanin (4 μg / ml) og / eller Alexa555 esel anti-mus (4 μg / ml) antistoffer ved romtemperatur i 1 time.
- Vask cellene 3 ganger i PBS i 10 minutter ved romtemperatur.
- Monter immunfargede celler med monteringsmedium som inneholder DAPI (se tabell over materialer). Undersøk perilipin- og S-myosinuttrykk ved hjelp av et fluorescerende mikroskop (eksitasjonslaser: 543 nm, 540/45 nm excitasjon og 600/50 nm-utslipp) og ta bilder under et 40 x objektiv (0,60 NA).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
FACS-parametere, inkludert laserintensitet og kanalkompensasjon, korrigeres basert på resultatene av ubestemt kontroll og fargekontroller. PDGFRβ-PE-FMO-kontrollen brukes til å sette gaten for PDGFRβ-PE + -populasjonen ( figur 1A ). Blant PDGFRβ-PE - cellene er to populasjoner som representerer Nestin-GFP + og Nestin-GFP - celler tydelig skilt ( Figur 1A ). Gatinggrenser for PDGFRβ-PE + Nestin-GFP + og PDGFRβ-PE + Nestin-GFP - populasjonene er satt ut fra gaten for PDGFRβ-PE + og Nestin-GFP + ( Figur 1A ). Disse grensene brukes til å definere og sortere PDGFRβ-PE + Nestin-GFP + (type II pericytes) og PDGFRβ-PE + Nestin-GFP - (type I pericytEs) celler fra prøven ( figur 1B ). Isolert PDGFRβ-PE + Nestin-GFP- og PDGFRβ-PE + Nestin-GFP + -celler utgjør henholdsvis 9,5% og 2,1% av de totale cellene i en-celleløsningen.
FACS-isolerte type I og type II perikytter viser morfologiske forskjeller etter tre dager i kultur. Type I pericytes viser amoeboid morfologi, med runde celler og korte prosesser ( Figur 2 ). Type II pericytes viser imidlertid ramified morfologi, preget av småcellede kropper og lange, tynne prosesser ( Figur 2 ). På denne tiden forbli de fleste type II-pericytene som Nestin-GFP + , mens type I pericytes er Nestin-GFP - ( Figur 2 ).
I tillegg skriver jeg, men ikke type II, pericyTes skiller seg inn i perilipin-uttrykkende adipocytter etter 14 dager i adipogent medium ( figur 3 ). Type II, men ikke type I, perikytter differensierer til S-myosin-uttrykker myotubes etter 14 dager i myogent medium ( Figur 4 ). Disse resultatene tyder sterkt på at type I pericytter er adipogene, mens type II perikytter er myogene.
Figur 1 : Gating grenser og representativ sortering. ( A ) Fluorescerende plot av PDGFRβ-PE-FMO kontrollen, som demonstrerer PDGFRβ-PE + Nestin-GFP- og PDGFRβ-PE + Nestin-GFP + gatinggrensene. ( B ) Representativt fluorescerende tomt av prøven som viser fordelingen av PDGFRβ-PE + Nestin-GFP
Figur 2: Morfologi og Nestin-GFP uttrykk i sorterte type I og type II pericytes. Sorterte type I og type II perikytter ble sådd på dekselplater og dyrket i pericyte medium i 3 dager. Type I pericytes viste runde cellelegemer med korte prosesser og ingen endogent GFP-signal under et fluorescerende mikroskop (exciterings Laser: 488 nm, excitasjons- og utslippsfiltre: henholdsvis 470/40 nm og 515/30 nm). Type II pericytes viste småcellede kropper, med lange og tynne prosesser, og et sterkt endogent GFP-signal under enFluorescerende mikroskop under de samme innstillingene. Skalbjelke = 100 μm Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Adipogen differensiering av sorterte type I og type II pericytter. Sorterte type I og type II perikytter ble dyrket i pericyt medium i 3 dager. De ble deretter differensiert i adipogent medium i 14 dager. Cellene ble fikset og immunostained med anti-perilipin antistoff etterfulgt av Alexa555 esel anti-kanin antistoff. Immunocytokjemi viste at type I, men ikke type II, perikytter uttrykte adipocytmarkørperilipinen (rød) under et fluorescerende mikroskop (eksitasjonslaser: 543 nm, excitasjons- og utslippsfiltre: 540/45 nm og 600/50 nm, respekt ively). Skalbjelke = 50 μm Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4 : Myogen differensiering av sorterte type I og type II pericytter. Sorterte type I og type II perikytter ble dyrket i pericyt medium i 3 dager og ble deretter differensiert i myogent medium i 14 dager. Cellene ble fikset og immunostained med anti-S-myosin antistoff og Alexa555 esel anti-mus antistoff. Immunocytokjemi viste at type II, men ikke type I, perikytter uttrykte den modne myotube / myofiber-markøren S-myosin (rød) under et fluorescerende mikroskop (eksiteringslaser: 543 nm, excitasjons- og utslippsfiltre: 540/45 nm og 600/50 nm , Henholdsvis). Skalbjelke = 50 μm//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55904/55904fig4large.jpg "target =" _ blank "> Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
