Summary
ここでは、ヒト細胞におけるモロニーマウス白血病ウイルスベースのレトロウイルスベクターの組み込み部位のゲノムワイドマッピングのためのプロトコールについて記載する。
Abstract
モロニーマウス白血病（MLV）ウイルスベースのレトロウイルスベクターは、主にアセチル化エンハンサーおよびプロモーターに組み込まれる。この理由から、mLV組込み部位は、活性調節エレメントの機能的マーカーとして使用することができる。ここでは、細胞特異的エンハンサーおよびプロモーターのゲノムワイドな同定を可能にするレトロウイルススキャニングツールを紹介します。簡潔には、標的細胞集団をmLV由来ベクターで形質導入し、ゲノムDNAを頻繁に切断する制限酵素で消化する。適合するDNAリンカーでゲノム断片をライゲーションした後、リンカー媒介ポリメラーゼ連鎖反応（LM-PCR）により、ウィルス - ホストゲノム接合の増幅が可能になる。アンプリコンの大規模な配列決定は、全ゲノムのmLVインテグレーションプロファイルを定義するために使用されます。最後に、細胞型特異的転写プログラムの活性化に関与する細胞特異的調節領域を同定するために、反復インテグレーションのクラスターを定義する。
例えば、体細胞幹細胞）の遡及的同定のための道具技術を表す。
Introduction
細胞同一性は、特定の遺伝子セットの発現によって決定される。プロモーターおよびエンハンサーのようなシス調節要素の役割は、細胞型特異的転写プログラムの活性化にとって重要である。これらの調節領域は、特異的ヒストン修飾、転写因子および補因子結合、およびクロマチン接近可能性などの特定のクロマチン特徴によって特徴づけられ、いくつかの細胞タイプ1,2,3 においてそのゲノムワイド同定に広く使用されている。特に、ヒストンH3リジン27（H3K27ac）のアセチル化のゲノムワイドプロファイルは、一般に、活性プロモーター、エンハンサーおよびスーパーエンハンサー4,5,6を定義するために使用される。
モロニーマウス白血病ウイルス（MLV）は、遺伝子に広く使用されているガンマ - レトロウイルスである哺乳動物細胞での転移。標的細胞を感染させた後、レトロウイルスRNAゲノムは、ウイルスおよび細胞タンパク質に結合して、前組み込み複合体（PIC）を構築する二本鎖DNA分子に逆転写される。 PICは核に入り、宿主細胞のクロマチンに結合する。ここで、重要なPIC成分であるウィルスインテグラーゼは、プロウイルスDNAの宿主細胞ゲノムへの組み込みを媒介する。ゲノムDNAにおけるmLVの組込みは、ランダムではなく、細胞特異的様式で、プロモーターおよびエンハンサーのような活性なシス調節エレメントにおいて起こる（7,8,9,10）。この特有の組込みプロファイルは、mLVインテグラーゼと細胞ブロモドメインおよび外胚葉ドメイン（BET）タンパク質11,12,13との間の直接的相互作用によって媒介される。 BETタンパク質（BRD2、BRD3、およびBRD4）は、宿主のクロマチンとmLV PICとの間の橋渡しとして作用する：それらのブロモドメインを介して、高度にアセチル化されたシス調節領域を認識するが、外側のドメインはmLVインテグラーゼ11,12,13と相互作用する。
ここでは、mLVの統合特性に基づいて活性なシス調節領域をマッピングするための新規ツールであるレトロウイルススキャニングについて説明します。簡潔に述べると、細胞は、増強緑色蛍光タンパク質（eGFP）レポーター遺伝子を発現するmLV由来レトロウイルスベクターで形質導入される。ゲノムDNA抽出後、mLVベクターの3 '末端反復配列（LTR）とゲノムDNAとの間の接合部をリンカー媒介PCR（LM-PCR）によって増幅し、大量配列決定する。 mLV組み込み部位はヒトゲノムにマッピングされ、mLVによって高度に標的化されるゲノム領域はmLV組み込み部位のクラスターとして定義される。
レトロウイルススキャンいくつかのヒト初代細胞14,15 において、細胞特異的活性調節エレメントを定義するために使用された。エピジェネティックに定義されたプロモーターおよびエンハンサー（ほとんどがH3K27acなどの活性ヒストンマークを有し、細胞特異的である）と共マップされたmLVクラスターである。レトロウイルススキャニングは、前向きに単離された細胞集団7,14、ならびにケラチノサイト幹細胞のような遡及的に規定された細胞集団において、将来の単離のための有効なマーカーを欠くゲノムワイドな同定を可能にする15 。
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Protocol
1.ヒト細胞のMLV形質導入
- 標的細胞を単離し、eGFPレポーター遺伝子を有し、水疱性口内炎ウイルスG（VSV-G）または両性エンベロープ糖タンパク質16でシュードタイピングしたmLV由来レトロウイルスベクターでそれらを形質導入する。
- 以下の分析のために、偽形質導入細胞を陰性対照として保つ。 mLVベースのレトロウイルスベクターは効率的に分裂している細胞に形質導入できるので、細胞分裂を刺激する条件で標的細胞集団を培養する。形質導入条件は、研究中の各細胞型について特異的に最適化する必要がある。ヒト造血前駆体、T細胞および表皮細胞の細胞増殖および形質導入条件は参考文献7,14,15および17に記載されている。
- 形質導入の48時間後、2％ウシ胎仔血清を含むリン酸緩衝食塩水（PBS）300μLに100,000細胞を再懸濁し、eGFP発現をf低サイトメトリー分析（488nm励起レーザー）。陰性対照として偽形質導入細胞を使用する。最適な組込み部位検索のために、蛍光活性化細胞選別（FACS）によりGFP +細胞を精製する。
