Summary
Descrevemos aqui um protocolo para o mapeamento gen�ico dos s�ios de integra�o de vectores retrovirais baseados em v�us de leucemia murina de Moloney em c�ulas humanas.
Abstract
Os vectores retrovirais baseados em vírus da leucemia murina de Moloney (MLV) integram-se predominantemente em intensificadores e promotores acetilados. Por esta razão, os locais de integração mLV podem ser utilizados como marcadores funcionais de elementos reguladores activos. Aqui, apresentamos uma ferramenta de varredura retroviral, que permite a identificação genoma-wide de potenciadores e promotores específicos de células. Resumidamente, a população de células alvo é transduzida com um vector derivado de mLV e o ADN genómico é digerido com uma enzima de restrição de corte frequente. Após ligação dos fragmentos genómicos com um ligador de ADN compatível, a reacção em cadeia da polimerase mediada por ligante (LM-PCR) permite a amplificação das junções do genoma do vírus-hospedeiro. A sequenciação maciça dos amplicões é utilizada para definir o perfil de integração de mLV em todo o genoma. Finalmente, agrupamentos de integrações recorrentes são definidos para identificar as regiões reguladoras específicas de células, responsáveis pela ativação de programas de transcrição específicos de células.
por exemplo , células estaminais somáticas) que não possuem marcadores robustos para isolamento prospectivo.
Introduction
A identidade celular é determinada pela expressão de conjuntos específicos de genes. O papel dos elementos reguladores cis, tais como promotores e intensificadores, é crucial para a activação de programas de transcrição específicos do tipo celular. Estas regiões reguladoras são caracterizadas por características específicas da cromatina, tais como modificações peculiares das histonas, factores de transcrição e ligação dos co-factores e acessibilidade à cromatina, que têm sido amplamente utilizados para a sua identificação genómica em vários tipos de células 1 , 2 , 3 . Em particular, o perfil gen�ico de acetila�o da histona H3 lisina 27 (H3K27ac) � comummente utilizado para definir promotores activos, potenciadores e super-potenciadores 4 , 5 , 6 .
O vírus da leucemia murina de Moloney (MLV) é um gamma-retrovírus que é amplamente utilizado para o geneTransferência em células de mamíferos. Depois de infectar uma célula alvo, o genoma retroviral de ARN é retrotraducido numa molécula de ADN de cadeia dupla que se liga a proteínas virais e celulares para montar o complexo de pré-integração (PIC). O PIC entra no núcleo e liga a cromatina da célula hospedeira. Aqui, a integrase viral, um componente PIC chave, medeia a integração do ADN proviral no genoma da célula hospedeira. A integração de mLV no DNA genómico não é aleatória, mas ocorre em elementos reguladores cis-activos, tais como promotores e intensificadores, numa forma específica de célula 7 , 8 , 9 , 10 . Este perfil de integração peculiar é mediado por uma interacção directa entre a integrase de mLV e as proteínas do domínio do bromodominio celular e do domínio extraterminal (BET) 11 , 12 , 13 . As proteínas BET (BRD2, BRD3 eBRD4) atuam como uma ponte entre a cromatina do hospedeiro e o PIC mLV: através de seus bromodominios eles reconhecem regiões reguladoras cis altamente acetiladas, enquanto que o domínio extraterminal interage com a integrase mLV 11 , 12 , 13 .
Aqui, descrevemos a varredura retroviral, uma nova ferramenta para mapear regiões cis-reguladoras ativas com base nas propriedades de integração de mLV. Resumidamente, as células são transduzidas com o vector retroviral derivado de mLV que expressa o gene repórter de proteína fluorescente verde aumentada (eGFP). Após a extracção do ADN genómico, as junções entre a repetição terminal longa (LTR) 3 'do vector mlV e o ADN genómico são amplificadas por PCR (LM-PCR) mediada por ligantes e sequenciadas maciçamente. Os locais de integração de mLV são mapeados para o genoma humano e as regiões genómicas altamente direccionadas por mLV são definidas como agrupamentos de locais de integração de mLV.
Varredura retroviralNing foi usado para definir elementos específicos reguladores de células específicas em várias células primárias humanas 14,15. MLV co-mapeados com promotores epigenicamente definidos e potenciadores, a maioria dos quais abrigou marcas de histonas activas, tais como H3K27ac, e foram específicos de células. A varredura retroviral permite a identificação genômica de elementos reguladores do DNA em populações de células purificadas prospectivamente 7,14 , bem como em populações celulares retrospectivamente definidas, como as células-tronco de queratinócitos, que carecem de marcadores efetivos para o isolamento prospectivo 15 .
