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Developmental Biology

लाइव इमेजिंग द्वारा माउस और उनके विज़ुअलाइज़ेशन में मानवहित अस्थि मरो माइक्रोएवावरमेंट्स बायोइंजिनिअरिंग

Published: August 1, 2017 doi: 10.3791/55914
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1, 1
1Haematopoietic Stem Cell Laboratory, The Francis Crick Institute
* These authors contributed equally

Summary

चूहों में अलग-अलग मानवीय अस्थि-मज्जाओं को बनाने और जीवित-चित्र बनाने की एक विधि प्रस्तुत की गई है। मानव मेसेनकैमिकल कोशिकाओं द्वारा बनाई गई सहायक जगहों के आधार पर, मानव एंडोथेलियल कोशिकाओं के अलावा मानव वाहिकाओं के निर्माण को शामिल किया गया है, जबकि आरएबीएमपी -2 के अलावा मानव-माउस चिमरिक परिपक्व अस्थि ऊतक के गठन को प्रेरित करता है।

Abstract

मानव हेमटोपोएटिक स्टेम कोशिकाएं (एचएससी) अस्थि मज्जा (बी.एम.) आला में रहते हैं, साइटोकिन्स, विकास कारक, और बाह्य मैट्रिक्स बनाने वाले घटकों के एक जटिल, बहुसंख्यक नेटवर्क। एचएससी की स्थिरता, स्व-नवीनीकरण या अंतर, और उत्परिवर्तन प्राप्त करने और घातक होने की क्षमता जटिल स्ट्रोक पर निर्भर करती है जो वे अलग-अलग स्ट्रॉम्मल घटकों के साथ स्थापित करते हैं। मानव एचएससी और शारीरिक और रोग संबंधी स्थितियों में मानव बी.एम. आला के बीच क्रॉसस्टॉक का निरीक्षण करने के लिए, हम एक्टोपिकी मॉडल और छवि को इम्यूनोडिफेसियर चूहों में मानवकृत बीएम की जगह के लिए एक प्रोटोकॉल बनाया है। हम दिखाते हैं कि विभिन्न सेलुलर घटकों के उपयोग से मानवीय संरचनाओं के निर्माण और दीर्घावधि मानव हेमटोपोएटिक एनग्रेमेंटमेंट को बनाए रखने का अवसर प्रदान किया जा सकता है। दो-फोटॉन माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके, हम इन संरचनाओं को एकल-सेल रिजोल्यूशन में स्वस्थानी रूप से लाइव-छवि बना सकते हैं, जिससे मानव बीएम एम के कार्यात्मक लक्षण वर्णन के लिए एक शक्तिशाली नया उपकरण प्रदान किया जा सकता है।आईसीआरओएनएनेयरमेंट और सामान्य और घातक हेमटोपोइजिस को विनियमित करने में इसकी भूमिका।

Introduction

स्टेम सेल डिब्बों में मनाए गए सेल भाग्य के फैसले को दोनों आंतरिक और बाहरी कारकों द्वारा कसकर विनियमित किया जाता है। विशेष रूप से, अब यह व्यापक रूप से मान्यता प्राप्त है कि बी.एम. माइक्रोएन्नेन्मेंट एचएससी में स्विचिंग को एक सक्रिय राज्य से स्विच करने के साथ-साथ अपने आत्म-नवीकरण या भेदभाव के निर्णय के निर्णय 1 में नियंत्रित करने के लिए एक मौलिक भूमिका निभाता है। इसके अलावा, हाल के निष्कर्षों से पता चलता है कि मैमेटोलॉजिकल दुर्दम्य बीएम माइक्रोएनेयरमेंट के कार्य को प्रभावित करते हैं, जो 2 डिवार्टमेंट 2 , 3 , 4 , 5 , 6 के बीच सक्रिय क्रोसस्टॉक के अस्तित्व को इंगित करता है। हालिया प्रगति के बावजूद, कई मुख्य प्रश्न इस बारे में रहते हैं कि कैसे बी.एम. के विशिष्ट घटकों की गतिविधि एचएससी व्यवहार और घातक परिवर्तन में योगदान करती है।

बी.एम. माइक्रोएनेरिवेशन एक बहुत ही प्रभावी है कई अलग-अलग प्रकार के कोशिकाओं के कुरआन और जटिल मिश्रण, विशेष कार्य के साथ प्रत्येक प्रचुर मात्रा में endothelial (ईसी) और संवहनी घटक पोषक तत्व और मेटाबोलाइट का कारोबार, बी.एम. से और विभिन्न कोशिकाओं के प्रवेश और निकास और कई एचएससी कार्यों 7 , 8 को विनियमित करते हैं। Mesenchymal stromal कोशिकाओं (एमएससी), तीन अलग वंश ( यानी, osteogenic, chondrogenic, एक adipogenic) के माध्यम से प्रतिबद्ध undifferentiated स्टेम कोशिकाओं और पूर्वज के एक विषम जनसंख्या, बीएम आला का एक और मौलिक घटक है। ये एमएससी दोनों बी.एम. के केंद्रीय क्षेत्रों में और अंतोस्टेल क्षेत्र की निकटता में स्थानीयकरण करते हैं। वे संवहनी संरचनाओं से संबद्ध हो सकते हैं और एचएससी फंक्शन 9 , 10 , 11 , 12 , 13 ,"> 14 , 15

कई रिपोर्ट बताती हैं कि एचएससी मस्तिष्क में विभिन्न परिभाषित साइटों में रहते हैं और उनका कार्य उनके सटीक स्थानीयकरण पर निर्भर हो सकता है। वर्तमान में एचएससी के बारे में ज्ञान और बीएम माइक्रोएनेन्नेनमेंट के साथ उनकी बातचीत मुरीयन स्टडीज 1 से प्राप्त होती है। एक्सनोग्राफ्ट मॉडलों के उपयोग ने इस ज्ञान को मानव सामान्य और घातक एचएससी के लिए बढ़ाया है , 16 , 17 , 18 , 1 9 , 20 के इम्यूनोडिफीसियर चूहों के मुरीन बीएम के भीतर छिद्रण किया। यद्यपि यह एक मान्य मॉडल का प्रतिनिधित्व करता है, लेकिन यह अभी भी कई चुनौतियों को प्रस्तुत करता है, जैसे कि अधिकांश मामलों में प्राप्तकर्ता माउस की शर्त के लिए मानव एचएससी घरानुक्रम और इंग्रीमेंटमेंट या क्रॉस-प्रजाति बाधा और सेल-सेल इंटरैक्शन पर इसके खराब रूप से प्रभावित प्रभाव और कार्य करता है।

जीनोट्रान्सप्लटेंशन के साथ एंटीबॉडी और आनुवंशिक रूप से संशोधित चूहों को निष्क्रिय करने का उपयोग, जटिल संवाद को उजागर करने में महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है, जो कि मानव एचएससी अपने सूक्ष्म वातावरणों के साथ स्थापित होते हैं। इंट्राविटिकल दो फोटान confocal माइक्रोस्कोपी के परिचय और विकास ने इन अध्ययनों को एक कदम आगे बढ़ाया है, जो हड्डी 1 9 , 20 , 21 , 22 के प्रत्यक्ष, उच्च संकल्प, और गतिशील इमेजिंग की अनुमति देता है और कार्यात्मक के लिए एक शक्तिशाली उपकरण प्रदान करता है बी.एम. microenvironment और एचएससी समारोह को विनियमित करने में इसकी भूमिका के लक्षण वर्णन। क्लासिकल एक्सनोट्रेंसप्लेंटेशन मॉडल में उत्पन्न होने वाली कुछ समस्याओं को दूर करने के लिए, मानविकीकृत बी.एम. संरचना को इंजीनियरिंग की अवधारणा को सामने लाया गया है। बायोमैटिरियल्स और सेल-इम्प्लांटेशन अवधारणाओं को मिलाकर, रिपोर्ट ने मानव हड्डियों की नकल करने की व्यवहार्यता को दिखाया हैहेरोटेपिक क्षेत्रों 23 , 24 , 25 , 26 , 27 में तीर माइक्रोएनेरिनिगरी यह मानव सामान्य और घातक हेमटोपोइजिस 28 , 29 , 30 , 31 , 32 , 33 , 34 , 35 , 36 , 37 , 38 , 3 9 , ट्यूमराइजिनेसिस और मेटास्टेसिस 40 , 41 , 42 का अध्ययन करने के लिए माउस मॉडल में बायोइंजिनियरिंग का उपयोग करने की संभावना को खोलता है। , 43 , 44