- ゲノムDNA調製のために0.5〜500万個の細胞を収集する。分化していないプロウイルスを希釈するためにはより長い培養期間（> 7日間）が好ましく、 真正幹細胞の長期間の子孫を分析する場合には必要である（ 討論欄および参考文献15参照）。細胞ペレットをスナップ凍結し、使用するまで-80℃で保存することができます。
リンカー媒介PCR（LM-PCR）によるmLV組み込み部位の増幅は、
- ゲノムDNA（gDNA）の調製
- カラムベースのDNA抽出キットを使用してgDNAを抽出し、製造元の指示に従って培養細胞のプロトコールに従う。
- 制限酵素消化に
- 1.5 mLのチューブで1サンプルあたり4つの制限酵素消化を設定します。 1μLのTru9I（10U）と1μLのBuffer Mを最終容量10μLで加えることにより、各チューブに0.1〜1μggDNAを消化する。反応液を65℃で6時間または一晩インキュベートする。
- 各反応物に1μLのPstI（10U）、1μLの緩衝液Hおよび8μLの水を加える。 37℃で6時間または一晩反応をインキュベートする。サンプルは使用するまで-20℃で保存することができます。
- リンカーライゲーション
- 100μM濃度のリンカープラス鎖およびリンカーマイナス鎖オリゴヌクレオチドを混合することにより、1.5mLチューブ中の100μMのTru9Iリンカーストック溶液を調製する。チューブを100℃にセットした水に入れ、室温で冷却させます。 Tru9Iリンカーストック溶液は、使用するまで-20℃で保存することができます。
- 1.5mLのチューブで8個のリンカーライゲーション反応をセットアップする。各反応について、以下の成分10μLの制限酵素消化：1.4μLの10X T4 DNAリガーゼ反応緩衝液、1μLの10μMリンカーTru9I、1μL（2,000U）のT4 DNAリガーゼおよび0.6μLの水。 16℃で3〜6時間インキュベートする。サンプルは使用するまで-20℃で保存することができます。
- 最初のPCR
- 0.2mLチューブ中で48のPCR反応（各ライゲーションチューブから6反応）をセットアップする。各PCRについて、以下の試薬を2μLのライゲーション反応に添加する：5μLの10X PCRバッファー、2μLの50 mM硫酸マグネシウム、1μLの10 mMデオキシヌクレオチド（dNTP）Mix、1μLの10μMリンカープライマー、1 10μMmLV-3'LTRプライマーμL、Taq DNAポリメラーゼ0.3μL（1.5U）および水37.7μLを添加した。プライマー配列を表1に示す。
- 次のように、加熱された蓋付きのサーマルサイクラーでPCR反応を行います：95℃で2分間; 95℃で15秒、55℃で30秒、72℃で1分のサイクルを25サイクル; 72°; 5分間C; 4℃で保持する。サンプルは使用するまで-20℃で保存することができます。
- 第2のPCR
- 0.2mLチューブ中で48のPCR反応（各「最初のPCR」チューブから1つ）をセットアップする。各PCRについて、以下の成分を2μLの第1のPCR反応に加える：5μLの10X PCR緩衝液、2μLの50mM硫酸マグネシウム、1μLの10mM dNTP Mix、1μLの10μMリンカーネスト化プライマー、1μL 10μMのmLV-3'LTR入れ子プライマー、0.3μLのTaq DNAポリメラーゼ（1.5U）および37.7μLの水を含む。選択された特定の巨大な配列決定戦略のために設計されたネストされたプライマーを使用する：（i）リンカーネストプライマーおよびイルミナプラットフォームと適合するmLV-3 'LTRネストプライマー; （ii）Rocheプラットフォームに適合するリンカーネステッドプライマーおよびmLV-3'LTRネストプライマー。プライマー配列を表1に示す 。
- 次のように、加熱された蓋付きのサーマルサイクラーでPCR反応を行います：95℃で2分間; 2595℃で15秒、58℃で30秒、72℃で1分のサイクル; 72℃で5分間; 4℃で保持する。サンプルは使用するまで-20℃で保存することができます。
- 48 mLの入れ子になったPCR反応液を15 mLチューブ（最終容量〜2.4 mL）にプールする。サンプルは使用するまで-20℃で保存することができます。
- アガロースゲル電気泳動によってLM-PCR産物の存在およびサイズを決定する。
- 4μLのLoading Bufferを20μLのLM-PCR産物に加え、サンプルを100 bp DNAラダーとともに1％アガロースゲルにロードします。ゲルを5V / cmで30〜60分間泳動し、エチジウムブロマイド染色によってPCR産物を視覚化する。
- ネガティブコントロールとして偽形質導入サンプルからLM-PCR反応を行う。
- 0.1容量の酢酸ナトリウム溶液（3M; pH5.2）および2.5容量の100％エタノールを加えることによってアンプリコンを沈殿させる。混合し、-80℃で20分間凍結させる。
- フーでスピン標準微量遠心分離機で4℃、20分間スピードアップします。上清を捨て、ペレットを70％エタノールで洗浄する。 4℃で5分間標準マイクロ遠心分離機で最高速度でスピンします。
- 上清を捨て、ペレットを空気乾燥する。 PCR等級の水200μLを加え、DNAを再懸濁する。サンプルは使用するまで-20℃で保存することができます。
