Summary
Qui descriviamo un protocollo per la mappatura genomica dei siti di integrazione dei vettori retrovirali basati su virus della leucemia murina Moloney nelle cellule umane.
Abstract
I vettori retrovirali a base virale di leucemia murina Moloney (MLV) si integrano prevalentemente in promotori e promotori acetilati. Per questo motivo, i siti di integrazione di mLV possono essere utilizzati come marcatori funzionali di elementi regolatori attivi. Qui presentiamo uno strumento di scansione retrovirale, che consente la identificazione genica di promotori e promotori specifici delle cellule. In breve, la popolazione di cellule bersaglio viene trasdotta con un vettore derivato da mLV e il DNA genomico viene digerito con un enzima di restrizione a taglio frequente. Dopo la legatura di frammenti genomici con un linker DNA compatibile, la reazione a catena di polimerasi mediata da linker (LM-PCR) consente l'amplificazione dei giunti del genoma del virus-ospite. La sequenza massiccia degli ampliconi viene utilizzata per definire il profilo di integrazione mLV in tutto il genoma. Infine, sono definiti cluster di integrazioni ricorrenti per identificare regioni regolatori specifiche per le cellule, responsabili dell'attivazione di programmi transcrizionali specifici di tipo cellulare.
ad esempio cellule staminali somatiche) che non dispongono di marcatori robusti per l'isolamento prospettico.
Introduction
L'identità cellulare è determinata dall'espressione di set specifici di geni. Il ruolo degli elementi cis-regolatori, come promotori e promotori, è fondamentale per l'attivazione di programmi transcrizionali specifici di tipo cellulare. Queste regioni regolatrici sono caratterizzate da caratteristiche specifiche di cromatina, quali modificazioni peculiari dell'istone, fattori di trascrizione e co-fattori legati e accessibilità cromatica, che sono stati ampiamente utilizzati per la loro identificazione a livello genomico in diversi tipi di cellule 1 , 2 , 3 . In particolare, il profilo genomico di acetilazione della istina H3 lisin 27 (H3K27ac) è comunemente usato per definire promotori attivi, enhancer e super-enhancer 4 , 5 , 6 .
Moloney virus della leucemia murina (MLV) è un retrovirus gamma che è ampiamente usato per il geneTrasferimento in cellule di mammiferi. Dopo l'infezione di una cellula bersaglio, il genoma RNA retrovirale viene retro-trascritto in una molecola del DNA a doppio filamento che lega le proteine virali e cellulari per assemblare il complesso di pre-integrazione (PIC). Il PIC entra nel nucleo e lega la cromatina della cellula ospite. Qui, l'integasi virale, un componente chiave del PIC, media l'integrazione del DNA provirale nel genoma delle cellule ospite. MLV nel DNA genomico non è casuale, ma si verifica in elementi cis-regolatori attivi, quali promotori e promotori, in un modo specifico per le cellule 7 , 8 , 9 , 10 . Questo particolare profilo di integrazione è mediato da un'interazione diretta tra l'integrasi di mLV e le proteine cellulodiche del bromodomano e del dominio extraterminale (BET) 11 , 12 , 13 . BET proteine (BRD2, BRD3 eBRD4) agiscono come un ponte tra la cromatina dell'ospite e il mLV PIC: attraverso i loro bromodomi riconoscono regioni cis-regolatori altamente acetilizzate, mentre il dominio extraterminale interagisce con la mLV integrase 11 , 12 , 13 .
Qui descriviamo la scansione retrovirale, un nuovo strumento per mappare regioni attive di cis-regolazione in base alle proprietà di integrazione di mLV. In breve, le cellule sono trasdotte con il vettore retrovirale derivato da mLV che esprime il gene reporter del proteine verde fluorescente (eGFP). Dopo l'estrazione genomica del DNA, le giunzioni tra il 3 'lungo ripetizione terminale (LTR) del vettore mLV e il DNA genomico vengono amplificate mediante PCR linker-mediata (LM-PCR) e sequenzialmente massicciamente. MLV sono mappati al genoma umano e le regioni genomiche altamente mirate da mlV sono definite come cluster di siti di integrazione mLV.
Scansione retroviraleNing è stato utilizzato per definire elementi regolatori attivi specifici per le cellule in diverse cellule primarie umane 14 , 15 . MlV co-mappati con promotori e valorificatori epigeneticamente definiti, la maggior parte dei quali conteneva segni attivi di istone, come H3K27ac, e erano specifiche per le cellule. La scansione retrovirale permette l'identificazione genetica degli elementi regolatori del DNA nelle popolazioni cellulari prospetticamente purificate 7 , 14 , nonché nelle popolazioni cellulari definite retrospettivamente, come le cellule staminali di cheratinociti, che non dispongono di marcatori efficaci per l'isolamento prospettico15.
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Protocol
1. MLV Trasduzione di cellule umane
- Isolare le cellule bersaglio e trasportarle con un vettore retrovirale derivato da mlV che ospita il gene del reporter eGFP e pseudotipizzato con vescicolare Stomatite Virus G (VSV-G) o la glicoproteina dell'amfotropo 16 .
- Tenere le cellule mock transduced come un controllo negativo per le analisi seguenti. Poiché i vettori retrovirali basati su mLV possono trasducere cellule divide in modo efficiente, coltivare la popolazione delle cellule bersaglio in condizioni che stimolano la divisione cellulare. Le condizioni di trasduzione devono essere specificamente ottimizzate per ciascun tipo di cellule in studio. Le condizioni di crescita cellulare e di trasduzione per i progenitori ematopoietici umani, le cellule T e le cellule epidermiche sono descritte nei riferimenti 7, 14, 15 e 17.
- 48 h dopo la trasduzione, risospendere 100.000 cellule in 300 μL di soluzione fisiologica tamponata con fosfato (PBS) contenente 2% di siero fetale fetale e misurare l'espressione eGFP per fBassa analisi citometrica (laser di eccitazione 488 nm). Utilizzare le cellule mock transduced come controllo negativo. Per ottimizzare il recupero di siti di integrazione, purificare le cellule GFP + mediante Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS).
- Raccogliere da 0,5 a 5 milioni di cellule per la preparazione del DNA genomico. È preferibile un periodo di coltura più lungo (> 7 giorni) per diluire il provirio non integrato e necessario analizzando la progenie a lungo termine delle cellule staminali bona fide (cfr . Sezione Discussione e riferimento 15 ). Le pellicole cellulari possono essere congelate e conservate a -80 ° C fino all'uso.
2. Amplificazione dei siti di integrazione di mLV tramite PCR mediati da linker (LM-PCR)
- Preparazione del DNA genomico (gDNA)
- Estrarre il gDNA utilizzando un kit di estrazione del DNA basato sulla colonna e seguire il protocollo per le cellule colte, secondo le istruzioni del produttore.
- Enzima di restrizione digestisopra
- Impostare 4 digestioni di enzimi di restrizione per campione in tubi da 1,5 ml. Digest 0.1 - 1 μg gDNA in ogni tubo aggiungendo 1 μL di Tru9I (10U) e 1 μL di Tampone M in un volume finale di 10 μL. Incubare le reazioni a 65 ° C per 6 ore o durante la notte.
- Aggiungere ad ogni reazione 1 μl di PstI (10U), 1 μl di Tampone H e 8 μl di acqua. Incubare le reazioni a 37 ° C per 6 ore o durante la notte. I campioni possono essere conservati a -20 ° C fino all'uso.
- Ligation del linker
- Preparare una soluzione di base di linker Tru9I da 100 μM in un tubo da 1,5 mL mescolando il linker più filo e linker minus strand oligonucleotidi a una concentrazione di 100 μM. Mettere il tubo in un set di acqua a 100 ° C e lasciarlo raffreddare a temperatura ambiente. La soluzione di titanio Tru9I può essere conservata a -20 ° C fino all'uso.
- Impostare 8 reazioni di legatura del linker in tubi da 1,5 ml. Per ogni reazione, aggiungere il seguente componenteS fino a 10 μL di digestione enzimatica di restrizione: 1,4 μL di 10X T4 DNA Ligase Reaction buffer, 1 μl di 10 μM di linker Tru9I, 1 μL (2.000U) di T4 DNA ligasi e 0.6 μL di acqua. Incubare a 16 ° C per 3 a 6 h. I campioni possono essere conservati a -20 ° C fino all'uso.
- Primo PCR
- Impostare 48 reazioni PCR (6 reazioni da ogni tubo di legatura) in 0,2 mL tubi. Per ogni PCR, aggiungete i seguenti reagenti a 2 μL di reazione di legame: 5 μL di tampone PCR 10X, 2 μL di 50 mM di solfato di magnesio, 1 μl di 10 mM deoxynucleotide (dNTP) Mix, 1 μl di primer di collegamento 10 μM, 1 ΜL di 10 μM mLV-3 'LTR primer, 0,3 μL (1,5U) di Taq DNA Polimerasi e 37,7 μl di acqua. Le sequenze di primer sono fornite nella tabella 1.
- Eseguire la reazione PCR in un cycler termico con coperchio riscaldato, come segue: 95 ° C per 2 min; 25 cicli di 95 ° C per 15 s, 55 ° C per 30 s, 72 ° C per 1 min; 72 °; C per 5 min; Tenere a 4 ° C. I campioni possono essere conservati a -20 ° C fino all'uso.
- Secondo PCR
- Impostare 48 reazioni PCR (1 da ogni tubo "primo PCR") in tubi da 0,2 mL. Per ogni PCR, aggiungere i seguenti componenti a 2 μL della prima reazione PCR: 5 μL di tampone PCR 10X, 2 μL di 50 mM di solfato di magnesio, 1 μL di 10 mM dNTP Mix, 1 μl di primer nidificato 10 μM, 1 ΜL di primer nidificato 10 μM mLV-3 'LTR, 0,3 μl di Taq DNA Polymerase (1,5 U) e 37,7 μL di acqua. Utilizzare primer nidificati progettati per la specifica strategia di sequenza massiccia scelto: (i) primer nidificato con linker e primer nidificato con mLV-3 'LTR compatibile con la piattaforma Illumina; (Ii) primer nidificato con linker e primer nidificato mLV-3 'LTR compatibile con la piattaforma Roche. Le sequenze di primer sono elencate nella tabella 1 .
- Eseguire la reazione PCR in un cycler termico con coperchio riscaldato, come segue: 95 ° C per 2 min; 25Cicli di 95 ° C per 15 s, 58 ° C per 30 s, 72 ° C per 1 min; 72 ° C per 5 min; Tenere a 4 ° C. I campioni possono essere conservati a -20 ° C fino all'uso.
- Raccogliere le 48 reazioni PCR nidificate in un tubo da 15 mL (volume finale di ~ 2,4 mL). I campioni possono essere conservati a -20 ° C fino all'uso.
- Determinare la presenza e la dimensione dei prodotti LM-PCR mediante elettroforesi di agarosio.
- Aggiungere 4 μl di buffer di caricamento a 20 μL di prodotti LM-PCR e caricare il campione su un gel di agarosio al 1%, insieme ad una scala del DNA a 100 bp. Eseguire il gel a 5 V / cm per 30-60 minuti e visualizzare i prodotti PCR con colorazione di bromuro di etidio.
- Eseguire una reazione LM-PCR dal campione trasfusibile come controllo negativo.
- Precipitare gli ampliconi aggiungendo 0,1 volumi di soluzione di acetato di sodio (3 M, pH 5,2) e 2,5 volumi di etanolo al 100%. Mescolare e congelare a -80 ° C per 20 minuti.
- Spin al fuVelocità in una microcentrifuga standard a 4 ° C per 20 minuti. Scartare il surnatante e lavare il pellet con il 70% di etanolo. Girare a piena velocità in una microcentrifuga standard a 4 ° C per 5 min.
- Scartare il supernatante e asciugare il pellet. Aggiungere 200 μL di acqua di PCR e riposizionare il DNA. I campioni possono essere conservati a -20 ° C fino all'uso.
- Aggiungere 20 μl di buffer di caricamento a 100 μL dei prodotti LM-PCR e caricare il campione su un gel agarosico del 1%, insieme ad una scala del DNA da 100 bp.
- Eseguire il gel a 5 V / cm per 30-60 minuti e tagliare la parte del gel contenente ampliamenti da 150 a 500 bp.
- Purificare i prodotti LM-PCR con un kit di estrazione del gel basato sulla colonna e misurare la concentrazione utilizzando uno spettrofotometro UV.
- Utilizzare 1 μL di libreria per valutare la lunghezza dei prodotti LM-PCR utilizzando uno strumento di bioanalizzatore, secondo le istruzioni del produttore.
- Utilizzare 20 ng dei prodotti purificati LM-PCR e clonarli nel vettore pCR2.1-TOPO, secondo le istruzioni del produttore.
- Eseguire reazioni di sequenza utilizzando il primer universale M13, seguito da mappe genomiche delle sequenze risultanti, per rivelare la presenza delle giunzioni virali-genomiche (incluso il primer annidato mLTR-3 'LTR) in> 50% dei cloni per identificare campioni adatti Per la sequenza massiccia. Esempio di giunzione virale-genoma:
MLR-3 'LTR primer 454 e primer nidificante linker 454 ( Tabella 1 ) sono indicati in grassetto e l'estremità 3' del LTR virale in corsivo. La sequenza genomica umana è evidenziata in rosso (chr10: 6439408-6439509, hg19).
3. Sequencing massiccia dei siti di integrazione mLV
NOTA: LM-PCR prodPossono essere sequenziati utilizzando piattaforme commerciali (scegliendo la corretta coppia primer nidificata nella seconda reazione PCR, si veda il paragrafo 2.5.1). Per il sequenziamento della piattaforma pirocedente Roche GS-FLX, fare riferimento ai precedenti articoli 7 , 14 e 15 . In questa sezione viene descritto un protocollo di nuova ottimizzazione per la piattaforma di sequenziamento Illumina.
- Preparazione alla libreria
- Impostare 1 reazione PCR di indice per campione in tubi da 0,2 mL. Per ogni PCR, aggiungere i seguenti reagenti a 5 μL (150-170 ng) di prodotto purificato di LM-PCR: 5 μL di Primer 1, 5 μL di Primer 2, 25 μL di Master Mix 2X e 10 μL di PCR- Acqua di qualità. Utilizza una combinazione di indice diversa per ogni campione.
- Eseguire reazioni PCR in un cycler termico con coperchio riscaldato, come segue: 95 ° C per 3 min; 8 cicli di 95 ° C per 30 s, 55 ° C per 30 s, 72 ° C per 30 s; 72 ° C per 5 min; Tenere a 4 ° C.
- Purificare i prodotti PCR usando un protocollo di isolamento a spruzzo in fase solida (SPRI): in nuovi tubi da 1,5 ml aggiungere 56 μL di perle a ciascun campione e procedere seguendo le istruzioni del produttore. Eluire in 25 μl di Tris-HCl 10 mM. Le biblioteche possono essere conservate a -20 ° C fino all'uso.
- Controllo della libreria
- Utilizzare 1 μl di campione per valutare la dimensione della libreria utilizzando uno strumento di bioanalizzatore.
- Utilizzare 1 μl di campione per quantificare la molecolarità della biblioteca usando un test PCR real time basato su fluorescenza, secondo le istruzioni del produttore.
- Diluizione e sequenza della biblioteca
- Dilute le librerie a 10 nM usando Tris-HCl 10 mM. Per la raccolta di librerie, trasferire 5 μL di ogni libreria diluita in un nuovo tubo da 1,5 ml e quindi diluire la piscina a 4 nM in Tris-HCl 10 mM.
- Mescolare 5 μL di piscina diluita con 5 μL di 0,2 N NaOH in un nuovo 1,5 mL, vorticare brevemente, spin-down e incubare per 5 minuti a temperatura ambiente per denaturare le librerie.
- Mettere i tubi sul ghiaccio e aggiungere 990 μl di tampone di ibridazione pre-refrigerato (HT1). Aliquota 300 μL di piscina denaturata in un nuovo tubo da 1,5 ml e aggiungere 300 μl di HT1 pre-refrigerato per ottenere una piscina di biblioteca finale di 10 μM.
- Parallelamente, mescolare 2 μl di libreria di controllo PhiX (10 nM) con 3 μL di Tris-HCl 10 mM in un tubo da 1,5 mL. Aggiungere 5 μL di NaOH 0,2 N, vorticare brevemente, spin-down e incubare per 5 minuti a temperatura ambiente per denaturare il PhiX diluito. Mettere il tubo sul ghiaccio e aggiungere 990 μl di HT1 pre-refrigerato.
- Aliquota 300 μL di PhiX denaturato in un nuovo tubo da 1,5 ml e aggiungere 300 μl di HT1 pre-refrigerato per ottenere una PhiX finale di 10 μM.
- In un nuovo tubo da 1,5 ml, mescolare 510 μL di pool di biblioteca denaturato con 90 μL di libreria PhiX denaturato, ottenendo così una piscina finale di 10 pM con il 15% di controllo PhiX.
- Pipettate questi 600 μL di campioneVolume nel serbatoio del campione di carica della cartuccia del reagente di sequenza scongelato e procedere immediatamente per eseguire una singola lettura a 150 cicli.
NOTA: i reagenti critici e le sequenze primer necessarie per questo protocollo sono elencati nella tabella 1 .
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Representative Results
Flusso di lavoro della procedura di scansione retrovirale
Il flusso di lavoro della procedura di scansione retrovirale è schematizzato in Figura 1 . La popolazione delle cellule bersaglio viene purificata e trasfusa con un vettore retrovirale derivato da mLV che esprime un gene reporter del eGFP. Il transgene è affiancato dalle due identiche ripetizioni terminali lunghe (5 'e 3' LTR), garantendo la sintesi, la trascrizione inversa e l'integrazione del genoma virale nel DNA ospite. L'efficienza di trasduzione è valutata con l'analisi FACS dell'espressione eGFP. La popolazione cellulare contenente una proporzione elevata (> 30%) di cellule mLV trasdotte viene amplificata e successivamente lisata per estrarre DNA genomico contenente le cassette virali integrali mLV. Il DNA genomico viene digerito e legato con un linker compatibile e le giunzioni tra le virali 3 'LTR e il genoma ospite sono amplificate da LM-PCR. VirLe giunzioni del genoma us-host vengono poi sequenziate in maniera massiccia usando le piattaforme Roche o Illumina. Infine, i siti di integrazione di mLV sono mappati al genoma umano per definire cluster genomici di siti di inserimento ricorrenti.
Amplificazione dei siti di integrazione mLV da LM-PCR
Il LM-PCR è schematizzato in Figura 2 . Il DNA genomico viene estratto dalle cellule mLV trasdurate e digerito con l'enzima di restrizione Tru9I, che taglia frequentemente il genoma umano, generando frammenti con una media di 70 bp. Un secondo enzima di restrizione (PstI) viene utilizzato per impedire l'amplificazione di frammenti integrati e non integrati di 5 'LTR. Un linker a doppio filamento Tru9I viene quindi legato ai frammenti genomici e LM-PCR viene eseguito con primer specifici per il linker e Il 3 'LTR per amplificare le giunzioni del genoma del virus-ospite. Il PCR nidificato può essere eseguito usando priCompatibile con le piattaforme di sequenza di Roche o Illumina.
Analisi di ampliconi di giunzione del genoma del virus-host
Nell'esperimento rappresentato in Figura 3 , abbiamo purificato i progenitori / precursori mielodici CD34 - CD13 + (MPP) e li trasdussi con un retrovirale derivato da mLV che esprimeva il gene del reporter del eGFP. Più del 60% delle cellule MPP ha espresso eGFP 48 h dopo la trasduzione (dati non mostrati). 15 giorni dopo la trasduzione, abbiamo raccolto le cellule, estratto gDNA e amplificato le giunzioni genomiche del virus-oste, come sopra descritto. Una aliquota dei prodotti LM-PCR riuniti è stata caricata su un gel agarosico del 1% per verificare la presenza e la dimensione degli ampliconi. Abbiamo visualizzato con successo una striscia di DNA corrispondente ai prodotti LM-PCR di diverse dimensioni, che vanno da 150 a 500 bp ( figura 3A ). All'epoca erano gli AmpliconiConcentrata per precipitazione del DNA e caricata su un gel agarosico del 1%. I prodotti LM-PCR sono stati purificati con gel e eseguiti su un sistema di bioanalizzatore, confermando le dimensioni dell'amplicone previste (tra 150 e 500 bp; Figura 3B ).
Mappatura delle integrazioni di mLV in regioni regolatorie attive e specifiche della cellula
Nell'esperimento riportato in Figura 4 , cellule staminali / progenitori ematopoietiche (HSPC), progenitori eritroidi / precursori (EPP) e progenitori mieloidi / precursori (MPP) sono stati trasdotti con un vettore retrovirale derivato da mLV. Questi risultati sono stati ottenuti elaborando e sequenziando campioni derivanti da diversi tipi di cellule separatamente, per evitare la potenziale contaminazione / collisioni 18 , 19 . Le letture di sequenze grezze generate da sequenze massive sono state elaborate da una bioinformatica automatizzataPipeline per eliminare le sequenze virali e linker. Quindi, sequenze uniche di almeno 20 bp sono state mappate sul genoma umano utilizzando Blat 17 . Gli allineamenti grezzi sono stati filtrati che richiedono che la partita parte entro i primi 3 nucleotidi, le partite univoche e una identità minima del 95%. I cluster di integrazioni mLV ricorrenti sono state definite da un confronto statistico con un set di sequenze genomiche casuali, generato in modo casuale estrazione di posizioni genomiche dal genoma umano con un motivo di restrizione Tru91 ad una distanza compatibile con la piattaforma di sequenza. Le sequenze di controllo sono state quindi elaborate attraverso la stessa pipeline di mappatura e filtraggio utilizzate per le sequenze di integrazione, per generare un insieme casuale di siti unici. Per definire i cluster mLV, abbiamo applicato l'algoritmo di clustering DBSCAN 19 , confrontando la distribuzione di integrazioni mLV consecutive con quella di un numero uguale di siti casuali per identificare le regioni di integrazioni altamente clusterizzate, che defGli elementi regolatori specifici delle cellule ine 7 , 14 , 15 . Al fine di evitare la generazione di cluster falsi, sono state eseguite più estrazioni dal dataset di controllo casuale. Abbiamo mappato da LM-PCR e da pyrosequencing siti di integrazione di 32.574, 27.546 e 36.358 mLV in HSPC, EPP e MPP rispettivamente. Cluster di integrazioni mLV ricorrenti co-mappate con valorizzatori e promotori acetilati ( Figura 4A ). La maggior parte delle regioni regolatori mirate di mLV erano cellule-specifiche, come: (i) il promotore di HSPC specifico gene SPINK2 ( Figura 4B ); (Ii) la regione di controllo Locus contenente potenti enzimi dei geni globinici β simili a eritroide ( Figura 4C ); (Iii) potenziatori situati a monte del gene LYZ specifico per MPP ( Figura 4D ). Infine, abbiamo utilizzato test di luciferasi per convalidareUn sottogruppo di enfasi mirata di cellule specifiche per cellule specificate da mLV in EPP e MPP ( Figura 4E ).
Figura 1: Uno schema generale della procedura di mappatura del sito di integrazione retrovirale. Le cellule target vengono trasdurate con un vettore retrovirale a base mLV contenente una cassetta eGFP. Il DNA genomico ottenuto da cellule trasdotte viene digerito con Tru9I e legato con un linker a doppio strato Tru9I compatibile. MLV sono stati amplificati da LM-PCR nidificati e la libreria di giunzioni del genoma del virus-ospite può essere sequenziata in massa utilizzando piattaforme Illumina o Roche. Le letture risultanti sono state mappate al genoma umano per definire cluster di integrazioni mLV ricorrenti. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. </ P>
Figura 2: Amplificazione di giunzioni del genoma del virus-ospite da LM-PCR. Il DNA genomico (gDNA) contenente il provirus mLV integrato viene digerito con enzimi di restrizione Tru9I e PstI e legato con un linker Tru9I compatibile. Il PCR nidificato viene eseguito utilizzando primer specifici per il LTR e il linker. Sono indicati i siti di restrizione Tru9I e PstI nel virus e nel genoma umano. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Analisi di ampliconi LM-PCR. ( A ) I prodotti LM-PCR (corsia +) sono stati eseguiti su un gel di agarosio del 1% e visualizzatiDa bromuro di etidio colorazione. Un campione di template non è stato utilizzato come campione di controllo negativo, in cui sono stati visualizzati solo primer PCR (corsia -). ( B ) Dopo la depurazione del gel, la dimensione del prodotto LM-PCR è stata controllata mediante elettroforesi microcapillare. Le dimensioni del campione (bp) e l'intensità di fluorescenza (FU) sono rappresentate rispettivamente sugli assi x e y dell'elettroferogramma. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Mappatura dell'integrazione di mLV in regioni regolatorie definite epigeneticamente. ( A ) Abbiamo definito 3,498, 2,989 e 4,103 cluster di siti di integrazione mLV ricorrenti in HSPC, EPP e MPP, rispettivamente. In ciascuna popolazione cellulare,> 95% dei cluster mLV si sovrapponeva con enhanc definito epigeneticamenteEnti e promotori. ( B , C e D ) Le regioni mirate per cellule specificate con mLV sono state altamente acetilate e associate all'espressione specifica delle cellule del gene mirato ( SPINK2 , HBB e LYZ , quasi esclusivamente espresse in HSPC, EPP e MPP rispettivamente come determinato Mediante analisi Cap dell'espressione genica). MlV singole integrazioni sono raffigurati con piccole barre. TPM indica Tag Per Million. ( E ) Enfatizzatori mirati per cellule specifici per cellule MLV in EPP e MPP. La figura 4 è adattata dal riferimento 14 . Abbiamo ricevuto il permesso di riutilizzare questa figura sotto la licenza Creative Commons. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Qui abbiamo descritto un protocollo per la mappatura genomica dei siti di integrazione di mLV, un retrovirus che mira alle regioni di cromatina, contrassegnato epigeneticamente come promotori e promotori attivi. I passi critici e / o le limitazioni del protocollo includono: (i) trasduzione mLV della popolazione cellulare target; (Ii) amplificazione di giunzioni virali-host da parte di LM-PCR; (Iii) recupero di un'alta percentuale di siti di integrazione. I vettori retrovirali basati su mLV trasudano in modo efficiente le cellule divisorie. La bassa efficienza di trasduzione di cellule non divisorie (ad es. Cellule neuronali post-mitotiche) è una limitazione potenziale di questa tecnica. Tuttavia, può essere superato attraverso la selezione delle cellule della popolazione trasudata basata sull'espressione del gene reporter ( ad es. EGFP). La generazione di ampliconi relativamente brevi da LM-PCR (da 150 a 500 bp) è obbligatoria per generare una libreria di ampliconi compatibili con le attuali strategie di sequenziamento attualmente utilizzate e per consentire un gene completoUn'analisi completa di siti di integrazione mLV. Ad esempio, l'amplificazione di prodotti lunghi di LM-PCR a partire da> 500 bp può derivare da una digestione parziale genomica del DNA o da una intra-legatura di frammenti genomici digeriti Tru9I, come valutato dalla clonazione di fucile di ampliconi LM-PCR (dati non mostrati). Nel primo caso, il problema può essere risolto ulteriormente ottimizzando le condizioni di digestione genomica del DNA, mentre in quest'ultimo caso, il successo di sequenziamento massiccio dei siti di integrazione di mLV può essere ottenuto attraverso una purificazione di ampificanti di gel tra 150 e 500 bp. Infine, l'impiego di enzimi di restrizione per tagliare il DNA genomico può portare all'amplificazione e alla rilevazione preferenziali di siti di integrazione che si trovano vicino ad un sito di restrizione. La percentuale di siti di integrazione che l'enzima di restrizione Tru9I può recuperare è stimato pari al ~ 50%. Quindi, questa tecnica può essere ulteriormente ottimizzata per migliorare il recupero del sito di integrazione utilizzando più enzimi di restrizione o eseguire DNA casuale sheariNg per sonicazione 20 , 21 .
Recentemente, abbiamo ottimizzato il sequenziamento dei siti di integrazione virale utilizzando la piattaforma Illumina ampiamente utilizzata, come descritto in questo documento. Questo approccio di sequenziamento consente di generare un numero maggiore di letture per esecuzione rispetto alla piattaforma Roche, aumentando notevolmente il numero di siti di integrazione recuperati da un singolo esperimento, riducendo così globalmente i tempi ei costi.
L'identificazione genomica delle regioni regolatorie specifiche per le cellule richiede la mappatura di una o tre modificazioni dell'istone da parte di ChIP-seq 6 (mono- e tri-metilazione della istina H3 lisin 4 per identificare i promotori e promotori e H3K27ac per distinguere tra attivo e inattivo Elementi regolatori) 4 , 5 , 6 e un confronto sistematico di diversi tipi di cellule da definireElementi cis-attivi attivi esclusivamente in una determinata popolazione cellulare. Abbiamo mappato i siti di integrazione mLV in popolazioni di cellule bersaglio di tipo prospetticamente isolato, come progenitori ematopoietici multipotenti e la loro progenie 14 eritroide e mielodica, cellule staminali embrionali, cellule staminali simili a neuroepiteleli e cheratinociti differenziati 15 . La scansione retrovirale ha permesso la definizione di elementi di regolazione specifici delle cellule in ciascuna popolazione cellulare analizzata, rendendo gli studi comparativi a livello genomico non strettamente necessari. Importante, questo strumento può essere utilizzato per l'identificazione di elementi regolatori attivi nelle popolazioni di cellule rare ( ad es. Cellule staminali somatiche) che non dispongono di marcatori robusti per l'isolamento prospettico e non possono essere analizzati mediante analisi ChIP-seq delle modificazioni dell'istone 15 . In queste popolazioni cellulari l'integrazione di mLV è un marcatore genetico permanente delle regioni regolatori attive, permettendo cosìIdentificazione retrospettiva nella più potente progenie cellulare in vitro e in vivo. Ad esempio, abbiamo utilizzato con successo cluster di integrazione mLV come marcatori surrogati di promotori e enhancers in una popolazione di cellule staminali (KSC) retrospettivamente identificate. Abbiamo trasduzione una coltura di cheratinociti derivata dalla prepuzia contenente KSC con un vettore mLV, quindi abbiamo passato queste cellule per> 35 doublings di cellule per arricchire nella progenie di KSCs, così definiti dalla loro capacità di mantenere la cultura per questo numero di passaggi. In questo caso, le integrazioni di mLV hanno segnato in modo permanente le regioni regolatori attive nella popolazione KSC trasduttiva originale 15 . Gli studi futuri mireranno a individuare in modo genomico gli elementi normativi specifici per le cellule in un numero maggiore di rari popolazioni di cellule staminali umane.
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Disclosures
Gli autori non hanno niente da rivelare.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni del Consiglio europeo della ricerca (ERC-2010-AdG, GT-SKIN), Ministero italiano dell'istruzione, delle università e della ricerca (FIRB-Futuro in Ricerca 2010-RBFR10OS4G, FIRB-Futuro in Ricerca 2012-RBFR126B8I_003 , EPIGEN Epigenomics Flagship Project), il Ministero della Salute italiano (Giovani ricercatori Chiamata 2011 GR-2011-02352026) e la Fondazione Imagine Institute (Parigi, Francia).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PBS, pH 7.4 | ThermoScientific | 10010031 | or equivalent |
| Fetal Bovine Serum | ThermoScientific | 16000044 | or equivalent |
| 0.2 ml tubes | general lab supplier | ||
| 1.5 ml tubes | general lab supplier | ||
| QIAGEN QIAmp DNA mini Kit | QIAGEN | 51306 | or equivalent |
| T4 DNA ligase | New England BioLabs | M0202T | |
| T4 DNA Ligase Reaction buffer | New England BioLabs | M0202T | |
| Linker Plus Strand oligonucleotide | general lab supplier | 5’-PO4-TAGTCCCTTAAGCGGAG-3’ (Purification grade: SDS-PAGE) | |
| Linker Minus Strand oligonucleotide | general lab supplier | 5’-GTAATACGACTCACTATAGGGCTCCGCTTAAGGGAC-3’ (Purification grade: SDS-PAGE) | |
| Tru9I | Roche-Sigma-Aldrich | 11464825001 | |
| SuRE/Cut Buffer M | Roche-Sigma-Aldrich | 11417983001 | |
| PstI | Roche-Sigma-Aldrich | 10798991001 | |
| SuRE/Cut Buffer H | Roche-Sigma-Aldrich | 11417991001 | |
| Platinum Taq DNA Polimerase High Fidelity | Invitrogen | 11304011 | |
| 10 mM dNTP Mix | Invitrogen | 18427013 | or equivalent |
| PCR grade water | general lab supplier | ||
| 96-well thermal cycler (with heated lid) | general lab supplier | ||
| linker primer | general lab supplier | 5’-GTAATACGACTCACTATAGGGC-3’ (Purification grade: PCR grade) | |
| MLV-3’ LTR primer | general lab supplier | 5’-GACTTGTGGTCTCGCTGTTCCTTGG-3’ (Purification grade: PCR grade) | |
| linker nested primer 454 | general lab supplier | 5’-GCCTTGCCAGCCCGCTCAG[AGGGCTCCGCTTAAGGGAC](Purification grade: SDS-PAGE) | |
| MLV-3’ LTR nested primer 454 | general lab supplier | 5’-GCCTCCCTCGCGCCATCAGTAGC[GGTCTCCTCTGAGTGATTGACTACC](Purification grade: SDS-PAGE) | |
| linker nested primer Illumina | general lab supplier | 5'-TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAG-[AGGGCTCCGCTTAAGGGAC](Purification grade: SDS-PAGE) | |
| MLV-3’ LTR nested primer Illumina | general lab supplier | 5'-GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAG-[GGTCTCCTCTGAGTGATTGACTACC](Purification grade: SDS-PAGE) | |
| Sodium Acetate Solution (3M) pH 5.2 | general lab supplier | ||
| Ethanol (absolute) for molecular biology | Sigma-Aldrich | E7023 | or equivalent |
| Topo TA Cloning kit (with pCR2.1-TOPO vector) | Invitrogen | K4500-01 | |
| QIAquick Gel Extraction kit | QIAGEN | 28704 | |
| Agarose | Sigma-Aldrich | A9539 | or equivalent |
| Ethidium bromide | Sigma-Aldrich | E1510 | or equivalent |
| 100 bp DNA ladder | Invitrogen | 15628019 | or equivalent |
| 6x Loading Buffer | ThermoScientific | R0611 | or equivalent |
| NanoDrop 2000 UV-Vis Spectrophotometer | ThermoScientific | ND-2000 | |
| Nextera XT Index kit | Illumina | FC-131-1001 or FC-131-1002 | |
| 2x KAPA HiFi Hot Start Ready Mix | KAPA Biosystems | KK2601 | |
| Dynal magnetic stand for 2 ml tubes | Invitrogen | 12321D | or equivalent |
| Agencourt AMPure XP 60 ml kit | Beckman Coulter Genomics | A63881 | |
| Tris-HCl 10 mM, pH 8.5 | general lab supplier | ||
| Agilent 2200 TapeStation system | Agilent Technologies | G2964AA | or equivalent |
| D1000 ScreenTape | Agilent Technologies | 5067-5582 | or equivalent |
| D1000 Reagents | Agilent Technologies | 5067-5583 | or equivalent |
| KAPA Library Quantification Kit for Illumina platforms (ABI Prism) | KAPA Biosystems | KK4835 | |
| ABI Prism 7900HT Fast Real-Time PCR System | Applied Biosystems | 4329003 | |
| NaOH 1.0 N, molecular biology-grade | general lab supplier | ||
| HT1 (Hybridization Buffer) | Illumina | Provided in the MiSeq Reagent Kit | |
| MiSeq Reagent Kit v3 (150 cycles) | Illumina | MS-102-3001 | |
| MiSeq System | Illumina | SY-410-1003 | |
| PhiX Control v3 | Illumina | FC-110-3001 |
References
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