Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

Bioengineering av humaniserade benmärgsmiljöer i mus och deras visualisering genom Live Imaging

Published: August 1, 2017 doi: 10.3791/55914
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1, 1
1Haematopoietic Stem Cell Laboratory, The Francis Crick Institute
* These authors contributed equally

Summary

En metod för att skapa och levande bild olika humaniserade benmärgsnischer i möss presenteras. Baserat på den stödjande nischen som skapas av humana mesenkymceller inducerar tillsättningen av humana endotelceller bildandet av humana kärl, medan tillsatsen av rhBMP-2 inducerar bildningen av human-mus-chimär mogen benvävnad.

Abstract

Humana hematopoetiska stamceller (HSCs) ligger i benmärgs (BM) nischen, ett invecklat multifaktoriellt nätverk av komponenter som producerar cytokiner, tillväxtfaktorer och extracellulär matris. HSCs förmåga att förbli vilande, självförnya eller differentiera och förvärva mutationer och bli maligna beror på de komplexa interaktioner som de etablerar med olika stromkomponenter. För att observera överensstämmelsen mellan humana HSC och den humana BM-nischen i fysiologiska och patologiska förhållanden, utformade vi ett protokoll för ektopisk modell och bildar en humaniserad BM-nisch i immunofrekventa möss. Vi visar att användningen av olika cellulära komponenter möjliggör bildandet av humaniserade strukturer och möjligheten att bibehålla långvarig humant hematopoietisk engraftment. Med hjälp av tvåfotonmikroskopi kan vi levande bilda dessa strukturer in situ vid encellsupplösningen, vilket ger ett kraftfullt nytt verktyg för den funktionella karakteriseringen av humant BM mMikromiljö och dess roll vid reglering av normal och malign hematopoiesis.

Introduction

Cellbeslutsbeslut som observeras i stamcellerna regleras tätt av både inneboende och extrinsiska faktorer. I synnerhet är det nu allmänt erkänt att BM-mikromiljön spelar en grundläggande roll vid styrning av omkopplaren i HSCs från en vila till ett aktivt tillstånd, såväl som i deras självförnyelse eller differentierings ödet 1 . Vidare visar nya fynd att hematologiska maligniteter påverkar BM-mikromiljöns funktion, vilket pekar på förekomsten av aktiv korsning mellan de två facken 2 , 3 , 4 , 5 , 6 . Trots de senaste framstegen kvarstår många viktiga frågor om hur aktiviteten av specifika BM-nischkomponenter bidrar till HSC-beteende och malign transformation.

BM mikromiljö är en mycket heterogent Enous och komplex blandning av många olika celltyper, var och en med specialiserade funktioner. Den rikliga endoteliala (EC) och vaskulära komponenten reglerar omsättning av näringsämnen och metaboliter, ingressen och utgången från olika celler till och från BM och flera HSC-funktioner 7 , 8 . Mesenkymala stromceller (MSC), en heterogen population av odifferentierade stamceller och föregångare begåtta genom tre olika linjer ( dvs osteogen, kondrogent, adipogen) är en annan grundläggande del av BM-nischen. Dessa MSC lokaliserar både i centrala områden av BM och i närheten av endosteal regionen. De kan vara associerade med vaskulära strukturer och är inblandade i regleringen av HSC-funktionen 9 , 10 , 11 , 12 , 13 ,"> 14 , 15 .

Många rapporter tyder på att HSCs bor i olika definierade platser inom margen och att deras funktion kan bero på deras exakta lokalisering. De flesta av den nuvarande kunskapen om HSCs och deras interaktion med BM mikromiljö härrör från murina studier 1 . Användningen av xenograftmodeller har utökat denna kunskap till humana normala och maligna HSCs, engrafting inom murin BM av immunbristande möss 16 , 17 , 18 , 19 , 20 . Även om detta representerar en giltig modell, presenterar den fortfarande många utmaningar, såsom behovet att betinga mottagarmusen i de flesta fall för att tillåta humant HSC-homing och engraftment eller cross-species barriären och dess dåligt förstådda inflytande på cell-cell-interaktioner och funktioner.

Användningen av neutraliserande antikroppar och genetiskt modifierade möss, tillsammans med xenotransplantation, har bidragit till att markera den komplexa dialog som mänskliga HSCs etablerar med sina mikroenheter. Introduktionen och utvecklingen av intravital två-foton-konfokalmikroskopi har flyttat dessa studier ett steg framåt, vilket möjliggör direkt, högupplösning och dynamisk bildbehandling av benmärgen 19 , 20 , 21 , 22 och ger ett kraftfullt verktyg för funktionell Karakterisering av BM mikromiljö och dess roll vid reglering av HSC-funktionen. För att kringgå några av de problem som uppstår i klassiska xenotransplantationsmodeller har begreppet teknik en humaniserad BM-struktur tagits fram. Sammanslagning av biomaterial och cellimplantationskoncept, rapporter har visat möjligheten att efterlikna humant benmPilmikromiljö i heterotopområdena 23 , 24 , 25 , 26 , 27 . Detta öppnar möjligheten att använda bioengineering i musmodeller för att studera human normal och malign hematopoiesis 28 , 29 , 30 , 31 , 32 , 33 , 34 , 35 , 36 , 37 , 38 , 39 , tumörgenes och metastaser 40 , 41 , 42 , 43, 44.

Baserat på tidigare erfarenhet av benvävnadsteknik och in vivo- bildbehandling 19 , 22 , 45 , 46 , 47 , 48 , 49 , 50 , 51 , 52 beskriver vi ett protokoll till bioengineer och levande bildorganotiska humana BM-vävnader. Dessa strukturer härrör från implanteringen av humana BM-härledda stromaceller till kollagenbaserade ställningar subkutant ympade i immunbristande möss. I en tidigare rapport visade vi att mänskliga MSC säkerställer bildandet av en human mikromiljö som är tillräcklig för engraftment av humana hematopoetiska celler 45 . Dessutom beskriver vi hur samimplantationen av andra humana BM-cellkomponenterS, såsom humana endotelceller (hEC) och / eller cytokiner som är viktiga för benbildning ( t.ex. hBMP2), samarbetar med hMSCs för att generera olika humaniserade mikromiljöer, som kan vara levande avbildade in situ .

Protocol

Alla djurförsök utfördes under PPL 70/8904, godkänd av Storbritanniens hemkontor och i enlighet med Cancer Research UK-riktlinjer. Användningen av humant navelsträngsblod (UCB) och primära humant akut myeloid leukemi (AML) -prover godkändes av den etiska kommittén för östra London efter godkännande och genomfördes i enlighet med Helsingfors deklaration.

1. Bioengineering-kollagenbaserade byggnadsställningar med humana hematopoietiska och stromala celler

OBS: Hela protokollet ska utföras i sterila förhållanden och med sterilt material. Cellodlingsmedium 1 motsvarar hMSC-medium (MEM-a, P / S och 10% hMSC-FBS); Cellodlingsmedium 2 motsvarar EC-medium (M199, 20% FBS, P / S, 10 mM HEPES, 50 | ig / ml heparin, 2 mM glutamin och 50 | ig / ml ECGS) och cellodlingsmedium 3 motsvarar hematopoietiskt cellmedium (H5100 Och P / S).