| rør | farging |
| Ubestemt kontroll | Enkelcellesuspensjon fra wildtype-mus |
| DAPI-fargekontroll (døde celleutestenging) | Enkelcellesuspensjon fra wildtype-mus + DAPI (5 μg / ml) |
| GFP-fargekontroll | Enkelcellesuspensjon fra Nestin-GFP-mus |
| PE-fargekontroll | OneComp eBeads + PDGFRβ-PE antistoff (4 μg / ml) |
| PE-FMO-kontroll | Enkelcellesuspensjon fra Nestin-GFP-mus + DAPI (1 μg / ml) |
| Prøve | Enkelcellesuspensjon fra Nestin-GFP-mus + PDGFRβ-PE antistoff (4 μg / ml) +DAPI (1 μg / ml) |
Tabell 1: Staining protokoll for single-color kontroller, PDGFRβ-PE-FMO kontroll og muskelprøve.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Pericytter er multipotente perivaskulære celler 22 , 23 som er plassert på den abluminale overflate av kapillærene 21 , 26 . I skjelettmuskler er perikytter i stand til å differensiere langs adipogene og / eller myogene veier 19 , 20 , 24 . Nylige studier viste to subpopulasjoner av pericytter, med forskjellig markøruttrykk og forskjellige differensieringspotensialer 19 , 24 , 25 . Type I (NG2 + Nestin - ) pericytter er adipogene, mens type II (NG2 + Nestin + ) pericytter er myogene. Isoleringen av disse subpopulasjonene for in vitro- studier krever NG2-DsRed og Nestin-GFP dobbelt-transgen muselinje. Avhengigheten av denne rensingenProtokollen på dobbelt-transgene mus begrenser sin anvendelse og dermed undersøkelser på biologien til perikittiske subpopulasjoner.
Denne videoartikkelen illustrerer en alternativ metode for isolering av type I og type II perikytter fra muskelskjeletts muskler. Denne nye metoden bygger fortsatt på en FACS-basert teknikk for celleseparering. Imidlertid, i stedet for å benytte transgen NG2-DsRed-fluorescens, målretter den det endogene PDGFRβ-signal. Dette er basert på observasjonen at NG2-DsRed-uttrykk co-lokaliseres med PDGFRβ i skjelettmuskel 19 . Sammenlignet med den opprinnelige metoden har denne protokollen flere fordeler. For det første krever det ikke NG2-DsRed-genetisk bakgrunn, selv om Nestin-GFP-bakgrunnen fortsatt er nødvendig. For det andre, i stedet for å målrette mot NG2, bruker denne protokollen PDGFRβ, en velkarakterisert markør med validerte og kommersielt tilgjengelige antistoffer. For det tredje gjør det mulig for samtidig isolering av boDe type I og type II pericytene. For eksempel demonstrerer PDGFRβ-PE + Nestin-GFP- og PDGFRβ-PE + Nestin-GFP + -celler som er isolert ved hjelp av denne protokollen, tydelige differensieringsegenskaper. Spesifikt differensierer PDGFRβ-PE + Nestin-GFP-, men ikke PDGFRβ-PE + Nestin-GFP + , celler til adipocytter i adipogen tilstand, mens PDGFRβ-PE + Nestin-GFP + , men ikke PDGFRβ-PE + Nestin-GFP - , Celler gjennomgår myogen differensiering under myogen tilstand. Disse dataene stemmer overens med tidligere rapporter som viser at NG2-DsRed + Nestin-GFP - celler (type I pericytes) er adipogene og NG2-DsRed + Nestin-GFP + -celler (type II pericytes) er myogene 19 , 24 , noe som antyder at isolert PDGFRβ -PE + Nestin-GFP- og PDGFRβ-PE + NEstin-GFP + -celler er henholdsvis type I og type II perikytter. Sammen tyder disse resultatene på at denne nye protokollen tillater forholdsvis enkel isolering / rensing av pericyte subpopulasjoner fra muskelskjeletts muskler, og muligens andre vev. Dette vil fremme studier av pericytebiologi og deres terapeutiske oversettelse for ulike lidelser.