- LM-PCR産物100μLにLoading Buffer20μLを添加し、サンプルを100％DNAラダーとともに1％アガロースゲルにロードします。
- ゲルを5V / cmで30〜60分間流し、150〜500bpのアンプリコンを含むゲル部分を切断する。
- カラムベースのゲル抽出キットでLM-PCR産物を精製し、UV分光光度計を使用して濃度を測定する。
- メーカーの指示に従って、バイオアナライザを使用してLM-PCR産物の長さを評価するために、1μLのライブラリーを使用する。
- 20 ngの精製LM-PCR産物を使用し、pCR2.1-TOPOベクター中で製造業者の指示に従ってクローン化する。
- 得られた配列のゲノムマッピングを行ってM13ユニバーサルプライマーを用いたシークエンシング反応を行い、適切なサンプルを同定するためにクローンの> 50％のウイルスゲノム接合部（mLV-3 'LTRネストプライマーを含む）の存在を明らかにする大規模な配列決定のため。ウイルスゲノム接合部の例：
MLV-3 'LTRネストプライマー454およびリンカーネステッドプライマー454（ 表1 ）を太字で示し、ウイルスLTRの3'末端をイタリックで示す。ヒトゲノム配列は赤色のテキストで強調表示されている（chr10：6439408-6439509、hg19）。
3. mLV統合サイトの大規模配列決定
注：LM-PCRは市販のプラットフォームを使用して配列決定することができます（2回目のPCR反応で適切な入れ子になったプライマー対を選択します（2.5.1項を参照）。 Roche GS-FLXパイロシーケンシングプラットフォームによるシークエンシングについては、以前の論文7,14,15を参照してください。このセクションでは、Illuminaシーケンシングプラットフォームのために新たに最適化されたプロトコルについて説明します。
- 図書館の準備
- 0.2 mLのチューブで1サンプルあたり1回のインデックスPCR反応を設定します。各PCRについて、精製LM-PCR産物5μL（150-170ng）に以下の試薬を添加する：5μLのIndexPrimer1,5μLのIndexPrimer2,25μLの2X Master Mixおよび10μLのPCR-グレードの水。各サンプルに異なるインデックスの組み合わせを使用します。
- 次のように、加熱された蓋付きのサーマルサイクラーでPCR反応を行います：95℃で3分間; 95℃で30秒間、55℃で30秒間、72℃で30秒間の8サイクル; 72℃5mに; 4℃で保持する。
- 固相可逆固定（SPRI）ビーズ分離プロトコルを使用してPCR産物を精製する：新しい1.5mLチューブで、各サンプルにビーズ56μLを加え、製造業者の指示に従う。 25μLのTris-HCl（10mM）で溶出する。ライブラリは、使用するまで-20℃で保存することができます。
- ライブラリチェック
- バイオアナライザを使用してライブラリのサイズを評価するには、1μLのサンプルを使用します。
- メーカーの指示に従って、蛍光ベースのリアルタイムPCRアッセイを使用してライブラリーモル濃度を定量するために1μLのサンプルを使用します。
- ライブラリーの希釈およびシークエンシング
- Tris-HCl 10mMを用いて10nMにライブラリを希釈する。ライブラリーをプールするために、各希釈ライブラリー5μLを新しい1.5mLチューブに移し、次いでプールをTris-HCl 10mM中で4nMに希釈する。
- 5μLの希釈したプールを5μLの0.2N NaOHと新たに1.5mで混合する。Lチューブに入れ、短時間ボルテックスし、スピンダウンし、室温で5分間インキュベートしてライブラリーを変性させる。
- チューブを氷上に置き、予冷したハイブリダイゼーション緩衝液（HT1）990μLを加える。新しい1.5mLチューブに300μLの変性プールを分注し、300μLの予備冷却したHT1を添加して、10μM最終ライブラリープールを得る。
- 並行して、2mLのPhiXコントロールライブラリー（10nM）を3mLのTris-HCl 10mMと1.5mLのチューブに混合する。 5μLのNaOH 0.2Nを添加し、短時間ボルテックスし、スピンダウンし、室温で5分間インキュベートして、希釈したPhiXを変性させる。チューブを氷上に置き、予め冷却したHT1990μLを加える。
- 新たな1.5mLチューブに300μLの変性PhiXを分注し、予め冷却したHT1300μLを加えて10μMの最終PhiXを得る。
- 新しい1.5mLチューブに、変性ライブラリープール510μLを変性PhiXライブラリー90μLと混合し、15％PhiXコントロールを含む最終10pMプールを得る。
- これらのサンプル600μLをピペット容積を解凍したシーケンシング試薬カートリッジのロードサンプルリザーバーに入れ、直ちにシングルリード150サイクルを実行します。
注：このプロトコールに必要な重要な試薬およびプライマー配列を表1に示します。
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Representative Results
レトロウイルススキャニング手順のワークフロー