  1. Förbered navelsträngsblod mOnonukleära celler (CB-MNC) eller primära AML (benmärg eller perifera blod-MNC) med användning av en Ficoll-Paque densitetsgradient enligt väl etablerade protokoll 53 .
    1. För AML, tappa T-cellerna med hjälp av OKT.3-antikroppen. Inkubera 4 μg OKT.3 per 1 x 10 6 AML MNCs i 30 minuter vid rumstemperatur innan tvätten av cellerna i PBS. Om så erfordras cryopreserverar MNC: erna i FBS med 10% DMSO vid 2 x 10 ^ celler per ml.
  2. Förbered hMSC (odlingsmedium 1) och EC (odlingsmedium 2) cellkulturer. Placera hMSC-celler (se Materialetabell ) på vanliga cellodlingskolvar i hMSC-medium. Plate ECs (se materialet ) på kollagen 1-belagda ytor i EC-medium.
  3. Vid 85-90% cellsammanflöde avlägsna mediet, tvätta två gånger med PBS, och tillsätt trypsin-EDTA-lösning (20 | il per cm 2).
    1. Efter 5 min, kontrollera att cellerna är fristående. Återställ cellerna genom att späda 1:3 med cellodlingsmedium. Centrifugera vid 300 xg under 5 min och suspendera i motsvarande medium för varje celltyp och räkna cellerna med en Neubauer-kammare.
    2. Använd celler vid 2 x 10 6 - 10 7 celler per ml. Om båda celltyperna behöver användas tillsammans, blanda hMSC- och EC-suspensionerna i ett 1: 1-förhållande.
  4. Överför cellsuspensionen till en insulinspruta.
  5. Med hjälp av en skalpell, skär den inledande ställningen (20 mm x 60 mm x 7 mm) av steriliserad gelatinssvamp ( t.ex. gelfoam) i 24 stycken av liknande storlek (6,6 mm x 7,5 mm x 7 mm, Figur 1A och B ).
  6. Rekonstituera gelatinställningar genom nedsänkning i PBS (5 min).
  7. En efter en sätta försiktigt ställningarna på en steril vävnad för att avlägsna överskott av PBS. Överför byggnadsställen till en brunn i en brunn med 24 brunnar (ultralåg fastsättningsyta) och använd sprutan för att injicera 50 μL innehållande 10 5 - 10 6 celler (hMSC alEn eller i kombination med hEC; Figur 1C ).
  8. Upprepa steg 1.7 med varje byggnadsställning tills alla nödvändiga byggnadsställningar är sådda med stromala celler.
  9. Inkubera i 1 timme i en cellodlings-inkubator (37 ° C och CO 2 5%).
  10. Fyll varje brunn med 3 ml cellodlingsmedium 1 ( Figur 1D ) och returnera byggnadsställena till en cellodlings-inkubator (37 ° C och CO 2 5%) för inkubation över natten. Använd cellodlingsmedium 2 om ECs används i ställningarna.
  11. Tina CB-MNCs och isolera CD34 + -celler från dem efter ett lämpligt CD34 + sektions kit protokoll. Stäng de valda CD34 + -cellerna i medium 3 och räkna dem i en Neubauer-kammare.
    OBS: Här användes celler i en koncentration av 2 x 106 celler per ml.
    1. Om AML-patientavledade primärprover används, tina cellerna, späd dem 1:10 i FBS, centrifugera dem i 5 minuter vid 300Xg, resuspendera cellerna i PBS-2% FBS, tillsätt anti-human CD3-antikropp (2 - 4 μg per 10 6 celler) och inkubera vid rumstemperatur i 30 minuter. Centrifugera i 5 minuter vid 300 xg och resuspendera i hematopoietiskt cellmedium kompletterat med cytokiner (20 ng / ml granulocytkolonistimulerande faktor (G-CSF), 20 ng / ml IL-3 och 20 ng / ml trombopoietin (TPO)) .
  12. Upprepa steg 1,7 - 1,9, men i detta fall frö 1 x 10 5 humana hematopoetiska celler i stället för stromala komponenter, som ovan.
    1. Fyll brunnen med 3 ml cellodlingsmedium 3 ( Figur 1D ) och returnera byggnadsställena till en cellodlingsinkubator (37 ° C och CO 2 5%) för inkubation över natten. Använd en 1: 1-blandning av cellodlingsmedia 2 och 3 Om ECs används i ställningarna.
  13. För endast rekombinanta humant benmorfogenetiska protein-2 (rhBMP-2) bärarställningar, lägg försiktigt byggnadsställena en efter en på en steril vävnad för att avlägsna överskott PBS. Överför byggnadsställen till en brunn i en u-bottenplatta med 96 brunnar ( Figur 1E ) och tillsätt 5 μL rhBMP-2, som täcker stallet noggrant.
    1. Tillsätt 20 μl trombin följt av 20 μl fibrinogen, täcker noga ställningen varje gång ( Figur 1F ). Upprepa proceduren för varje byggnadsställning tills alla nödvändiga byggnadsställningar behandlas och inkubera sedan i 5 - 10 min vid 37 ° C. Kontrollera om koagulering har lyckats bildas.

2. Kirurgisk implantering av bioengineerad byggnadsställningar

OBS! Här användes antingen man eller kvinna, 6- till 12 veckor gamla NSG-möss. Eftersom djuren är immunofrekventa bör alla förfaranden göras under sterila betingelser. Steg 2.10 - 2.13 är relaterade till överlevnadsstrategier och postkirurgisk vård.

  1. 60 - 120 min före operationen, administrera smärtstillande medel (carprofen, 5 mg / kg kroppsvikt / mus) subkutant.
  2. Inducera anestesi i en kammare med 0,5% isofluran och 2 L / min O 2. Möss bör övervakas kontinuerligt under proceduren. Överför djuret till operationsområdet i benäget läge för att få lätt åtkomst till ryggen. Hålla djuret under anestesi med användning av en noskon föra 1,5% isofluran och 2 L / min O 2. Håll musen under anestesi under det kirurgiska förfarandet och kontrollera ofta djurtillståndet.
  3. Medan den är under anestesi, använd ögonhaltig gel i ögon på musen för att förhindra torrhet och håll musen vid 37 ° C.
  4. Rak bort det kirurgiska området på baksidan av musen med hjälp av en elektrisk trimmer. För att sterilisera huden, doppa en bomullsspets i utspädd clorexidin (utspädd 1:10 i PBS) och använd detta tips för att rengöra hudytan. Upprepa denna procedur två gånger.
  5. Använd sterila tångar och en skalpell (eller sax), gör en 0,5 till 0,7 cm främre till bakre hela snittet av huden. Använd pincettinställningarnaUnder subkutan vävnad för att göra en ficka.
  6. Sätt in byggnadsstället subkutant och se till att det är placerat djupt i fickan ( Figur 1G och H ). Stäng snittet med kirurgiskt lim ( Figur 1I och J ).
  7. För behandling av postkirurgisk smärta, administrera subkutant buprenorfin (0,1 mg / kg kroppsvikt).
  8. Under återhämtning placerar djuret på sin sida i en förvärmd bur och övervakar återhämtningen tills normalt beteende observeras.
  9. Späd smärtstillande läkemedel i vatten (carprofen, 0,1 mg / ml vatten) och ge den till djur som dricksvatten i 4 dagar efter operationen.
  10. Kontrollera djuret och såret ofta under 48 timmar efter operationen för möjliga biverkningar.

3. Musbehandlingar, eutanasi och provhämtning för bildbehandling

OBS: Analys av byggnadsställningarna utförs mellan8 och 24 veckor efter implantation.