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Protocol
1. Transdução MLV de Células Humanas
- Isolar as c�ulas alvo e transduzi-las com um vector retroviral derivado de mLV contendo o gene rep�ter eGFP e pseudotipado com o VSV-G de estomatite vesicular ou a glicoprote�a de envelope anfotr�ico 16 .
- Manter as células simuladas transduzidas como um controlo negativo para as seguintes análises. Uma vez que os vectores retrovirais baseados em mLV podem transduzir células de divisão eficiente, cultivar a população de células alvo em condições que estimulam a divisão celular. As condições de transdução precisam ser especificamente optimizadas para cada tipo de célula em estudo. As condições de crescimento celular e transdução para progenitores hematopoiéticos humanos, células T e células epidérmicas estão descritas nas Referências 7, 14, 15 e 17.
- 48 h após a transdução, ressuspender 100 000 células em 300 μL de soro fisiológico tamponado com fosfato (PBS) contendo 2% de soro bovino fetal e medir a expressão de eGFP por fBaixa citometria (laser de excitação de 488 nm). Utilizar células transduzidas de forma simulada como controlo negativo. Para a recuperação ideal do local de integração, purifique as células GFP + por Classificação de Células Ativadas por Fluorescência (FACS).
- Recolher 0,5 a 5 milhões de células para a preparação de DNA genômico. É preferido um período de cultura mais longo (> 7 dias) para diluir o provírus não integrado e necessário quando se analisa a progénie a longo prazo de células estaminais de boa fé (ver Secção de Discussão e referência 15 ). Os grânulos de células podem ser congelados instantaneamente e armazenados a -80 ° C até à sua utilização.
2. Amplificação dos locais de integração de mLV por PCR ligada a ligante (LM-PCR)
- Preparação de ADN genómico (gDNA)
- Extrair gDNA usando um kit de extração de DNA baseado em coluna e seguir o protocolo para células cultivadas, de acordo com as instruções do fabricante.
- Enzima de restrição digestiem
- Preparar 4 digestões de enzimas de restrição por amostra em tubos de 1,5 mL. Digerir 0,1 a 1 μg de gDNA em cada tubo adicionando 1 μL de Tru9I (10 U) e 1 μL de Tampão M num volume final de 10 μL. Incubar as reacções a 65 ° C durante 6 h ou durante a noite.
- Adicionar a cada reacção 1 μL de PstI (10 U), 1 μL de Tampão H e 8 μL de água. Incubar as reacções a 37 ° C durante 6 h ou durante a noite. As amostras podem ser armazenadas a -20 ° C até serem utilizadas.
- Ligação ligante
- Preparar uma solução de reserva de ligante Tru9I 100 μM num tubo de 1,5 mL misturando os oligonucleótidos de cadeia mais ligante e ligante menos cadeia a uma concentração de 100 μM. Colocar o tubo em água a 100 ° C e deixar arrefecer à temperatura ambiente. A solução stock do ligante Tru9I pode ser armazenada a -20 ° C até à sua utilização.
- Estabelecer 8 reações ligadura linker em tubos de 1,5 mL. Para cada reacção, adicione o seguinte componenteS a 10 μL de digestão com enzima de restrição: 1,4 μL de tampão de reacção de 10X T4 ADN Ligase, 1 μL de ligante Tru9I 10 μM, 1 μL (2 000 U) de T4 DNA ligase e 0,6 μL de água. Incubar a 16 ° C durante 3 a 6 h. As amostras podem ser armazenadas a -20 ° C até serem utilizadas.
- Primeiro PCR
- Estabelecer 48 reações de PCR (6 reações de cada tubo de ligação) em tubos de 0,2 mL. Para cada PCR, adicionar os seguintes reagentes a 2 μL de reacção de ligação: 5 μL de tampão de PCR 10X, 2 μL de Sulfato de Magnésio 50 mM, 1 μL de Mistura de desoxinucleótido 10 mM (dNTP), 1 μL de iniciador ligante 10 μM, 1 ΜL de iniciador LTR mLV-3 '10 μM, 0,3 μL (1,5 U) de Taq DNA Polimerase e 37,7 μL de água. As sequências de iniciadores são fornecidas na Tabela 1.
- Realizar a reacção de PCR num ciclador térmico com tampa aquecida, como se segue: 95 ° C durante 2 min; 25 ciclos de 95 ° C durante 15 s, 55 ° C durante 30 s, 72 ° C durante 1 min; 72 °; C durante 5 min; Mantenha a 4 ° C. As amostras podem ser armazenadas a -20 ° C até serem utilizadas.
