Summary
Hier beschreiben wir ein Protokoll zur genomweiten Kartierung der Integrationsorte von Moloney murinen Leukämie-Virus-basierten retroviralen Vektoren in menschlichen Zellen.
Abstract
Moloney murine Leukämie (MLV) Virus-basierte retrovirale Vektoren integrieren sich überwiegend in acetylierte Enhancer und Promotoren. Aus diesem Grund können mLV-Integrationsorte als funktionale Marker aktiver regulatorischer Elemente verwendet werden. Hier präsentieren wir ein retrovirales Scan-Tool, das die genomweite Identifizierung von zellspezifischen Enhancern und Promotoren ermöglicht. Kurz gesagt wird die Zielzellpopulation mit einem mLV-abgeleiteten Vektor transduziert und genomische DNA wird mit einem häufig schneidenden Restriktionsenzym verdaut. Nach der Ligation von genomischen Fragmenten mit einem kompatiblen DNA-Linker ermöglicht die Linker-vermittelte Polymerase-Kettenreaktion (LM-PCR) die Amplifikation der Virus-Host-Genom-Übergänge. Die massive Sequenzierung der Ampullen wird verwendet, um das mLV-Integrationsprofil genomweit zu definieren. Schließlich werden Cluster von wiederkehrenden Integrationen definiert, um zellspezifische regulatorische Regionen zu identifizieren, die für die Aktivierung von zelltypspezifischen Transkriptionsprogrammen verantwortlich sind.
z. B. somatische Stammzellen) dar, die keine robusten Marker für eine prospektive Isolation aufweisen.
Introduction
Die Zellidentität wird durch die Expression spezifischer Gene bestimmt. Die Rolle von cis-regulatorischen Elementen wie Promotoren und Enhancern ist entscheidend für die Aktivierung von zelltypspezifischen Transkriptionsprogrammen. Diese regulatorischen Regionen zeichnen sich durch spezifische Chromatin-Merkmale aus, wie z. B. eigenartige Histon-Modifikationen, Transkriptionsfaktoren und Co-Faktoren-Bindung und Chromatin-Zugänglichkeit, die für ihre genomweite Identifizierung in mehreren Zelltypen 1 , 2 , 3 weit verbreitet sind. Insbesondere wird das genomweite Profil der Acetylierung von Histon H3-Lysin 27 (H3K27ac) üblicherweise zur Definition von aktiven Promotoren, Enhancern und Super-Enhancern 4 , 5 , 6 verwendet.
Moloney murine Leukämie-Virus (MLV) ist ein Gamma-Retrovirus, das weit verbreitet für Gen verwendet wirdTransfer in Säugetierzellen. Nach der Infektion einer Zielzelle wird das retrovirale RNA-Genom in einem doppelsträngigen DNA-Molekül retro-transkribiert, das virale und zelluläre Proteine bindet, um den Vorintegrationskomplex (PIC) zu bilden. Der PIC tritt in den Kern ein und bindet das Wirtszellchromatin. Hier vermittelt die virale Integrase, eine Schlüssel-PIC-Komponente, die Integration der proviralen DNA in das Wirtszellgenom. Die mLV-Integration in die genomische DNA ist nicht zufällig, sondern tritt in aktiven cis-regulatorischen Elementen wie Promotoren und Enhancern in zellspezifischer Weise 7 , 8 , 9 , 10 auf . Dieses eigenartige Integrationsprofil wird durch eine direkte Wechselwirkung zwischen der mLV-Integrase und den zellulären Bromodomain- und extraterminalen Domänen (BET) -Proteinen 11 , 12 , 13 vermittelt. BET - Proteine (BRD2, BRD3 undBRD4) als Brücke zwischen Wirtschromatin und mLV PIC: Durch ihre Bromodomänen erkennen sie hoch acetylierte cis-regulatorische Regionen, während die extraterminalen Domäne mit der mLV-Integrase 11 , 12 , 13 wechselwirkt.
Hier beschreiben wir das retrovirale Scannen, ein neuartiges Werkzeug, um aktive cis-regulatorische Regionen auf der Basis der Integrationseigenschaften von mLV abzubilden. Kurz gesagt werden die Zellen mit einem mLV-abgeleiteten retroviralen Vektor transduziert, der das verstärkte rekonstruierte Gen (EGFP) -Reporter-Gen des grünen fluoreszierenden Proteins exprimiert. Nach der genomischen DNA-Extraktion werden die Übergänge zwischen der 3'-langen terminalen Wiederholung (LTR) des mLV-Vektors und der genomischen DNA durch Linker-vermittelte PCR (LM-PCR) amplifiziert und massiv sequenziert. MLV-Integrationsstandorte werden dem menschlichen Genom zugeordnet, und genomische Regionen, die stark von mLV gezielt sind, werden als Cluster von mLV-Integrationsstellen definiert.
Retroviraler ScanNing wurde verwendet, um zellspezifische aktive regulatorische Elemente in mehreren menschlichen Primärzellen 14 , 15 zu definieren. MLV-Cluster, die mit epigenetisch definierten Promotoren und Enhancern co-mapped waren, von denen die meisten aktive Histonmarken wie H3K27ac enthielten und zellspezifisch waren. Das retrovirale Scannen ermöglicht die genomweite Identifizierung von DNA-regulatorischen Elementen in prospektiv gereinigten Zellpopulationen 7 , 14 sowie in retrospektiv definierten Zellpopulationen wie Keratinozyten-Stammzellen, die keine wirksamen Marker für die prospektive Isolation fehlen 15 .
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Protocol
1. MLV-Transduktion von menschlichen Zellen
- Isolieren Sie die Zielzellen und transduzieren sie mit einem mVV-abgeleiteten retroviralen Vektor, der das eGFP-Reportergen beherbergt und mit dem vesikulären Stomatitisvirus G (VSV-G) oder dem amphotropen Hüllglykoprotein 16 pseudotypisiert ist.
- Halten Sie mock-transduzierte Zellen als Negativkontrolle für die folgenden Analysen. Da mVV-basierte retrovirale Vektoren effizient transduzierende Zellen transduzieren können, Kultur die Zielzellpopulation unter Bedingungen, die die Zellteilung stimulieren. Die Transduktionsbedingungen müssen für jeden untersuchten Zelltyp spezifisch optimiert werden. Zellwachstum und Transduktionsbedingungen für menschliche hämatopoetische Vorläufer, T-Zellen und epidermale Zellen sind in den Literaturstellen 7, 14, 15 und 17 beschrieben.
- 48 h nach der Transduktion werden 100.000 Zellen in 300 μl phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) mit 2% fötalem Rinderserum resuspendiert und die eGFP-Expression mit f gemessenNiedrige zytometrische Analyse (488-nm-Anregungslaser). Verwenden Sie mock-transduzierte Zellen als Negativkontrolle. Zur optimalen Integrationsstelle retrieval, reinigen Sie GFP + -Zellen durch Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierung (FACS).
- Sammeln Sie 0,5 bis 5 Millionen Zellen für die genomische DNA-Präparation. Eine längere Kulturperiode (> 7 Tage) wird bevorzugt, um das unintegrierte Provirus zu verdünnen und notwendig, wenn man die Langzeit-Nachkommenschaft von bona fide Stammzellen analysiert (siehe Diskussionsteil und Referenz 15 ). Die Zellpellets können bei -80 ° C bis zur Verwendung eingefroren und gelagert werden.
2. Amplifikation von mLV-Integrationsstellen durch Linker-vermittelte PCR (LM-PCR)
- Vorbereitung der genomischen DNA (gDNA)
- Extrahieren von gDNA unter Verwendung eines säulenbasierten DNA-Extraktionskits und folgen dem Protokoll für kultivierte Zellen gemäß den Anweisungen des Herstellers.
- Restriktionsenzym Digestiauf
- Richten Sie 4 Restriktionsenzymverdauungen pro Probe in 1,5 ml Röhrchen ein. Digest 0,1 bis 1 μg gDNA in jedem Röhrchen durch Zugabe von 1 μl Tru9I (10U) und 1 μl Puffer M in einem Endvolumen von 10 μl. Inkubieren Sie die Reaktionen bei 65 ° C für 6 h oder über Nacht.
- Zu jeder Reaktion werden 1 μl PstI (10U), 1 μl Puffer H und 8 μl Wasser gegeben. Inkubieren Sie die Reaktionen bei 37 ° C für 6 h oder über Nacht. Proben können bei -20 ° C bis zur Verwendung gelagert werden.
- Linker ligation
- Vorbereitung einer 100 & mgr; M Tru9I-Linker-Stammlösung in einem 1,5 ml-Röhrchen durch Mischen der Linker plus Strang- und Linker-Minus-Strang-Oligonukleotide bei einer Konzentration von 100 & mgr; M. Setzen Sie das Röhrchen in ein Wasser auf 100 ° C und lassen Sie es bei Raumtemperatur abkühlen lassen. Tru9I Linker-Stammlösung kann bei -20 ° C bis zur Verwendung gelagert werden.
- Richten Sie 8 Linker Ligationsreaktionen in 1,5 ml Röhrchen ein. Fügen Sie für jede Reaktion die folgende Komponente hinzuS bis 10 μl Restriktionsenzymverdauung: 1,4 μl 10X T4 DNA Ligase Reaction Puffer, 1 μl 10 μM Linker Tru9I, 1 μL (2.000U) T4 DNA Ligase und 0,6 μl Wasser. Inkubieren bei 16 ° C für 3 bis 6 h. Proben können bei -20 ° C bis zur Verwendung gelagert werden.
- Erste PCR
- Stellen Sie 48 PCR-Reaktionen (6 Reaktionen von jedem Ligaturrohr) in 0,2 ml Röhrchen auf. Für jede PCR fügen Sie die folgenden Reagenzien zu 2 μl Ligationsreaktion hinzu: 5 μl 10X PCR Puffer, 2 μl 50 mM Magnesiumsulfat, 1 μl 10 mM Desoxynukleotid (dNTP) Mix, 1 μl 10 μM Linker Primer, 1 & Mgr; l 10 & mgr; M mLV-3 'LTR-Primer, 0,3 & mgr; l (1,5 U) Taq-DNA-Polymerase und 37,7 & mgr; l Wasser. Primer-Sequenzen sind in Tabelle 1 angegeben.
- Die PCR-Reaktion in einem Thermocycler mit beheiztem Deckel wie folgt durchführen: 95 ° C für 2 min; 25 Zyklen von 95 ° C für 15 s, 55 ° C für 30 s, 72 ° C für 1 min; 72 °C für 5 min; Bei 4 ° C halten. Proben können bei -20 ° C bis zur Verwendung gelagert werden.
- Zweite PCR
- Stellen Sie 48 PCR-Reaktionen (1 von jedem "ersten PCR" -Rohr) in 0,2 ml Röhrchen auf. Für jede PCR fügen Sie die folgenden Komponenten zu 2 μl der ersten PCR-Reaktion hinzu: 5 μl 10X PCR-Puffer, 2 μl 50 mM Magnesiumsulfat, 1 μl 10 mM dNTP Mix, 1 μl 10 μM Linker verschachtelter Primer, 1 & Mgr; l 10 & mgr; M mLV-3 'LTR-verschachtelter Primer, 0,3 & mgr; l Taq-DNA-Polymerase (1,5 U) und 37,7 & mgr; l Wasser. Verwenden Sie verschachtelte Primer, die für die gewählte massive Sequenzierungsstrategie entwickelt wurden: (i) Linker verschachtelte Primer und mLV-3 'LTR verschachtelte Primer kompatibel mit Illumina Plattform; (Ii) Linker verschachtelte Primer und mLV-3 'LTR verschachtelte Primer kompatibel mit Roche-Plattform. Primer-Sequenzen sind in Tabelle 1 aufgelistet.
- Die PCR-Reaktion in einem Thermocycler mit beheiztem Deckel wie folgt durchführen: 95 ° C für 2 min; 25Zyklen von 95 ° C für 15 s, 58 ° C für 30 s, 72 ° C für 1 min; 72 ° C für 5 min; Bei 4 ° C halten. Proben können bei -20 ° C bis zur Verwendung gelagert werden.
- Beide die 48 verschachtelten PCR-Reaktionen in einem 15-ml-Röhrchen (Endvolumen von ~ 2,4 ml). Proben können bei -20 ° C bis zur Verwendung gelagert werden.
- Bestimmen Sie die Anwesenheit und die Größe der LM-PCR-Produkte durch Agarose-Gelelektrophorese.
- Man gibt 4 μl Ladepuffer auf 20 μl LM-PCR-Produkte und beladen die Probe auf ein 1% Agarosegel zusammen mit einer 100 bp DNA Leiter. Führen Sie das Gel bei 5 V / cm für 30 bis 60 min und visualisieren Sie die PCR-Produkte durch Ethidiumbromid-Färbung.
- Führen Sie eine LM-PCR-Reaktion aus der mock-transduzierten Probe als Negativkontrolle aus.
- Die Amplifikate durch Zugabe von 0,1 Volumina Natriumacetatlösung (3 M, pH 5,2) und 2,5 Volumina 100% igem Ethanol abfließen lassen. Mischen und Einfrieren bei -80 ° C für 20 min.
- Spin bei fuGeschwindigkeit in einer Standard-Mikrozentrifuge bei 4 ° C für 20 min. Den Überstand verwerfen und das Pellet mit 70% Ethanol waschen. Mit hoher Geschwindigkeit in einer Standard-Mikrozentrifuge bei 4 ° C für 5 min drehen.
- Den Überstand verwerfen und das Pellet an der Luft trocknen. 200 μl PCR-Wasser geben und die DNA resuspendieren. Proben können bei -20 ° C bis zur Verwendung gelagert werden.
- Füge 20 μl Ladepuffer auf 100 μl der LM-PCR-Produkte hinzu und lade die Probe auf ein 1% Agarosegel zusammen mit einer 100 bp DNA Leiter.
- Führen Sie das Gel bei 5 V / cm für 30 bis 60 min und schneiden Sie den Teil des Gels mit 150 bis 500 bp-langen Ampullen.
- Reinigen Sie die LM-PCR-Produkte mit einem säulenbasierten Gel-Extraktionskit und messen Sie die Konzentration mit einem UV-Spektrophotometer.
- Verwenden Sie 1 μl Bibliothek, um die Länge der LM-PCR-Produkte mit einem Bioanalyzer-Instrument nach den Anweisungen des Herstellers zu bewerten.
- Verwenden Sie 20 ng der gereinigten LM-PCR-Produkte und klonen sie im pCR2.1-TOPO-Vektor gemäß den Anweisungen des Herstellers.
- Führen Sie Sequenzierungsreaktionen mit dem M13 Universal-Primer durch, gefolgt von einer genomischen Kartierung der resultierenden Sequenzen, um die Anwesenheit der Virus-Genom-Übergänge (einschließlich des mLV-3 'LTR-verschachtelten Primers) in> 50% der Klone zu identifizieren, um die geeigneten Proben zu identifizieren Für massive sequenzierung. Beispiel einer Virus-Genom-Kreuzung:
MLV-3 'LTR verschachtelte Primer 454 und Linker verschachtelte Primer 454 ( Tabelle 1 ) sind fett markiert und das 3'-Ende des viralen LTR kursiv. Die menschliche genomische Sequenz wird im roten Text hervorgehoben (chr10: 6439408-6439509, hg19).
3. Massive Sequenzierung von mLV Integration Sites
HINWEIS: LM-PCR prodKönnen mit kommerziellen Plattformen sequenziert werden (Auswahl des richtigen verschachtelten Primerpaares in der zweiten PCR-Reaktion, siehe Abschnitt 2.5.1). Zur Sequenzierung der Roche GS-FLX Pyrosequenzierungsplattform siehe vorherige Papiere 7 , 14 , 15 . In diesem Abschnitt wird ein neu optimiertes Protokoll für die Illumina-Sequenzplattform beschrieben.
- Bibliotheksvorbereitung
- Stellen Sie 1 Indexing PCR Reaktion pro Probe in 0,2 ml Röhrchen ein. Für jede PCR fügen Sie die folgenden Reagenzien zu 5 μl (150-170 ng) gereinigtem LM-PCR-Produkt hinzu: 5 μl Index Primer 1, 5 μl Index Primer 2, 25 μl 2X Master Mix und 10 μl PCR- Klasse Wasser. Verwenden Sie für jede Probe eine andere Indexkombination.
- Durchführen von PCR-Reaktionen in einem Thermocycler mit beheiztem Deckel wie folgt: 95 ° C für 3 min; 8 Zyklen von 95 ° C für 30 s, 55 ° C für 30 s, 72 ° C für 30 s; 72 ° C für 5 mim; Bei 4 ° C halten.
- Reinigen Sie die PCR-Produkte mit einem Festphasen-Reversible Immobilisierungsprotokoll (SPRI) -Wulst-Isolationsprotokoll: In neuen 1,5-ml-Röhrchen werden 56 μl Perlen zu jeder Probe gegeben und folgen Sie den Anweisungen des Herstellers. Eluieren in 25 & mgr; l Tris-HCl 10 mM. Bibliotheken können bei -20 ° C bis zum Gebrauch gelagert werden.
- Bibliotheksprüfung
- Verwenden Sie 1 μl Probe, um die Bibliotheksgröße mit einem Bioanalyzer-Instrument zu beurteilen.
- Verwenden Sie 1 & mgr; l Probe, um die Bibliotheksmolarität unter Verwendung eines Fluoreszenz-basierten Echtzeit-PCR-Tests gemäß den Anweisungen des Herstellers zu quantifizieren.
- Bibliotheksverdünnung und Sequenzierung
- Verdünnen Sie Bibliotheken auf 10 nM mit Tris-HCl 10 mM. Zur Bündelung von Bibliotheken werden 5 μl jeder verdünnten Bibliothek in ein neues 1,5 mL Röhrchen gegeben und dann den Pool auf 4 nM in Tris-HCl 10 mM verdünnt.
- Mischen Sie 5 μl verdünntes Pool mit 5 μl 0,2 N NaOH in einer neuen 1,5 mL-Röhrchen, kurz vorspülen, abschleudern und 5 min bei Raumtemperatur inkubieren, um die Bibliotheken zu denaturieren.
- Die Röhrchen auf Eis geben und 990 μl vorgekühlter Hybridisierungspuffer (HT1) zugeben. Aliquotieren Sie 300 & mgr; l denaturierten Pool in einem neuen 1,5 ml-Röhrchen und fügen Sie 300 & mgr; l vorgekühltes HT1 hinzu, um ein 10 pF-Endbibliothekspool zu erhalten.
- Parallel dazu werden 2 μl PhiX-Kontrollbibliothek (10 nM) mit 3 μl Tris-HCl 10 mM in einem 1,5 mL-Röhrchen vermischt. 5 μl NaOH 0,2 N zugeben, kurz vorspülen, abschleudern und 5 min bei Raumtemperatur inkubieren, um das verdünnte PhiX zu denaturieren. Setzen Sie das Röhrchen auf Eis und fügen Sie 990 μl vorgekühltes HT1 hinzu.
- Aliquotieren Sie 300 & mgr; l denaturierten PhiX in einem neuen 1,5 ml-Röhrchen und fügen Sie 300 & mgr; l vorkühlendes HT & sub1; hinzu, um ein 10 pM EndphiX zu erhalten.
- In einem neuen 1,5-ml-Röhrchen werden 510 μl denaturierter Bibliothekspool mit 90 μl denaturierter PhiX-Bibliothek vermischt und damit ein endgültiges 10 pM-Pool mit 15% PhiX-Kontrolle erhalten.
- Pipettieren Sie diese 600 μl ProbeVolumen in das Load Sample Reservoir der aufgetauten Sequenzreagenzkartusche ein und fährt sofort fort, um einen einmal gelesenen 150-Zyklus-Lauf durchzuführen.
HINWEIS: Die für dieses Protokoll benötigten kritischen Reagenzien und Primer-Sequenzen sind in Tabelle 1 aufgelistet.
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Representative Results
Arbeitsablauf des retroviralen Scanvorgangs
Der Arbeitsablauf des retroviralen Abtastvorgangs ist in Abbildung 1 schematisiert. Die Zielzellpopulation wird gereinigt und mit einem mLV-abgeleiteten retroviralen Vektor transduziert, der ein eGFP-Reportergen exprimiert. Das Transgen wird von den beiden identischen langen terminalen Wiederholungen (5 'und 3' LTR) flankiert, was die Synthese, die reverse Transkription und die Integration des viralen Genoms in die Wirts-DNA gewährleistet. Die Transduktionseffizienz wird durch FACS-Analyse der eGFP-Expression beurteilt. Die Zellpopulation, die einen hohen Anteil (> 30%) von mLV-transduzierten Zellen enthält, wird amplifiziert und anschließend lysiert, um genomische DNA zu extrahieren, die die integrierten mLV-Viruskassetten enthält. Genomische DNA wird verdaut und mit einem kompatiblen Linker ligiert und die Übergänge zwischen den viralen 3'-LTRs und dem Wirtsgenom werden durch LM-PCR amplifiziert. VirUs-Host-Genom-Junctions werden dann massiv mit Roche- oder Illumina-Plattformen sequenziert. Schließlich werden mLV-Integrationsstellen dem menschlichen Genom zugeordnet, um genomische Cluster von wiederkehrenden Insertionsstellen zu definieren.
Verstärkung der mLV-Integrationsstellen durch LM-PCR
Die LM-PCR ist in Abbildung 2 dargestellt. Genomische DNA wird aus mLV-transduzierten Zellen extrahiert und mit dem Tru9I-Restriktionsenzym verdaut, das häufig das menschliche Genom schneidet und Fragmente mit einer mittleren Länge von 70 bp erzeugt. Ein zweites Restriktionsenzym (PstI) wird verwendet, um die Amplifikation von integrierten und nicht integrierten internen 5'-LTR-Fragmenten zu verhindern. Ein Tru9I-Doppelstrang-Linker wird dann an die genomischen Fragmente ligiert und LM-PCR wird mit für den Linker spezifischen Primern durchgeführt Die 3 'LTR zur Verstärkung der Virus-Host-Genom-Übergänge. Nested PCR kann mit pri durchgeführt werdenMers kompatibel mit Roche oder Illumina Sequenzplattformen.
Analyse von Virus-Host-Genom-Junction-Ampullen
In dem in Abbildung 3 dargestellten Experiment wurden CD34 - CD13 + myeloide Vorläufer / Vorläufer (MPP) gereinigt und mit einem mLV-abgeleiteten Retrovirus transduziert, das das eGFP-Reportergen exprimiert. Mehr als 60% der MPP-Zellen exprimierten eGFP 48 h nach der Transduktion (Daten nicht gezeigt). 15 Tage nach der Transduktion sammelten wir die Zellen, extrahierten gDNA und amplifizierten die Virus-Host-Genom-Übergänge, wie oben beschrieben. Ein Aliquot der gepoolten LM-PCR-Produkte wurde auf ein 1% Agarosegel geladen, um das Vorhandensein und die Größe der Ampullen zu verifizieren. Wir haben erfolgreich einen DNA-Abstrich visualisiert, der den LM-PCR-Produkten unterschiedlicher Größe entspricht, die von 150 bis 500 bp reichen (Abbildung 3A ). Amplicons waren dannKonzentriert durch DNA-Präzipitation und beladen auf ein 1% Agarosegel. LM-PCR-Produkte wurden gelgereinigt und auf einem Bioanalysatorsystem durchgeführt und bestätigten die erwarteten Amplikongrößen (zwischen 150 und 500 bp, Abbildung 3B ).
Mapping von mLV-Integrationen in aktive und zellspezifische regulatorische Regionen
In dem in Abbildung 4 berichteten Experiment wurden hämatopoetische Stamm- / Vorläuferzellen (HSPC), erythroide Vorläufer / Vorläufer (EPP) und myeloide Vorläufer / Vorläufer (MPP) mit einem mVV-abgeleiteten retroviralen Vektor transduziert. Diese Ergebnisse wurden durch Verarbeitungs- und Sequenzierungsproben erhalten, die von verschiedenen Zelltypen getrennt abgeleitet wurden, um die potentiellen Kontamination / Kollisionen 18 , 19 zu vermeiden. Die durch massive Sequenzierung erzeugten Rohsequenzen wurden durch eine automatisierte Bioinformatik verarbeitetPipeline zur Beseitigung von Virus- und Linker-Sequenzen. Dann wurden einzigartige Sequenzen von mindestens 20 bp auf das menschliche Genom unter Verwendung von Blat 17 abgebildet. Raw-Ausrichtungen wurden gefiltert, so dass die Übereinstimmung innerhalb der ersten 3 Nukleotide, eindeutige Streichhölzer und ein Minimum von 95% Identität beginnen sollte. Cluster von rezidivierenden mLV-Integrationen wurden durch einen statistischen Vergleich mit einem Datensatz von zufälligen genomischen Sequenzen definiert, die zufällig die Genomspositionen aus dem menschlichen Genom mit einem Tru91-Restriktionsmotiv in einer mit der Sequenzierungsplattform kompatiblen Distanz extrahierten. Kontrollsequenzen wurden dann durch die gleiche Mapping- und Filter-Pipeline verarbeitet, die für Integrationssequenzen verwendet wurde, um einen zufälligen Satz von einzigartigen Websites zu erzeugen. Um mLV-Cluster zu definieren, haben wir den DBSCAN-Clustering-Algorithmus 19 angewendet, wobei die Verteilung der aufeinanderfolgenden mLV-Integrationen mit der einer gleichen Anzahl von zufälligen Standorten verglichen wird, um Bereiche von hochgruppierten Integrationen zu identifizieren, die defIne zellspezifischen regulatorischen Elementen 7 , 14 , 15 . Um die Erzeugung von falschen Clustern zu vermeiden, wurden mehrere Extraktionen aus dem zufälligen Kontroll-Dataset durchgeführt. Wir wurden durch LM-PCR und Pyrosequenzierung 32.574, 27.546 und 36.358 mLV Integrationsstellen in HSPC, EPP und MPP zugeordnet. Cluster von rezidivierenden mLV-Integrationen, die mit acetylierten Enhancern und Promotoren co-mapped sind (Abbildung 4A ). Die meisten der mLV-zielgerichteten regulatorischen Regionen waren zellspezifisch, wie: (i) der Promotor des HSPC- spezifischen SPINK2- Gens ( Abbildung 4B ); (Ii) die Locus-Kontrollregion, die potent Enhancer der erythroidspezifischen β-ähnlichen Globin-Gene enthält (Abbildung 4C ); (Iii) Enhancer, die stromaufwärts des MPP-spezifischen LYZ- Gens lokalisiert sind ( 4D ). Schließlich haben wir Luciferase-Assays verwendet, um zu validierenEine Teilmenge von putativen zellspezifischen mLV-zielgerichteten Enhancern in EPP und MPP (Abbildung 4E ).
Abbildung 1: Ein allgemeines Schema der Methode der retroviralen Integrationsstelle. Zielzellen werden mit einem mVV-basierten retroviralen Vektor transduziert, der eine eGFP-Kassette enthält. Genomische DNA, die aus transduzierten Zellen erhalten wird, wird mit Tru9I verdaut und mit einem kompatiblen Tru9I-Doppelstrang-Linker ligiert. MLV-Integrationsstellen wurden durch verschachtelte LM-PCR amplifiziert und die Bibliothek von Virus-Host-Genom-Übergängen kann mit Hilfe von Illumina- oder Roche-Plattformen massiv sequenziert werden. Die resultierenden Lasten wurden dem menschlichen Genom zugeordnet, um Cluster von rezidivierenden mLV-Integrationen zu definieren. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen. </ P>
Abbildung 2: Amplifikation von Virus-Host-Genom-Übergängen durch LM-PCR. Genomische DNA (gDNA), die das integrierte mLV-Provirus enthält, wird mit Tru9I- und PstI-Restriktionsenzymen verdaut und mit einem kompatiblen Tru9I-Linker ligiert. Nested PCR wird unter Verwendung von Primern durchgeführt, die für die LTR und den Linker spezifisch sind. Tru9I- und PstI-Restriktionsstellen im viralen und im menschlichen Genom sind indiziert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 3: Analyse von LM-PCR-Ampullen. ( A ) LM-PCR-Produkte (Spur +) wurden auf einem 1% Agarosegel durchgeführt und sichtbar gemachtDurch Ethidiumbromidfärbung. Eine No-Template-Probe diente als Negativkontrolle Probe, wo nur PCR-Primer visualisiert wurden (Spur -). ( B ) Nach der Gelreinigung wurde die LM-PCR-Produktgröße durch Mikrokapillar-Elektrophorese überprüft. Die Probengröße (bp) und die Fluoreszenzintensität (FU) sind jeweils auf x- und y-Achsen des Elektropherogramms dargestellt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 4: Abbildung der mLV-Integration in epigenetisch definierte Regulationsregionen ( A ) Wir definierten 3,498, 2,989 und 4,103 Cluster von rezidivierenden mLV-Integrationsstellen in HSPC, EPP und MPP. In jeder Zellpopulation überlappten sich> 95% der mLV-Cluster mit epigenetisch definierten VerbesserungenUnd promoter ( B , C und D ) Zellspezifische mLV-zielgerichtete Regionen waren hoch acetyliert und mit der zellspezifischen Expression des Zielgens ( SPINK2 , HBB und LYZ , fast ausschließlich exprimiert in HSPC, EPP und MPP, jeweils bestimmt Durch Cap-Analyse von Genexpression). MLV einzelne integrationen sind mit kleinen stangen dargestellt. TPM zeigt Tag pro Million an. ( E ) Putative zellspezifische mLV-zielgerichtete Enhancer in EPP und MPP. Fig. 4 ist aus dem Bezugszeichen 14 angepaßt. Wir erhielten die Erlaubnis, diese Zahl unter der Creative Commons Lizenz wieder zu verwenden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
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Discussion
Hier haben wir ein Protokoll zur genomweiten Kartierung der Integrationsstellen von mLV beschrieben, ein Retrovirus, das Chromatinregionen anspricht, epigenetisch als aktive Promotoren und Enhancer markiert. Kritische Schritte und / oder Einschränkungen des Protokolls umfassen: (i) mLV-Transduktion der Zielzellpopulation; (Ii) Amplifikation von Virus-Host-Übergängen durch LM-PCR; (Iii) Abrufen eines hohen Anteils an Integrationsstellen. MLV-basierte retrovirale Vektoren effizient transduzierende Zellen. Die geringe Effizienz der Transduktion von nicht-teilenden Zellen (zB post-mitotische neuronale Zellen) ist eine mögliche Einschränkung dieser Technik. Allerdings kann es durch Zellsortierung der transduzierten Population auf der Grundlage der Expression des Reportergens ( zB eGFP) überwunden werden. Die Erzeugung von relativ kurzen Ampullen durch LM-PCR (150 bis 500 bp) ist zwingend erforderlich, um eine Bibliothek von Amplikonen zu erstellen, die mit den derzeit verwendeten massiven Sequenzierungsstrategien kompatibel ist und ein umfassendes Gen ermöglichtOme-weite Analyse der mLV-Integrationsstellen. Als Beispiel kann die Amplifikation von> 500 bp langen LM-PCR-Produkten entweder aus einer partiellen genomischen DNA-Verdauung oder einer Intra-Ligation von Tru9I-verdauten genomischen Fragmenten resultieren, wie durch Schrotflinten-Klonierung von LM-PCR-Ampullen (Daten nicht gezeigt) bewertet. Im ersten Fall kann das Problem durch weitere Optimierung der genomischen DNA-Verdauungsbedingungen gelöst werden, während im letzteren Fall die erfolgreiche massive Sequenzierung von mLV-Integrationsstellen durch eine Gelreinigung von Ampullen zwischen 150 und 500 bp erreicht werden kann. Schließlich kann die Verwendung von Restriktionsenzymen, um die genomische DNA zu schneiden, zu einer bevorzugten Amplifikation und Detektion von Integrationsstellen führen, die nahe an einer Restriktionsstelle liegen. Der Prozentsatz der Integrationsstellen, die das Tru9I-Restriktionsenzym abrufen kann, wird auf 50% geschätzt. Somit kann diese Technik weiter optimiert werden, um die Wiederherstellung der Integrationsstelle zu verbessern, indem mehrere Restriktionsenzyme verwendet werden oder die zufällige DNA-Sheari durchgeführt wirdNg durch Beschallung 20 , 21 .
In letzter Zeit haben wir die Sequenzierung von viralen Integrationsstellen mit der weit verbreiteten Illumina-Plattform optimiert, wie in dieser Arbeit beschrieben. Dieser Sequenzierungsansatz ermöglicht die Erzeugung einer höheren Anzahl von Lesevorgängen pro Lauf im Vergleich zur Roche-Plattform, was die Anzahl der aus einem einzigen Experiment entnommenen Integrationsstellen stark erhöht und damit die Zeit und die Kosten weltweit reduziert.
Die genomweite Identifizierung von zellspezifischen regulatorischen Regionen erfordert die Abbildung von ein bis drei Histonmodifikationen durch ChIP-seq 6 (Mono- und Tri-Methylierung von Histon H3-Lysin 4 zur Identifizierung von Enhancern und Promotoren und H3K27ac zur Unterscheidung zwischen aktivem und inaktivem Regulatorische Elemente) 4 , 5 , 6 und ein systematischer Vergleich verschiedener Zelltypen zu definierenCis-aktive Elemente, die ausschließlich in einer bestimmten Zellpopulation aktiv sind. Wir migrierten mLV-Integrationsstandorte in prospektiv isolierten Zielzellpopulationen wie multipotenten hämatopoetischen Progenitoren und deren engagierten Erythroid- und Myeloid-Nachkommen 14 , embryonalen Stammzellen, neuroepithelialen Stammzellen und differenzierten Keratinozyten 15 . Das retrovirale Scannen ermöglichte die genomweite Definition von zellspezifischen regulatorischen Elementen in jeder untersuchten Zellpopulation, so dass die vergleichenden genomweiten Studien nicht unbedingt notwendig waren. Wichtig ist, dass dieses Werkzeug zur Identifizierung von aktiven regulatorischen Elementen in seltenen Zellpopulationen ( zB somatische Stammzellen) verwendet werden kann, die keine robusten Marker für eine prospektive Isolation aufweisen und nicht durch ChIP-seq-basierte Analyse von Histonmodifikationen analysiert werden können 15 . In diesen Zellpopulationen ist die mLV-Integration ein permanenter genetischer Marker von aktiven regulatorischen Regionen, so dass thEare retrospektive Identifizierung in der reichlich vorhandenen Zell-Nachkommen in vitro und in vivo. Als Beispiel haben wir mLV-Integrationscluster erfolgreich als Surrogatmarker von Promotoren und Enhancern in einer retrospektiv identifizierten Keratinozyten-Stammzell- (KSC-) Population eingesetzt. Wir führten eine vorübergehende, vorhautabgeleitete Keratinozytenkultur mit KSCs mit einem mLV-Vektor um, dann passierten wir diese Zellen für> 35 Zellverdopplungen, um die Nachkommenschaft von KSCs zu bereichern, also definiert durch ihre Fähigkeit, die Kultur für diese Zahl zu erhalten Passagen In diesem Fall markierten die mLV-Integrationen permanent die regulatorischen Regionen, die in der ursprünglichen transduzierten KSC-Population aktiv waren 15 . Zukünftige Studien zielen darauf ab, in einer genomweiten Weise zellspezifische regulatorische Elemente in einer größeren Anzahl von seltenen menschlichen Stammzellpopulationen zu identifizieren.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts zu offenbaren.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde durch Stipendien des Europäischen Forschungsrates (ERC-2010-AdG, GT-SKIN), des italienischen Ministeriums für Bildung, Universitäten und Forschung (FIRB-Futuro in Ricerca 2010-RBFR10OS4G, FIRB-Futuro in Ricerca 2012-RBFR126B8I_003) unterstützt , EPIGEN Epigenomics Flagship Project), das italienische Gesundheitsministerium (Young Researchers Call 2011 GR-2011-02352026) und die Imagine Institute Foundation (Paris, Frankreich).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PBS, pH 7.4 | ThermoScientific | 10010031 | or equivalent |
| Fetal Bovine Serum | ThermoScientific | 16000044 | or equivalent |
| 0.2 ml tubes | general lab supplier | ||
| 1.5 ml tubes | general lab supplier | ||
| QIAGEN QIAmp DNA mini Kit | QIAGEN | 51306 | or equivalent |
| T4 DNA ligase | New England BioLabs | M0202T | |
| T4 DNA Ligase Reaction buffer | New England BioLabs | M0202T | |
| Linker Plus Strand oligonucleotide | general lab supplier | 5’-PO4-TAGTCCCTTAAGCGGAG-3’ (Purification grade: SDS-PAGE) | |
| Linker Minus Strand oligonucleotide | general lab supplier | 5’-GTAATACGACTCACTATAGGGCTCCGCTTAAGGGAC-3’ (Purification grade: SDS-PAGE) | |
| Tru9I | Roche-Sigma-Aldrich | 11464825001 | |
| SuRE/Cut Buffer M | Roche-Sigma-Aldrich | 11417983001 | |
| PstI | Roche-Sigma-Aldrich | 10798991001 | |
| SuRE/Cut Buffer H | Roche-Sigma-Aldrich | 11417991001 | |
| Platinum Taq DNA Polimerase High Fidelity | Invitrogen | 11304011 | |
| 10 mM dNTP Mix | Invitrogen | 18427013 | or equivalent |
| PCR grade water | general lab supplier | ||
| 96-well thermal cycler (with heated lid) | general lab supplier | ||
| linker primer | general lab supplier | 5’-GTAATACGACTCACTATAGGGC-3’ (Purification grade: PCR grade) | |
| MLV-3’ LTR primer | general lab supplier | 5’-GACTTGTGGTCTCGCTGTTCCTTGG-3’ (Purification grade: PCR grade) | |
| linker nested primer 454 | general lab supplier | 5’-GCCTTGCCAGCCCGCTCAG[AGGGCTCCGCTTAAGGGAC](Purification grade: SDS-PAGE) | |
| MLV-3’ LTR nested primer 454 | general lab supplier | 5’-GCCTCCCTCGCGCCATCAGTAGC[GGTCTCCTCTGAGTGATTGACTACC](Purification grade: SDS-PAGE) | |
| linker nested primer Illumina | general lab supplier | 5'-TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAG-[AGGGCTCCGCTTAAGGGAC](Purification grade: SDS-PAGE) | |
| MLV-3’ LTR nested primer Illumina | general lab supplier | 5'-GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAG-[GGTCTCCTCTGAGTGATTGACTACC](Purification grade: SDS-PAGE) | |
| Sodium Acetate Solution (3M) pH 5.2 | general lab supplier | ||
| Ethanol (absolute) for molecular biology | Sigma-Aldrich | E7023 | or equivalent |
| Topo TA Cloning kit (with pCR2.1-TOPO vector) | Invitrogen | K4500-01 | |
| QIAquick Gel Extraction kit | QIAGEN | 28704 | |
| Agarose | Sigma-Aldrich | A9539 | or equivalent |
| Ethidium bromide | Sigma-Aldrich | E1510 | or equivalent |
| 100 bp DNA ladder | Invitrogen | 15628019 | or equivalent |
| 6x Loading Buffer | ThermoScientific | R0611 | or equivalent |
| NanoDrop 2000 UV-Vis Spectrophotometer | ThermoScientific | ND-2000 | |
| Nextera XT Index kit | Illumina | FC-131-1001 or FC-131-1002 | |
| 2x KAPA HiFi Hot Start Ready Mix | KAPA Biosystems | KK2601 | |
| Dynal magnetic stand for 2 ml tubes | Invitrogen | 12321D | or equivalent |
| Agencourt AMPure XP 60 ml kit | Beckman Coulter Genomics | A63881 | |
| Tris-HCl 10 mM, pH 8.5 | general lab supplier | ||
| Agilent 2200 TapeStation system | Agilent Technologies | G2964AA | or equivalent |
| D1000 ScreenTape | Agilent Technologies | 5067-5582 | or equivalent |
| D1000 Reagents | Agilent Technologies | 5067-5583 | or equivalent |
| KAPA Library Quantification Kit for Illumina platforms (ABI Prism) | KAPA Biosystems | KK4835 | |
| ABI Prism 7900HT Fast Real-Time PCR System | Applied Biosystems | 4329003 | |
| NaOH 1.0 N, molecular biology-grade | general lab supplier | ||
| HT1 (Hybridization Buffer) | Illumina | Provided in the MiSeq Reagent Kit | |
| MiSeq Reagent Kit v3 (150 cycles) | Illumina | MS-102-3001 | |
| MiSeq System | Illumina | SY-410-1003 | |
| PhiX Control v3 | Illumina | FC-110-3001 |
References
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