レトロウイルススキャニング手順のワークフローは図1に図式化されています。標的細胞集団を精製し、eGFPレポーター遺伝子を発現するmLV由来のレトロウイルスベクターで形質導入する。導入遺伝子には、2つの同一の長い末端反復（5 'および3'LTR）が隣接し、ウイルスゲノムの合成、逆転写および宿主DNAへの組み込みを確実にする。形質導入効率は、eGFP発現のFACS分析によって評価される。高比率（> 30％）のmLV形質導入細胞を含む細胞集団を増幅し、続いて溶解して、mLVウイルスカセットを含むゲノムDNAを抽出する。ゲノムDNAを消化し、互換性のあるリンカーで連結し、ウイルス3'LTRと宿主ゲノムとの間の接合部をLM-PCRにより増幅する。ヴィルその後、我々の宿主ゲノム接合部はRocheまたはIlluminaプラットフォームを用いて大規模に配列決定される。最後に、mLV組込み部位をヒトゲノムにマッピングして、反復挿入部位のゲノムクラスターを規定する。
LM-PCRによるmLV組込み部位の増幅
LM-PCRを図2に示す 。ゲノムDNAをmLV形質導入細胞から抽出し、Tru9I制限酵素で消化し、ヒトゲノムを頻繁に切断し、中央値70bpの断片を生成する。第2の制限酵素（PstI）を用いて、組み込まれたおよび組み込まれていない内部5'LTRフラグメントの増幅を防止する。次いで、Tru9I二本鎖リンカーをゲノムフラグメントに連結し、LM-PCRを、リンカーに特異的なプライマーおよびウイルス - 宿主ゲノム接合部を増幅するための3 'LTR。ネストされたPCRはpriを使用して実行できますRocheまたはIlluminaシーケンシングプラットフォームと互換性があります。
ウイルス - ホストゲノム接合部アンプリコンの解析
図3に示す実験では、CD34 - CD13 +骨髄前駆細胞/前駆細胞（MPP）を精製し、eGFPレポーター遺伝子を発現するmLV由来のレトロウイルスでそれらを形質導入した。 MPP細胞の60％以上が形質導入後48時間でeGFPを発現した（データは示されていない）。形質導入の15日後、上記のように、細胞を回収し、gDNAを抽出し、ウイルス - 宿主ゲノム接合部を増幅させた。プールされたLM-PCR産物のアリコートを1％アガロースゲルに負荷して、アンプリコンの存在およびサイズを確認した。本発明者らは150〜500bpの異なるサイズのLM-PCR産物に対応するDNAスメアを視覚化することに成功した（ 図3A ）。その後、アンプリコンはDNA沈殿により濃縮し、1％アガロースゲルに負荷した。 LM-PCR産物をゲル精製し、バイオアナライザーシステム上で実行し、予想されるアンプリコンサイズ（150〜500bp; 図3B ）を確認した。
mLV組み込みの活性および細胞特異的調節領域へのマッピング
図4に報告された実験では、造血幹/前駆細胞（HSPC）、赤血球前駆細胞/前駆細胞（EPP）および骨髄球前駆細胞/前駆細胞（MPP）をmLV由来のレトロウイルスベクターで形質導入した。これらの結果は、潜在的な汚染/衝突を避けるために、異なる細胞型から別々に得られた試料の処理および配列決定を行った18,19。大規模配列決定によって生成された生の配列の読み取りは、自動バイオインフォマティクスウィルスおよびリンカー配列を排除する。次に、少なくとも20bpのユニークな配列を、Blat 17を用いてヒトゲノム上にマッピングした。未処理のアライメントは、最初の3ヌクレオチド内で開始する一致、一義性の一致および最低95％の同一性を必要とするようにろ過された。反復mLVインテグレーションのクラスタは、シーケンシングプラットフォームと互換性のある距離でTru91制限モチーフを用いてヒトゲノムからゲノム位置を無作為に抽出して生成したランダムゲノム配列のデータセットとの統計的比較により定義した。制御配列は、次に、統合配列に使用される同じマッピングおよびフィルタリングパイプラインを介して処理され、一意的な部位のランダムなセットを生成する。 mLVクラスタを定義するために、我々はDBSCANクラスタリングアルゴリズム19を適用し、連続するmLV積分の分布を等しくランダムなサイトの分布と比較して、高度にクラスタ化された積分の領域を特定したine細胞特異的調節エレメント7,14,15。誤ったクラスタの発生を回避するために、ランダム制御データセットからの複数の抽出が実行された。我々は、HSPC、EPPおよびMPPにおけるそれぞれ32,574,27,546および36,358mLのインテグレーション部位をLM-PCRおよびパイロシーケンシングによりマッピングした。反復mLV組込みのクラスターは、アセチル化エンハンサーおよびプロモーターと共同マッピングした（ 図4A ）。 mLV標的化調節領域の大部分は、以下のような細胞特異的であった：（i）HSPC特異的SPINK2遺伝子のプロモーター（ 図4B ）; （ii）赤血球特異的β様グロビン遺伝子の強力なエンハンサーを含む遺伝子座制御領域（ 図4C ）; （iii）MPP特異的LYZ遺伝子の上流に位置するエンハンサー（ 図4D ）。最後に、我々はルシフェラーゼアッセイを用いてEPPおよびMPPにおける推定上の細胞特異的mLV標的エンハンサーのサブセットである（ 図4E ）。
図1：レトロウイルス組み込み部位マッピング手順の一般的なスキーム。標的細胞は、eGFPカセットを含むmLVベースのレトロウイルスベクターで形質導入される。形質導入された細胞から得られたゲノムDNAをTru9Iで消化し、互換性のあるTru9I二本鎖リンカーで連結する。 mLV組込み部位を入れ子型LM-PCRにより増幅し、ウイルス - 宿主ゲノム接合部のライブラリーを、IlluminaまたはRocheプラットフォームを用いて大規模に配列決定することができる。得られた読み取りをヒトゲノムにマッピングして、反復mLV組み込みのクラスターを定義した。 この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。 </ p>