- Segunda PCR
- Configure 48 reações de PCR (1 de cada "primeiro tubo de PCR") em tubos de 0,2 mL. Para cada PCR, adicione os seguintes componentes a 2 μL da primeira reacção de PCR: 5 μL de tampão de PCR 10X, 2 μL de Sulfato de Magnésio 50 mM, 1 μL de Mistura de dNTP 10 mM, 1 μL de iniciador aninhado 10 μM, 1 Μl de iniciador aninhado mLV-3 'LTR 10 μM, 0,3 μL de Taq DNA Polimerase (1,5 U) e 37,7 μL de água. Use iniciadores aninhados projetados para a estratégia de seqüenciamento maciça específica escolhida: (i) iniciador aninhado de ligante e iniciador aninhado mLV-3 'LTR compatível com a plataforma Illumina; (Ii) iniciador aninhado de ligante e iniciador aninhado mLV-3 'LTR compatível com a plataforma Roche. As sequências de iniciadores estão listadas na Tabela 1 .
- Realizar a reacção de PCR num ciclador térmico com tampa aquecida, como se segue: 95 ° C durante 2 min; 25Ciclos de 95 ° C durante 15 s, 58 ° C durante 30 s, 72 ° C durante 1 min; 72 ° C durante 5 min; Mantenha a 4 ° C. As amostras podem ser armazenadas a -20 ° C até serem utilizadas.
- Juntar as 48 reacções de PCR aninhadas num tubo de 15 mL (volume final de ~ 2,4 mL). As amostras podem ser armazenadas a -20 ° C até serem utilizadas.
- Determinar a presença e o tamanho dos produtos LM-PCR por electroforese em gel de agarose.
- Adicionar 4 μL de tampão de carga a 20 μL de produtos de LM-PCR e carregar a amostra num gel de agarose a 1%, juntamente com uma escada de DNA de 100 pb. Executar o gel a 5 V / cm durante 30 a 60 min e visualizar os produtos de PCR por coloração com brometo de etídio.
- Executar uma reacção de LM-PCR a partir da amostra transduzida de forma simulada como controlo negativo.
- Precipitar os amplicões adicionando 0,1 volumes de solução de acetato de sódio (3 M, pH 5,2) e 2,5 volumes de etanol a 100%. Misturar e congelar a -80 ° C durante 20 min.
- Girar em fuLl em uma microcentrífuga padrão a 4 ° C por 20 min. Descartar o sobrenadante e lavar o sedimento com etanol a 70%. Girar à velocidade máxima numa microcentrífuga padrão a 4 ° C durante 5 min.
- Descartar o sobrenadante e secar ao ar a pastilha. Adicionar 200 μL de água de grau PCR e ressuspender o DNA. As amostras podem ser armazenadas a -20 ° C até serem utilizadas.
- Adicionar 20 μL de tampão de carga a 100 μL dos produtos LM-PCR e carregar a amostra num gel de agarose a 1%, juntamente com uma escada de ADN de 100 pb.
- Executar o gel a 5 V / cm durante 30 a 60 min e cortar a porção do gel contendo 150 a 500 pb de comprimento amplicons.
- Purificar os produtos LM-PCR com um kit de extração de gel à base de coluna e medir a concentração usando um espectrofotômetro UV.
- Utilizar 1 μL de biblioteca para avaliar o comprimento dos produtos LM-PCR utilizando um instrumento bioanalisador, de acordo com as instruções do fabricante.
- Utilizar 20 ng dos produtos LM-PCR purificados e cloná-los no vector pCR2.1-TOPO, de acordo com as instruções do fabricante.
- Efectuar reacções de sequenciação utilizando o iniciador M13 Universal, seguido de mapeamento genómico das sequências resultantes, para revelar a presença das junções do genoma viral (incluindo o iniciador aninhado LTR mLV-3 ') em> 50% dos clones para identificar amostras adequadas Para sequenciamento maciço. Exemplo de uma junção viral-genoma:
O iniciador aninhado MLV-3 'LTR 454 e o iniciador aninhador ligador 454 ( Tabela 1 ) estão indicados em negrito e a extremidade 3' da LTR viral em itálico. A sequência genómica humana é realçada em texto vermelho (chr10: 6439408-6439509, hg19).