हड्डी ऊतक इंजीनियरिंग और विवो इमेजिंग में पिछले अनुभव के आधार पर 1 9 , 22 , 45 , 46 , 47 , 48 , 49 , 50 , 51 , 52 , हम जैवइंजिनियर और लाइव-इमेजटिपाईक मानव बीएम टिशू के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं। इन संरचनाएं मानव बीएम-व्युत्पन्न स्ट्रॉम्मल कोशिकाओं के आरोपण को कोलेजन-आधारित स्कॉफॉल्ड्स से उत्पन्न होती हैं जो थकावट से इम्यूनोडिफेसियर चूहों में जुटाई जाती हैं। पिछली रिपोर्ट में, हमने यह दर्शाया है कि मानव एमएससी द्वारा मानव हेमेटोपोएटिक कोशिकाओं के उत्कर्ष के लिए पर्याप्त मानव माइक्रोएनेरमेंट बनाने का सुनिश्चित किया गया 45 । इसके अलावा, हम यहां बताते हैं कि अन्य मानव बीएम सेलुलर घटक के सह-आरोपण कैसेएस, जैसे कि मानव एन्डोथेलियल कोशिकाएं (एचईसी), और / या हड्डी के गठन के लिए महत्वपूर्ण साइटोकिन्स ( जैसे, एचबीएमपी 2), एचएमएससी के साथ विभिन्न मानवीय माइक्रोएवन वातावरण उत्पन्न करने के लिए सहयोग करते हैं, जो कि सीटू में लाइव-इमेजड हो सकते हैं।

Protocol

यूपी होम ऑफिस द्वारा अनुमोदित पीएपीएल 70/8904 के तहत सभी पशु प्रयोग किए गए और कैंसर रिसर्च यूके के दिशानिर्देशों के अनुसार मानव नाभि गर्भनाल रक्त (यूसीबी) और प्राथमिक मानव तीव्र मैलॉइड ल्यूकेमिया (एएमएल) के नमूनों का उपयोग सहमति प्राप्त करने के बाद ईस्ट लंदन एथिकल कमेटी द्वारा अनुमोदित किया गया था और हेलसिंकी घोषणापत्र के अनुसार किया गया था।

1. बायोइंजिनिअरिंग कोलेजन-आधारित स्कैफोल्ड्स विद हेन हेमटोपोएटिक और स्ट्रोमल सेल

नोट: संपूर्ण प्रोटोकॉल बाँझ शर्तों में और बाँझ सामग्री के साथ किया जाना चाहिए। सेल संस्कृति माध्यम 1 एचएमएससी माध्यम (एमईएम-α, पी / एस, और 10% एचएमएससी-एफबीएस) से मेल खाती है; सेल संस्कृति माध्यम 2 ईसी माध्यम (एम 9 9, 20% एफबीएस, पी / एस, 10 एमएम हेप्स, 50 माइग्राम / एमएल हेपरिन, 2 एमएम ग्लूटामाइन और 50 माइक्रोग्राम / एमएल ईसीजीएस) से मेल खाती है और सेल संस्कृति माध्यम 3 हेमेटोपोएटिक सेल मध्यम (एच 5100 और पी / एस)

  1. नाभि गर्भनाल रक्त मीटर तैयार करेंसुप्रसिद्ध प्रोटोकॉल 53 के अनुसार, एफिकॉएल-पके घनत्व ढाल का उपयोग करते हुए परमाणु कोशिकाओं (सीबी-एमएनसी) या प्राथमिक एएमएल (अस्थि मज्जा या परिधीय रक्त बहुराष्ट्रीय कंपनियों)
    1. एएमएल के लिए, OKT.3 एंटीबॉडी का उपयोग कर टी कोशिकाओं को कम करना। पीबीएस में कोशिकाओं को धोने से पहले कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए प्रति 1 x 10 6 एएमएल बहुराष्ट्रीय कंपनियों के 4 ग्राम OKT.3 सेते हैं। यदि आवश्यक हो, तो एफबीएस में 10% डीएमएसओ के साथ 2 x 10 8 सेल प्रति एमएल पर बहुराष्ट्रीय कंपनियों को क्रियो प्रोसेसर
  2. एचएमएससी (संस्कृति माध्यम 1) और चुनाव आयोग (संस्कृति माध्यम 2) सेल संस्कृतियों को तैयार करें एचएमएससी माध्यम में नियमित सेल संस्कृति फ्लास्क पर प्लेट एचएमएससी कोशिकाओं ( सामग्री की तालिका देखें) ईसी मध्यम में कोलेजन 1-लेपित सतहों पर प्लेट ईसीएस ( सामग्री की सारणी देखें)
  3. 85-90% सेल संगम में मध्यम हटायें, पीबीएस के साथ दो बार धो लें और ट्रिप्सिन-ईडीटीए समाधान (20 μL प्रति सेमी 2 ) जोड़ें।
    1. 5 मिनट के बाद, जांचें कि कोशिकाओं को अलग कर दिया गया है। 1 को पतला करके कोशिकाओं को पुनर्प्राप्त करें:सेल संस्कृति माध्यम के साथ 3 5 मिनट के लिए 300 xg पर अपकेंद्रित्र और प्रत्येक सेल प्रकार के लिए इसी माध्यम में पुनः निलंबन और एक Neubauer चैम्बर का उपयोग कर कोशिकाओं की गणना।
    2. 2 x 10 6 - 10 7 कोशिकाओं प्रति एमएल पर कोशिकाओं का उपयोग करें। यदि दोनों प्रकार की कोशिकाओं को एक साथ उपयोग करने की आवश्यकता है, तो एचएमएससी और ईसी निलंबन को 1: 1 अनुपात में मिलाएं।
  4. इंसुलिन सिरिंज के लिए सेल निलंबन स्थानांतरण।
  5. एक स्केलपेल का इस्तेमाल करते हुए , स्केलाइलेटेड जिलेटिन स्पंज ( जैसे, जिफ़ोम) में समान आकार के 24 टुकड़ों (6 मिमी x 7.5 मिमी x 7 मिमी; चित्रा 1 ए और बी ) में प्रारंभिक पाड़ (20 मिमी x 60 मिमी x 7 मिमी) काट लें।
  6. पीबीएस (5 मिनट) में विसर्जन द्वारा जेलेटिन स्कैफोल्ड का पुनर्निर्माण
  7. एक से एक करके, अतिरिक्त पीबीएस को हटाने के लिए बाँझ ऊतक पर स्कैफोल्ड को धीरे से रखें। एक 24-अच्छी तरह से प्लेट (अल्ट्रा-कम अटैचमेंट की सतह) के एक कुंड में स्कॉफॉल्ड्स को ट्रांसफ़र करें और सिरिंज का उपयोग 50 μL को 10 5 - 10 6 कोशिकाओं (एचएमएससी अलएक या एचईसी के साथ संयोजन; चित्रा 1 सी )
  8. प्रत्येक पाड़ के साथ चरण 1.7 दोहराएं जब तक कि सभी आवश्यक स्कॉफल्ड को स्ट्रॉम्मल कोशिकाओं के साथ वरीयता नहीं दी जाती।
  9. एक सेल संस्कृति इनक्यूबेटर (37 डिग्री सेल्सियस और सीओ 2 5%) के अंदर 1 घंटे के लिए सेते हैं।
  10. सेल संस्कृति माध्यम 1 ( चित्रा 1 डी ) के 3 एमएल के साथ प्रत्येक अच्छी तरह से भरें और रातोंरात ऊष्मायन के लिए एक सेल कल्चर इनक्यूबेटर (37 डिग्री सेल्सियस और सीओ 2 5%) के लिए स्कॉफल्ड को लौटाएं। सेल संस्कृति माध्यम 2 का उपयोग करें यदि ईसीएस स्कॉफॉल्ड में उपयोग किया जाता है।
  11. सीडी-एमएनसी का पिघलना और उपयुक्त सीडी34 + सेक्शन किट प्रोटोकॉल के बाद उनसे सीडी 34 + कोशिकाओं को अलग करना। मध्यम 3 में चयनित सीडी34 + कोशिकाओं को निलंबित करें और उन्हें एक न्यूबॉयर चैंबर में गिनाएं।
    नोट: यहां, कोशिकाओं का उपयोग प्रति मिनट 2 x 10 6 कोशिकाओं की एकाग्रता में किया गया था।
    1. यदि एएमएल रोगी-व्युत्पन्न प्राथमिक नमूनों का उपयोग किया जाता है, तो कोशिकाओं को पिघलना, उन्हें 1:10 एफडीएस में पतला करें, उन्हें 300 से 5 मिनट के लिए अपकेंद्रित करेंएक्सजी, पीबीएस -2% एफबीएस में कोशिकाओं को पुन: resuspend, विरोधी मानव सीडी 3 एंटीबॉडी (2 - 4 μg प्रति 10 6 कोशिकाओं) जोड़ें, और 30 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर सेते हैं साइटोकिन्स (20 एनजी / एमएल ग्रैनलोकिटे-कॉलोनी उत्तेजक कारक (जी-सीएसएफ), 20 एनजी / एमएल आईएल -3 और 20 एनजी / एमएल थ्रोम्बोसोइटिन (टीपीओ) के साथ पूरक हेमटोपोएटिक सेल माध्यम में 5 मिनट पर 300 मिनट में अपकेंद्रित्र और रेसस्पेंड। ।
  12. चरण 1.7 - 1.9 दोहराएं लेकिन इस मामले में ऊपर के रूप में, stromal घटकों के बजाय बीज 1 x 10 5 मानव hematopoietic कोशिकाओं।
    1. सेल संस्कृति माध्यम 3 ( चित्रा 1 डी ) के 3 एमएल के साथ अच्छी तरह से भरें और रातोंरात ऊष्मायन के लिए एक सेल संस्कृति इनक्यूबेटर (37 डिग्री सेल्सियस और सीओ 2 5%) के लिए स्कॉफल्ड को वापस लौटाएं। सेल संस्कृति मीडिया 2 और 3 का 1: 1 मिश्रण का उपयोग करें यदि ईसीएस स्कैफोल्ड में उपयोग किया जाता है।
  13. केवल पुनः संयोजक मानव अस्थि morphogenetic प्रोटीन -2 (आरएबीएमपी -2) वाहक के लिए, धीरे से एक पीढ़ी के ऊतक पर एक के बाद एक अतिरिक्त पी को हटाने के लिए scaffolds डाल दियाबी एस। स्कॉफॉल्ड्स को एक नीचे, 96-अच्छी तरह से प्लेट ( चित्रा 1 ई ) के एक कुएं में स्थानांतरित करें और आरबीएमपी -2 के 5 μL जोड़ें, अच्छी तरह से पाड़ को कवर करें।
    1. 20 μL थ्रोम्बिन जोड़ें, उसके बाद 20 μL फाइब्रिनोजेन, प्रत्येक बार पाड़ को पूरी तरह से कवर करें ( चित्रा 1 एफ )। प्रत्येक पाड़ के लिए प्रक्रिया दोहराएं जब तक कि सभी आवश्यक स्कॉफल्ड का इलाज न किया जाए और फिर 5 से 10 मिनट 37 डिग्री सेल्सियस जांचें कि क्या जमावट सफलतापूर्वक बनाई गई है