図2：LM-PCRによるウイルス - ホストゲノム接合部の増幅。組み込まれたmLVプロウイルスを含有するゲノムDNA（gDNA）をTru9IおよびPstI制限酵素で消化し、互換性のあるTru9Iリンカーで連結する。ネステッドPCRは、LTRおよびリンカーに特異的なプライマーを用いて実施する。ウイルスゲノムおよびヒトゲノムにおけるTru9IおよびPstI制限部位が示される。 この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。
図3：LM-PCRアンプリコンの解析。 （ A ）LM-PCR産物（レーン+）を1％アガロースゲルで泳動し、可視化したエチジウムブロマイド染色による。鋳型のないサンプルは、PCRプライマーのみが視覚化されたネガティブコントロールサンプル（レーン - ）として役立った。 （ B ）ゲル精製後、マイクロキャピラリー電気泳動でLM-PCR産物の大きさを確認した。試料サイズ（bp）および蛍光強度（FU）は、エレクトロフェログラムのx軸およびy軸にそれぞれ示されている。 この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。
図4：エピジェネティックに規定された調節領域へのmLVインテグレーションのマッピング。 （ A ）我々は、HSPC、EPPおよびMPPそれぞれにおいて、再発性mLV組込み部位の3,498,2989および4,103クラスターをそれぞれ定義した。各細胞集団において、mLVクラスターの> 95％がエピジェネティックに定義されたエンハンサーと重複しているersとプロモーター。 （ B 、 CおよびD ）細胞特異的mLV標的化領域は高度にアセチル化され、標的遺伝子（ SPINK2 、 HBBおよびLYZ 、ほぼ独占的にそれぞれHSPC、EPPおよびMPPでのみ発現される）の細胞特異的発現と関連した遺伝子発現のキャップ分析による）。 mLVの単一積分は小さな棒で描かれている。 TPMはミリオンあたりのタグを示します。 （ E ）EPPおよびMPPにおける推定上の細胞特異的mLV標的化エンハンサー。図4は、参考文献14から適合されている。私たちはクリエイティブコモンズライセンスの下でこの数字を再利用する許可を受けました。 この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。
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Discussion
ここでは、クロマチン領域を標的とするレトロウイルスであるmLVの組込み部位のゲノムワイドマッピングのためのプロトコールについて記載し、活性化プロモーターおよびエンハンサーとしてエピジェネティックにマークした。プロトコルの重要なステップおよび/または限界には、（i）標的細胞集団のmLV形質導入; （ii）LM-PCRによるウイルス - 宿主接合部の増幅; （iii）集積部位の高い割合の回収。 mLVベースのレトロウイルスベクターは分裂細胞に効率的に形質導入する。分裂していない細胞（例えば、有糸分裂後の神経細胞）の形質導入効率が低いことは、この技術の潜在的な限界である。しかし、それは、レポーター遺伝子（ 例えば、 eGFP）の発現に基づいて、形質導入された集団の細胞選別によって克服することができる。 LM-PCR（150〜500bp）による比較的短いアンプリコンの生成は、現在使用されている大規模な配列決定戦略に適合するアンプリコンのライブラリーを作製し、mLV組込み部位の全般的分析。一例として、> 500 bpのLM-PCR産物の増幅は、部分的ゲノムDNA消化またはTru9I消化ゲノム断片のライゲーション（LM-PCRアンプリコンのショットガンクローニングによって評価される）のいずれかから生じ得る（データは示されていない）。最初のケースでは、ゲノムDNA消化条件をさらに最適化することによって問題を解決することができますが、後者の場合、150〜500 bpのアンプリコンのゲル精製によってmLVインテグレーション部位の大量シーケンシングが成功する可能性があります。最後に、ゲノムDNAを切断するための制限酵素の使用は、制限部位の近くにある組込み部位の優先的増幅および検出を導き得る。 Tru9I制限酵素が回収できる組込み部位のパーセンテージは〜50％と推定される。したがって、この技術は、複数の制限酵素を使用するか、またはランダムDNAシアーリを実施することによって、組込み部位検索を改善するようにさらに最適化することができる超音波による20,21 。
最近、我々は、この論文で詳述されているように、広く使用されているイルミナ（Illumina）プラットフォームを用いてウイルスの組込み部位の配列決定を最適化した。このシークエンシング手法により、Rocheプラットフォームと比較して1回の実行でより多くの読み取りを生成できるため、1回の実験で取得した統合サイトの数が大幅に増加し、時間とコストが全体的に削減されます。