  1. 60 min före bildbehandling, håll den implanterade musen varm i en värmebox vid 37 ° C och administrera 100 μl humant immunoglobulin intravenöst för att blockera ospecificerade ställen.
  2. 30 min före bildbehandling administrera intravenöst 10 μg (per mus) av specifika antikroppar för att märka cellerna av intresse.
  3. 5 min före bildbehandling administrera intravenöst 15 μl (utspädd i 100 | il PBS) av 655 nm fluorofärmärkt, kärlpoolningsmedel (655-VPA) för att visualisera vaskulära strukturer.
  4. Euthanize musen via cervikal dislokation.
  5. Med en vass sax gör du ett longitudinellt snitt på huden på musens baksida, nära den ursprungliga implantationsplatsen.
  6. Med hjälp av pincett och sax skar du noga av huden från den subkutana facken där ställningen har implanterats.
  7. Håll stället med pincett och försiktigt utplanta det från huden genom att skära det kvarvarande membranet aNd vävnad som omger ställningen med hjälp av sax. Se exempel på byggnadsställningar som ska återvinnas i Figur 2 .
  8. Säkra byggnadsstället med snabbverkande lim på en bildplatta (en 35 mm x 10 mm petriskål) och fyll i saltlösning (PBS) vid rumstemperatur.
  9. För BMP-byggnadsställningar, före fyllning av plattan med PBS, använd en kirurgisk mikrodrill för att tunna benytan under ett mikrokirurgiskt mikroskop. Detta möjliggör fluoroforevisualisering och bildupptagning med hög upplösning. Använd antingen 1,2 eller 1,6 mm burrar, beroende på byggnadsstorleken.
    OBS: Användaren kommer att inse hur mycket som ska borras beroende på benets tjocklek. I allmänhet, eftersom BMP-ställningarna är vaskulära, kommer benet något att ändra färg och bli mer röd när den närmar sig rätt tjocklek för bildbehandling.
  10. Sätt in plattan på scenen av det konfokala mikroskopet.

4. Live-imaging med två-photon Microscopiera

OBS! Vid användning av icke-avkodade detektorer (NDD), använd alltid NDD-reglaget för bildbehandling för att rikta fluorescensen till NDD. Mikroskopkonfigurationen tillhandahålls i figur 3 .

  1. Slå på mikroskopet och datorn, starta programvaran genom att klicka på "Starta system" och gå till "Acquisition" -läget.
  2. Markera rutan "Visa manuella verktyg". I "Laser" -menyn slår du på tvåfotonlasern och låter den värma upp och stabilisera.
  3. I menyn "Imaging Setup" aktiverar du samtidigt "Channel Mode" och "Switch track every Frame." På menyn "Light Path" väljer du "Non Descanned" och "Main Beam Splitter MBS 760+." Markera för att aktivera de fyra NDD: erna och ställ in konfigurationen enligt figur 3 .
    ANMÄRKNING: Med denna konfiguration kan kollagensignalen från benstrukturer (sekOnd harmonisk generation, SHG) samlas vid 380 - 485 nm, FITC-hCD31 + humana endotelceller och AF488-hCD45 + humana hematopoietiska celler vid 500-550 nm och 655-VPA vid 640-690 nm.
  4. I menyn "Kanaler" ställer du in "laservåglängden" till 890 nm och effekten till 50%. Ställ in "Gain (Master)" till 500-600, "Digital Offset" till 0 och "Digital Gain" till 15 för varje kanal. Justera dessa värden när förvärvet har börjat.
  5. I "Acquisition Mode" ställer du in de nödvändiga parametrarna för att få högupplösta bilder utan att skada vävnaden och bleka fluorophorerna. Ställ in skanningsläge till "Frame", "Frame Size" till "x512 y512," Line Step "till 1," Speed ​​"till 9," Averaging Number "till 8," Bit Depth "till" 8 Bit " Läge "till" rad, "" Direction "till" bidirectional "och" Method "till" mean. "
    1. Ställ in "ZoOm "till 1 för den första skanningen av bilden, och öka den om det behövs för att fokusera på specifika områden.
  6. Placera plattan som innehåller byggnadsställningen på mikroskopsteget under 20X, 1.0 NA vattendämpningslinsen och sänk linsen tills den rör saltlösningen. Ställ in linsens fokus på ställningen med hjälp av mikroskopögon, med hjälp av en lampa som ljuskälla.
  7. Aktivera "Z-stack" -menyn, välj funktionen "Första / Senast" och ställ in det önskade intervallet mellan två stycken sekvenser ( t.ex. 2-μm Z-stack). Håll intervallet konstant inom Z-stacken.
  8. Välj "Live" för att bilda en direktsökning av provet och justera "Digital Gain" och "Digital Offset" för optimal exponering. För att visualisera flera kanaler samtidigt, välj "Split" -funktionen.
  9. I "Stage" -menyn, i "Live" -läget, skanna bilden och "Markera" regionerna i interEst (ROI), såsom placeringen av humana hematopoietiska celler och vaskulära strukturer. När genomsökningen av provet är klar flyttar du till det första avkastningen för att starta bildbehandling.
  10. I läget "Live" ställer du upp den övre och nedre delen av 3D Z-stacken kring området av intresse med funktionen "Set first" och "Set last". När du är klar, ställ in mitten, "C." Börja förvärvet av avkastningen med "start experiment" -knappen. Se exempel på bilder i Figur 4 , Figur 5 och Figur 6 .
  11. När förvärvet är klart, spara bilden i den angivna mappen. Flytta till nästa avkastning och upprepa steg 4.10. När försöket är klart, ta bort bildplattan från mikroskopet, ta försiktigt av provet från plattan och rengör eventuellt kvarvarande lim.
  12. Förbered provet för nästa analysteknik.

5. ProvprocessG för histologi och immunförstärkning

OBS: Prover bearbetas enligt protokollet som beskrivs i JoVE generella laboratorietekniker 54 som beskriver provfixering, inbäddning och sektionsprocesser. Benformande prover ska behandlas i 7 dagar i ett EDTA-baserat avkalkningsmedel mellan fixerings- och inbäddningsförfarandena. Blockerings / permeabiliseringslösningen är 10 mM PBS pH 7,4 buffert med 1% Triton X-100, 1% bovint serumalbumin (BSA) och 10% normalt get serum (NGS).

  1. Sätta skivorna i xylen i 10 min), xylen under 5 min, 100% etanol under 5 min, 70% etanol under 5 min, 50% etanol under 5 min, och H 2 O för 5 min.
  2. Överför skivorna till en citratbaserad antigenlösningslösning.
  3. Koka skivorna i 15 minuter och låt dem svalna till rumstemperatur.
  4. Tvätta skivorna i 10 mM PBS pH 7,4 lösning med 1% Triton X-100 (5 min, 3 gånger).
  5. Överför samPles till blockerings / permeabiliseringslösningen och inkubera i 30 min.
  6. Tillsätt primär antikropp utspädd i blockerings / permeabiliseringslösning och inkubera över natten vid 4 ° C.
  7. Tvätta skivorna i 10 mM PBS pH 7,4 lösning med 1% Triton X-100 (5 min, 3 gånger).
  8. Tillsätt sekundär antikropp utspädd i blockerande / permeabiliseringslösning under 1 timme i mörkret vid rumstemperatur.
  9. Tvätta med H 2 O (5 min, 3 gånger).
  10. För att minska bakgrundsfluorescensen, sänk skivorna i Sudan Black arbetslösning i 10 minuter, i mörkret och vid rumstemperatur.
  11. Tvätta skivorna i H 2 O (5 min, 3 gånger).
  12. Montera skivorna med hjälp av fluorescerande monteringsmedium med DAPI (0,5 μg / ml).
  13. Lagra skivorna vid 4 ° C och kontrollera att monteringsmediet är torrt innan du utför fluorescerande avbildning. Se exempel på bilder i Figur 7 .

Representative Results

I figur 1 visas representativa bilder av byggnadscells sådd- och implantationsprocesser. I figur 1C noteras att celler injiceras direkt i ställningen. I Figur 1G noteras att ett snitt görs på musens baksida, där den subkutana fickan skapas och ställningen implanteras. Figur 2 visar grossmorfologin för olika byggnadsställningar implanterade i NSG-möss och hämtas efter 8 veckor. Observera den lätta vaskuläriseringen i hMSC-fröformade byggnadsställningar ( Figur 2A ). Samsedningen av mänskliga EC med hMSC i ställningen möjliggör bildandet av mer relevant vaskulatur i byggnadsställningar ( Figur 2B ). Slutligen inducerar närvaron av rhBMP-2 benbildning. De hämtade byggnadsställningarna är större i detta fall och de utgörs avBenliknande hårdvävnad.

Figur 3 visar konfigurationen av kanalkonfigurationen på mikroskopet för live-imaging med NDD (detaljer i figurlegenden). Figur 4 och Video 1 visar humana hematopoietiska celler i hMSC-belagda byggnadsställningar. Byggnadsställningar eksplanterades 8 veckor efter implantation och efter intravenös inokulering av AF488-hCD45 antikropp och 655-VPA. Denna procedur möjliggör visualisering av implanterade humana hematopoietiska celler och den vaskulära strukturen genom två-foton-konfokalmikroskopi. I detta fall visar bilderna blodkärl (655-VPA) i byggnadsställningar och den långsiktiga engraftmenten av humana hematopoetiska celler (AF488-hCD45) i ställningsparenchymen. Figur 5 och Video 2 motsvarar mänskliga byggnadsställningar utsäde med hEC och hMSCs. 8 veckor efter operationen utplånade byggnadsställningarna efter intravenOus inokulering av FITC-hCD31 antikropp och 655-VPA, och bilder förvärvades med ett två-foton konfokalmikroskop, som nämnts tidigare. Bilder visar deltagandet av hEC i kärlbildning i ställningen, vilket resulterar i en murin-human kimär vaskulatur.

Figur 6A visar representativa data av den metod som användes för att stimulera benbildning i MSC-ställningar. I likhet med tidigare figurer, 8 veckor efter implantation, utfördes intravenös inokulering av 655-VPA, byggnadsställningar hämtades och bilder förvärvades med två-foton konfokalmikroskopi. RhBMP-2-stimulerade byggnadsställningar inducerar bildandet av benvävnad, vilket kan visualiseras på grund av SHG (cyanfärg i bilderna) som tillhandahålls av kalcium i benet. De bildade bilderna visar också bildningen av håligheter och vaskulär endostal vävnad, som mycket liknar BM endosteal vävnaden. I figur 6B Video 3 , hECs co-implanterades med hMSCs. Byggnadsställningar hämtades efter intravenös inokulering av FITC-hCD31-antikropp och 655-VPA, och tvåfoton-konfokala mikroskopiska bilder visar deltagandet av hEC i neovaskularisering i en benformande ställning.

Figur 7 visar representativa bilder av histologi, ett förfarande som utförts för att bekräfta tidigare beskrivna resultat. Immunfluorescerande bilder visar muskärl, hEC, hMSCs och långsiktiga engrafted humana hematopoietiska celler i byggnadsstrukturerna. Byggnadsställningar som hämtats från möss fixerades och användes för immunofluorescens. I rhBMP-2-bärarbenformningsställen ( Figur 7D- F ) noteras morfologin hos vävnaden, som liknar mogen benmärg med fettvävnad. I denna benformande ställning visar vi att hMSCs är fibroblaster, vilket skulle indikera tHatt de bidrar till nybildad vävnad som stromala celler. Vi visar också humant adipocytmarkörsuttryck, vilket skulle indikera att hMSCs också bidrar till bildandet av fettvävnad.

Figur 1
Figur 1. Representativa bilder av cellsåtande och implantationsprocesser. A) Inledande ställning och dess skärmetod med hjälp av en skalpell. B) 24 bitar erhållna från den ursprungliga ställningen. C) Scaffold cell-sådd metod med en spruta. D) Cellsågda byggnadsställningar med odlingsmedium, redo att implanteras. EF) Särskilda steg för benbildande ställningar: E) ställning överförs till en 96-brunn, u-bottenplatta och F) representativ bild av metoden som används för att tillsätta rhBMP2, trombin och fibrinogen till ställningen. GJ) Surgi Cal implantationsförfarande under generell anestesi: G) sår skapat i huden och ställningen implantering, H) implantationsmetod och IJ) sårslutningsförfarande med användning av kirurgiskt lim. Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.

Figur 2
Figur 2. Olika byggnadsställningar som hämtas från möss. Representativa bilder av MSC-byggnadsställningar (vänster), MSC + EC-byggnadsställningar (mitten) och MSC + EC + BMP-byggnadsställningar (höger). Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.

4 / 55914fig3.jpg "/>
Figur 3. Kanalkonfiguration. Mikroskopfilterinställningen visas. A) Det finns fyra NDD-detektormoduler: I den första modulen finns det två filterkubar; Den andra och tredje modulen har en filterkub varje; Och den sista modulen har ingen kub (används inte). Det första fotomultiplikatorröret (PMT) är för fjärrkanalen (640-690 nm), vilket återspeglar de lägre våglängderna; Följande är 380 - 485 nm, 500 - 550 nm och 555 - 625 nm (ordern är alltid från lägre till högre våglängder). B) Fluoroförutsläppen som kan detekteras med ovanstående konfigurationer (färgkodad). Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.

Figur 4
Figur 4. MSC-ställning S tillåta bildandet av en nisch för humana hematopoietiska celler. A) och B) 3D-rekonstruktioner av Z-stackar som tas efter explant efter intravenös ympning med AF488-hCD45 (grön) för att märka humana hematopoetiska celler och 655-VPA (magenta) m för att märka vaskulatur. Skalstänger representerar 20 μm i A och B (övre paneler) och 5 μm i B (nedre paneler). Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.

Video 1
Video 1. MSC-byggnadsställningar tillåter bildandet av en nisch för humana hematopoietiska celler . 3D rekonstruktion av humana hematopoetiska celler (AF488-hCD45) associerad med vaskulaturen (655-VPA) i MSC-ställningen (kollagenstrukturer: SHG, cyan). Varje stapel mäter 140 x 140 μm.Ef = "http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55914/55914video1.mov" target = "_ blank"> Vänligen klicka här för att se den här videon. (Högerklicka för att ladda ner.)

Figur 5
Figur 5. Mänskliga ECs deltar i bildandet av humaniserade fartyg i MSC-byggnadsställningar. 3D rekonstruktion av kärl (655-VPA) kantad av ECs av mänskligt ursprung (FITC-hCD31) i MSC + EC-ställningar. Skalstänger representerar 20 μm. Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.

Video 2
Video 2. Mänskliga ECs deltar i bildandet av humaniserade fartyg i MSC-byggnadsställningar. 3D rekonstruktion av mänskliga ECs (FITC-hCD31) som ligger på va Sculature (655-VPA) i MSC + EC-byggnadsställningar. Varje stapel mäter 240 x 240 μm. Vänligen klicka här för att se den här videon. (Högerklicka för att ladda ner.)

Figur 6
Figur 6. rhBMP-2 bärarställningar har benytor och humaniserad vasculatur som liknar benmärgen. A) 3D-rekonstruktion av MSC + BMP-ställningar som visar bildandet av benstrukturer (SHG-cyan) och vaskulatur (655-VPA). Skala barer representerar 100 μm (vänster), 70 μm (mitten) och 50 μm (höger). B) 3D-rekonstruktion av MSC + EC + BMP-byggnadsställningar som visar humaniserade kärl (655-VPA) fodrade med humana ECs (FITC-hCD31). Skala barer representerar 50 μm (vänster) och 30 μm (mitten och höger).14 / 55914fig6large.jpg "target =" _ blank "> Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.

Video 3
Video 3. rhBMP-2 bärarställningar har benytor och humaniserad vasculatur som liknar benmärgen. 3D rekonstruktion av MSC + VERA + BMP ställning (ben: SHG; kärl: 655-VPA; human EC: FITC-hCD31). Varje stapel mäter 600 x 600 μm. Vänligen klicka här för att se den här videon. (Högerklicka för att ladda ner.)

Figur 7
Figur 7. Representativa bilder av immunfluorescens utförd på fasta ställningar. AF) Immunofluorescensstudier utförda för lokalisering av humana celler implanterade iN byggnadsställningar. AC) Ställen implanterade med hEC, hMSCs och hHSCs. DF) Benformande byggnadsställningar implanterade med hEC, hMSCs och hHSCs. Färgkanalerna är följande: AD) human EC (hCD31) och musaskaskruktur (endomucin, ENDOM), BE) hMSCs (hVimentin, hVIM) och musaskulceller (endomucin, ENDOM), C) humana hematopoietiska celler (hCD45) Och musaskulatur (endomucin, ENDOM) och F) humant adiposdifferentieringsrelaterat protein (hADRP) och musaskulatur (endomucin, ENDOM). Skalstänger representerar 10 | im (A och C), 20 | im (B och E) och 40 (D och F) | im. Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.

Discussion

Betydelse med befintliga metoder:

I detta protokoll beskrev vi en metod för att generera olika humaniserade mikromiljöer i möss och att visualisera sin arkitektur via tvåfotonmikroskopi och histologi. De angivna representativa uppgifterna visar möjligheten av tillvägagångssättet, med användning av olika stromceller för att manipulera humaniserade vävnader. Protokollet har specifika tillämpningar på studien av humana hematopoietiska celler och benmärgs nisch-härledda celler under normala och patologiska förhållanden. Dessa applikationer innefattar studien av klonal evolution, läkemedelsscreening och crosstalk mellan humana HSC och stromala komponenter. I det framväxande området för vävnadsteknik har flera alternativa tillvägagångssätt föreslagits. Tillvägagångssätt för notering innefattar utvecklingen av 3D humaniserade BM-strukturer in vitro 55 , 56 , 57 ,S = "xref"> 58 , 59 , 60 , 61 , 62 , 63 och det ortopotopiska implantatet av humaniserade BM-byggnadsställningar i möss 64 . Vårt tillvägagångssätt har fördelen att kombinera både komplexiteten hos in vivo- systemet med den lättanatomiska tillgängligheten hos det humaniserade vävnadstransplantatet.

Ändringar och felsökning:

En variabelkälla i detta protokoll finns i valet av celler som används för att frösta byggnadsställena. I vårt arbete använde vi BM-härledda hMSCs. Mesenkymceller kan emellertid erhållas från flera vävnader, vilka kan uppvisa särskiljande egenskaper beroende på ursprunget. Därför kan användningen av hMSC som härrör från olika organ beaktas. Emellertid bör deras förmåga att bilda benvävnad in vivo testas före användning i denna pRotokoll. Detta protokoll använder en kommersiellt tillgänglig human endotelcellerkälla ( dvs. E4ORF1-transducerad HUVEC). Nyligen har användningen av organspecifika endotelceller för olika ändamål rapporterats 65 , 66 . Vidare kan användningen av primära hEC härledda från BM representera en intressant förbättring av protokollet. Därför kan användningen av olika källor av endotelceller ge olika in vivo- resultat.

Vi använde NSG-immunkompromitterade mottagande möss för att gynna implantationen av humaniserade byggnadsställningar och för att undvika vävnadsavstötning. Vi utesluter inte möjligheten att använda detta protokoll för att konstruera ektopiska benmärgsvävnader i andra musstammar. I själva verket kan rhBMP-2 inducera benbildning i olika däggdjursmodeller 47 , 48 , 49 , 50 52 . Däremot kan skillnader i cellleabilitet och långtidstransplantation observeras med olika stammar / modeller.

Tidpunkten för byggnadsåterställning kan också vara flexibel, beroende på experimentets slutliga syfte. I det presenterade protokollet återställer vi prover vid 8 - 12 veckor efter implantation för att bedöma långvarig hematopoietisk engraftment. För att studera tidiga steg i den humana BM-nischedningen ( t.ex. osteokondral vävnadsbildning 47 eller vaskulär utveckling) kan olika tidspunkter väljas.

Den levande bildteknik som vi beskrivit i detta protokoll är indikerad för kortvarig bildbehandling av explanter. Användningen av en jämviktad kammare för att upprätthålla fysiologisk temperatur, syrspänning och CO 2 -koncentration bör övervägas vid långvarig avbildning, såsom att studera motilitetsbeteenden.

Kritisk StEps inom protokollet:

Bland de utmaningar som är relaterade till protokollet framhävs de tekniska färdigheter som krävs för några steg. Mesenkymala och endotelceller bör användas vid lågcellspassagerantal; Annars kommer de inte att kunna stödja humant hematopoietisk cell engraftment in vivo eller att delta i de novo vaskulatur och benbildning in vivo . Vi rekommenderar användning av hMSCs och hECs vid passagerna 1 - 5. Förberedelser av städe och cellsåtning kräver grundläggande cellkultur färdigheter och kunskap om egenskaperna hos de specifika celler som används i proceduren. Operationsprotokollet är ganska enkelt men kräver viss övning. Underhåll av en aseptisk miljö för att undvika kontaminering av de implanterade ställningarna i immunoförmögen möss är avgörande för att försökets framgång ska lyckas. Provplanta och levande bildbehandling kräver kirurgisk praxis (speciellt för användning av mikrodrill) och kunskap omMikroskop system. Slutligen kräver provbehandling och histologi grundläggande kunskaper om de tekniker som ska användas.

Begränsningar av tekniken:

Tillvägagångssättet beskriver vi möjliggör visualisering av levande humana hematopoietiska celler som sårar en humaniserad benmärgsmikro-miljö, med mänskliga endotelceller som bildar vaskulära strukturer och mesenkymceller som bildar ben / benmärgsutrymme. När vävnaden bildas in vivo , kommer den slutgiltiga byggnadsställningen fortfarande att vara chimär (human och murin). Denna fråga bör beaktas, eftersom den chimära vävnaden kanske inte fullständigt efterliknar mänsklig benmärgskomplexitet och miljö.

Plåtarna implanterade har en begränsad storlek (vi försökte maximalt 6,6 x 7,5 x 7 mm) och kan därför vara värd för ett begränsat antal celler för xenotransplantation. Det absoluta antalet återvunna celler kommer också att vara begränsat; Således bör antalet implanterade byggnadsställningarBeräknas som en funktion av antalet celler som krävs för experimentet.

Den avbildningsapplikation som vi beskrivit är speciellt användbar för att observera stora områden av levande vävnad vid djup 150-200 um från ytan utan att störa arkitekturen och skada cellerna. Därför tillåter det inte visualisering av hela ställningen. Om en fullständig avsökning av vävnaden är nödvändig skulle vanliga immunofluorescensmetoder vara mer lämpliga.