Det skal imidlertid bemerkes at det er en begrensning av denne metoden på grunn av bruk PDGFRβ. Det har vist seg i en tidligere studie at PW1 + interstitiale celler (PICs) også uttrykker PDGFRβ 20 . Derfor kan isolerte PDGFRβ-PE + Nestin-GFP- og PDGFRβ-PE + Nestin-GFP + -populasjoner inneholde PICs. Imidlertid er bidraget fra disse PIC'ene til pericyte differensiering begrenset, gitt at perikytene overskrider PICs i skjelettmuskler 20 og den typen jeg pericytter ikke gjennomgår minOgenesis 19 , 25 .
Ved hjelp av denne metoden ble type I og type II perikytter oppnådd ved utbytter på henholdsvis 9,5% og 2,1%. Disse tallene var sammenlignbare med de rapporterte utbyttene på henholdsvis 2,8% og 3,4% i de dobbelt-transgene musene 19 . Den lille forskjellen kan skyldes forskjellige gatingstrategier eller fordøyelsesprotokoller. Disse resultatene foreslår igjen at den foreslåtte protokollen kan brukes til å isolere subtyper av pericytter fra skjelettmuskler.
De kritiske trinnene i denne protokollen inkluderer følgende punkter: (1) Kontroller at skjelettmuskulaturene er fullt hakkede og i stand til å passere enkelt gjennom en 10 ml serologisk pipette. Store muskelblokker forstyrrer enzymatisk fordøyelse og reduserer ytelsen betydelig. (2) Bruk nyopprettet kollagenase løsning for muskel fordøyelse og la mild omrøring (35 omdreininger / min) under inkubasjon. (3) HoldKontroller og prøve på is gjennom farging og sorteringstrinn. (4) Bruk FMO kontroller for å sette opp grenser.
I tillegg til differensieringskapasitet viser type I og type II perikytter også forskjellig morfologi. Spesielt har type I pericytene runde cellekroppar, med korte prosesser og relativt store kjerne. Type II pericytes, derimot, har vanligvis småcellede kropper, med lange og tynne prosesser og små kjerne. De morfologiske forskjellene antyder at type I og type II pericytene er egentlig forskjellige, noe som er i samsvar med den heterogene karakteren av pericytter 21 . Hva som forårsaker / opprettholder forskjellen mellom type I og type II perikytter, samt de underliggende molekylære mekanismer, forblir uklare og krever ytterligere undersøkelse. Denne isolasjonsprotokollen vil bidra til å svare på disse viktige spørsmålene.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Alle forfattere har ingen interessekonflikt til å avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble delvis støttet av et fond-a-stipendiat fra Myotonic Dystrophy Foundation (MDF-FF-2014-0013) og Scientific Development Grant fra American Heart Association (16SDG29320001).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell Sorter | Sony | SH800 | |
| Automatic Setup Beads | Sony | LE-B3001 | |
| DMEM | Gibco | 11995 | |
| Avertin | Sigma | T48402 | |
| Pericyte Growth Medium | ScienCell | 1201 | |
| MSC Basal Medium (Mouse) | Stemcell Technologies | 5501 | |
| Adipogenic Stimulatory Supplement (Mouse) | Stemcell Technologies | 5503 | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 16000 | |
| Horse Serum | Sigma | H1270 | |
| Collagenase Type 2 | Worthington | LS004176 | |
| 0.25% Trypsin/EDTA | Gibco | 25200 | |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15140 | |
| PDL | Sigma | P6407 | |
| PDGFRβ-PE Antibody | eBioscience | 12-1402 | |
| Perilipin Antibody | Sigma | P1998 | |
| S-Myosin Antibody | DSHB | MF-20 | |
| Alexa 555-anti-rabbit antibody | ThermoFisher Scientific | A-31572 | |
| Alexa 555-anti-mouse antibody | ThermoFisher Scientific | A-31570 | |
| Mounting Medium with DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | |
| DAPI | ThermoFisher Scientific | D1306 | |
| HEPES | Gibco | 15630 | |
| EDTA | Fisher | BP120 | |
| BSA | Sigma | A2058 | |
| NH4Cl | Fisher Scientific | A661 | |
| KHCO3 | Fisher Scientific | P184 | |
| PBS | Gibco | 14190 | |
| 18 G Needles | BD | 305196 | |
| 10 mL Serological Pipette | BD | 357551 | |
| OneComp eBeads | eBioscience | 01-1111 |
References
- Rennert, R. C., Sorkin, M., Garg, R. K., Gurtner, G. C. Stem cell recruitment after injury: lessons for regenerative medicine. Regenerative medicine. 7 (6), 833-850 (2012).
- Sambasivan, R., et al. Pax7-expressing satellite cells are indispensable for adult skeletal muscle regeneration. Development. 138 (17), 3647-3656 (2011).
- Relaix, F., Zammit, P. S. Satellite cells are essential for skeletal muscle regeneration: the cell on the edge returns centre stage. Development. 139 (16), 2845-2856 (2012).
- von Maltzahn, J., Jones, A. E., Parks, R. J., Rudnicki, M. A. Pax7 is critical for the normal function of satellite cells in adult skeletal muscle. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (41), 16474-16479 (2013).
- Lepper, C., Partridge, T. A., Fan, C. M. An absolute requirement for Pax7-positive satellite cells in acute injury-induced skeletal muscle regeneration. Development. 138 (17), 3639-3646 (2011).
- Kuang, S., Charge, S. B., Seale, P., Huh, M., Rudnicki, M. A. Distinct roles for Pax7 and Pax3 in adult regenerative myogenesis. J Cell Biol. 172 (1), 103-113 (2006).
- Murphy, M. M., Lawson, J. A., Mathew, S. J., Hutcheson, D. A., Kardon, G. Satellite cells, connective tissue fibroblasts and their interactions are crucial for muscle regeneration. Development. 138 (17), 3625-3637 (2011).
- Morgan, J. E., Pagel, C. N., Sherratt, T., Partridge, T. A. Long-term persistence and migration of myogenic cells injected into pre-irradiated muscles of mdx mice. J Neurol Sci. 115 (2), 191-200 (1993).
- Beauchamp, J. R., Morgan, J. E., Pagel, C. N., Partridge, T. A. Dynamics of myoblast transplantation reveal a discrete minority of precursors with stem cell-like properties as the myogenic source. J Cell Biol. 144 (6), 1113-1122 (1999).
- Partridge, T. A. Invited review: myoblast transfer: a possible therapy for inherited myopathies. Muscle Nerve. 14 (3), 197-212 (1991).
- Montarras, D., et al. Direct isolation of satellite cells for skeletal muscle regeneration. Science. 309 (5743), 2064-2067 (2005).
- Asakura, A., Seale, P., Girgis-Gabardo, A., Rudnicki, M. A. Myogenic specification of side population cells in skeletal muscle. J Cell Biol. 159 (1), 123-134 (2002).
- Tamaki, T., et al. Skeletal muscle-derived CD34+/45- and CD34-/45- stem cells are situated hierarchically upstream of Pax7+ cells. Stem Cells Dev. 17 (4), 653-667 (2008).
- Dellavalle, A., et al. Pericytes resident in postnatal skeletal muscle differentiate into muscle fibres and generate satellite cells. Nat Commun. 2, 499 (2011).
- Mitchell, K. J., et al. Identification and characterization of a non-satellite cell muscle resident progenitor during postnatal development. Nat Cell Biol. 12 (3), 257-266 (2010).
- Pannerec, A., Formicola, L., Besson, V., Marazzi, G., Sassoon, D. A. Defining skeletal muscle resident progenitors and their cell fate potentials. Development. 140 (14), 2879-2891 (2013).
- Dellavalle, A., et al. Pericytes of human skeletal muscle are myogenic precursors distinct from satellite cells. Nat Cell Biol. 9 (3), 255-267 (2007).
- Kostallari, E., et al. Pericytes in the myovascular niche promote post-natal myofiber growth and satellite cell quiescence. Development. 142 (7), 1242-1253 (2015).
- Birbrair, A., et al. Role of pericytes in skeletal muscle regeneration and fat accumulation. Stem Cells Dev. 22 (16), 2298-2314 (2013).
- Yao, Y., Norris, E. H., Mason, C. E., Strickland, S. Laminin regulates PDGFRbeta(+) cell stemness and muscle development. Nat Commun. 7, 11415 (2016).
- Armulik, A., Genove, G., Betsholtz, C. Pericytes: developmental, physiological, and pathological perspectives, problems, and promises. Dev Cell. 21 (2), 193-215 (2011).
- Dore-Duffy, P. Pericytes: pluripotent cells of the blood brain barrier. Curr Pharm Des. 14 (16), 1581-1593 (2008).
- Dore-Duffy, P., Katychev, A., Wang, X., Van Buren, E. CNS microvascular pericytes exhibit multipotential stem cell activity. J Cereb Blood Flow Metab. 26 (5), 613-624 (2006).
- Birbrair, A., et al. Skeletal muscle pericyte subtypes differ in their differentiation potential. Stem Cell Res. 10 (1), 67-84 (2013).
- Gautam, J., Nirwane, A., Yao, Y. Laminin differentially regulates the stemness of type I and type II pericytes. Stem Cell Research & Therapy. 8 (1), 28 (2017).
- Birbrair, A., et al. Pericytes: multitasking cells in the regeneration of injured, diseased, and aged skeletal muscle. Front Aging Neurosci. 6, 245 (2014).