細胞特異的調節領域のゲノムワイド同定には、ChIP-seq6（ヒストンH3リジン4のエンハンサーおよびプロモーターを同定するためのモノおよびトリメチル化、および活性および非活性を区別するH3K27acのモノメチル化およびトリメチル化による1から3回のヒストン修飾のマッピングが必要）調節要素） 4,5,6および異なる細胞型の系統的比較を定義するシス作用性エレメントは、決定された細胞集団においてのみ排他的に活性である。我々は、多分化能性造血前駆細胞およびそのコミットされた赤血球および骨髄系子孫、胚性幹細胞、神経上皮様幹細胞および分化したケラチノサイトなどの、前向きに単離された標的細胞集団におけるmLV組込み部位をマッピングした15 。レトロウイルススキャンにより、解析された各細胞集団における細胞特異的調節エレメントのゲノムワイドな定義が可能となり、比較ゲノムワイドの研究は厳密には必要ではなかった。重要なことに、このツールは、予期される単離のための強力なマーカーがなく、ヒストン修飾のChIP-seqに基づく分析によって分析することができない稀な細胞集団（ 例えば、体細胞幹細胞）における活性調節エレメントの同定に用いることができる。これらの細胞集団において、mLVインテグレーションは、活性調節領域の永続的な遺伝的マーカーであり、インビトロおよびインビボでより豊富な細胞子孫における遡及的同定。例として、我々は遡及的に同定されたケラチノサイト幹細胞（KSC）集団におけるプロモーターおよびエンハンサーの代理マーカーとしてmLVインテグレーションクラスターを首尾よく使用した。 KSCを含む早期継代の包皮由来ケラチノサイト培養物にmLVベクターを形質導入した後、これらの細胞を継代して> 35細胞倍加でKSCの子孫を濃縮し、この数の培養を維持する能力によって定義した。通路。この場合、mLV組み込みは、元の形質導入KSC集団15において活性な調節領域を永久に標識した。将来の研究は、より多くの希少なヒト幹細胞集団における細胞特異的調節要素をゲノムワイドに同定することを目的とする。
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Disclosures
著者は何も開示することはない。
Acknowledgments
この研究は、イタリア教育省、大学および研究省（FIRB-Futuro in Ricerca 2010-RBFR10OS4G、FIRB-Futuro in Ricerca 2012-RBFR126B8I_003）の欧州研究評議会（ERC-2010-AdG、GT-SKIN） 、EPIGEN Epigenomics Flagship Project）、イタリア保健省（若手研究者は2011年GR-2011-02352026）、Imagine Institute Foundation（フランス、パリ）があります。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PBS, pH 7.4 | ThermoScientific | 10010031 | or equivalent |
| Fetal Bovine Serum | ThermoScientific | 16000044 | or equivalent |
| 0.2 ml tubes | general lab supplier | ||
| 1.5 ml tubes | general lab supplier | ||
| QIAGEN QIAmp DNA mini Kit | QIAGEN | 51306 | or equivalent |
| T4 DNA ligase | New England BioLabs | M0202T | |
| T4 DNA Ligase Reaction buffer | New England BioLabs | M0202T | |
| Linker Plus Strand oligonucleotide | general lab supplier | 5’-PO4-TAGTCCCTTAAGCGGAG-3’ (Purification grade: SDS-PAGE) | |
| Linker Minus Strand oligonucleotide | general lab supplier | 5’-GTAATACGACTCACTATAGGGCTCCGCTTAAGGGAC-3’ (Purification grade: SDS-PAGE) | |
| Tru9I | Roche-Sigma-Aldrich | 11464825001 | |
| SuRE/Cut Buffer M | Roche-Sigma-Aldrich | 11417983001 | |
| PstI | Roche-Sigma-Aldrich | 10798991001 | |
| SuRE/Cut Buffer H | Roche-Sigma-Aldrich | 11417991001 | |
| Platinum Taq DNA Polimerase High Fidelity | Invitrogen | 11304011 | |
| 10 mM dNTP Mix | Invitrogen | 18427013 | or equivalent |
| PCR grade water | general lab supplier | ||
| 96-well thermal cycler (with heated lid) | general lab supplier | ||
| linker primer | general lab supplier | 5’-GTAATACGACTCACTATAGGGC-3’ (Purification grade: PCR grade) | |
| MLV-3’ LTR primer | general lab supplier | 5’-GACTTGTGGTCTCGCTGTTCCTTGG-3’ (Purification grade: PCR grade) | |
| linker nested primer 454 | general lab supplier | 5’-GCCTTGCCAGCCCGCTCAG[AGGGCTCCGCTTAAGGGAC](Purification grade: SDS-PAGE) | |
| MLV-3’ LTR nested primer 454 | general lab supplier | 5’-GCCTCCCTCGCGCCATCAGTAGC[GGTCTCCTCTGAGTGATTGACTACC](Purification grade: SDS-PAGE) | |
| linker nested primer Illumina | general lab supplier | 5'-TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAG-[AGGGCTCCGCTTAAGGGAC](Purification grade: SDS-PAGE) | |
| MLV-3’ LTR nested primer Illumina | general lab supplier | 5'-GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAG-[GGTCTCCTCTGAGTGATTGACTACC](Purification grade: SDS-PAGE) | |
| Sodium Acetate Solution (3M) pH 5.2 | general lab supplier | ||
| Ethanol (absolute) for molecular biology | Sigma-Aldrich | E7023 | or equivalent |
| Topo TA Cloning kit (with pCR2.1-TOPO vector) | Invitrogen | K4500-01 | |
| QIAquick Gel Extraction kit | QIAGEN | 28704 | |
| Agarose | Sigma-Aldrich | A9539 | or equivalent |
| Ethidium bromide | Sigma-Aldrich | E1510 | or equivalent |
| 100 bp DNA ladder | Invitrogen | 15628019 | or equivalent |
| 6x Loading Buffer | ThermoScientific | R0611 | or equivalent |
| NanoDrop 2000 UV-Vis Spectrophotometer | ThermoScientific | ND-2000 | |
| Nextera XT Index kit | Illumina | FC-131-1001 or FC-131-1002 | |
| 2x KAPA HiFi Hot Start Ready Mix | KAPA Biosystems | KK2601 | |
| Dynal magnetic stand for 2 ml tubes | Invitrogen | 12321D | or equivalent |
| Agencourt AMPure XP 60 ml kit | Beckman Coulter Genomics | A63881 | |
| Tris-HCl 10 mM, pH 8.5 | general lab supplier | ||
| Agilent 2200 TapeStation system | Agilent Technologies | G2964AA | or equivalent |
| D1000 ScreenTape | Agilent Technologies | 5067-5582 | or equivalent |
| D1000 Reagents | Agilent Technologies | 5067-5583 | or equivalent |
| KAPA Library Quantification Kit for Illumina platforms (ABI Prism) | KAPA Biosystems | KK4835 | |
| ABI Prism 7900HT Fast Real-Time PCR System | Applied Biosystems | 4329003 | |
| NaOH 1.0 N, molecular biology-grade | general lab supplier | ||
| HT1 (Hybridization Buffer) | Illumina | Provided in the MiSeq Reagent Kit | |
| MiSeq Reagent Kit v3 (150 cycles) | Illumina | MS-102-3001 | |
| MiSeq System | Illumina | SY-410-1003 | |
| PhiX Control v3 | Illumina | FC-110-3001 |
References
- Ernst, J., et al. Mapping and analysis of chromatin state dynamics in nine human cell types. Nature. 473 (7345), 43-49 (2011).
- Shlyueva, D., Stampfel, G., Stark, A. Transcriptional enhancers: from properties to genome-wide predictions. Nat Rev Genet. 15 (4), 272-286 (2014).
- Roadmap Epigenomics Consortium. Integrative analysis of 111 reference human epigenomes. Nature. 518 (7539), 317-330 (2015).
- Heintzman, N. D., et al. Histone modifications at human enhancers reflect global cell-type-specific gene expression. Nature. 459 (7243), 108-112 (2009).
- Creyghton, M. P., et al. Histone H3K27ac separates active from poised enhancers and predicts developmental state. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (50), 21931-21936 (2010).
- Hnisz, D., et al. Super-enhancers in the control of cell identity and disease. Cell. 155 (4), 934-947 (2013).
- Cattoglio, C., et al. High-definition mapping of retroviral integration sites identifies active regulatory elements in human multipotent hematopoietic progenitors. Blood. 116 (25), 5507-5517 (2010).
- Biasco, L., et al. Integration profile of retroviral vector in gene therapy treated patients is cell-specific according to gene expression and chromatin conformation of target cell. EMBO Mol Med. 3 (2), 89-101 (2011).
- De Ravin, S. S., et al. Enhancers are major targets for murine leukemia virus vector integration. J Virol. 88 (8), 4504-4513 (2014).
- LaFave, M. C., et al. mLV integration site selection is driven by strong enhancers and active promoters. Nucleic Acids Res. 42 (7), 4257-4269 (2014).
- Gupta, S. S., et al. Bromo- and extraterminal domain chromatin regulators serve as cofactors for murine leukemia virus integration. J Virol. 87 (23), 12721-12736 (2013).
- Sharma, A., et al. BET proteins promote efficient murine leukemia virus integration at transcription start sites. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (29), 12036-12041 (2013).
- De Rijck, J., et al. The BET family of proteins targets moloney murine leukemia virus integration near transcription start sites. Cell reports. 5 (4), 886-894 (2013).
- Romano, O., et al. Transcriptional, epigenetic and retroviral signatures identify regulatory regions involved in hematopoietic lineage commitment. Sci Rep. 6, 24724 (2016).
- Cavazza, A., et al. Dynamic Transcriptional and Epigenetic Regulation of Human Epidermal Keratinocyte Differentiation. Stem Cell Reports. 6 (4), 618-632 (2016).
- Miller, A. D., Law, M. F., Verma, I. M. Generation of helper-free amphotropic retroviruses that transduce a dominant-acting, methotrexate-resistant dihydrofolate reductase gene. Mol Cell Biol. 5 (3), 431-437 (1985).
- Cattoglio, C., et al. High-definition mapping of retroviral integration sites defines the fate of allogeneic T cells after donor lymphocyte infusion. PLoS One. 5 (12), e15688 (2010).
- Aiuti, A., et al. Lentiviral hematopoietic stem cell gene therapy in patients with Wiskott-Aldrich syndrome. Science. 341 (6148), 1233151 (2013).
- Biffi, A., et al. Lentiviral hematopoietic stem cell gene therapy benefits metachromatic leukodystrophy. Science. 341 (6148), 1233158 (2013).
- Gabriel, R., et al. Comprehensive genomic access to vector integration in clinical gene therapy. Nat Med. 15 (12), 1431-1436 (2009).
- Gillet, N. A., et al. The host genomic environment of the provirus determines the abundance of HTLV-1-infected T-cell clones. Blood. 117 (11), 3113-3122 (2011).