Framtida applikationer:

Den framtida riktningen för denna biotekniska modell skulle vara att öka komplexiteten hos de humana komponenterna i vävnaden. Kunskapen och karakteriseringen av den mänskliga BM-nischen har utvecklats under de senaste åren 67 och det beskrivna protokollet kan vara en intressant plattform för att studera funktionen hos dessa nya cellulära komponenter och lösliga faktorer, liksom deras roll i att stödja normal / malignAnt HSCs.

Vidare ger bildteknik potentialen för intravital bildbehandling av byggnadsställningarna i longitudinella studier, vilket skulle kräva tekniska förbättringar för att avbilda byggnadsställningarna i levande, bedövade möss med återvinning efter kirurgi. Detta tillvägagångssätt skulle kräva ytterligare steg och undersöks för närvarande i laboratoriet.

Disclosures

Författarna har ingenting att avslöja.

Acknowledgments

Vi tackar personalen i kärnanläggningarna vid Francis Crick Institute (Biologisk Forskningsfacilitet, In Vivo Imaging and Experimental Histopathology) och Yolanda Saavedra-Torres och Mercedes Sanchez-Garzon, veterinärerna vid Crick och LRI, för deras värdefulla hjälp. Vi är tacksamma för Dr. W. Gray för att kritiskt läsa manuskriptet. DP stöddes av ett icke-kliniskt stipendium från EHA. Detta arbete stöddes av The Francis Crick Institute, som mottar sin kärnfinansiering från Cancer Research UK (FC001045), UK Medical Research Council (FC001045) och Welcome Trust (FC001045).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Ficoll-Paque Ge Healthcare 17-1440-03
Cd34 positive selection Kit Stemcell 18056 Store a 4°C.
Magnet Stemcell 18000
Anti-human CD3 antibody, clone OKT-3 Bioxcell BE0001-2 Store at 4°C. Used for T cell depletion in primary AML samples. 
Cytokines (IL3, G-CSF, and TPO) PeproTech 200-03, 300-23 and 300-18 For doing the stock: Dilute each one of the cytokines in 100 μL of water and mix them. Add 200 μL, do alicuots of 45 μL and Store at -20 °C.
DMSO Sigma D4540
FBS Life technologies 10270106 Heat-inactivate at 56 °C during 30 min, do aliquots and freeze down. Warm in 37 °C water bath before use.
MEM-α Invitrogen 32571-028 Store at 4 °C. Warm in 37 °C water bath before use.
Myelocult H5100 corning 5100 Store at 4 °C. Warm in 37 °C water bath before use.
199 Gibco 41150-020 Store at 4 °C. Warm in 37 °C water bath before use.
hMSC-FBS, Heat-inactivated Gibco 12662-029 Store at -20 °C. Warm in 37 °C water bath before use.
P/S Sigma-Aldrich P0781 Store at -20 °C. Warm in 37 °C water bath before use.
ECGS Millipore 02-102 Dilute in culture media and use 0.22 mm filter.
HEPES Sigma-Aldrich S1558-50ML Store at 4 °C.
Heparin Sigma-Aldrich H3149 Store at 4 °C.
Glutamine Gibco 25030 Store at -20 °C.
Collagen 1 coated cell culture plate corning 354505
Trypsin-EDTA solution Thermo-Fisher 25200056 Store at -20 °C. Warm in 37 °C water bath before use.
hMSC Lonza PT-2501 Alternatively, hMSCs we also kindly provided by Dr. Dosquet (University Paris Diderot, Paris) from human bone marrow obtained during orthopaedic surgery under ethical approval 10-038 from IRB00006477. 
VeraVec HUVEC endothelial cells Angiocrine bioscience hVera101 Alternatively, other human endothelial cell source may be used.
Human hematopoietic cells Umbilical Cord blood or primary Acute Myeloid Leukemia (AML) samples were obtained from the Royal London Hospital (London, UK) after informed consent and protocol of use was approved by the East London Ethical Committee and carried out in accordance with the Declaration of Helsinki. 
Gelfoam, Size 12 - 7mm Pfizer 00009-0315-08 Alternative supplier: Febelco
PBS Thermo-Fisher 10010023
Surgical material Multiple Sterile forceps, tweezers and sharp scissors.
Sterile tissues Heat-sterilize paper tissues.
1 mL Syringe with needle of 25G Terumo SS+01H25161
Ultra Low Attachment Multiple Well Plates Corning 3473 or 3471
BMP2 Noricum rhBMP-2 Dilute at 5 mg/mL in acetic acid 50 mM and store at 4 °C.
Thrombin Sigma T8885 Dilute in CaCl2 2%, 500 mL per vial, and store at 4 °C.
Fibrinogen Sigma F3879 Dilute at 4 mg/100 mL in PBS. Store at -20 °C. Warm before use.
Tissue-culture dishes 35 mm x 10 mm Falcon 353001
U-Botton 96 well plate Falcon 353077
NSG mice The Jackson Laboratory 5557 NSG mice were a kind gift from Dr Leonard Shultz (The Jackson Laboratory).
Chlorhexidine G9 Dilute 1:10 before use
Carprofen Pfizer Rimadyl 5 mg/kg of mouse
Buprenorphine Alstoe Vetergesic 0.1 mg/kg of mouse body weight
Isoflurane Abbott B506 Induction of anaesthesia 2%, maintenance 1%
Trimmer Wella Contura HS61
Surgical glue 3M Vetbond
carbomer (polyacrylic acid) as Ophthalmic gel Novartis Viscotears Liquid Gel
Human Normal Immunoglobulin Gammaplex 10g vial 100 mL/mouse intravenously, 30 min before infusion of specific antibody.
NT-QTracker Invitrogen Q21021MP Vessel-pooling agent. Administrate 15 mL/mouse intravenously 5 min before imaging.
AF488-hCD45 Biolegend 304017 100 mL/mouse intravenously, 30 min before imaging.
FITC-hCD31 BD Pharmigen 555445 100 mL/mouse intravenously, 30 min before imaging.
Super glue Loctite Super Glue
Micro-Drill Kit IDEAL - Fisher Scientific NC9010016
Microsurgical microscope No specific brand/company is adviced.
LSM 710 NLO Zeiss Upright confocal microscope with motorized stage, two-photon laser and 20X 1.0 NA water immersion lens. Alternatively, a microscope with similar specifications could be used.
MaiTai “High Performance” fully automated 1-box 517 mode-locked Ti:Sapphire laser with DeepSee dispersion compensation Spectra-Physics
Formalin solution, neutral buffered, 10%  Sigma-Aldrich HT501128
Ethanol Sigma-Aldrich 32294
Osteosoft Millipore 1.01728.1000
Polysine slices Thermo scientific J2800AMNZ
Antigen unmasking solution Vector H-3300 Store at 4 °C. Dilute 1:100 in H2O for working solution.
Triton 100x Sigma-Aldrich T9284
Bovine serum albumin (BSA) Sigma-Aldrich A96470 Store at 4 °C.
Normal Goat serum (NGS) Sigma-Aldrich G9023 Store at 4 °C.
Endomucin Antibody Santa Cruz sc-65495 Store at 4 °C.
hVimentin antibody Santa Cruz sc-6260 Store at 4 °C.
hCD31 antibody DAKO M0823 Store at 4 °C.
hCD45 antibody DAKO M0701 Store at 4 °C.
ADRP (Perilipin2) antibodies-online ABIN283918 Store at 4 °C.
Goat anti mouse secondary antibodies Invitrogen A11029 or A11005 Store at 4 °C.
Goat anti Rabbit secondary antibodies Invitrogen A11037 or A11008 Store at 4 °C.
Goat anti Rat secondary antibodies Invitrogen A11007 or A21247 Store at 4 °C.
Sudan Black Sigma S2380 Prepare a stock of 1% sudan black in ethanol 70%. Store at RT. Prepare working solution of 0.1% sudan black in ethanol 70% and filter using filter-paper before use.
DAPI Sigma D8417 Prepare stock in H20 at 100 mg/mg. Store at 4 °C.
Fluorescent mounting media Dako S3023 Add DAPI before use (1:400 from DAPI stock).
Cover glass VWR 631-0147