2. बायोइन्निजिनियरड स्कॉफॉल्ड्स के सर्जिकल इम्प्लांटेशन

नोट: यहां पुरुष या महिला या तो 6 से 12 सप्ताह के एनएसजी चूहों का उपयोग किया गया था। चूंकि जानवर इम्यूनोडेसिएसिस हैं, सभी प्रक्रियाएं बाँझ शर्तों में होनी चाहिए। चरण 2.10 - 2.13 उत्तरजीविता रणनीति और सर्जिकल देखभाल के बाद संबंधित हैं।

  1. शल्यचिकित्सा से 60 से 120 मिनट, थकावट से दर्द दवा (कारप्रोफेन, 5 मिलीग्राम / किलोग्राम वजन / माउस) को नियंत्रित करते हैं।
  2. 0.5% isoflurane और 2 एल / मिनट ओ 2 के साथ एक कक्ष में संज्ञाहरण प्रेरित करें। प्रक्रिया के दौरान चूहे की निरंतर निगरानी की जानी चाहिए। पीठ को आसानी से पहुंचने के लिए प्रवण स्थिति में शल्य चिकित्सा क्षेत्र में पशु को स्थानांतरित करें। 1.5% आईसोफ्लुरेन और 2 एल / मिनट ओ 2 की आपूर्ति वाली नाक शंकु के उपयोग से जानवर को संज्ञाहरण के तहत रखें। सर्जरी प्रक्रिया के दौरान माउस को संज्ञाहरण के तहत रखें और अक्सर पशु राज्य की जांच करें।
  3. हालांकि यह संज्ञाहरण के तहत है, सूक्ष्मता को रोकने के लिए माउस की आंखों पर नेत्र जेल का उपयोग करें और माउस को 37 डिग्री सेल्सियस पर रखें।
  4. शल्य चिकित्सा क्षेत्र को बिजली के ट्रिमर का उपयोग करके माउस के पीछे दाएं। त्वचा को बाँझने के लिए, पतला क्लोरोक्सिडाइन (पीबीएस में पतला 1:10) में एक सूती टिप डुबकी और त्वचा की सतह को साफ करने के लिए इस टिप का उपयोग करें। इस प्रक्रिया को दो बार दोहराएं।
  5. बाँझ संदंश और एक स्केलपेल (या कैंची) का प्रयोग करना, त्वचा के पूर्व-से-पीछे की पूरी चीरा को 0.5 से 0.7 सेंटीमीटर बनाना। संदंश सम्मिलित करें का उपयोग करेंएक जेब बनाने के लिए चमड़े के नीचे के ऊतकों के नीचे।
  6. स्कॉफॉल्ड थैलेदार ढंग से डालें, यह सुनिश्चित कर लें कि यह जेब ( चित्रा 1 जी और एच ) के भीतर गहराई से रखा गया है। शल्य गोंद ( चित्रा 1I और जे ) के साथ चीरा बंद करें।
  7. सर्जिकल दर्द के बाद इलाज के लिए, बुखारोपण (0.1 मिलीग्राम / किलोग्राम वजन) के नीचे की तरफ प्रशासन करें।
  8. वसूली के दौरान, एक पूर्व-गर्म पिंजरे में जानवर को अपने पक्ष में रखें और वसूली की निगरानी करें जब तक सामान्य व्यवहार मनाया न जाए।
  9. पानी में दर्द दवा (कार्प्रोफेन, 0.1 मिलीग्राम / एमएल पानी) पतला और शल्य चिकित्सा के 4 दिनों के बाद इसे पीने के पानी के रूप में पशुओं को प्रदान करें।
  10. संभावित प्रतिकूल प्रभावों के लिए सर्जरी की अवधि 48-एच के दौरान पशु और घाव को अक्सर जांचें।

3. इमेजिंग के लिए माउस उपचार, ईथनेसिया, और नमूना पुनर्प्राप्ति

नोट: scaffolds के विश्लेषण के बीच किया जाता है8 और 24 सप्ताह बाद के आरोपण

  1. इमेजिंग से पहले 60 मिनट, एक गर्म बॉक्स में 37 डिग्री सेल्सियस पर प्रत्यारोपित माउस को गर्म रखें और अनिर्धारित साइटों को अवरुद्ध करने के लिए 100 इंसुलिन इंसिनोमोलोबुलिन के इंसुलिन से प्रशासन करें।
  2. इमेजिंग से 30 मिनट पहले, ब्याज की कोशिकाओं को लेबल करने के लिए विशिष्ट एंटीबॉडी के 10 माइक्रोग्राम प्रति (प्रति माउस) निदान नहीं करता है।
  3. इमेजिंग से पहले 5 मिनट, 655-एनएम फ्लोरोफोरे-लेबल, पोत-पूलिंग एजेंट (655-वीपीए) के नाड़ी संरचनाओं को देखने के लिए 15 μL (पीबीएस के 100 μL में पतला) निदान नहीं करता है।
  4. ग्रीवा अव्यवस्था के माध्यम से माउस को कुचलना।
  5. तेज कैंची का उपयोग करना, मूल आरोपण स्थल के पास, माउस के पीछे एक अनुदैर्ध्य त्वचा चीरा बनाना।
  6. चिमटी और कैंची की सहायता से, त्वचा को चमड़े के नीचे की जेब से ध्यान से अलग कर दें जहां पाड़ प्रत्यारोपित किया गया है।
  7. चिमटी के साथ पाड़ पकड़ो और धीरे-धीरे अवशिष्ट झिल्ली को काटने के द्वारा त्वचा से इसे खोजेंकैंची का उपयोग करते हुए पाड़ के आसपास के ऊतक ऊतक। चित्रा 2 में वसूल करने के लिए स्कॉफल्ड के उदाहरण देखें
  8. एक इमेजिंग प्लेट (एक 35 मिमी x 10 मिमी पेट्री डिश) में तेजी से अभिनय चिपकने वाला गोंद के साथ पाड़ सुरक्षित करें और कमरे के तापमान पर खारा समाधान (पीबीएस) से भरें।
  9. पीबीएस के साथ थाली को भरने से पहले, बीएमपी स्कॉफॉल्ड्स के लिए, सूक्ष्म खुर्दबीन के नीचे की हड्डी की सतह को पतला करने के लिए सर्जिकल माइक्रोड्रिल का उपयोग करें; यह फ्लोरोफोरे दृश्य और उच्च-रिज़ॉल्यूशन छवि कैप्चर की अनुमति देता है। स्कैफोल्ड के आकार के आधार पर 1.2 या 1.6 मिमी बर्गर्स का उपयोग करें।
    नोट: उपयोगकर्ता को एहसास होगा कि हड्डी की मोटाई के आधार पर ड्रिल कितनी होगी। सामान्य रूप में, बीएमपी स्कॉफल्ड को विस्कुलित किया जाता है, इसलिए इमेजिंग के लिए सही मोटाई के निकट हड्डी थोड़ा रंग बदल जाएगा और लाल बन जाएंगे।
  10. Confocal सूक्ष्मदर्शी के मंच पर प्लेट डालें

4. लाइव-इमेजिंग दो-फोटॉन माइक्रोस्कोप का उपयोग करनाकी प्रतिलिपि बनाएं

नोट: गैर-डिटेक्टर डिटेक्टरों (एनडीडी) का उपयोग करते समय, एनडीडी को प्रतिदीप्ति निर्देशित करने के लिए हमेशा इमेजिंग के लिए एनडीडी स्लाइडर का उपयोग करें। माइक्रोस्कोप कॉन्फ़िगरेशन को चित्र 3 में प्रदान किया गया है।

  1. सूक्ष्मदर्शी और कंप्यूटर पर स्विच करें, "सिस्टम प्रारंभ करें" पर क्लिक करके, "अधिग्रहण" मोड पर जाकर सॉफ़्टवेयर को प्रारंभ करें।
  2. "मैनुअल टूल दिखाएं" बॉक्स को टिकें "लेजर" मेनू में दो फोटॉन लेजर पर "स्विच" स्विच किया जाता है और इसे गर्म और स्थिर करने की अनुमति देती है।
  3. "इमेजिंग सेटअप" मेनू में, साथ ही "चैनल मोड" और "प्रत्येक फ़्रेम पर स्विच करें" को सक्रिय करें। "लाइट पथ" मेनू में, "गैर-डिस्केनटेड" और "मेन बीम स्प्लिटर एमबीएस 760+" का चयन करें। चार एनडीडी को सक्रिय करने के लिए टिक करें और कॉन्फ़िगरेशन सेट करें जैसा कि चित्रा 3 में दिखाया गया है।
    नोट: इस विन्यास के साथ, हड्डी संरचनाओं से कोलेजन सिग्नल (सेकएचडीओ) 380 - 485 एनएम, एफआईटीसी - एचसीडी 31 + मानव एंडोथेलियल कोशिकाओं और एएफए 488 एचसीडी 45 + मानव हेमटोपोएटिक कोशिकाओं में 500-550 एनएम और 640-690 एनएम पर 655-वीपीए पर एकत्र किया गया है।
  4. "चैनल" मेनू में, "लेजर तरंगलांबी" को 890 एनएम और 50% तक की शक्ति में सेट करें। 500-600 तक "लाभ (मास्टर)", 0 से "डिजिटल ऑफसेट" और प्रत्येक चैनल के लिए 15 के लिए "डिजिटल लाभ" सेट करें। अधिग्रहण शुरू होने के बाद इन मानों को समायोजित करें।
  5. "अधिग्रहण विधि" में, उच्च-रिज़ॉल्यूशन की छवियों को प्राप्त करने के लिए ऊतकों को क्षतिग्रस्त किए बिना और फ्लोरोफोर्स को विरंजित करने के लिए आवश्यक पैरामीटर सेट करें। "स्कैन मोड" से "फ़्रेम", "फ्रेम आकार" से "x512 y512", "पंक्ति चरण" से 1, "स्पीड" 9 तक, "औसत संख्या" से 8 तक, "बिट की गहराई" से "8 बिट", " मोड "से" रेखा, "" दिशा "" द्विदिश ", और" विधि "से" मतलब। "
    1. "ज़ो" सेट करेंओम "छवि के शुरुआती स्कैन के लिए 1 के लिए, और इसे बढ़ाने के लिए अगर विशेष क्षेत्रों पर ध्यान केंद्रित करने के लिए आवश्यक है
  6. 20X, 1.0 एनए वाटर-विसर्जन लेंस के तहत खुर्दबीन चरण पर पाड़ युक्त प्लेट रखें और लेंस को कम करें जब तक कि यह खारा समाधान को छू न दे। प्रकाश स्रोत के रूप में दीपक का उपयोग करते हुए, माइक्रोस्कोप ऐपिस का उपयोग करके पाड़ पर लेंस का फ़ोकस सेट करें
  7. "Z- स्टैक" मेनू को सक्रिय करें, "प्रथम / अंतिम" फ़ंक्शन का चयन करें, और दो उप-अनुक्रमिक स्लाइस ( उदाहरण के लिए, 2-माइक्रिया Z- स्टैक) के बीच आवश्यक अंतराल सेट करें। Z- ढेर के भीतर अंतराल स्थिर रखें।
  8. नमूने का लाइव स्कैन करने के लिए "लाइव" का चयन करें और इष्टतम एक्सपोजर के लिए "डिजिटल लाभ" और "डिजिटल ऑफसेट" समायोजित करें। एक ही समय में कई चैनलों को विज़ुअलाइज़ करने के लिए, "स्प्लिट" फ़ंक्शन का चयन करें।
  9. "स्टेज" मेनू में, जबकि "लाइव" मोड में, छवि को स्कैन करें और अंतर के "मार्क" क्षेत्रों को स्कैन करेंएट (आरओआई), जैसे कि मानव हेमेटोपोएटिक कोशिकाओं और संवहनी संरचनाओं का स्थान। जब नमूना का स्कैन पूरा हो जाता है, इमेजिंग शुरू करने के लिए पहले आरओआई पर जाएं
  10. "लाइव" मोड में, "पहले सेट करें" और "अंतिम सेट करें" फ़ंक्शन का उपयोग करके रुचि के क्षेत्र के आस-पास 3D Z- स्टैक के ऊपर और नीचे सेट करें एक बार समाप्त हो जाने पर, केंद्र सेट करें, "सी।" "आरंभ प्रयोग" बटन के साथ आरओआई के अधिग्रहण को प्रारंभ करें चित्रा 4 , चित्रा 5 और चित्र 6 में चित्रों के उदाहरण देखें।
  11. एक बार अधिग्रहण पूर्ण हो जाने पर, छवि को नामित फ़ोल्डर में सहेजें। अगले आरओआई पर जाएं और चरण 4.10 को दोहराएं। एक बार प्रयोग पूरा हो जाने के बाद, माइक्रोस्कोप से इमेजिंग प्लेट को हटा दें, प्लेट से नमूना को ध्यान से अलग करें और किसी भी अवशिष्ट गोंद को साफ करें।
  12. अगले विश्लेषण तकनीक के लिए नमूना तैयार करें।

5. नमूना प्रक्रियाहिस्टोलॉजी और इम्यूनोस्टाईनिंग के लिए जी

नोट: नमूनों का नमूना प्रोटोकॉल के अनुसार जोव सामान्य प्रयोगशाला तकनीक 54 में वर्णित है, नमूना निर्धारण, एम्बेडिंग और सेक्शनिंग प्रक्रियाओं का वर्णन। बोन बनाने के नमूनों का निर्धारण एक EDTA- आधारित decalcifying एजेंट में निर्धारण और एम्बेडिंग प्रक्रियाओं के बीच 7 दिनों के लिए किया जाना चाहिए। अवरुद्ध / परिमेयकरण समाधान 10 मिमी पीबीएस पीएच 7.4 बफर 1% ट्राइटन एक्स -100, 1% गोजातीय सीरम एल्बुमिन (बीएसए) और 10% सामान्य बकरी सीरम (एनजीएस) है।

  1. 10 मिनट के लिए xylene में स्लाइस रखें, 5 मिनट के लिए xylene, 5 मिनट के लिए 100% इथेनॉल, 5 मिनट के लिए 70% इथेनॉल, 5 मिनट के लिए 50% इथेनॉल, और 5 मिनट के लिए एच 2 ओ डाल दें।
  2. स्लाइस को एक साइट्रेट-आधारित एंटीजन के साथ काम करने वाले समाधान के लिए स्थानांतरण करें।
  3. 15 मिनट के लिए स्लाइस उबालें और उन्हें कमरे के तापमान पर ठंडा करने दें
  4. 10 मिमी पीबीएस पीएच 7.4 समाधान में 1% ट्राइटन एक्स -100 (5 मिनट, 3 बार) के साथ स्लाइस धो लें।
  5. सैम स्थानांतरणअवरुद्ध / परिमेयकरण समाधान के लिए ples और 30 मिनट के लिए सेते हैं
  6. अवरोधन / परिमेयकरण समाधान में पतला प्राथमिक एंटीबॉडी जोड़ें और 4 डिग्री सेल्सियस पर रातोंरात सेते रहें
  7. 10 मिमी पीबीएस पीएच 7.4 समाधान में 1% ट्राइटन एक्स -100 (5 मिनट, 3 बार) के साथ स्लाइस धो लें।
  8. अवरुद्ध / परिमेयकरण समाधान में 1 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर अंधेरे में पतला माध्यमिक एंटीबॉडी जोड़ें।
  9. एच 2 ओ (5 मिनट, 3 बार) के साथ धो लें
  10. पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति को कम करने के लिए, सूडान ब्लैक में समाधान 10 मिनट के लिए, अंधेरे में और कमरे के तापमान पर स्लाइस को विसर्जित करें।
  11. एच 2 ओ (5 मिनट, 3 बार) में स्लाइस धो लें
  12. डीएपीआई (0.5 माइक्रोग्राम / एमएल) के साथ फ्लोरोसेंट बढ़ते माध्यम का उपयोग करके स्लाइस माउंट करें।
  13. स्लाइस 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें और देखें कि फ्लोरोसेंट इमेजिंग आयोजित करने से पहले बढ़ते माध्यम सूखी है। चित्र 7 में उदाहरण के चित्र देखें

Representative Results

चित्रा 1 में , पाड़ सेल बीजांकन और आरोपण प्रक्रियाओं की प्रतिनिधि छवियों को दिखाया गया है। चित्रा 1 सी में , ध्यान दें कि कोशिकाओं को सीधे पाड़ में इंजेक्ट किया जाता है। चित्रा 1 जी में , ध्यान दें कि चीरा माउस के पीछे बनाई जाती है, जहां चमड़े के नीचे की जेब बनाई जाती है और पाड़ प्रत्यारोपित होता है। चित्रा 2 चित्रा 2 एनएसजी चूहों में प्रत्यारोपित विभिन्न scaffolds के सकल आकारिकी दिखाता है और 8 सप्ताह के बाद पुनर्प्राप्त। एचएमएससी वरीयता वाले स्कॉफॉल्ड्स ( चित्रा 2 ए ) में मामूली विस्किलीकरण नोट करें। स्कैफोल्ड में एचएमएससी के साथ मानव ईसीएस के सह-बीजांकन, स्कॉफल्ड में अधिक प्रासंगिक वास्कुल निर्माण ( चित्रा 2 बी ) के निर्माण के लिए अनुमति देता है। अंत में, आरबीएमपीपी -2 की उपस्थिति में हड्डी का गठन होता है। इस मामले में पुनर्प्राप्त किए गए स्कैफोल्ड बड़ी हैं, और वे इनके द्वारा गठित हैंकठोर ऊतक जैसी हड्डी

चित्रा 3 एनडीडी के साथ जी-इमेजिंग के लिए माइक्रोस्कोप पर चैनल कॉन्फ़िगरेशन सेटअप को दिखाता है (आकृति कथा में विवरण)। चित्रा 4 और वीडियो 1 एचएमएससी लेपित स्कॉफॉल्ड्स में मानव हेमटोपोएटिक कोशिकाओं को दिखाते हैं। स्कॉफॉल्ड्स के बाद 8 सप्ताह के बाद आरोपण किया गया और एएफए -488-एचसीडी 45 एंटीबॉडी और 655-वीपीए के अंतःशिरा टीकाकरण के बाद। इस प्रक्रिया में प्रत्यारोपित मानव हेमटोटोपेटिक कोशिकाओं के दृश्यांकन और दो फोटॉन confocal माइक्रोस्कोपी द्वारा संवहनी संरचना के लिए अनुमति देता है। इस मामले में, छवियां स्कैफॉल्ड में रक्त वाहिकाओं (655-वीपीए) दिखाती हैं और स्कैफोल्ड पैरेकाइमा में मानव हेमेटोपोइएटिक कोशिकाओं (एएफ 488-एचसीडी 45) के दीर्घकालिक इंजेक्शन को दर्शाती हैं। चित्रा 5 और वीडियो 2 एचईसी और एचएमएससी के साथ वरीयता वाले मानव मचान के अनुरूप है। सर्जरी के 8 सप्ताह बाद, इंट्रावेन के बाद स्कॉफॉल्ड का पता लगाया गया थाएफआईटीसी-एचसीडी 31 एंटीबॉडी और 655-वीपीए के इन्सुलेशन, और इमेज को दो फ़िटेन कन्फोकल माइक्रोस्कोप से अधिग्रहण किया गया था, जैसा कि पहले बताया गया है। छवियां पाबंदी में पोत निर्माण में एचईसी की भागीदारी को दर्शाती हैं, जिसके परिणामस्वरूप मुरुण-मानव चिरागिक vasculature का परिणाम होता है।

चित्रा 6 ए एमएससी स्कैफोल्ड में हड्डी के गठन को प्रोत्साहित करने के लिए इस्तेमाल किए जाने वाले दृष्टिकोण के प्रतिनिधि डेटा को दर्शाता है। इम्प्लांटेशन के 8 सप्ताह के पिछले आंकड़ों के समान, 655-वीपीए के नसों का टीकाकरण किया गया था, स्कॉफल्ड को पुनः प्राप्त किया गया था, और छवियों को दो फोटॉन confocal microscopy के साथ अधिग्रहण किया गया था। आरएबीएमपी -2-उत्तेजित स्कॉफॉल्ड्स हड्डी में कैल्शियम द्वारा प्रदान किए गए एसएचजी (चित्रों में सियान रंग) की वजह से अस्थि ऊतक के गठन को प्रेरित कर सकते हैं। प्रदान की गई छवियों में गुहाओं के निर्माण और विस्कुलरिज्ड एंडोस्टील टिशू भी दिखाए जाते हैं, जो बीएम एंडोस्टील टिशू के समान होते हैं। चित्रा 6 बी में वीडियो 3 , एचईसी को एचएमएससी के साथ सह-प्रत्यारोपित किया गया था। एफआईटीसी-एचसीडी 31 एंटीबॉडी और 655-वीपीए के नसों के निषेचन के बाद, और दो फोटॉन confocal माइक्रोस्कोपी छवियों को एक हड्डी के गठन पाड़ में neovascularization में एचईसी की भागीदारी दिखाते हैं।

चित्रा 7 , हिस्टोलॉजी के प्रतिनिधि चित्र दिखाती है, पहले वर्णित परिणामों की पुष्टि करने के लिए की गई एक प्रक्रिया। इम्यूनोफ्लोरेसेंट इमेज माउस व्हस्क्यूलेचर, एचईसीज़, एचएमएससी, और पाबंदी संरचनाओं में मानव हेमटोपोएटिक कोशिकाओं को दीर्घकालिक रूप से तैयार करते हैं। चूहों से प्राप्त मचान निश्चित थे और इम्यूनोफ्लोरेसेंस के लिए इस्तेमाल किया गया था। आरएबीएमपी -2 के वाहक की हड्डी बनाने वाली स्कॉफॉल्ड्स ( चित्रा 7 डी- एफ ) में, ऊतक के आकारिकी को नोट करें, वसा ऊतक के साथ परिपक्व अस्थि मज्जा जैसा दिखता है। इस हड्डी के गठन पाड़ में, हम दिखाते हैं कि एचएमएससी फाइब्रोब्लास्ट हैं, जो कि टीटोपी वे stromal कोशिकाओं के रूप में नवगठित ऊतक में योगदान। हम मानव एडिपोसाइट मार्कर अभिव्यक्ति भी दिखाते हैं, जो यह संकेत देगा कि एचएमएससी भी वसा ऊतकों के गठन में योगदान करते हैं।

आकृति 1
चित्रा 1. सेल-बोने और इम्प्लांटेशन प्रक्रियाओं की प्रतिनिधि छवियां। ए) एक स्केलपेल का उपयोग करते हुए प्रारंभिक पाड़ और इसकी काटने की विधि बी) प्रारंभिक पाड़ से प्राप्त 24 टुकड़े सी) एक सिरिंज का उपयोग करके मैदानी कोशिका-बीजिंग विधि। डी) संस्कृति के माध्यम से सेल-वरीय स्कैफोल्ड, प्रत्यारोपित होने के लिए तैयार। ईएफ) हड्डी बनाने वाली स्कॉफल्ड के लिए विशिष्ट कदम: ई) पाड़ को 96-अच्छी तरह से, यू-नीचे प्लेट में स्थानांतरित किया गया और एफ) पाबंदी के लिए आरबीएमएमपी 2, थ्रोम्बिन और फाइब्रिनोजेन को जोड़ने के लिए इस्तेमाल की जाने वाली विधि की प्रतिनिधि छवि। जीजे) सर्जी सामान्य संज्ञाहरण के तहत सीएल आरोपण प्रक्रिया: जी) त्वचा और पाड़ आरोपण में उत्पन्न घाव, एच) आरोपण विधि, और IJ) सर्जिकल गोंद का उपयोग कर समापन प्रक्रिया घाव। इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें

चित्र 2
चित्रा 2. चित्रा 2. चूहे से प्राप्त विभिन्न Scaffolds। एमएससी स्कॉफॉल्ड्स (बाएं), एमएससी + ईसी स्कॉफॉल्ड्स (मध्य), और एमएससी + ईसी + बीएमपी स्कॉफॉल्ड्स (दाएं) की प्रतिनिधि छवियां इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें

4 / 55914fig3.jpg "/>
चित्रा 3. चैनल विन्यास। माइक्रोस्कोप फिल्टर सेटअप दिखाया गया है। ए) चार एनडीडी डिटेक्टर मॉड्यूल हैं: पहले मॉड्यूल में, दो फ़िल्टर क्यूब्स हैं; दूसरे और तीसरे मॉड्यूल में एक फिल्टर क्यूब प्रत्येक है; और अंतिम मॉड्यूल में कोई क्यूब नहीं है (उपयोग नहीं किया गया) पहली फोटोमल्टीप्लियर ट्यूब (पीएमटी) दूर-रेड चैनल (640-690 एनएम) के लिए है, निचले तरंग दैर्ध्य को दर्शाती है; निम्नलिखित हैं 380 - 485 एनएम, 500 - 550 एनएम, और 555 - 625 एनएम (ऑर्डर हमेशा से कम तरंग दैर्ध्य तक)। बी) उपरोक्त विन्यास (रंग कोडित) के साथ detectable fluorophore उत्सर्जन। इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें

चित्रा 4
चित्रा 4 चित्रा 4. एमएससी पाड़ मानव Hematopoietic कोशिकाओं के लिए एक आला के गठन के लिए अनुमति है ए) और बी) मानव-हेमटोटोपेटिक कोशिकाओं को लेबल करने के लिए, और vasculature लेबल करने के लिए 655-VPA (मेजेन्टा) एम के लिए एएफए -488 एचसीडी 45 (हरा) के साथ अंतःशिरा टीकाकरण के बाद, जेड-स्टैक्स के 3 डी पुनर्निर्माण के बाद अन्वेषण किए गए। स्केल सलाखों में ए और बी (ऊपरी पैनल) में 20 माइक्रोन और बी (कम पैनल) में 5 माइक्रोन का प्रतिनिधित्व करते हैं। इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें

वीडियो 1
वीडियो 1. मानव Hematopoietic कोशिकाओं के लिए एक आला बनाने के लिए MSC Scaffolds अनुमति देते हैं । एमएससी स्कैफोल्ड (कोलेजन स्ट्रक्चरः एसएचजी, सियान) में वैसक्यूलेचर (655-वीपीए) के साथ जुड़े मानव हेमेटोपोएटिक कोशिकाओं के 3 डी पुनर्निर्माण (एएफए 488-एचसीडी 45)। प्रत्येक स्टैक 140 x 140 सुक्ष्ममापी उपाय करता हैEf = "http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55914/55914video1.mov" target = "_ blank"> कृपया इस वीडियो को देखने के लिए यहां क्लिक करें। (डाउनलोड करने के लिए राइट-क्लिक करें।)

चित्रा 5
चित्रा 5. मानव ईसीएस एमएससी स्कैफोल्ड में मानव जाति के निर्माण में भाग लेते हैं। एमएससी + ईसी स्कैफोल्ड में मानव उत्पत्ति के ईसीएस (एफआईटीसी-एच सी सी 3131) द्वारा तैयार की गई vasculature (655-VPA) के 3D पुनर्निर्माण स्केल सलाखों 20 माइक्रोन प्रतिनिधित्व करते हैं। इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें

वीडियो 2
वीडियो 2. मानव ईसीएस एमएससी स्कैफोल्ड में मानव जाति के निर्माण में भाग लेते हैं। मानव ईसीएस (एफआईटीसी-एचसीडी 31) के 3 डी पुनर्निर्माण VA MSC + EC scaffolds में sculature (655-VPA) प्रत्येक स्टैक 240 x 240 सुक्ष्ममापी उपाय करता है कृपया इस वीडियो को देखने के लिए यहां क्लिक करें। (डाउनलोड करने के लिए राइट-क्लिक करें।)

चित्रा 6
चित्रा 6. चित्रा 6. आरएबीएमपी -2-2 कैरियर स्कॉफॉल्ड्स के पास अस्थि सतह और ह्यूमन वैसिकलमेंट है जो अस्थि मरो के समान है। ए) एमएससी + बीएमपी स्कैफोल्ड के 3 डी पुनर्निर्माण जो हड्डी संरचनाओं (एसएचजी-सियान) और vasculature (655-VPA) के गठन को दर्शाते हैं। स्केल सलाखों 100 माइक्रोन (बाएं), 70 माइक्रोन (मध्यम), और 50 माइक्रोन (दाएं) का प्रतिनिधित्व करते हैं। बी) मानव ईसीएस (एफ़आईटीसी-एचसीडी 31) के साथ खड़ा होने वाले एमएमसी + ईसी + बीएमपी स्कैफोल्ड के 3 डी पुनर्निर्माण के लिए मानवीय जहाज (655-वीपीए) दिखाए गए हैं। स्केल सलाखों 50 माइक्रोन (बाएं) और 30 माइक्रोन (बीच और दाएं) का प्रतिनिधित्व करते हैं।14 / 55914fig6large.jpg "target =" _ blank "> कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

वीडियो 3
वीडियो 3. आरबीएमपी -2-कैरियर स्कॉफॉल्ड्स के पास अस्थि सतह और मानवीय वसूली बोन मैरो के समान है। एमएससी + वीरा + 3 डी के पुनर्निर्माण + बीएमपी पाड़ (हड्डी: एसएचजी; जहाजों: 655-वीपीए; मानव ईसीएस: एफआईटीसी-एचसीडी 31)। प्रत्येक स्टैक 600 x 600 सुक्ष्ममापी उपाय करता है कृपया इस वीडियो को देखने के लिए यहां क्लिक करें। (डाउनलोड करने के लिए राइट-क्लिक करें।)

चित्रा 7
चित्रा 7. स्थिर स्कार्फॉल्ड्स पर प्रदर्शन इम्यूनोफ्लोरेसेंस की प्रतिनिधि छवियां एएफ) मानव कोशिकाओं को लगाने के लिए इम्यूनोफ्लोरेसेंस अध्ययन कियाएन स्कॉफॉल्ड्स एसी) एचईसी, एचएमएससी, और एचएचएससी के साथ प्रत्यारोपित स्कॉफल्ड। डीएफ) एचईसी, एचएमएससी और एचएचएससी के साथ प्रत्यारोपित बोन-फार्मिंग स्कॉफोल्ड। रंग चैनल इस प्रकार हैं: एडी) मानव चुनाव आयोग (hCD31) और माउस संवहनी संरचना (endomucin, ENDOM), बीई) hMSCs (hVimentin, hVIM) और माउस संवहनी कोशिकाओं (endomucin, ENDOM), सी) मानव hematopoietic कोशिकाओं (hCD45) और माउस vasculature (endomucin, endom), और एफ) मानव वसा भेदभाव संबंधित प्रोटीन (एचएडीआरपी) और माउस vasculature (endomucin, ENDOM)। स्केल सलाखों 10 माइक्रोन (ए और सी), 20 माइक्रोन (बी और ई), और 40 (डी और एफ) माइक्रोन दिखाते हैं। इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें

Discussion

मौजूदा तरीकों के सम्मान के साथ महत्व:

इस प्रोटोकॉल में, हमने चूहों में अलग-अलग मानवीय सूक्ष्मवाहिनियों को उत्पन्न करने और दो-फोटॉन माइक्रोस्कोपी और ऊतक विज्ञान के माध्यम से उनकी वास्तुकला की कल्पना करने के लिए एक विधि का वर्णन किया है। प्रदान किए गए प्रतिनिधि डेटा मानवीय ऊतकों को इंजीनियर करने के लिए अलग-अलग स्ट्रॉम्मल कोशिकाओं का उपयोग करते हुए दृष्टिकोण की व्यवहार्यता को दर्शाता है। प्रोटोकॉल में मानव हेमटोपोएटिक कोशिकाओं के अध्ययन और सामान्य और रोग संबंधी परिस्थितियों में अस्थि मज्जा आला-व्युत्पन्न कोशिकाओं के विशिष्ट अनुप्रयोग होते हैं। इन अनुप्रयोगों में मानव एचएससी और स्ट्रॉमल घटकों के बीच क्लोनल उत्क्रांति, दवा स्क्रीनिंग और क्रोसस्टक का अध्ययन शामिल है। ऊतक इंजीनियरिंग के उभरते क्षेत्र में, कई वैकल्पिक दृष्टिकोण प्रस्तावित किए गए हैं। नोट के दृष्टिकोण में इनोवोडो 55 , 56 , 57 में 3 डी मानविकीय बी.एम. संरचनाओं का विकास शामिल है ,S = "xref"> 58 , 59 , 60 , 61 , 62 , 63 और चूहों 64 में humanized बीएम scaffolds के orthotopic भ्रष्टाचार। हमारे दृष्टिकोण को मानवीय ऊतक भ्रष्टाचार की आसान शारीरिक पहुंच के साथ विवो प्रणाली की जटिलता दोनों के संयोजन का लाभ है।

संशोधन और समस्या निवारण:

इस प्रोटोकॉल में परिवर्तनशीलता का एक स्रोत स्कैफोल्ड के बीज के लिए इस्तेमाल की जाने वाली कोशिकाओं के चयन में पाया जा सकता है। हमारे काम में, हमने बीएम-व्युत्पन्न एचएमएससी का इस्तेमाल किया हालांकि, मेसेनचिमल कोशिकाएं कई ऊतकों से प्राप्त की जा सकती हैं, जो मूल के आधार पर विशिष्ट गुण दिखा सकती हैं। इसलिए, विभिन्न अंगों से प्राप्त एचएमएससी के उपयोग पर विचार किया जा सकता है। हालांकि, इस पी में उपयोग करने से पहले विवो में हड्डी के ऊतकों को बनाने की उनकी क्षमता का परीक्षण किया जाना चाहिएरोटोकल। यह प्रोटोकॉल वाणिज्यिक रूप से उपलब्ध मानव एंडोथिलियल सेल स्रोत ( यानी, E4ORF1-transduced HUVEC) का उपयोग करता है। हाल ही में, विभिन्न उद्देश्यों के लिए अंग-विशिष्ट एन्डोथेलियल कोशिकाओं के उपयोग की सूचना 65 , 66 है । इसके अलावा, बीएम से प्राप्त प्राथमिक एचईसी का उपयोग प्रोटोकॉल में एक दिलचस्प सुधार का प्रतिनिधित्व कर सकता है। इसलिए, एंडोथेलियल कोशिकाओं के विभिन्न स्रोतों के उपयोग से विवो परिणामों में अलग-अलग उत्पादन हो सकता है।

हमने एनएसजी इम्युनोकॉम्रप्रोमिज्ड प्राप्तकर्ता चूहों का इस्तेमाल किया है ताकि मानवीय स्कॉफॉल्ड्स का आरोपण किया जा सके और ऊतक अस्वीकृति से बचा जा सके। हम इस प्रोटोकॉल को अन्य माउस उपभेदों में एक्टोपिक अस्थि मज्जा के ऊतकों को इंजीनियर करने की संभावना को बाहर नहीं करते हैं। दरअसल, आरएबीएमपीपी -2 विभिन्न स्तनधारी मॉडल 47 , 48 , 49 , 50 में हड्डी गठन को प्रेरित कर सकता है 52 हालांकि, अलग-अलग उपभेदों / मॉडलों के उपयोग से सेल व्यवहार्यता और दीर्घकालिक प्रत्यारोपण में अंतर देखा जा सकता है।

प्रयोग के अंतिम उद्देश्य के आधार पर पाड़ की वसूली का समय भी लचीला हो सकता है। प्रस्तुत प्रोटोकॉल में, हम दीर्घकालिक हेमेटोपोएटिक एनग्रेमेंटमेंट का आकलन करने के लिए आरोपण के 8 से 12 सप्ताह के नमूने पुनः प्राप्त करते हैं। मानव बी.एम. आला निर्माण ( जैसे, ओस्टिओचोंड्रल ऊतक गठन 47 या संवहनी विकास) के प्रारंभिक चरण का अध्ययन करने के लिए, विभिन्न समय बिंदुओं को चुना जा सकता है।

इस प्रोटोकॉल में वर्णित लाइव-इमेजिंग तकनीक व्याख्यान की अल्पावधि इमेजिंग के लिए संकेतित है। शारीरिक तापमान, ऑक्सीजन तनाव, और सीओ 2 एकाग्रता बनाए रखने के लिए एक संतुलित कक्ष का उपयोग दीर्घकालिक इमेजिंग के मामलों में विचार किया जाना चाहिए, जैसे गतिशीलता व्यवहार का अध्ययन करना।

क्रिटिकल सेंटप्रोटोकॉल के भीतर ईपीएस:

प्रोटोकॉल से संबंधित चुनौतियों में, हम कुछ चरणों के लिए आवश्यक तकनीकी कौशल को उजागर करेंगे। कम सेल बीतने की संख्या में Mesenchymal और endothelial कोशिकाओं का इस्तेमाल किया जाना चाहिए; अन्यथा, वे विवो में मानव हेमटोपोएटिक कोशिका इंग्रीमेंटमेंट का समर्थन नहीं कर पाएंगे या विवो में नोजो वास्क्यूलेचर और हड्डी गठन में भाग लेने में सक्षम नहीं होंगे। हम अनुशंसा करते हैं कि एचएमएससी और एचईसी के उपयोग 1 से 5 के पैराग्राफ पर हैं। मैला तैयारी और सेल-सीडिंग के कदमों में मूल सेल-संस्कृति कौशल और प्रक्रिया में प्रयुक्त विशिष्ट कोशिकाओं के गुणों का ज्ञान आवश्यक है। सर्जरी प्रोटोकॉल काफी सरल है लेकिन कुछ अभ्यास की आवश्यकता है प्रयोग की सफलता सुनिश्चित करने के लिए इम्यूनोडेफेसियर चूहों में प्रत्यारोपित स्कॉफॉल्ड्स के प्रदूषण से बचने के लिए एक सच्ची पर्यावरण का रखरखाव करना महत्वपूर्ण है। नमूना स्पष्टीकरण और लाइव इमेजिंग के लिए सर्जिकल अभ्यास (विशेष रूप से माइक्रोड्रिल के उपयोग के लिए) और ज्ञान की आवश्यकता होती हैमाइक्रोस्कोप प्रणाली अंत में, नमूना प्रसंस्करण और ऊतक विज्ञान के उपयोग की जाने वाली तकनीकों के बुनियादी ज्ञान की आवश्यकता होती है।

तकनीक की सीमाएं:

हमारे द्वारा व्यक्त किए जाने वाले दृष्टिकोण मानव मानव हेटोपोटोएटिक कोशिकाओं के दृश्यांकन को मानवीय अस्थि मज्जा सूक्ष्म ऊर्जा के विकास के लिए अनुमति देता है, साथ ही मानव एंडोथेलियल कोशिकाएं जो संवहनी संरचनाएं बनाते हैं और हड्डी / अस्थि मज्जा जगह बनाने वाली मेसेनचिमल कोशिकाएं बनाती हैं। जैसे कि विवो में ऊतक बनता है , अंतिम इंजीनियर स्कैफोल्ड अभी भी चिड़चिड़ा (मानव और मूरीन) होगा। इस मुद्दे को ध्यान में रखा जाना चाहिए, क्योंकि चिरात्मक ऊतक मानव अस्थि मज्जा जटिलता और पर्यावरण की पूरी तरह नकल नहीं कर सकते हैं।

स्कैफोल्ड के पास सीमित आकार (हम अधिकतम 6.6 x 7.5 x 7 मिमी) की कोशिश की है, और इसलिए, वे एक्सनोट्रांस्पांटेशन के लिए सीमित संख्या में कोशिकाओं को होस्ट करने में सक्षम हैं। बरामद कोशिकाओं की पूर्ण संख्या भी सीमित हो जाएगी; इस प्रकार, प्रत्यारोपित स्कॉफॉल्ड्स की संख्या को चाहिएप्रयोग के लिए आवश्यक कोशिकाओं की संख्या के एक समारोह के रूप में गणना की जानी चाहिए

इमेजिंग आवेदन हम विशेष रूप से सतह से 150-200 माइक्रोन की गहराई पर रहते ऊतकों के बड़े क्षेत्रों को देखने के लिए उपयोगी हैं, बिना आर्किटेक्चर में बाधा पहुंचाते हैं और कोशिकाओं को नुकसान पहुंचाते हैं। इसलिए, यह पूरे पाड़ के दृश्य के लिए अनुमति नहीं देता है। यदि ऊतक के एक पूर्ण स्कैन की आवश्यकता होती है, तो मानक इम्यूनोफ्लोरेसेंस के दृष्टिकोण अधिक उपयुक्त होंगे।

भविष्य के अनुप्रयोग:

इस बायोइंजिनियर्ड मॉडल की भविष्य की दिशा ऊतक में मानव घटकों की जटिलता को बढ़ाने के लिए होगी। मानव बी.एम. आला के ज्ञान और लक्षण वर्णन हाल के वर्षों में प्रगति की है 67 , और वर्णित प्रोटोकॉल इन नए सेलुलर घटकों और घुलनशील कारकों के कार्य के अध्ययन के साथ ही सामान्य / दुर्भावनापूर्ण समर्थन में उनकी भूमिका के लिए एक दिलचस्प मंच हो सकता हैचींटी एचएससी

इसके अलावा, इमेजिंग तकनीक अनुदैर्ध्य अध्ययनों में स्कॉफॉल्ड्स के इंट्राविलेट इमेजिंग की क्षमता प्रदान करती है, जिसके लिए सर्जरी के बाद वसूली के साथ लाइव, एनेस्थेटीज्ड चूहों में स्कॉफॉल्ड्स इमेजिंग में तकनीकी सुधार की आवश्यकता होगी। इस दृष्टिकोण के लिए अतिरिक्त कदमों की आवश्यकता होगी और वर्तमान में प्रयोगशाला में जांच की जा रही है।

Disclosures

लेखकों के पास खुलासे के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

हम फ्रांसिस क्रिक इंस्टीट्यूट (जैविक अनुसंधान सुविधा, इन विवो इमेजिंग और प्रायोगिक हिस्टोपैथोलॉजी) और योलान्डा सावेद्र-टोरेस और मर्सिडीज सांचेज़-गार्जोन में मुख्य सुविधाएं में स्टाफ का धन्यवाद करते हैं, उनके मूल्यवान मदद के लिए क्रिक और एलआरआई में वेट्स। पांडुलिपि को गंभीर रूप से पढ़ने के लिए हम डॉ। डब्लू। ग्रे के आभारी हैं। डीपी को ईएचए के गैर-नैदानिक ​​अनुसंधान फैलोशिप द्वारा समर्थित किया गया था। यह कार्य फ्रांसिसी क्रिक संस्थान द्वारा समर्थित था, जो कैंसर रिसर्च यूके (एफसी 2001045), यूके मेडिकल रिसर्च काउंसिल (एफसी 2001045) और वेलकम ट्रस्ट (एफसी 001045) से इसका मूल वित्तपोषण प्राप्त करता है।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Ficoll-Paque Ge Healthcare 17-1440-03
Cd34 positive selection Kit Stemcell 18056 Store a 4°C.
Magnet Stemcell 18000
Anti-human CD3 antibody, clone OKT-3 Bioxcell BE0001-2 Store at 4°C. Used for T cell depletion in primary AML samples. 
Cytokines (IL3, G-CSF, and TPO) PeproTech 200-03, 300-23 and 300-18 For doing the stock: Dilute each one of the cytokines in 100 μL of water and mix them. Add 200 μL, do alicuots of 45 μL and Store at -20 °C.
DMSO Sigma D4540
FBS Life technologies 10270106 Heat-inactivate at 56 °C during 30 min, do aliquots and freeze down. Warm in 37 °C water bath before use.
MEM-α Invitrogen 32571-028 Store at 4 °C. Warm in 37 °C water bath before use.
Myelocult H5100 corning 5100 Store at 4 °C. Warm in 37 °C water bath before use.
199 Gibco 41150-020 Store at 4 °C. Warm in 37 °C water bath before use.
hMSC-FBS, Heat-inactivated Gibco 12662-029 Store at -20 °C. Warm in 37 °C water bath before use.
P/S Sigma-Aldrich P0781 Store at -20 °C. Warm in 37 °C water bath before use.
ECGS Millipore 02-102 Dilute in culture media and use 0.22 mm filter.
HEPES Sigma-Aldrich S1558-50ML Store at 4 °C.
Heparin Sigma-Aldrich H3149 Store at 4 °C.
Glutamine Gibco 25030 Store at -20 °C.
Collagen 1 coated cell culture plate corning 354505
Trypsin-EDTA solution Thermo-Fisher 25200056 Store at -20 °C. Warm in 37 °C water bath before use.
hMSC Lonza PT-2501 Alternatively, hMSCs we also kindly provided by Dr. Dosquet (University Paris Diderot, Paris) from human bone marrow obtained during orthopaedic surgery under ethical approval 10-038 from IRB00006477. 
VeraVec HUVEC endothelial cells Angiocrine bioscience hVera101 Alternatively, other human endothelial cell source may be used.
Human hematopoietic cells Umbilical Cord blood or primary Acute Myeloid Leukemia (AML) samples were obtained from the Royal London Hospital (London, UK) after informed consent and protocol of use was approved by the East London Ethical Committee and carried out in accordance with the Declaration of Helsinki. 
Gelfoam, Size 12 - 7mm Pfizer 00009-0315-08 Alternative supplier: Febelco
PBS Thermo-Fisher 10010023
Surgical material Multiple Sterile forceps, tweezers and sharp scissors.
Sterile tissues Heat-sterilize paper tissues.
1 mL Syringe with needle of 25G Terumo SS+01H25161
Ultra Low Attachment Multiple Well Plates Corning 3473 or 3471
BMP2 Noricum rhBMP-2 Dilute at 5 mg/mL in acetic acid 50 mM and store at 4 °C.
Thrombin Sigma T8885 Dilute in CaCl2 2%, 500 mL per vial, and store at 4 °C.
Fibrinogen Sigma F3879 Dilute at 4 mg/100 mL in PBS. Store at -20 °C. Warm before use.
Tissue-culture dishes 35 mm x 10 mm Falcon 353001
U-Botton 96 well plate Falcon 353077
NSG mice The Jackson Laboratory 5557 NSG mice were a kind gift from Dr Leonard Shultz (The Jackson Laboratory).
Chlorhexidine G9 Dilute 1:10 before use
Carprofen Pfizer Rimadyl 5 mg/kg of mouse
Buprenorphine Alstoe Vetergesic 0.1 mg/kg of mouse body weight
Isoflurane Abbott B506 Induction of anaesthesia 2%, maintenance 1%
Trimmer Wella Contura HS61
Surgical glue 3M Vetbond
carbomer (polyacrylic acid) as Ophthalmic gel Novartis Viscotears Liquid Gel
Human Normal Immunoglobulin Gammaplex 10g vial 100 mL/mouse intravenously, 30 min before infusion of specific antibody.
NT-QTracker Invitrogen Q21021MP Vessel-pooling agent. Administrate 15 mL/mouse intravenously 5 min before imaging.
AF488-hCD45 Biolegend 304017 100 mL/mouse intravenously, 30 min before imaging.
FITC-hCD31 BD Pharmigen 555445 100 mL/mouse intravenously, 30 min before imaging.
Super glue Loctite Super Glue
Micro-Drill Kit IDEAL - Fisher Scientific NC9010016
Microsurgical microscope No specific brand/company is adviced.
LSM 710 NLO Zeiss Upright confocal microscope with motorized stage, two-photon laser and 20X 1.0 NA water immersion lens. Alternatively, a microscope with similar specifications could be used.
MaiTai “High Performance” fully automated 1-box 517 mode-locked Ti:Sapphire laser with DeepSee dispersion compensation Spectra-Physics
Formalin solution, neutral buffered, 10%  Sigma-Aldrich HT501128
Ethanol Sigma-Aldrich 32294
Osteosoft Millipore 1.01728.1000
Polysine slices Thermo scientific J2800AMNZ
Antigen unmasking solution Vector H-3300 Store at 4 °C. Dilute 1:100 in H2O for working solution.
Triton 100x Sigma-Aldrich T9284
Bovine serum albumin (BSA) Sigma-Aldrich A96470 Store at 4 °C.
Normal Goat serum (NGS) Sigma-Aldrich G9023 Store at 4 °C.
Endomucin Antibody Santa Cruz sc-65495 Store at 4 °C.
hVimentin antibody Santa Cruz sc-6260 Store at 4 °C.
hCD31 antibody DAKO M0823 Store at 4 °C.
hCD45 antibody DAKO M0701 Store at 4 °C.
ADRP (Perilipin2) antibodies-online ABIN283918 Store at 4 °C.
Goat anti mouse secondary antibodies Invitrogen A11029 or A11005 Store at 4 °C.
Goat anti Rabbit secondary antibodies Invitrogen A11037 or A11008 Store at 4 °C.
Goat anti Rat secondary antibodies Invitrogen A11007 or A21247 Store at 4 °C.
Sudan Black Sigma S2380 Prepare a stock of 1% sudan black in ethanol 70%. Store at RT. Prepare working solution of 0.1% sudan black in ethanol 70% and filter using filter-paper before use.
DAPI Sigma D8417 Prepare stock in H20 at 100 mg/mg. Store at 4 °C.
Fluorescent mounting media Dako S3023 Add DAPI before use (1:400 from DAPI stock).
Cover glass VWR 631-0147

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Passaro, D., Abarrategi, A., Foster, … More

Passaro, D., Abarrategi, A., Foster, K., Ariza-McNaughton, L., Bonnet, D. Bioengineering of Humanized Bone Marrow Microenvironments in Mouse and Their Visualization by Live Imaging. J. Vis. Exp. (126), e55914, doi:10.3791/55914 (2017).

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