3. Seqüenciamento maciço de sites de integração mLV
NOTA: Produtor LM-PCRPodem ser sequenciados usando plataformas comerciais (escolhendo o par de iniciadores aninhados apropriado na segunda reação de PCR, veja a subseção 2.5.1). Para seqüenciamento pela plataforma de pirosequenciação Roche GS-FLX, consultar os artigos anteriores 7 , 14 , 15 . Nesta seção, um protocolo recém-otimizado para a plataforma de sequenciamento Illumina é descrito.
- Preparação da biblioteca
- Estabelecer 1 reação de PCR de indexação por amostra em tubos de 0,2 mL. Para cada PCR, adicionar os seguintes reagentes a 5 μL (150-170 ng) de produto de LM-PCR purificado: 5 μL de Index Primer 1, 5 μL de Index Primer 2, 25 μL de 2X Master Mix e 10 μL de PCR- Grau água. Use uma combinação de índice diferente para cada amostra.
- Realizar as reacções de PCR num termociclador com tampa aquecida, como se segue: 95 ° C durante 3 min; 8 ciclos de 95 ° C durante 30 s, 55 ° C durante 30 s, 72 ° C durante 30 s; 72 ° C durante 5 mdentro; Mantenha a 4 ° C.
- Purificar os produtos de PCR utilizando um protocolo de isolamento de grânulos de imobilização reversível em fase sólida (SPRI): em tubos novos de 1,5 mL, adicionar 56μL de esferas a cada amostra e seguir as instruções do fabricante. Eluir em 25 μL de Tris-HCl 10 mM. As bibliotecas podem ser armazenadas a -20 ° C até à sua utilização.
- Verificação de biblioteca
- Utilizar 1 μL de amostra para avaliar o tamanho da biblioteca utilizando um instrumento de bioanálise.
- Utilizar 1 μL de amostra para quantificar a molaridade da biblioteca utilizando um ensaio de PCR em tempo real baseado em fluorescência, de acordo com as instruções do fabricante.
- Diluição e sequenciação da biblioteca
- Diluir as bibliotecas até 10 nM utilizando Tris-HCl 10 mM. Para pooling bibliotecas, transferir 5 μL de cada biblioteca diluída para um novo tubo de 1,5 mL e, em seguida, diluir o pool para 4 nM em Tris-HCl 10 mM.
- Misture 5 μL de solução diluída com 5 μL de NaOH 0,2 N em uma nova solução de 1,5 mL tubo, vórtice brevemente, spin-down e incubar durante 5 min à temperatura ambiente para desnaturar as bibliotecas.
- Coloque os tubos em gelo e adicione 990 μL de tampão de hibridização pré-refrigerado (HT1). Alíquota 300 μL de pool desnaturado em um novo tubo de 1,5 mL e adicione 300 μL de HT1 pré-resfriado para obter um pool de biblioteca final de 10 pM.
- Em paralelo, misturar 2 μL de biblioteca de controlo PhiX (10 nM) com 3 μL de Tris-HCl 10 mM num tubo de 1,5 mL. Adicionar 5 μL de NaOH 0,2 N, agitar vortex brevemente, centrifugar e incubar durante 5 min à temperatura ambiente para desnaturar a PhiX diluída. Coloque o tubo em gelo e adicione 990 μL de HT1 pré-resfriado.
- Alíquota de 300 μL de PhiX desnaturado num novo tubo de 1,5 mL e adicione 300 μL de HT1 pré-arrefecido para obter uma PhiX final de 10 μM.
- Num novo tubo de 1,5 mL, misturar 510 μL de pool de biblioteca desnaturado com 90 μL de biblioteca PhiX desnaturada, obtendo-se assim um pool final de 10 μM com 15% de controlo PhiX.
- Pipetar estes 600 μL de amostraVolume no reservatório de amostra de carga do cartucho de reagente de sequencia�o descongelado e prosseguir imediatamente para executar um ciclo de 150 ciclos.
NOTA: Os reagentes críticos e sequências de iniciadores necessários para este protocolo estão listados na Tabela 1 .
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Representative Results
Fluxo de trabalho do procedimento de varredura retroviral
O fluxo de trabalho do procedimento de varrimento retroviral é esquematizado na Figura 1 . A população de células alvo é purificada e transduzida com um vector retroviral derivado de mLV que expressa um gene repórter eGFP. O transgene é flanqueado pelas duas repetições terminais longas idênticas (5 'e 3' LTR), assegurando a síntese, a transcrição reversa e a integração do genoma viral no ADN do hospedeiro. A eficiência de transdução é avaliada por análise de FACS da expressão de eGFP. A popula�o celular contendo uma propor�o elevada (> 30%) de c�ulas transduzidas com mLV �amplificada e subsequentemente lisada para extrair ADN gen�ico contendo as cassetes virais mLV integradas. O ADN genómico é digerido e ligado com um ligante compatível e as junções entre as LTRs 3 'virais e o genoma do hospedeiro são amplificadas por LM-PCR. VirUs-host genoma junções são então massivamente seqüenciados usando plataformas Roche ou Illumina. Finalmente, os locais de integração de mLV são mapeados para o genoma humano para definir aglomerados genómicos de locais de inserção recorrentes.
Amplificação de locais de integração de mLV por LM-PCR
A LM-PCR é esquematizada na Figura 2 . O ADN genómico é extraído de células transduzidas com mLV e digerido com a enzima de restrição Tru9I, que corta frequentemente o genoma humano, gerando fragmentos com um comprimento médio de 70 pb. Uma segunda enzima de restrição (PstI) é utilizada para prevenir a amplificação de fragmentos LTR internos 5 'integrados e não integrados. Um ligante de cadeia dupla Tru9I é então ligado aos fragmentos genómicos e a LM-PCR é realizada com iniciadores específicos para o ligante e O 3 'LTR para amplificar o vírus-hospedeiro genoma junções. A PCR aninhada pode ser realizada usando priCompatíveis com as plataformas de sequenciamento Roche ou Illumina.
Análise dos amplicons da junção do genoma do vírus-anfitrião
No experimento representado na Figura 3 , purificamos os progenitores / precursores mielóides CD34 - CD13 + (MPP) e os transduzimos com um retrovírus derivado de mLV que expressa o gene repórter eGFP. Mais de 60% das células MPP expressaram eGFP 48 h após transdução (dados não apresentados). 15 dias após a transdução, recolhemos as células, extraímos gDNA e amplificámos as junções do genoma vírus-hospedeiro, como descrito acima. Carregou-se uma alíquota dos produtos LM-PCR reunidos num gel de agarose a 1% para verificar a presença e o tamanho dos amplicões. Visualizamos com sucesso um esfregaço de DNA correspondente aos produtos LM-PCR de diferentes tamanhos, variando de 150 a 500 pb ( Figura 3A ). Os amplicões foram entãoConcentrada por precipitação de ADN e carregada num gel de agarose a 1%. Os produtos de LM-PCR foram purificados em gel e executados num sistema bioanalisador, confirmando os tamanhos de amplicão esperados (entre 150 e 500 pb; Figura 3B ).
Mapeamento de integrações de mLV em regiões reguladoras ativas e específicas de células
No experimento relatado na Figura 4 , foram transduzidas células progenitoras / células progenitoras hematopoiéticas (HSPC), progenitor / precursor eritróide (EPP) e precursores / precursores mielóides (MPP) com um vector retroviral derivado de mlV. Estes resultados foram obtidos processando e sequenciando amostras derivadas de diferentes tipos de células separadamente, para evitar a potencial contaminação / colisões 18 , 19 . Leituras de seqüência crua geradas pelo seqüenciamento maciço foram processadas por uma bioinformática automatizadaPipeline para eliminar sequências virais e de ligação. Em seguida, sequências únicas de pelo menos 20 pb foram mapeadas no genoma humano utilizando Blat 17 . Os alinhamentos em bruto foram filtrados, exigindo que a partida começasse dentro dos primeiros 3 nucleótidos, correspondências unívocas e um mínimo de 95% de identidade. Os agrupamentos de integra�es de mLV recorrentes foram definidos por uma compara�o estat�tica com um conjunto de dados de sequ�cias gen�icas aleat�ias, geradas extraindo aleatoriamente posi�es gen�icas do genoma humano com um motivo de restri�o Tru91 a uma dist�cia compat�el com a plataforma de sequencia�o. As sequências de controlo foram então processadas através da mesma tubagem de mapeamento e filtragem utilizada para sequências de integração, para gerar um conjunto aleatório de sítios únicos. Para definir clusters de mLV, aplicamos o algoritmo de agrupamento DBSCAN 19 , comparando a distribuição de integrações mLV consecutivas com a de um número igual de locais aleatórios para identificar regiões de integrações altamente agrupadas, as quais defIne-celulares 7 , 14 , 15 . Para evitar a geração de clusters falsos, foram realizadas múltiplas extrações do conjunto de dados de controle aleatório. Foram mapeados por LM-PCR e pirosequenciação de 32.574, 27.546 e 36.358 mLV de locais de integração em HSPC, EPP e MPP, respectivamente. Agrupamentos de integra�es de mLV recorrentes co-mapeadas com intensificadores e promotores acetilados ( Figura 4A ). A maior parte das regi�s reguladoras orientadas para mLV eram espec�icas de c�ulas, tais como: (i) o promotor do gene SPINK2 espec�ico de HSPC ( Figura 4B ); (Ii) a Região de Controlo de Locus contendo potenciadores potentes dos genes de globina tipo-β eritróide-específicos ( Figura 4C ); (Iii) intensificadores localizados a montante do gene LYZ específico de MPP ( Figura 4D ). Finalmente, utilizamos ensaios de luciferase para validarUm subconjunto de putativos específicos de células mLV-alvo potenciadores em EPP e MPP ( Figura 4E ).
Figura 1: Esquema geral do procedimento de mapeamento do local de integração retroviral. As células alvo são transduzidas com um vector retroviral baseado em mLV contendo uma cassete eGFP. O ADN genómico obtido a partir de células transduzidas é digerido com Tru9I e ligado com um ligante Tru9I de cadeia dupla compatível. MLV foram amplificados por LM-PCR aninhada e a biblioteca de junções de genoma de vírus-hospedeiro pode ser massivamente sequenciada utilizando plataformas Illumina ou Roche. As leituras resultantes foram mapeadas para o genoma humano para definir clusters de integrações de mLV recorrentes. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. </ P>
Figura 2: Amplificação de junções genómicas vírus-hospedeiro por LM-PCR. O ADN genómico (gDNA) contendo o provírus mLV integrado é digerido com as enzimas de restrição Tru9I e PstI e ligado com um ligante Tru9I compatível. A PCR aninhada é realizada utilizando iniciadores específicos para a LTR e o ligante. Os locais de restrição Tru9I e PstI no genoma viral e no genoma humano estão indicados. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Análise de amplicões de LM-PCR. ( A ) Os produtos LM-PCR (pista +) foram executados num gel de agarose a 1% e visualizadosPor coloração com brometo de etídio. Uma amostra sem modelo serviu como amostra de controlo negativo, onde apenas os iniciadores de PCR foram visualizados (pista -). ( B ) Após purificação em gel, o tamanho do produto de LM-PCR foi verificado por electroforese microcapilar. O tamanho da amostra (pb) ea intensidade de fluorescência (FU) são mostrados nos eixos xe y do eletroferograma, respectivamente. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Mapeamento da integração mLV em regiões reguladoras epigenéticamente definidas. ( A ) Foram definidos 3,498, 2,989 e 4,103 agrupamentos de locais de integração de mLV recorrentes em HSPC, EPP e MPP, respectivamente. Em cada população celular,> 95% dos agregados de mLV sobrepõem-se a epigeneticamente definidosE promotores. ( B , C e D ) As regiões específicas para a célula mLV foram altamente acetiladas e associadas à expressão específica de células do gene alvo ( SPINK2 , HBB e LYZ , expressas quase exclusivamente em HSPC, EPP e MPP, respectivamente, conforme determinado Por análise de Cap de Expressão Genética). As integrações simples mLV são representadas com barras pequenas. O TPM indica Tag por milhão. ( E ) potenciadores potencialmente específicos de células mLV específicos para células em EPP e MPP. A Figura 4 é adaptada da referência 14 . Recebemos a permissão para reutilizar este valor sob a licença creative commons. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Aqui, descrevemos um protocolo para genoma de todo o mapeamento dos locais de integração de mLV, um retrovírus que metas regiões cromatina, epigenicamente marcado como promotores ativos e potenciadores. As etapas críticas e / ou limitações do protocolo incluem: (i) a transdução mLV da população de células alvo; (Ii) amplificação de junções vírus-hospedeiro por LM-PCR; (Iii) recuperação de uma fração elevada de locais de integração. Os vectores retrovirais baseados em mLV transduzem eficientemente células em divisão. A baixa eficiência de transdução de células não divisórias (por exemplo, células neuronais pós-mitóticas) é uma limitação potencial desta técnica. No entanto, pode ser superado através da separação de células da população transduzida com base na expressão do gene repórter ( eg eGFP). A geração de amplicões relativamente curtos por LM-PCR (150 a 500 bp) é obrigatória para gerar uma biblioteca de amplicões compatíveis com as estratégias de sequenciação maciça actualmente utilizadas e para permitir uma genOme-wide análise de mLV sites de integração. Como exemplo, a amplificação de produtos de LM-PCR de 500 bp de comprimento pode resultar de digestão parcial do ADN genómico ou intra-ligação de fragmentos genómicos digeridos com Tru9I, tal como avaliado por clonagem de espingardas de amplicões de LM-PCR (dados não apresentados). No primeiro caso, o problema pode ser resolvido optimizando ainda mais as condições de digestão do ADN genómico, enquanto que, neste último caso, o sequenciamento maciço bem sucedido de locais de integração de mLV pode ser conseguido através de uma purificação em gel de amplicões entre 150 e 500 pb. Finalmente, a utilização de enzimas de restrição para cortar o ADN genómico pode conduzir à amplificação preferencial e à detecção de locais de integração que se encontram próximos a um local de restrição. A percentagem de locais de integração que a enzima de restrição Tru9I pode recuperar é estimada em ~ 50%. Deste modo, esta técnica pode ser ainda optimizada para melhorar a recuperação do local de integração utilizando múltiplas enzimas de restrição ou realizando aleatoriamente sheari de ADNNg por sonicação 20 , 21 .
Recentemente, temos otimizado a seqüência de sites de integração viral usando a plataforma amplamente utilizada Illumina, como detalhado neste artigo. Essa abordagem de seqüenciamento permite a geração de um maior número de leituras por execução em comparação com a plataforma Roche, aumentando consideravelmente o número de sites de integração recuperados de uma única experiência, reduzindo assim, globalmente, tempo e custos.
A identificação genómica de regiões reguladoras específicas de células requer o mapeamento de uma a três modificações de histonas por ChIP-seq 6 (mono- e trimetilação da histona H3 lisina 4 para identificar intensificadores e promotores e H3K27ac para distinguir entre activos e inactivos Elementos reguladores) 4 , 5 , 6 e uma comparação sistemática de diferentes tipos de células paraCis-atuando ativos exclusivamente em uma determinada população celular. Foram mapeados locais de integração de mLV em populações de células alvo prospectivamente isoladas, tais como progenitores hematopoiéticos multipotentes e sua progenia eritróide e mieloide 14 comprometida, células estaminais embrionárias, células-tronco neuroepiteliais e queratinócitos diferenciados 15 . A varredura retroviral permitiu a definição genômica de elementos reguladores específicos de células em cada população celular analisada, tornando os estudos comparativos ao genoma não estritamente necessários. É importante destacar que esta ferramenta pode ser usada para a identificação de elementos reguladores ativos em populações de células raras ( por exemplo , células-tronco somáticas), que carecem de marcadores robustos para isolamento prospectivo e não podem ser analisadas por análises de modificações de histonas com base em ChIP-seq. Nessas populações celulares, a integração de mLV é um marcador genético permanente de regiões reguladoras ativas,Sua identificação retrospectiva na progênie celular mais abundante in vitro e in vivo. Como exemplo, utilizamos com sucesso clusters de integração de mLV como marcadores substituintes de promotores e intensificadores numa população de células estaminais de queratinócitos (KSC) identificada retrospectivamente. Transduzimos uma cultura de queratinócitos derivada do prepúcio de passagem precoce contendo KSCs com um vector mLV, passamos então estas células para duplicações de células> 35 para enriquecer na progenia de KSCs, assim definidas pela sua capacidade de manter a cultura para este número de Passagens Nesse caso, as integrações de mLV marcaram permanentemente as regiões reguladoras ativas na população original de KSC transduzida 15 . Estudos futuros terão como objetivo identificar, em todo o genoma, elementos reguladores específicos de células em um número maior de raras populações de células estaminais humanas.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado por subvenções do Conselho Europeu de Investigação (ERC-2010-AdG, GT-SKIN), do Ministério italiano da Educação, Universidades e Investigação (FIRB-Futuro em Ricerca 2010-RBFR10OS4G, FIRB-Futuro em Ricerca 2012-RBFR126B8I_003 , EPIGEN Epigenomics Flagship Project), o Ministério Italiano da Saúde (Jovens Pesquisadores Chamam 2011 GR-2011-02352026) ea Imagine Institute Foundation (Paris, França).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PBS, pH 7.4 | ThermoScientific | 10010031 | or equivalent |
| Fetal Bovine Serum | ThermoScientific | 16000044 | or equivalent |
| 0.2 ml tubes | general lab supplier | ||
| 1.5 ml tubes | general lab supplier | ||
| QIAGEN QIAmp DNA mini Kit | QIAGEN | 51306 | or equivalent |
| T4 DNA ligase | New England BioLabs | M0202T | |
| T4 DNA Ligase Reaction buffer | New England BioLabs | M0202T | |
| Linker Plus Strand oligonucleotide | general lab supplier | 5’-PO4-TAGTCCCTTAAGCGGAG-3’ (Purification grade: SDS-PAGE) | |
| Linker Minus Strand oligonucleotide | general lab supplier | 5’-GTAATACGACTCACTATAGGGCTCCGCTTAAGGGAC-3’ (Purification grade: SDS-PAGE) | |
| Tru9I | Roche-Sigma-Aldrich | 11464825001 | |
| SuRE/Cut Buffer M | Roche-Sigma-Aldrich | 11417983001 | |
| PstI | Roche-Sigma-Aldrich | 10798991001 | |
| SuRE/Cut Buffer H | Roche-Sigma-Aldrich | 11417991001 | |
| Platinum Taq DNA Polimerase High Fidelity | Invitrogen | 11304011 | |
| 10 mM dNTP Mix | Invitrogen | 18427013 | or equivalent |
| PCR grade water | general lab supplier | ||
| 96-well thermal cycler (with heated lid) | general lab supplier | ||
| linker primer | general lab supplier | 5’-GTAATACGACTCACTATAGGGC-3’ (Purification grade: PCR grade) | |
| MLV-3’ LTR primer | general lab supplier | 5’-GACTTGTGGTCTCGCTGTTCCTTGG-3’ (Purification grade: PCR grade) | |
| linker nested primer 454 | general lab supplier | 5’-GCCTTGCCAGCCCGCTCAG[AGGGCTCCGCTTAAGGGAC](Purification grade: SDS-PAGE) | |
| MLV-3’ LTR nested primer 454 | general lab supplier | 5’-GCCTCCCTCGCGCCATCAGTAGC[GGTCTCCTCTGAGTGATTGACTACC](Purification grade: SDS-PAGE) | |
| linker nested primer Illumina | general lab supplier | 5'-TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAG-[AGGGCTCCGCTTAAGGGAC](Purification grade: SDS-PAGE) | |
| MLV-3’ LTR nested primer Illumina | general lab supplier | 5'-GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAG-[GGTCTCCTCTGAGTGATTGACTACC](Purification grade: SDS-PAGE) | |
| Sodium Acetate Solution (3M) pH 5.2 | general lab supplier | ||
| Ethanol (absolute) for molecular biology | Sigma-Aldrich | E7023 | or equivalent |
| Topo TA Cloning kit (with pCR2.1-TOPO vector) | Invitrogen | K4500-01 | |
| QIAquick Gel Extraction kit | QIAGEN | 28704 | |
| Agarose | Sigma-Aldrich | A9539 | or equivalent |
| Ethidium bromide | Sigma-Aldrich | E1510 | or equivalent |
| 100 bp DNA ladder | Invitrogen | 15628019 | or equivalent |
| 6x Loading Buffer | ThermoScientific | R0611 | or equivalent |
| NanoDrop 2000 UV-Vis Spectrophotometer | ThermoScientific | ND-2000 | |
| Nextera XT Index kit | Illumina | FC-131-1001 or FC-131-1002 | |
| 2x KAPA HiFi Hot Start Ready Mix | KAPA Biosystems | KK2601 | |
| Dynal magnetic stand for 2 ml tubes | Invitrogen | 12321D | or equivalent |
| Agencourt AMPure XP 60 ml kit | Beckman Coulter Genomics | A63881 | |
| Tris-HCl 10 mM, pH 8.5 | general lab supplier | ||
| Agilent 2200 TapeStation system | Agilent Technologies | G2964AA | or equivalent |
| D1000 ScreenTape | Agilent Technologies | 5067-5582 | or equivalent |
| D1000 Reagents | Agilent Technologies | 5067-5583 | or equivalent |
| KAPA Library Quantification Kit for Illumina platforms (ABI Prism) | KAPA Biosystems | KK4835 | |
| ABI Prism 7900HT Fast Real-Time PCR System | Applied Biosystems | 4329003 | |
| NaOH 1.0 N, molecular biology-grade | general lab supplier | ||
| HT1 (Hybridization Buffer) | Illumina | Provided in the MiSeq Reagent Kit | |
| MiSeq Reagent Kit v3 (150 cycles) | Illumina | MS-102-3001 | |
| MiSeq System | Illumina | SY-410-1003 | |
| PhiX Control v3 | Illumina | FC-110-3001 |
References
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