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hoggatt, J., Kfoury, Y., Scadden, D. T. Hematopoietic Stem Cell Niche in Health and Disease. Annu Rev Pathol. 11, 555-581 (2016).
  2. Hanoun, M., et al. Acute myelogenous leukemia-induced sympathetic neuropathy promotes malignancy in an altered hematopoietic stem cell niche. Cell Stem Cell. 15 (3), 365-375 (2014).
  3. Frisch, B. J., et al. Functional inhibition of osteoblastic cells in an in vivo mouse model of myeloid leukemia. Blood. 119 (2), 540-550 (2012).
  4. Zhang, B., et al. Altered microenvironmental regulation of leukemic and normal stem cells in chronic myelogenous leukemia. Cancer Cell. 21 (4), 577-592 (2012).
  5. Schepers, K., et al. Myeloproliferative neoplasia remodels the endosteal bone marrow niche into a self-reinforcing leukemic niche. Cell Stem Cell. 13 (3), 285-299 (2013).
  6. Krause, D. S., et al. Differential regulation of myeloid leukemias by the bone marrow microenvironment. Nat Med. 19 (11), 1513-1517 (2013).
  7. Mendez-Ferrer, S., Scadden, D. T., Sanchez-Aguilera, A. Bone marrow stem cells: current and emerging concepts. Ann N Y Acad Sci. 1335, 32-44 (2015).
  8. Boulais, P. E., Frenette, P. S. Making sense of hematopoietic stem cell niches. Blood. 125 (17), 2621-2629 (2015).
  9. Ding, L., Morrison, S. J. Haematopoietic stem cells and early lymphoid progenitors occupy distinct bone marrow niches. Nature. 495 (7440), 231-235 (2013).
  10. Kunisaki, Y., et al. Arteriolar niches maintain haematopoietic stem cell quiescence. Nature. 502 (7473), 637-643 (2013).
  11. Pinho, S., et al. PDGFRalpha and CD51 mark human nestin+ sphere-forming mesenchymal stem cells capable of hematopoietic progenitor cell expansion. J Exp Med. 210 (7), 1351-1367 (2013).
  12. Mizoguchi, T., et al. Osterix marks distinct waves of primitive and definitive stromal progenitors during bone marrow development. Dev Cell. 29 (3), 340-349 (2014).
  13. Zhou, P., Wang, Y., Li, D., Hu, S. Y., Chen, G. H. Therapeutic efficacy of mixed hematopoietic stem cell transplantation for pediatric hematologic diseases. Zhongguo Shi Yan Xue Ye Xue Za Zhi. 22 (2), 434-439 (2014).
  14. Sugiyama, T., Kohara, H., Noda, M., Nagasawa, T. Maintenance of the hematopoietic stem cell pool by CXCL12-CXCR4 chemokine signaling in bone marrow stromal cell niches. Immunity. 25 (6), 977-988 (2006).
  15. Tzeng, Y. S., et al. Loss of Cxcl12/Sdf-1 in adult mice decreases the quiescent state of hematopoietic stem/progenitor cells and alters the pattern of hematopoietic regeneration after myelosuppression. Blood. 117 (2), 429-439 (2011).
  16. Pearce, D. J., et al. AML engraftment in the NOD/SCID assay reflects the outcome of AML: implications for our understanding of the heterogeneity of AML. Blood. 107 (3), 1166-1173 (2006).
  17. Sanchez, P. V., et al. A robust xenotransplantation model for acute myeloid leukemia. Leukemia. 23 (11), 2109-2117 (2009).
  18. Uzan, B., et al. Interleukin-18 produced by bone marrow-derived stromal cells supports T-cell acute leukaemia progression. EMBO Mol Med. 6 (6), 821-834 (2014).
  19. Foster, K., et al. Different Motile Behaviors of Human Hematopoietic Stem versus Progenitor Cells at the Osteoblastic Niche. Stem Cell Reports. 5 (5), 690-701 (2015).
  20. Hawkins, E. D., et al. T-cell acute leukaemia exhibits dynamic interactions with bone marrow microenvironments. Nature. 538 (7626), 518-522 (2016).
  21. Lo Celso, C., et al. Live-animal tracking of individual haematopoietic stem/progenitor cells in their niche. Nature. 457 (7225), 92-96 (2009).
  22. Lassailly, F., Foster, K., Lopez-Onieva, L., Currie, E., Bonnet, D. Multimodal imaging reveals structural and functional heterogeneity in different bone marrow compartments: functional implications on hematopoietic stem cells. Blood. 122 (10), 1730-1740 (2013).
  23. Holzapfel, B. M., Wagner, F., Thibaudeau, L., Levesque, J. P., Hutmacher, D. W. Concise review: humanized models of tumor immunology in the 21st century: convergence of cancer research and tissue engineering. Stem Cells. 33 (6), 1696-1704 (2015).
  24. Scotti, C., et al. Engineering of a functional bone organ through endochondral ossification. Proc Natl Acad Sci USA. 110 (10), 3997-4002 (2013).
  25. Scotti, C., et al. Recapitulation of endochondral bone formation using human adult mesenchymal stem cells as a paradigm for developmental engineering. Proc Natl Acad Sci USA. 107 (16), 7251-7256 (2010).
  26. Kuznetsov, S. A., et al. Single-colony derived strains of human marrow stromal fibroblasts form bone after transplantation in vivo. J Bone Miner Res. 12 (9), 1335-1347 (1997).
  27. Bianco, P., Robey, P. G. Skeletal stem cells. Development. 142 (6), 1023-1027 (2015).
  28. Vaiselbuh, S. R., Edelman, M., Lipton, J. M., Liu, J. M. Ectopic human mesenchymal stem cell-coated scaffolds in NOD/SCID mice: an in vivo model of the leukemia niche. Tissue Eng Part C Methods. 16 (6), 1523-1531 (2010).
  29. Groen, R. W., et al. Reconstructing the human hematopoietic niche in immunodeficient mice: opportunities for studying primary multiple myeloma. Blood. 120 (3), e9-e16 (2012).
  30. Chen, Y., et al. Human extramedullary bone marrow in mice: a novel in vivo model of genetically controlled hematopoietic microenvironment. Blood. 119 (21), 4971-4980 (2012).
  31. Reinisch, A., et al. A humanized bone marrow ossicle xenotransplantation model enables improved engraftment of healthy and leukemic human hematopoietic cells. Nat Med. 22 (7), 812-821 (2016).
  32. Sontakke, P., et al. Modeling BCR-ABL and MLL-AF9 leukemia in a human bone marrow-like scaffold-based xenograft model. Leukemia. 30 (10), 2064-2073 (2016).
  33. Theocharides, A. P., Rongvaux, A., Fritsch, K., Flavell, R. A., Manz, M. G. Humanized hemato-lymphoid system mice. Haematologica. 101 (1), 5-19 (2016).
  34. Antonelli, A., et al. Establishing human leukemia xenograft mouse models by implanting human bone marrow-like scaffold-based niches. Blood. 128 (25), 2949-2959 (2016).
  35. Holzapfel, B. M., et al. Tissue engineered humanized bone supports human hematopoiesis in vivo. Biomaterials. 61, 103-114 (2015).
  36. Reinisch, A., et al. Epigenetic and in vivo comparison of diverse MSC sources reveals an endochondral signature for human hematopoietic niche formation. Blood. 125 (2), 249-260 (2015).
  37. Lee, J., et al. Implantable microenvironments to attract hematopoietic stem/cancer cells. Proc Natl Acad Sci USA. 109 (48), 19638-19643 (2012).
  38. Lee, J., Heckl, D., Parekkadan, B. Multiple genetically engineered humanized microenvironments in a single mouse. Biomater Res. 20 (19), 1-13 (2016).
  39. Ho, M. S., Medcalf, R. L., Livesey, S. A., Traianedes, K. The dynamics of adult haematopoiesis in the bone and bone marrow environment. Br J Haematol. 170 (4), 472-486 (2015).
  40. Bersani, F., et al. Bioengineered implantable scaffolds as a tool to study stromal-derived factors in metastatic cancer models. Cancer Res. 74 (24), 7229-7238 (2014).
  41. Thibaudeau, L., et al. Mimicking breast cancer-induced bone metastasis in vivo: current transplantation models and advanced humanized strategies. Cancer Metastasis Rev. 33 (2-3), 721-735 (2014).
  42. Holzapfel, B. M., et al. Species-specific homing mechanisms of human prostate cancer metastasis in tissue engineered bone. Biomaterials. 35 (13), 4108-4115 (2014).
  43. Thibaudeau, L., Holzapfel, B. M., Hutmacher, D. W. Humanized mice models for primary bone tumor and bone metastasis research. Cell Cycle. 14 (14), 2191-2192 (2015).
  44. Thibaudeau, L., et al. A tissue-engineered humanized xenograft model of human breast cancer metastasis to bone. Dis Model Mech. 7 (2), 299-309 (2014).
  45. Abarrategi, A., Foster, K., Hamilton, A., Mian, S., Passaro, D., Gribben, J., Mufti, G., Bonnet, D. Versatile humanized niche model enables study of normal and malignant human hematopoiesis. J Clin Invest. 127 (2), (2017).
  46. Abarrategi, A., et al. In vivo ectopic implantation model to assess human mesenchymal progenitor cell potential. Stem Cell Rev. 9 (6), 833-846 (2013).
  47. Rubio, R., et al. Bone environment is essential for osteosarcoma development from transformed mesenchymal stem cells. Stem Cells. 32 (5), 1136-1148 (2014).
  48. Abarrategi, A., et al. Multiwall carbon nanotube scaffolds for tissue engineering purposes. Biomaterials. 29 (1), 94-102 (2008).
  49. Abarrategi, A., et al. Gene expression profile on chitosan/rhBMP-2 films: A novel osteoinductive coating for implantable materials. Acta Biomater. 5 (7), 2633-2646 (2009).
  50. Abarrategi, A., et al. Biological properties of solid free form designed ceramic scaffolds with BMP-2: in vitro and in vivo evaluation. PLoS One. 7 (3), e34117 (2012).
  51. Abarrategi, A., et al. Chitosan scaffolds for osteochondral tissue regeneration. J Biomed Mater Res A. 95 (4), 1132-1141 (2010).
  52. Abarrategi, A., et al. Improvement of porous beta-TCP scaffolds with rhBMP-2 chitosan carrier film for bone tissue application. Tissue Eng Part A. 14 (8), 1305-1319 (2008).
  53. Prasain, N., Meador, J. L., Yoder, M. C. Phenotypic and functional characterization of endothelial colony forming cells derived from human umbilical cord blood. J Vis Exp. (62), (2012).
  54. JoVE Science Education Database. General Laboratory Techniques. Histological Sample Preparation for Light Microscopy. J Vis Exp. , (2016).
  55. Hong, J. K., Yun, J., Kim, H., Kwon, S. Three-dimensional culture of mesenchymal stem cells. Tissue Eng Regen Med. 12 (4), 211-221 (2015).
  56. Bara, J. J., et al. Three-dimensional culture and characterization of mononuclear cells from human bone marrow. Cytotherapy. 17 (4), 458-472 (2015).
  57. Dong, H. W., Qin, S., Rafailovich, M., Ma, Y. Developing an Optimal Biofunctional Scaffold for Hematopoietic Stem Cell Quiescent Maintenance and Expansion. N Am J Med Sci. 8 (2), (2015).
  58. Raic, A., Rodling, L., Kalbacher, H., Lee-Thedieck, C. Biomimetic macroporous PEG hydrogels as 3D scaffolds for the multiplication of human hematopoietic stem and progenitor cells. Biomaterials. 35 (3), 929-940 (2014).
  59. Miyoshi, H., Morita, M., Ohshima, N., Sato, C. Expansion of mouse hematopoietic progenitor cells in three-dimensional cocultures on frozen-thawed stromal cell layers formed within porous scaffolds. Exp Hematol. 43 (2), 115-124 (2015).
  60. Cuddihy, M. J., Wang, Y., Machi, C., Bahng, J. H., Kotov, N. A. Replication of bone marrow differentiation niche: comparative evaluation of different three-dimensional matrices. Small. 9 (7), 1008-1015 (2013).
  61. Sharma, M. B., Limaye, L. S., Kale, V. P. Mimicking the functional hematopoietic stem cell niche in vitro: recapitulation of marrow physiology by hydrogel-based three-dimensional cultures of mesenchymal stromal cells. Haematologica. 97 (5), 651-660 (2012).
  62. Leisten, I., et al. 3D co-culture of hematopoietic stem and progenitor cells and mesenchymal stem cells in collagen scaffolds as a model of the hematopoietic niche. Biomaterials. 33 (6), 1736-1747 (2012).
  63. Ferreira, M. S., et al. Cord blood-hematopoietic stem cell expansion in 3D fibrin scaffolds with stromal support. Biomaterials. 33 (29), 6987-6997 (2012).
  64. Baldwin, J. G., et al. Periosteum tissue engineering in an orthotopic in vivo platform. Biomaterials. 121, 193-204 (2017).
  65. Rafii, S., Butler, J. M., Ding, B. S. Angiocrine functions of organ-specific endothelial cells. Nature. 529 (7586), 316-325 (2016).
  66. Seandel, M., et al. Generation of a functional and durable vascular niche by the adenoviral E4ORF1 gene. Proc Natl Acad Sci USA. 105 (49), 19288-19293 (2008).
  67. Medyouf, H. The microenvironment in human myeloid malignancies: emerging concepts and therapeutic implications. Blood. 129 (12), 1617-1626 (2017).

Tags

Utvecklingsbiologi utgåva 126 levande bildbehandling tvåfotonmikroskopi benmärg stroma mikromiljö humaniserad nisch humana hematopoetiska stamceller humant leukemi vaskulatur endotelceller mesenkymala stromceller BMP2
Bioengineering av humaniserade benmärgsmiljöer i mus och deras visualisering genom Live Imaging
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Passaro, D., Abarrategi, A., Foster, … More

Passaro, D., Abarrategi, A., Foster, K., Ariza-McNaughton, L., Bonnet, D. Bioengineering of Humanized Bone Marrow Microenvironments in Mouse and Their Visualization by Live Imaging. J. Vis. Exp. (126), e55914, doi:10.3791/55914 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter