Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

Bioengineering av humaniserte benmarg mikromiljøer i mus og deres visualisering av levende bildebehandling

Published: August 1, 2017 doi: 10.3791/55914
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1, 1
1Haematopoietic Stem Cell Laboratory, The Francis Crick Institute
* These authors contributed equally

Summary

En metode for å lage og levende bilde forskjellige humaniserte bein-margen nisjer i mus er presentert. Basert på den støttende nisje som er opprettet av humane mesenkymceller, induserer tilsetningen av humane endotelceller dannelsen av humane fartøy, mens tilsetningen av rhBMP-2 inducerer dannelsen av humant mus-kimerisk modent benvev.

Abstract

Humane hematopoietiske stamceller (HSCs) ligger i benmargen (BM) nisje, et intrikat, multifaktorielt nettverk av komponenter som produserer cytokiner, vekstfaktorer og ekstracellulær matrise. HSCs evne til å forbli hvilende, selvfornyelse eller differensiering, og tilegne seg mutasjoner og bli ondartet, avhenger av de komplekse samspillet de etablerer med forskjellige stromale komponenter. For å observere crosstalk mellom humane HSC og den humane BM nisje i fysiologiske og patologiske forhold, utformet vi en protokol for ektopisk modell og bildet en humanisert BM nisje i immunodeficiente mus. Vi viser at bruken av forskjellige cellulære komponenter tillater dannelse av humaniserte strukturer og muligheten til å opprettholde langsiktig human hematopoietisk engraftment. Ved hjelp av tofotonmikroskopi kan vi levebilde disse strukturene på stedet ved enkelcelleoppløsningen, og gi et kraftig nytt verktøy for funksjonell karakterisering av den humane BM mMikromiljø og dets rolle i regulering av normal og ondartet hematopoiesis.

Introduction

Cell-skjebnebeslutninger som observeres i stamcellefelt er tett regulert av både indre og ekstrinsiske faktorer. Spesielt er det nå allment anerkjent at BM mikromiljøet spiller en grunnleggende rolle i å kontrollere bryteren i HSCs fra en hvilende til en aktiv tilstand, så vel som i deres selvfornyelse eller differensiering skjebne 1 . Videre viser nylige funn at hematologiske maligniteter påvirker funksjonen til BM mikromiljøet, og peker på eksistensen av aktiv krysstal mellom de to rom 2 , 3 , 4 , 5 , 6 . Til tross for de siste fremskrittene, fortsetter mange viktige spørsmål om hvordan aktiviteten til bestemte BM-nisekomponenter bidrar til HSC-adferd og ondartet transformasjon.

BM mikromiljøet er svært heterogent Enous og kompleks blanding av mange forskjellige celletyper, hver med spesialiserte funksjoner. Den rikelige endotel (EC) og vaskulær komponent regulerer næringsinnhold og metabolittomsetning, inngangen og utgangen til forskjellige celler til og fra BM, og flere HSC-funksjoner 7 , 8 . Mesenkymale stromalceller (MSCs), en heterogen populasjon av utifferentierte stamceller og stamceller som er begått gjennom tre forskjellige linjer ( dvs. osteogen, kondrogen, en adipogen), er en annen grunnleggende komponent i BM nisje. Disse MSCene lokaliserer seg både i sentrale områder av BM og i nærheten av endosteal regionen. De kan være forbundet med vaskulære strukturer og er involvert i reguleringen av HSC-funksjon 9 , 10 , 11 , 12 , 13 ,"> 14 , 15 .

Mange rapporter tyder på at HSCs bor i ulike definerte steder i margen, og at deres funksjon kan avhenge av deres presise lokalisering. Det meste av dagens kunnskap om HSCs og deres interaksjon med BM mikromiljøet kommer fra murine studier 1 . Bruken av xenograftmodeller har utvidet denne kunnskapen til humane normale og ondartede HSCs, engrafting i murine BM av immunodeficiente mus 16 , 17 , 18 , 19 , 20 . Selv om dette representerer en gyldig modell, presenterer den fremdeles mange utfordringer, for eksempel behovet for å betinge mottakermusen i de fleste tilfeller for å tillate humant HSC-homing og engraftment eller kryssartsparrieren og den dårlig forstått påvirkning av cellecelleinteraksjoner og funksjoner.

Bruk av nøytraliserende antistoffer og genetisk modifiserte mus, sammen med xenotransplantasjon, har vært medvirkende til å markere den komplekse dialogen som menneskelige HSCs etablerer med sine mikro-miljøer. Introduksjonen og utviklingen av intravital to-foton-konfokalmikroskopi har flyttet disse studiene et skritt fremover, noe som muliggjør direkte, høyoppløselig og dynamisk avbildning av benmarg 19 , 20 , 21 , 22 og gir et kraftig verktøy for funksjonell Karakterisering av BM mikromiljøet og dets rolle i regulering av HSC-funksjonen. For å kringgå noen av problemene som oppstår i klassiske xenotransplantasjonsmodeller, er begrepet engineering en humanisert BM-struktur tatt i forkant. Sammenslåing av biomaterialer og celleimplantasjonskonsepter, rapporter har vist muligheten til å etterligne den menneskelige benmPil mikromiljø i heterotopområder 23 , 24 , 25 , 26 , 27 . Dette åpner muligheten for å bruke bioengineering i musemodeller for å studere human normal og ondartet hematopoiesis 28 , 29 , 30 , 31 , 32 , 33 , 34 , 35 , 36 , 37 , 38 , 39 , tumorigenese og metastase 40 , 41 , 42 , 43 , 44 .

Basert på tidligere erfaring i beinvevsteknikk og in vivo- bildebehandling 19 , 22 , 45 , 46 , 47 , 48 , 49 , 50 , 51 , 52 , beskriver vi en protokoll for bioengineer og levende bildeorganotiske humane BM-vev. Disse strukturene stammer fra implanteringen av humane BM-avledede stromaceller til kollagenbaserte stillaser subkutant podet i immunodeficiente mus. I en tidligere rapport demonstrerte vi at menneskelige MSCer sikrer dannelsen av et humant mikromiljø som er tilstrekkelig for engraftment av humane hematopoietiske celler 45 . Videre beskriver vi hvordan co-implantering av andre humane BM-cellekomponenterS, slik som humane endotelceller (hEC) og / eller cytokiner som er viktige for beindannelse ( f.eks. HBMP2), samarbeide med hMSCs for å generere forskjellige humaniserte mikro-miljøer, som kan bli levende avbildet in situ .

Protocol

Alle dyreforsøk ble utført under PPL 70/8904, godkjent av Det britiske hjemmekontor og i samsvar med Cancer Research UK retningslinjer. Bruken av humant navlestrengblod (UCB) og primær humant akutt myeloide leukemi (AML) -prøver ble godkjent av den østlige etiske komiteen etter å ha fått samtykke og ble utført i samsvar med Helsinki-erklæringen.

1. Bioengineering kollagenbaserte stillas med humane hematopoietiske og stromale celler

MERK: Hele protokollen skal utføres i sterile forhold og med sterilt materiale. Cellkulturmedium 1 tilsvarer hMSC-medium (MEM-a, P / S og 10% hMSC-FBS); Cellekulturmedium 2 tilsvarer EC-medium (M199, 20% FBS, P / S, 10 mM HEPES, 50 ug / ml heparin, 2 mM glutamin og 50 ug / mL ECGS) og cellekulturmedium 3 tilsvarer hematopoietisk cellemedium (H5100 Og P / S).

  1. Klargjør navlestrengsblod mOnonukleære celler (CB-MNC'er) eller primære AML (beinmarg eller perifert blod MNCs) ved bruk av en Ficoll-Paque densitetsgradient i henhold til veletablerte protokoller 53 .
    1. For AML, deplete T-cellene ved hjelp av OKT.3-antistoff. Inkubér 4 μg OKT.3 per 1 x 10 6 AML MNCs i 30 minutter ved romtemperatur før vasking av cellene i PBS. Hvis nødvendig, krypreserve MNCene i FBS med 10% DMSO ved 2 x 10 8 celler per ml.
  2. Forbered hMSC (kulturmedium 1) og EC (kulturmedium 2) cellekulturer. Plate hMSC-celler (se Materialetabell ) på vanlige cellekulturflaser i hMSC-medium. Plate ECs (se Materialetabell ) på kollagen 1-belagte overflater i EC-medium.
  3. Ved 85-90% celleforløp fjerner mediet, vaskes to ganger med PBS, og tilsetter trypsin-EDTA-løsning (20 μL per cm 2 ).
    1. Etter 5 minutter, kontroller at cellene er frittliggende. Gjenopprett cellene ved å fortynne 1:3 med cellekulturmedium. Sentrifuger ved 300 xg i 5 minutter og resuspender i tilsvarende medium for hver celletype og teller cellene ved å bruke et Neubauer-kammer.
    2. Bruk celler ved 2 x 10 6 - 10 7 celler per ml. Hvis begge celletyper skal brukes sammen, blandes hMSC- og EC-suspensjonene i et 1: 1-forhold.
  4. Overfør cellesuspensjonen til en insulin sprøyte.
  5. Ved hjelp av en skalpell, kutt den steriliserte gelatinsvampen ( f.eks. Gelfoam) første stillas (20 mm x 60 mm x 7 mm) i 24 stykker av tilsvarende størrelse (6,6 mm x 7,5 mm x 7 mm, figur 1A og B ).
  6. Rekonstituer gelatinestallene ved nedsenkning i PBS (5 min).
  7. En etter en, forsiktig sette stillasene på et sterilt vev for å fjerne overflødig PBS. Overfør stillasene til en brønn på en brønn med 24 brønner (ultralag festeplate) og bruk sprøyten til å injisere 50 μL inneholdende 10 5 - 10 6 celler (hMSC alEn eller i kombinasjon med hEC; Figur 1C ).
  8. Gjenta trinn 1.7 med hver stillas til alle nødvendige stillasene er frøet med stromalceller.
  9. Inkuber i 1 time i en cellekultur-inkubator (37 ° C og CO 2 5%).
  10. Fyll hver brønn med 3 ml cellekulturmedium 1 ( Figur 1D ) og returner stillasene til en cellekultur-inkubator (37 ° C og CO 2 5%) for inkubasjon over natten. Bruk cellekulturmedium 2 hvis ECs brukes i stillasene.
  11. Tine CB-MNCs og isolere CD34 + -celler fra dem etter en passende CD34 + -seksjonskontekst. Opphev de valgte CD34 + -cellene i medium 3 og telle dem i et Neubauer-kammer.
    MERK: Her celler ble anvendt ved en konsentrasjon på 2 x 10 6 celler pr ml.
    1. Hvis AML-pasientavledede primære prøver brukes, tine cellene, fortynn dem 1:10 i FBS, sentrifuger dem i 5 minutter ved 300Xg, resuspender cellene i PBS-2% FBS, tilsatt anti-humant CD3-antistoff (2 - 4 μg pr. 10 6 celler) og inkuber ved romtemperatur i 30 minutter. Sentrifuger i 5 minutter ved 300 xg og resuspenderes i hematopoietisk cellemedium suppleret med cytokiner (20 ng / ml granulocyt-kolonistimulerende faktor (G-CSF), 20 ng / ml IL-3 og 20 ng / ml trombopoietin (TPO)) .
  12. Gjenta trinn 1.7 - 1.9, men i dette tilfellet frø 1 x 10 5 humane hematopoietiske celler i stedet for stromale komponenter, som ovenfor.
    1. Fyll brønnen med 3 ml cellekulturmedium 3 ( Figur 1D ) og returner stillasene til en cellekulturinkubator (37 ° C og CO 2 5%) for inkubasjon over natten. Bruk en 1: 1 blanding av cellekulturmedier 2 og 3 Hvis ECs brukes i stillasene.
  13. For bare rekombinant humant benmorfogenetisk protein-2 (rhBMP-2) bærer stillasene forsiktig sette stillasene en etter en på et sterilt vev for å fjerne overflødig PBS. Overfør stillasene til en brønn på en bunnplate med 96 mm brønn ( Figur 1E ) og legg til 5 μL rhBMP-2, som dekker plassen grundig.
    1. Tilsett 20 μl trombin etterfulgt av 20 μl fibrinogen, og dekk grundig hver dag ( Figur 1F ). Gjenta prosedyren for hver stillas til alle nødvendige stillasene er behandlet og deretter inkuber i 5 - 10 min ved 37 ° C. Sjekk om koagulasjonen har blitt vellykket.

2. Kirurgisk implantering av bioenginerte stillas

MERK: Her ble enten mannlige eller kvinnelige, 6- til 12 uker gamle NSG-mus brukt. Da dyrene er immundefekte, bør alle prosedyrer gjøres i sterile forhold. Trinn 2.10 - 2.13 er relatert til overlevelsesstrategier og postkirurgisk behandling.

  1. 60 - 120 minutter før kirurgi, administrerer smertemedisinering subkutant (karprofen, 5 mg / kg kroppsvekt / mus).
  2. Indusere anestesi i et kammer med 0,5% isofluran og 2 l / min O 2. Mus bør overvåkes kontinuerlig under prosedyren. Overfør dyret til kirurgisk område i utsatt posisjon for å få enkel tilgang til ryggen. Hold dyret under anestesi ved hjelp av en nesekegle som gir 1,5% isofluran og 2 L / min O 2 . Hold musen under anestesi under den kirurgiske prosedyren og kontroller ofte dyrtilstanden.
  3. Mens det er under anestesi, bruk oftalmisk gel i øynene til musen for å forhindre tørrhet, og hold musen ved 37 ° C.
  4. Barber kirurgiområdet på baksiden av musen med en elektrisk trimmer. For å sterilisere huden, dip en bomullsspiss i fortynnet clorexidin (fortynnet 1:10 i PBS) og bruk dette tipset for å rengjøre hudoverflaten. Gjenta denne prosedyren to ganger.
  5. Ved hjelp av sterile pincett og en skalpell (eller saks), gjør du en 0,5 til 0,7 cm fremre og bakre full snitt av huden. Bruk pinnene satt innUnder subkutan vev for å lage en lomme.
  6. Sett stillaset subkutant, sørg for at det er plassert dypt inne i lommen ( Figur 1G og H ). Lukk snittet med kirurgisk lim ( figur 1I og J ).
  7. For å behandle postkirurgisk smerte, administrere subkutant buprenorfin (0,1 mg / kg kroppsvekt).
  8. Under gjenopprettingen plasseres dyret på sin side i en forvarmet bur og overvåker gjenoppretting til normal oppførsel blir observert.
  9. Fortynn smerte medisiner i vann (carprofen, 0,1 mg / ml vann) og gi det til dyr som drikkevann i 4 dager etter operasjonen.
  10. Sjekk dyret og såret ofte i 48-timers etter-kirurgisk periode for mulige bivirkninger.

3. Musebehandlinger, eutanasi og prøvetaking for bildebehandling

MERK: Analyse av stillasene utføres mellom8 og 24 uker etter implantasjon.

  1. 60 min før avbildning, hold den implanterte musen varm i en oppvarmingskasse ved 37 ° C og administrer 100 μL human immunoglobulin intravenøst ​​for å blokkere uspesifikke steder.
  2. 30 min før avbildning, administrere intravenøst ​​10 μg (per mus) av spesifikke antistoffer for å merke celler av interesse.
  3. 5 min før avbildning, administrere intravenøst ​​15 μl (fortynnet i 100 μl PBS) av 655 nm fluorfor-merket, karbonpulveringsmiddel (655-VPA) for å visualisere vaskulære strukturer.
  4. Euthanize musen via cervikal dislokasjon.
  5. Ved hjelp av skarpe saks, gjør du et langsgående hudinnsnitt på baksiden av musen, nær det originale implantasjonsstedet.
  6. Ved hjelp av pincet og saks, skiller huden forsiktig fra den subkutane lommen hvor stillaset er blitt implantert.
  7. Hold stillaset med pinsett og forsiktig ekspander det fra huden ved å kutte gjenværende membran aNd vev som omgir stillaset med saks. Se eksempler på stillasene som skal gjenvinnes i figur 2 .
  8. Fest stillaset med hurtigvirkende lim til en bildeplate (en 35 mm x 10 mm petriskål) og fyll opp med saltoppløsning (PBS) ved romtemperatur.
  9. For BMP stillasene, før du fyller platen med PBS, bruk en kirurgisk mikrodrill for å tynne beinoverflaten under et mikrokirurgisk mikroskop; Dette tillater fluoroforevisualisering og høyoppløselig bildeopptak. Bruk enten 1,2- eller 1,6 mm-burrene, avhengig av stillasets størrelse.
    MERK: Brukeren vil innse hvor mye å bore avhengig av benets tykkelse. Generelt, ettersom BMP-stillasene er vaskulariserte, vil beinet litt endre farge og bli mer rødt når nærmer seg riktig tykkelse for avbildning.
  10. Plasser platen på scenen av konfokalmikroskopet.

4. Live-bildebehandling ved bruk av to-foton mikroskopopier

MERK: Ved bruk av ikke-avkalkede detektorer (NDD), bruk alltid NDD-glidebryteren for avbildning for å lede fluorescensen til NDD. Mikroskopkonfigurasjonen er gitt i figur 3 .

  1. Slå på mikroskopet og datamaskinen, start programmet ved å klikke på "Start system", og gå til "Oppkjøp" -modus.
  2. Merk av i boksen "Vis manuelle verktøy". I "Laser" -menyen slår du på "to" -fotonlaseren og la den varme opp og stabilisere seg.
  3. I menyen "Imaging Setup" aktiverer du samtidig "Channel Mode" og "Switch track every Frame." I "Light Path" -menyen, velg "Non Descanned" "og" Main Beam Splitter MBS 760+. " Merk for å aktivere de fire NDDene og sett inn konfigurasjonen som vist på figur 3 .
    MERK: Med denne konfigurasjonen vil kollagenssignalet fra beinstrukturer (sekOnd harmonisk generasjon, SHG) oppsamles ved 380 - 485 nm, FITC-hCD31 + humane endotelceller og AF488-hCD45 + humane hematopoietiske celler ved 500-550 nm og 655-VPA ved 640-690 nm.
  4. I "Kanaler" -menyen, still inn "laserbølgelengden" til 890 nm og strømmen til 50%. Sett "Gain (Master)" til 500-600, "Digital Offset" til 0, og "Digital Gain" til 15 for hver kanal. Juster disse verdiene når oppkjøpet har startet.
  5. I "Oppkjøpsmodus" konfigurerer du de nødvendige parametrene for å oppnå høyoppløselige bilder uten å skade vevet og bleke fluorophorene. Still inn "Skannemodus" til "Ramme", "Rammeformat" til "x512 y512," Linjesteg "til 1," Hastighet "til 9," Gjennomsnittlig nummer "til 8," Bitdybde "til" 8 Bit " Modus "til" linje, "" retning "til" toveis, "og" metode "til" bety. "
    1. Sett "ZoOm "til 1 for den første skanningen av bildet, og øk den hvis nødvendig for å fokusere på bestemte områder.
  6. Plasser platen som inneholder stillaset på mikroskopetrinnet under 20X, 1,0 NA vanndypingslinsen og senk linsen til den berører saltoppløsningen. Still fokuset på linsen på stillaset ved hjelp av mikroskopobjektene, ved hjelp av en lampe som lyskilde.
  7. Aktiver "Z-stack" -menyen, velg "Første / Siste" -funksjonen, og sett inn ønsket intervall mellom to sub-sekvensielle skiver ( f.eks. 2-μm Z-stack). Hold intervallene konstant i Z-stabelen.
  8. Velg "Live" for å vise en levende skanning av prøven og juster "Digital Gain" og "Digital Offset" for optimal eksponering. For å visualisere flere kanaler samtidig, velg "Split" -funksjonen.
  9. I "Stage" -menyen, i "Live" -modus, skann bildet og "Mark" regionene i interEst (ROI), slik som plasseringen av humane hematopoietiske celler og vaskulære strukturer. Når skanningen av prøven er fullført, flytt til første avkastning for å starte avbildning.
  10. I "Live" -modus, sett toppen og bunnen av 3D Z-stabelen rundt området av interesse ved å bruke funksjonene "Set first" og "Set last". Når du er ferdig, setter du senteret, "C." Start oppkjøpet av avkastningen med "start eksperiment" -knappen. Se eksempler på bilder i figur 4 , figur 5 og figur 6 .
  11. Når oppkjøpet er fullført, lagre bildet i den angitte mappen. Flytt til neste avkastning og gjenta trinn 4.10. Når forsøket er fullført, fjern bildeskiltet fra mikroskopet, fjern forsiktig prøven fra platen, og rengjør eventuell resterende lim.
  12. Klargjør prøven for neste analyseteknikk.

5. PrøveprosessG for histologi og immunforsvar

MERK: Prøver behandles i henhold til protokollen beskrevet i JoVE-generell laboratorieteknikk 54 som beskriver prøvefiksering, innebygd og snittprosesser. Beindannende prøver skal behandles i 7 dager i et EDTA-basert dekalcifiseringsmiddel mellom fikserings- og innlejringsprosessene. Blokkerings / permeabiliseringsløsningen er 10 mM PBS pH 7,4 buffer med 1% Triton X-100, 1% bovint serumalbumin (BSA) og 10% normalt geit serum (NGS).

  1. Sett skivene i xylen i 10 min), xylen i 5 min, 100% etanol i 5 min, 70% etanol i 5 min, 50% etanol i 5 min, og H 2 O i 5 min.
  2. Overfør stykkene til en citratbasert antigenmaskerende arbeidsløsning.
  3. Kok skiver i 15 minutter og la dem avkjøles til romtemperatur.
  4. Vask skivene i 10 mM PBS pH 7,4 løsning med 1% Triton X-100 (5 minutter, 3 ganger).
  5. Overfør samPles til blokkering / permeabiliseringsoppløsningen og inkuber i 30 minutter.
  6. Tilsett primær antistoff fortynnet i blokkering / permeabiliseringsløsning og inkuber natten over ved 4 ° C.
  7. Vask skivene i 10 mM PBS pH 7,4 løsning med 1% Triton X-100 (5 minutter, 3 ganger).
  8. Tilsett sekundær antistoff fortynnet i blokkering / permeabiliseringsoppløsning i 1 time i mørket ved romtemperatur.
  9. Vask med H 2 O (5 min, 3 ganger).
  10. For å redusere bakgrunnsfluorescens, senk skivene i Sudan Black-arbeidsløsningen i 10 minutter, i mørket og ved romtemperatur.
  11. Vask stykkene i H 2 O (5 min, 3 ganger).
  12. Monter skiver med fluorescerende monteringsmedium med DAPI (0,5 μg / ml).
  13. Oppbevar skiver ved 4 ° C og kontroller at monteringsmediet er tørt før du utfører fluorescerende bildebehandling. Se eksempelbilder i Figur 7 .

Representative Results

I figur 1 er representative bilder av stillads- og implantasjonsprosessene for stillascellene vist. I figur 1C merk at celler injiseres direkte inn i stillaset. I figur 1G merkes det at et snitt er laget på baksiden av musen, hvor den subkutane lommen er opprettet og stillaset er implantert. Figur 2 viser brutto morfologi av forskjellige stillaser implantert i NSG-mus og hentet etter 8 uker. Legg merke til den svake vaskulariseringen i hMSC-frøplater ( figur 2A ). Samsøing av human ECs med hMSCs i stillaset muliggjør dannelse av mer relevant vaskulatur i stillas ( figur 2B ). Til slutt fremkaller tilstedeværelsen av rhBMP-2 beindannelse. De hentede stillasene er større i dette tilfellet, og de utgjøres avBenlignende hardt vev.

Figur 3 viser kanalkonfigurasjonsoppsettet på mikroskopet for live-imaging med NDD (detaljer i figurlegenden). Figur 4 og Video 1 viser humane hematopoietiske celler i hMSC-belagte stillaser. Stillasene ble eksplantert 8 uker etter implantasjon og etter intravenøs inokulering av AF488-hCD45 antistoff og 655-VPA. Denne prosedyren tillater visualisering av implanterte humane hematopoietiske celler og den vaskulære strukturen ved to-foton-konfokalmikroskopi. I dette tilfellet viser bildene blodkar (655-VPA) i stillasene og langsiktig engraftment av humane hematopoietiske celler (AF488-hCD45) i stillasparenchyma. Figur 5 og Video 2 tilsvarer menneskelige stillaser frøet med hEC og hMSCs. 8 uker etter operasjonen ble stillas eksplantert etter intravenøs brukOus inokulering av FITC-hCD31 antistoff og 655-VPA, og bilder ble ervervet med et tofoton konfokalmikroskop, som tidligere nevnt. Bilder viser deltakelsen av hEC i fartøyformasjon i stillaset, noe som resulterer i en murin-menneskelig kimær vaskulatur.

Figur 6A viser representative data av tilnærmingen som brukes til å stimulere beindannelse i MSC-stillasene. I likhet med tidligere figurer, 8 uker etter implantasjon, ble intravenøs inokulering av 655-VPA utført, stillas ble hentet, og bilder ble ervervet med tofoton-konfokalmikroskopi. RhBMP-2-stimulerte stillasene induserer dannelsen av beinvev, noe som kan visualiseres på grunn av SHG (cyanfarge i bildene) som er gitt av kalsium i benet. De angitte bildene viser også dannelsen av hulrom og vascularized endosteal vev, som i stor grad ligner BM endosteal vev. På figur 6B Video 3 , ble hECs co-implantert med hMSCs. Stillasene ble hentet etter intravenøs inokulering av FITC-hCD31 antistoff og 655-VPA, og tofoton-konfokale mikroskopi-bilder viser deltakelsen av hECs i neovaskularisering i et bendannende stillas.

Figur 7 viser representative bilder av histologi, en prosedyre utført for å bekrefte tidligere beskrevne resultater. Immunfluorescerende bilder viser musvaskulatur, hECs, hMSCs og langsiktige engrafted humane hematopoietiske celler i stillasstrukturene. Stillaser hentet fra mus ble fikset og brukt for immunofluorescens. I rhBMP-2-bærerbenformende stillasene ( Figur 7D- F ), merk morfologien til vevet, som ligner modent knoglemarv med fettvev. I dette benformede stillaset viser vi at hMSC er fibroblaster, noe som vil indikere tHue de bidrar til nydannet vev som stromaceller. Vi viser også humant adipocytmarkøruttrykk, noe som tilsier at hMSC også bidrar til dannelse av fettvev.

Figur 1
Figur 1. Representative bilder av cellesedings- og implantasjonsprosessene. A) Initial stillas og dens skjæremetode ved hjelp av en skalpell. B) 24 stykker oppnådd fra den første stillas. C) Stillascellesøtningsmetode ved hjelp av en sprøyte. D) Cell-seeded stillas med dyrkningsmedium, klar til å bli implantert. EF) Spesifikke trinn for beinformende stillas: E) Stillas overføres til en 96-brønn, u-bunnplate og F) Representativt bilde av metoden som brukes til å legge til rhBMP2, trombin og fibrinogen til stillaset. GJ) Surgi Cal implantasjonsprosedyre under generell anestesi: G) sår opprettet i hud- og stilladsimplantasjon, H) implanteringsmetode og IJ) sårlukningsprosedyre ved bruk av kirurgisk lim. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 2
Figur 2. Forskjellige stillaser hentet fra mus. Representative bilder av MSC stillas (til venstre), MSC + EC stillas (midten) og MSC + EC + BMP stillas (høyre). Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

4 / 55914fig3.jpg "/>
Figur 3. Kanalkonfigurasjon. Mikroskopfilteroppsettet vises. A) Det er fire NDD detektormoduler: I den første modulen er det to filterkasser; Den andre og tredje modulen har en filterkube hver; Og den siste modulen har ingen terning (ikke brukt). Det første fotomultiplikatorrøret (PMT) er for den fjernrøde kanalen (640 - 690 nm), som reflekterer de nedre bølgelengder; Følgende er 380 - 485 nm, 500 - 550 nm og 555 - 625 nm (rekkefølgen er alltid fra nedre til høyere bølgelengder). B) Fluoroforeutslippene som kan påvises med de ovennevnte konfigurasjonene (fargekodet). Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 4
Figur 4. MSC stillas S tillate for dannelse av en nisje for humane hematopoietiske celler. A) og B) 3D-rekonstruksjoner av Z-stabler tatt etter eksplantering, etter intravenøs inokulering med AF488-hCD45 (grønn), for å merke humane hematopoietiske celler og 655-VPA (magenta) m for å merke vasculatur. Skalestenger representerer 20 μm i A og B (øvre paneler) og 5 μm i B (nedre paneler). Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Video 1
Video 1. MSC stillasene tillater dannelse av en nisje for humane hematopoietiske celler . 3D-rekonstruksjon av humane hematopoietiske celler (AF488-hCD45) assosiert med vaskulaturen (655-VPA) i MSC-stillaset (kollagenstrukturer: SHG, cyan). Hver stabel måler 140 x 140 μm.Ef = "http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55914/55914video1.mov" target = "_ blank"> Vennligst klikk her for å se denne videoen. (Høyreklikk for å laste ned.)

Figur 5
Figur 5. Menneskelige ECs deltar i dannelsen av humaniserte fartøy i MSC stillas. 3D rekonstruksjon av vaskulatur (655-VPA) foret med ECs av human opprinnelse (FITC-hCD31) i MSC + EC stillas. Skalestenger representerer 20 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Video 2
Video 2. Menneskelige ECs deltar i dannelsen av humaniserte fartøy i MSC stillas. 3D rekonstruksjon av menneskelige ECs (FITC-hCD31) som ligger på vaien Sculature (655-VPA) i MSC + EC stillas. Hver stabel måler 240 x 240 μm. Vennligst klikk her for å se denne videoen. (Høyreklikk for å laste ned.)

Figur 6
Figur 6. rhBMP-2 Carrier Stillas har benflater og humanisert vaskulatur som ligner på benmarg. A) 3D rekonstruksjon av MSC + BMP stillas som viser dannelsen av benstrukturer (SHG-cyan) og vaskulatur (655-VPA). Skalestenger representerer 100 μm (venstre), 70 μm (midt) og 50 μm (høyre). B) 3D rekonstruksjon av MSC + EC + BMP stillas som viser humaniserte fartøy (655-VPA) foret med human ECs (FITC-hCD31). Skalestenger representerer 50 μm (venstre) og 30 μm (midten og høyre).14 / 55914fig6large.jpg "target =" _ blank "> Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Video 3
Video 3. rhBMP-2 Carrier Stillas har benflater og humanisert vaskulatur som ligner på benmarg. 3D rekonstruksjon av MSC + VERA + BMP stillas (bein: SHG; fartøy: 655-VPA; human ECs: FITC-hCD31). Hver stabling måler 600 x 600 μm. Vennligst klikk her for å se denne videoen. (Høyreklikk for å laste ned.)

Figur 7
Figur 7. Representative bilder av immunfluorescens utført på faste stillaser. AF) Immunofluorescensstudier utført for å lokalisere humane celler implantert iN stillas. AC) Stillaser implantert med hECs, hMSCs og hHSCs. DF) Benformede stillas implantert med hECs, hMSCs og hHSCs. Fargekanalene er som følger: AD) humant EC (hCD31) og mus vaskulær struktur (endomucin, ENDOM), BE) hMSCs (hVimentin, hVIM) og muse vaskulære celler (endomucin, ENDOM), c) humane hematopoietiske celler (hCD45) Og musvaskulatur (endomucin, ENDOM) og F) humant adiposdifferensieringsrelatert protein (hADRP) og musvaskulatur (endomucin, ENDOM). Skalestenger representerer 10 μm (A og C), 20 μm (B og E) og 40 (D og F) μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Discussion

Betydning med hensyn til eksisterende metoder:

I denne protokollen beskrev vi en metode for å generere forskjellige humaniserte mikromiljøer i mus og å visualisere deres arkitektur via tofotonmikroskopi og histologi. De representative dataene som er angitt, viser muligheten for tilnærmingen, ved bruk av forskjellige stromalceller for å konstruere humanisert vev. Protokollen har spesifikke anvendelser til studien av humane hematopoietiske celler og benmargnisjeavledede celler under normale og patologiske forhold. Disse applikasjonene inkluderer studiet av klonal evolusjon, medikamentscreening og krysskala mellom humane HSC og stromale komponenter. I det nye feltet vevsteknikk er det foreslått flere alternative tilnærminger. Tilnærminger til notatet inkluderer utvikling av 3D humaniserte BM strukturer in vitro 55 , 56 , 57 ,S = "xref"> 58 , 59 , 60 , 61 , 62 , 63 og det ortopotopiske implantatet av humaniserte BM stillaser i mus 64 . Vår tilnærming har fordelen av å kombinere både kompleksiteten til in vivo- systemet med den enkle anatomiske tilgjengeligheten til det humaniserte vevtransplantatet.

Modifikasjoner og feilsøking:

En variasjonskilde i denne protokollen finnes i valget av celler som brukes til å frøstille stillasene. I vårt arbeid brukte vi BM-avledede hMSCs. Imidlertid kan mesenkymceller oppnås fra flere vev, som kan vise karakteristiske egenskaper avhengig av opprinnelsen. Derfor kan bruk av hMSCer avledet fra forskjellige organer vurderes. Imidlertid bør deres evne til å danne bindevev in vivo testes før bruk i denne pRotokoll. Denne protokollen bruker en kommersielt tilgjengelig human endotelcellekilde ( dvs. E4ORF1-transduced HUVEC). Nylig har bruk av organspesifikke endotelceller for forskjellige formål blitt rapportert 65 , 66 . Videre kan bruken av primære hEC som er avledet fra BM, utgjøre en interessant forbedring av protokollen. Derfor kan bruk av forskjellige kilder til endotelceller produsere forskjellige in vivo utfall.

Vi brukte NSG-immunokompromitterte mottakermus for å favorisere implantasjonen av humaniserte stillas og for å unngå vevavvisning. Vi utelukker ikke muligheten for å bruke denne protokollen til å konstruere ektopiske knoglemarvvev i andre musestammer. Faktisk kan rhBMP-2 inducere beindannelse i forskjellige pattedyrsmodeller 47 , 48 , 49 , 50 52 . Imidlertid vil forskjeller i celle-levedyktighet og langsiktig transplantasjon sannsynligvis bli observert ved bruk av forskjellige stammer / modeller.

Tidspunktet for stillasgjenoppretting kan også være fleksibel, avhengig av det endelige formål med eksperimentet. I den presenterte protokollen gjenfinner vi prøver etter 8 - 12 uker etter implantasjon for å vurdere langsiktig hematopoietisk engraftment. For å studere tidlige trinn i den humane BM nisjeformasjonen ( f.eks. Osteokondral vevdannelse 47 eller vaskulær utvikling), kan forskjellige tidspunkter velges.

Live-imaging teknikken vi beskrev i denne protokollen er indikert for kortsiktig bildebehandling av eksplantater. Bruken av et ekvilibrert kammer for å opprettholde fysiologisk temperatur, oksygenspenning og CO 2 -konsentrasjon bør vurderes i tilfeller av langvarig avbildning, for eksempel for å studere motilitetsadferd.

Kritisk StEps i protokollen:

Blant utfordringene knyttet til protokollen vil vi fremheve de tekniske ferdighetene som kreves for noen trinn. Mesenkymale og endotelceller bør brukes ved lavcellepassasjenumre; Ellers vil de ikke kunne støtte humant hematopoietisk celle engraftment in vivo eller delta i de novo vaskulatur og beindannelse in vivo . Vi anbefaler bruk av hMSCs og hECs i passasjer 1 - 5. Stillas forberedelse og cellesedding trinn krever grunnleggende cellekultur ferdigheter og kunnskap om egenskapene til de spesifikke cellene som brukes i prosedyren. Operasjonsprotokollen er ganske enkel, men krever litt øvelse. Vedlikehold av et aseptisk miljø for å unngå forurensning av de implanterte stillasene i immunfektige mus er avgjørende for å sikre eksperimentets suksess. Eksempeleksplanter og levende bildebehandling krever kirurgisk praksis (spesielt for bruk av mikrodrill) og kunnskap omMikroskopsystem. Endelig krever prøvebehandling og histologi grunnleggende kunnskap om teknikkene som skal brukes.

Begrensninger av teknikken:

Tilnærmingen vi beskriver muliggjør visualisering av levende humane hematopoietiske celler som sårer et humanisert beinmargsmiljø, mens menneskelige endotelceller danner vaskulære strukturer og mesenkymceller som danner bein / beinmargeplass. Etter hvert som vevet dannes in vivo , vil den endelige konstruerte stillas fortsatt være kimær (human og murin). Dette problemet bør tas i betraktning, da det kimære vevet ikke fullt ut kan etterligne humant knoglemarvskompleksitet og miljø.

Stillasene som er implantert, har en begrenset størrelse (vi prøvde maksimalt 6,6 x 7,5 x 7 mm), og de kan derfor være vert for et begrenset antall celler for xenotransplantasjon. Det absolutte antall gjenvunnet celler vil også bli begrenset; Dermed skal antallet implanterte stillaseneBeregnes som en funksjon av antall celler som kreves for eksperimentet.

Bildeprogrammet vi beskrev er spesielt nyttig for å observere store områder av levende vev i dyp 150-200 μm fra overflaten uten å forstyrre arkitekturen og skade cellene. Derfor tillater det ikke visualisering av hele stillaset. Hvis en fullstendig skanning av vevet er nødvendig, vil standard immunofluorescens tilnærminger være mer hensiktsmessig.

Fremtidige applikasjoner:

Fremtidens retning for denne bioengineered-modellen ville være å øke kompleksiteten til de humane komponentene i vevet. Kunnskapen og karakteriseringen av den humane BM-nisje har utviklet seg de siste årene 67 , og den beskrevne protokollen kan være en interessant plattform for å studere funksjonen til disse nye cellekomponenter og løselige faktorer, samt deres rolle i å støtte normal / malignAnt HSCs.

Videre gir avbildningsteknikken potensialet for intravital avbildning av stillasene i langsgående studier, noe som vil kreve tekniske forbedringer ved å avdekke stillasene i levende bedøvede mus, med gjenvinning etter kirurgi. Denne tilnærmingen vil kreve ytterligere skritt og er for tiden undersøkt i laboratoriet.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

Vi takker de ansatte i kjernefasilitetene ved Francis Crick Institute (Biologisk forskningsfasilitet, In Vivo Imaging and Experimental Histopathology) og Yolanda Saavedra-Torres og Mercedes Sanchez-Garzon, dyrene hos Crick og LRI, for deres verdifulle hjelp. Vi er takknemlige for Dr. W. Gray for kritisk å lese manuskriptet. DP ble støttet av et ikke-klinisk forskningsmiljø fra EHA. Dette arbeidet ble støttet av The Francis Crick Institute, som mottar kjernefinansiering fra Cancer Research UK (FC001045), UK Medical Research Council (FC001045), og Welcome Trust (FC001045).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Ficoll-Paque Ge Healthcare 17-1440-03
Cd34 positive selection Kit Stemcell 18056 Store a 4°C.
Magnet Stemcell 18000
Anti-human CD3 antibody, clone OKT-3 Bioxcell BE0001-2 Store at 4°C. Used for T cell depletion in primary AML samples. 
Cytokines (IL3, G-CSF, and TPO) PeproTech 200-03, 300-23 and 300-18 For doing the stock: Dilute each one of the cytokines in 100 μL of water and mix them. Add 200 μL, do alicuots of 45 μL and Store at -20 °C.
DMSO Sigma D4540
FBS Life technologies 10270106 Heat-inactivate at 56 °C during 30 min, do aliquots and freeze down. Warm in 37 °C water bath before use.
MEM-α Invitrogen 32571-028 Store at 4 °C. Warm in 37 °C water bath before use.
Myelocult H5100 corning 5100 Store at 4 °C. Warm in 37 °C water bath before use.
199 Gibco 41150-020 Store at 4 °C. Warm in 37 °C water bath before use.
hMSC-FBS, Heat-inactivated Gibco 12662-029 Store at -20 °C. Warm in 37 °C water bath before use.
P/S Sigma-Aldrich P0781 Store at -20 °C. Warm in 37 °C water bath before use.
ECGS Millipore 02-102 Dilute in culture media and use 0.22 mm filter.
HEPES Sigma-Aldrich S1558-50ML Store at 4 °C.
Heparin Sigma-Aldrich H3149 Store at 4 °C.
Glutamine Gibco 25030 Store at -20 °C.
Collagen 1 coated cell culture plate corning 354505
Trypsin-EDTA solution Thermo-Fisher 25200056 Store at -20 °C. Warm in 37 °C water bath before use.
hMSC Lonza PT-2501 Alternatively, hMSCs we also kindly provided by Dr. Dosquet (University Paris Diderot, Paris) from human bone marrow obtained during orthopaedic surgery under ethical approval 10-038 from IRB00006477. 
VeraVec HUVEC endothelial cells Angiocrine bioscience hVera101 Alternatively, other human endothelial cell source may be used.
Human hematopoietic cells Umbilical Cord blood or primary Acute Myeloid Leukemia (AML) samples were obtained from the Royal London Hospital (London, UK) after informed consent and protocol of use was approved by the East London Ethical Committee and carried out in accordance with the Declaration of Helsinki. 
Gelfoam, Size 12 - 7mm Pfizer 00009-0315-08 Alternative supplier: Febelco
PBS Thermo-Fisher 10010023
Surgical material Multiple Sterile forceps, tweezers and sharp scissors.
Sterile tissues Heat-sterilize paper tissues.
1 mL Syringe with needle of 25G Terumo SS+01H25161
Ultra Low Attachment Multiple Well Plates Corning 3473 or 3471
BMP2 Noricum rhBMP-2 Dilute at 5 mg/mL in acetic acid 50 mM and store at 4 °C.
Thrombin Sigma T8885 Dilute in CaCl2 2%, 500 mL per vial, and store at 4 °C.
Fibrinogen Sigma F3879 Dilute at 4 mg/100 mL in PBS. Store at -20 °C. Warm before use.
Tissue-culture dishes 35 mm x 10 mm Falcon 353001
U-Botton 96 well plate Falcon 353077
NSG mice The Jackson Laboratory 5557 NSG mice were a kind gift from Dr Leonard Shultz (The Jackson Laboratory).
Chlorhexidine G9 Dilute 1:10 before use
Carprofen Pfizer Rimadyl 5 mg/kg of mouse
Buprenorphine Alstoe Vetergesic 0.1 mg/kg of mouse body weight
Isoflurane Abbott B506 Induction of anaesthesia 2%, maintenance 1%
Trimmer Wella Contura HS61
Surgical glue 3M Vetbond
carbomer (polyacrylic acid) as Ophthalmic gel Novartis Viscotears Liquid Gel
Human Normal Immunoglobulin Gammaplex 10g vial 100 mL/mouse intravenously, 30 min before infusion of specific antibody.
NT-QTracker Invitrogen Q21021MP Vessel-pooling agent. Administrate 15 mL/mouse intravenously 5 min before imaging.
AF488-hCD45 Biolegend 304017 100 mL/mouse intravenously, 30 min before imaging.
FITC-hCD31 BD Pharmigen 555445 100 mL/mouse intravenously, 30 min before imaging.
Super glue Loctite Super Glue
Micro-Drill Kit IDEAL - Fisher Scientific NC9010016
Microsurgical microscope No specific brand/company is adviced.
LSM 710 NLO Zeiss Upright confocal microscope with motorized stage, two-photon laser and 20X 1.0 NA water immersion lens. Alternatively, a microscope with similar specifications could be used.
MaiTai “High Performance” fully automated 1-box 517 mode-locked Ti:Sapphire laser with DeepSee dispersion compensation Spectra-Physics
Formalin solution, neutral buffered, 10%  Sigma-Aldrich HT501128
Ethanol Sigma-Aldrich 32294
Osteosoft Millipore 1.01728.1000
Polysine slices Thermo scientific J2800AMNZ
Antigen unmasking solution Vector H-3300 Store at 4 °C. Dilute 1:100 in H2O for working solution.
Triton 100x Sigma-Aldrich T9284
Bovine serum albumin (BSA) Sigma-Aldrich A96470 Store at 4 °C.
Normal Goat serum (NGS) Sigma-Aldrich G9023 Store at 4 °C.
Endomucin Antibody Santa Cruz sc-65495 Store at 4 °C.
hVimentin antibody Santa Cruz sc-6260 Store at 4 °C.
hCD31 antibody DAKO M0823 Store at 4 °C.
hCD45 antibody DAKO M0701 Store at 4 °C.
ADRP (Perilipin2) antibodies-online ABIN283918 Store at 4 °C.
Goat anti mouse secondary antibodies Invitrogen A11029 or A11005 Store at 4 °C.
Goat anti Rabbit secondary antibodies Invitrogen A11037 or A11008 Store at 4 °C.
Goat anti Rat secondary antibodies Invitrogen A11007 or A21247 Store at 4 °C.
Sudan Black Sigma S2380 Prepare a stock of 1% sudan black in ethanol 70%. Store at RT. Prepare working solution of 0.1% sudan black in ethanol 70% and filter using filter-paper before use.
DAPI Sigma D8417 Prepare stock in H20 at 100 mg/mg. Store at 4 °C.
Fluorescent mounting media Dako S3023 Add DAPI before use (1:400 from DAPI stock).
Cover glass VWR 631-0147

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hoggatt, J., Kfoury, Y., Scadden, D. T. Hematopoietic Stem Cell Niche in Health and Disease. Annu Rev Pathol. 11, 555-581 (2016).
  2. Hanoun, M., et al. Acute myelogenous leukemia-induced sympathetic neuropathy promotes malignancy in an altered hematopoietic stem cell niche. Cell Stem Cell. 15 (3), 365-375 (2014).
  3. Frisch, B. J., et al. Functional inhibition of osteoblastic cells in an in vivo mouse model of myeloid leukemia. Blood. 119 (2), 540-550 (2012).
  4. Zhang, B., et al. Altered microenvironmental regulation of leukemic and normal stem cells in chronic myelogenous leukemia. Cancer Cell. 21 (4), 577-592 (2012).
  5. Schepers, K., et al. Myeloproliferative neoplasia remodels the endosteal bone marrow niche into a self-reinforcing leukemic niche. Cell Stem Cell. 13 (3), 285-299 (2013).
  6. Krause, D. S., et al. Differential regulation of myeloid leukemias by the bone marrow microenvironment. Nat Med. 19 (11), 1513-1517 (2013).
  7. Mendez-Ferrer, S., Scadden, D. T., Sanchez-Aguilera, A. Bone marrow stem cells: current and emerging concepts. Ann N Y Acad Sci. 1335, 32-44 (2015).
  8. Boulais, P. E., Frenette, P. S. Making sense of hematopoietic stem cell niches. Blood. 125 (17), 2621-2629 (2015).
  9. Ding, L., Morrison, S. J. Haematopoietic stem cells and early lymphoid progenitors occupy distinct bone marrow niches. Nature. 495 (7440), 231-235 (2013).
  10. Kunisaki, Y., et al. Arteriolar niches maintain haematopoietic stem cell quiescence. Nature. 502 (7473), 637-643 (2013).
  11. Pinho, S., et al. PDGFRalpha and CD51 mark human nestin+ sphere-forming mesenchymal stem cells capable of hematopoietic progenitor cell expansion. J Exp Med. 210 (7), 1351-1367 (2013).
  12. Mizoguchi, T., et al. Osterix marks distinct waves of primitive and definitive stromal progenitors during bone marrow development. Dev Cell. 29 (3), 340-349 (2014).
  13. Zhou, P., Wang, Y., Li, D., Hu, S. Y., Chen, G. H. Therapeutic efficacy of mixed hematopoietic stem cell transplantation for pediatric hematologic diseases. Zhongguo Shi Yan Xue Ye Xue Za Zhi. 22 (2), 434-439 (2014).
  14. Sugiyama, T., Kohara, H., Noda, M., Nagasawa, T. Maintenance of the hematopoietic stem cell pool by CXCL12-CXCR4 chemokine signaling in bone marrow stromal cell niches. Immunity. 25 (6), 977-988 (2006).
  15. Tzeng, Y. S., et al. Loss of Cxcl12/Sdf-1 in adult mice decreases the quiescent state of hematopoietic stem/progenitor cells and alters the pattern of hematopoietic regeneration after myelosuppression. Blood. 117 (2), 429-439 (2011).
  16. Pearce, D. J., et al. AML engraftment in the NOD/SCID assay reflects the outcome of AML: implications for our understanding of the heterogeneity of AML. Blood. 107 (3), 1166-1173 (2006).
  17. Sanchez, P. V., et al. A robust xenotransplantation model for acute myeloid leukemia. Leukemia. 23 (11), 2109-2117 (2009).
  18. Uzan, B., et al. Interleukin-18 produced by bone marrow-derived stromal cells supports T-cell acute leukaemia progression. EMBO Mol Med. 6 (6), 821-834 (2014).
  19. Foster, K., et al. Different Motile Behaviors of Human Hematopoietic Stem versus Progenitor Cells at the Osteoblastic Niche. Stem Cell Reports. 5 (5), 690-701 (2015).
  20. Hawkins, E. D., et al. T-cell acute leukaemia exhibits dynamic interactions with bone marrow microenvironments. Nature. 538 (7626), 518-522 (2016).
  21. Lo Celso, C., et al. Live-animal tracking of individual haematopoietic stem/progenitor cells in their niche. Nature. 457 (7225), 92-96 (2009).
  22. Lassailly, F., Foster, K., Lopez-Onieva, L., Currie, E., Bonnet, D. Multimodal imaging reveals structural and functional heterogeneity in different bone marrow compartments: functional implications on hematopoietic stem cells. Blood. 122 (10), 1730-1740 (2013).
  23. Holzapfel, B. M., Wagner, F., Thibaudeau, L., Levesque, J. P., Hutmacher, D. W. Concise review: humanized models of tumor immunology in the 21st century: convergence of cancer research and tissue engineering. Stem Cells. 33 (6), 1696-1704 (2015).
  24. Scotti, C., et al. Engineering of a functional bone organ through endochondral ossification. Proc Natl Acad Sci USA. 110 (10), 3997-4002 (2013).
  25. Scotti, C., et al. Recapitulation of endochondral bone formation using human adult mesenchymal stem cells as a paradigm for developmental engineering. Proc Natl Acad Sci USA. 107 (16), 7251-7256 (2010).
  26. Kuznetsov, S. A., et al. Single-colony derived strains of human marrow stromal fibroblasts form bone after transplantation in vivo. J Bone Miner Res. 12 (9), 1335-1347 (1997).
  27. Bianco, P., Robey, P. G. Skeletal stem cells. Development. 142 (6), 1023-1027 (2015).
  28. Vaiselbuh, S. R., Edelman, M., Lipton, J. M., Liu, J. M. Ectopic human mesenchymal stem cell-coated scaffolds in NOD/SCID mice: an in vivo model of the leukemia niche. Tissue Eng Part C Methods. 16 (6), 1523-1531 (2010).
  29. Groen, R. W., et al. Reconstructing the human hematopoietic niche in immunodeficient mice: opportunities for studying primary multiple myeloma. Blood. 120 (3), e9-e16 (2012).
  30. Chen, Y., et al. Human extramedullary bone marrow in mice: a novel in vivo model of genetically controlled hematopoietic microenvironment. Blood. 119 (21), 4971-4980 (2012).
  31. Reinisch, A., et al. A humanized bone marrow ossicle xenotransplantation model enables improved engraftment of healthy and leukemic human hematopoietic cells. Nat Med. 22 (7), 812-821 (2016).
  32. Sontakke, P., et al. Modeling BCR-ABL and MLL-AF9 leukemia in a human bone marrow-like scaffold-based xenograft model. Leukemia. 30 (10), 2064-2073 (2016).
  33. Theocharides, A. P., Rongvaux, A., Fritsch, K., Flavell, R. A., Manz, M. G. Humanized hemato-lymphoid system mice. Haematologica. 101 (1), 5-19 (2016).
  34. Antonelli, A., et al. Establishing human leukemia xenograft mouse models by implanting human bone marrow-like scaffold-based niches. Blood. 128 (25), 2949-2959 (2016).
  35. Holzapfel, B. M., et al. Tissue engineered humanized bone supports human hematopoiesis in vivo. Biomaterials. 61, 103-114 (2015).
  36. Reinisch, A., et al. Epigenetic and in vivo comparison of diverse MSC sources reveals an endochondral signature for human hematopoietic niche formation. Blood. 125 (2), 249-260 (2015).
  37. Lee, J., et al. Implantable microenvironments to attract hematopoietic stem/cancer cells. Proc Natl Acad Sci USA. 109 (48), 19638-19643 (2012).
  38. Lee, J., Heckl, D., Parekkadan, B. Multiple genetically engineered humanized microenvironments in a single mouse. Biomater Res. 20 (19), 1-13 (2016).
  39. Ho, M. S., Medcalf, R. L., Livesey, S. A., Traianedes, K. The dynamics of adult haematopoiesis in the bone and bone marrow environment. Br J Haematol. 170 (4), 472-486 (2015).
  40. Bersani, F., et al. Bioengineered implantable scaffolds as a tool to study stromal-derived factors in metastatic cancer models. Cancer Res. 74 (24), 7229-7238 (2014).
  41. Thibaudeau, L., et al. Mimicking breast cancer-induced bone metastasis in vivo: current transplantation models and advanced humanized strategies. Cancer Metastasis Rev. 33 (2-3), 721-735 (2014).
  42. Holzapfel, B. M., et al. Species-specific homing mechanisms of human prostate cancer metastasis in tissue engineered bone. Biomaterials. 35 (13), 4108-4115 (2014).
  43. Thibaudeau, L., Holzapfel, B. M., Hutmacher, D. W. Humanized mice models for primary bone tumor and bone metastasis research. Cell Cycle. 14 (14), 2191-2192 (2015).
  44. Thibaudeau, L., et al. A tissue-engineered humanized xenograft model of human breast cancer metastasis to bone. Dis Model Mech. 7 (2), 299-309 (2014).
  45. Abarrategi, A., Foster, K., Hamilton, A., Mian, S., Passaro, D., Gribben, J., Mufti, G., Bonnet, D. Versatile humanized niche model enables study of normal and malignant human hematopoiesis. J Clin Invest. 127 (2), (2017).
  46. Abarrategi, A., et al. In vivo ectopic implantation model to assess human mesenchymal progenitor cell potential. Stem Cell Rev. 9 (6), 833-846 (2013).
  47. Rubio, R., et al. Bone environment is essential for osteosarcoma development from transformed mesenchymal stem cells. Stem Cells. 32 (5), 1136-1148 (2014).
  48. Abarrategi, A., et al. Multiwall carbon nanotube scaffolds for tissue engineering purposes. Biomaterials. 29 (1), 94-102 (2008).
  49. Abarrategi, A., et al. Gene expression profile on chitosan/rhBMP-2 films: A novel osteoinductive coating for implantable materials. Acta Biomater. 5 (7), 2633-2646 (2009).
  50. Abarrategi, A., et al. Biological properties of solid free form designed ceramic scaffolds with BMP-2: in vitro and in vivo evaluation. PLoS One. 7 (3), e34117 (2012).
  51. Abarrategi, A., et al. Chitosan scaffolds for osteochondral tissue regeneration. J Biomed Mater Res A. 95 (4), 1132-1141 (2010).
  52. Abarrategi, A., et al. Improvement of porous beta-TCP scaffolds with rhBMP-2 chitosan carrier film for bone tissue application. Tissue Eng Part A. 14 (8), 1305-1319 (2008).
  53. Prasain, N., Meador, J. L., Yoder, M. C. Phenotypic and functional characterization of endothelial colony forming cells derived from human umbilical cord blood. J Vis Exp. (62), (2012).
  54. JoVE Science Education Database. General Laboratory Techniques. Histological Sample Preparation for Light Microscopy. J Vis Exp. , (2016).
  55. Hong, J. K., Yun, J., Kim, H., Kwon, S. Three-dimensional culture of mesenchymal stem cells. Tissue Eng Regen Med. 12 (4), 211-221 (2015).
  56. Bara, J. J., et al. Three-dimensional culture and characterization of mononuclear cells from human bone marrow. Cytotherapy. 17 (4), 458-472 (2015).
  57. Dong, H. W., Qin, S., Rafailovich, M., Ma, Y. Developing an Optimal Biofunctional Scaffold for Hematopoietic Stem Cell Quiescent Maintenance and Expansion. N Am J Med Sci. 8 (2), (2015).
  58. Raic, A., Rodling, L., Kalbacher, H., Lee-Thedieck, C. Biomimetic macroporous PEG hydrogels as 3D scaffolds for the multiplication of human hematopoietic stem and progenitor cells. Biomaterials. 35 (3), 929-940 (2014).
  59. Miyoshi, H., Morita, M., Ohshima, N., Sato, C. Expansion of mouse hematopoietic progenitor cells in three-dimensional cocultures on frozen-thawed stromal cell layers formed within porous scaffolds. Exp Hematol. 43 (2), 115-124 (2015).
  60. Cuddihy, M. J., Wang, Y., Machi, C., Bahng, J. H., Kotov, N. A. Replication of bone marrow differentiation niche: comparative evaluation of different three-dimensional matrices. Small. 9 (7), 1008-1015 (2013).
  61. Sharma, M. B., Limaye, L. S., Kale, V. P. Mimicking the functional hematopoietic stem cell niche in vitro: recapitulation of marrow physiology by hydrogel-based three-dimensional cultures of mesenchymal stromal cells. Haematologica. 97 (5), 651-660 (2012).
  62. Leisten, I., et al. 3D co-culture of hematopoietic stem and progenitor cells and mesenchymal stem cells in collagen scaffolds as a model of the hematopoietic niche. Biomaterials. 33 (6), 1736-1747 (2012).
  63. Ferreira, M. S., et al. Cord blood-hematopoietic stem cell expansion in 3D fibrin scaffolds with stromal support. Biomaterials. 33 (29), 6987-6997 (2012).
  64. Baldwin, J. G., et al. Periosteum tissue engineering in an orthotopic in vivo platform. Biomaterials. 121, 193-204 (2017).
  65. Rafii, S., Butler, J. M., Ding, B. S. Angiocrine functions of organ-specific endothelial cells. Nature. 529 (7586), 316-325 (2016).
  66. Seandel, M., et al. Generation of a functional and durable vascular niche by the adenoviral E4ORF1 gene. Proc Natl Acad Sci USA. 105 (49), 19288-19293 (2008).
  67. Medyouf, H. The microenvironment in human myeloid malignancies: emerging concepts and therapeutic implications. Blood. 129 (12), 1617-1626 (2017).

Tags

Utviklingsbiologi utgave 126 levende bildebehandling tofotonmikroskopi benmarg stroma mikromiljø humanisert nisje humane hematopoietiske stamceller human leukemi vaskulatur endotelceller mesenkymale stromceller BMP2
Bioengineering av humaniserte benmarg mikromiljøer i mus og deres visualisering av levende bildebehandling
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Passaro, D., Abarrategi, A., Foster, … More

Passaro, D., Abarrategi, A., Foster, K., Ariza-McNaughton, L., Bonnet, D. Bioengineering of Humanized Bone Marrow Microenvironments in Mouse and Their Visualization by Live Imaging. J. Vis. Exp. (126), e55914, doi:10.3791/55914 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter