Summary
نقدم هنا، بروتوكول المكرر لفعالية الكشف عن بيوتينيلاتيد ديكستران أمين (BDA) وسم مع الفلورسنت تلطيخ الأسلوب من خلال مسار العصبية المعاملة بالمثل. ومناسبة لتحليل بنية غرامة من BDA وسم ويميزه عن سائر العناصر العصبية تحت ليزر [كنفوكل] مجهر مسح.
Abstract
ارتفاع الوزن الجزيئي بيوتينيلاتيد ديكستران أمين (BDA) استخدمت الراسم نيورواناتوميكال درجة عالية من حساسية لعقود عديدة. نظراً لتأثر نوعية وصفها عوامل مختلفة، من هنا، نحن نقدم بروتوكول المكرر لتطبيق عالية الوزن الجزيئي BDA لدراسة وضع العلامات العصبية الأمثل في الجهاز العصبي المركزي. بعد ضخ BDA المناظير باستخدام الأشعة في نواة بوستيروميديال البطني (VPM) المهاد في الفئران من خلال ماصة زجاجية حساسة، ملطخة بنيون ستريبتافيدين-أليكسا (AF) 594 BDA وكونتيرستينيد بوصمة عار الفلورسنت نسل AF500/525. على خلفية خضراء نسل تلطيخ، العلامات BDA الحمراء، بما في ذلك الهيئات الخلايا العصبية ومحطات محواري، أكثر اختلافاً واضحا تجلى في قشرة سوماتوسينسوري. وعلاوة على ذلك، مضاعفة تلطيخ الفلورسنت ل BDA وأجرى بارفالبومين البروتين الكالسيوم الملزمة (PV) لمراعاة الترابط بين وسم BDA وإينتيرنيورونس الكهروضوئية-الإيجابية في الهدف القشرية، وإتاحة الفرصة لدراسة المحلية العصبية الدوائر وخصائصها الكيميائية. وهكذا، هذا الأسلوب المكرر ليس فقط مناسبة لتصور وضع العلامات مع الوزن الجزيئي عالية BDA من خلال المسارات العصبية المتبادل بين قشرة الدماغ والمهاد العصبية ذات جودة عالية، ولكن سوف تسمح أيضا مظاهرة متزامنة من علامات العصبية الأخرى مع نيون هيستوتشيميستري أو إيمونوتشيميستري.
Introduction
ارتفاع الوزن الجزيئي BDA (الوزن الجزيئي 10,000)، تتبع حساسة للغاية، وقد استخدمت لتتبع المسارات العصبية في الجهاز العصبي المركزي لما يزيد على 20 سنة1. على الرغم من أن استخدام BDA المسالك العصبية شائعة تتبع الأسلوب، يمكن أن تتأثر نوعية BDA وسم في الحيوانات بمختلف العوامل1،،من23. دراستنا الأخيرة أشارت إلى أن الهيكل الأمثل لوسم BDA هو المرتبطة بوقت مناسب بعد انتهاء حقن بقاء، بل يرتبط أيضا ب أسلوب المصبوغة4. حتى الآن، ومجمع عبدين-البيوتين-البيروكسيديز التقليدية (ABC)، streptavidin-fluorescein isothiocyanate، وستريبتافيدين-AF594 استخدمت أساليب المصبوغة للكشف عن العلامات BDA في الدراسات السابقة2،3، 4،5. وبالمقارنة، صبغة الفلورسنت ل BDA يمكن بسهولة إجراء.
بغية توسيع نطاق تطبيق عالية الوزن الجزيئي BDA، أدخل بروتوكول المكرر في هذه الدراسة. عقب حقن BDA إلى VPM المهاد في الدماغ الفئران، وسم BDA كان كشفت بطريقة منتظمة لتلطيخ ABC القياسية وكذلك مزدوجة الفلورسنت تلطيخ، التي أجريت لرصد العلاقة بين العلامات BDA والأساسية العناصر العصبية أو إينتيرنيورونس في الهدف القشرية مع ستريبتافيدين-AF594 ونيون نسل هيستوتشيميستري أو PV-إيمونوتشيميستري، على التوالي. من خلال المسارات العصبية متبادلة بين VPM والقشرة الأولية somatosensory (S1)6،،من78، ركزنا ملاحظتنا على BDA وسم في محاور عصبية ثالاموكورتيكال المتوقعة وكورتيكوثالاميك حسام الخلية المتوقعة في S1. بهذه العملية، وكنا نتوقع أن يوفر بروتوكول مفصلة للحصول على الجودة العالية للعلامات العصبية مع ارتفاع الوزن الجزيئي BDA، ليس فقط، بل أيضا بروتوكول المكرر على المزيج من العلامات BDA الفلورسنت وغيرها علامات العصبية الفلورسنت مع هيستوتشيميستري أو إيمونوتشيميستري. وهذا النهج الأفضل لدراسة الدوائر العصبية المحلية وخصائصها الكيميائية تحت ليزر [كنفوكل] الفحص المجهري.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
هذه الدراسة أقرته لجنة الأخلاقيات في "الصين أكاديمية من الصينية العلوم الطبية" (مرجع رقم 20160014). وأجريت جميع الإجراءات وفقا "المعاهد الوطنية للصحة دليل" لرعاية واستخدام الحيوانات المختبرية (أكاديمية الصحافة الوطنية، واشنطن، العاصمة، 1996). واستخدمت في هذه الدراسة الفئران الذكور الكبار الأربعة (وزن ز 250-280). جميع الحيوانات يقع في دائرة ضوء/الظلام ح 12 مع التحكم في درجة الحرارة والرطوبة، والسماح بحرية الوصول إلى الغذاء والمياه. وقد أظهرت الأدوات والمواد المستخدمة في هذه الدراسة في الشكل 1. قبل الجراحة، تم تنظيف جميع الصكوك، مثل الإطار ستيريوتاكسيك وماصة زجاجية، استخدام الإيثانول 70%.
1-العمليات الجراحية
- تحديد مجال الاهتمام في VPM أطلس ستيريوتاكسيك9 (الشكل 2A) باستخدام تنسيق.
- إعداد 1 ميليلتر الصغرى-حقنه مزودة زجاج ميكروبيبيتي (مع تلميح يبلغ قطرها حوالي 10-20 ميكرومتر) (الشكل 1) واختباره مع البارافين السائل.
- تخدير الفئران مع 7% كلورال هيدرات (0.7 مل/100 g) بالحقن داخل.
- مجرد تأكيد التخدير العميق مع ذيل مدبب ودواسة منعكس سحب ويحلق الأعلى من رأسه الحيوان حلاقة الكهربائية وفرك موقع الجراحية 3 مرات مع اليود البوفيدون 10% تليها الإيثانول 70% على التوالي.
- وضع الفئران في الجهاز ستيريوتاكسيك بوضع أشرطة الإذن صراحة إلى الأذان ووضع القواطع العلوية للفئران إلى صاحب الفم (الشكل 1E)، ومن ثم تطبيق مرهم العيون في العيون.
- تنظيف جلد الرأس الموقع الجراحي مرة أخرى باستخدام الإيثانول 70%. استخدام القفازات الجراحية المعقمة والمناشف للحفاظ على عملية جراحية تحت ظروف معقمة.
- جعل شق السهمي في الجلد مع مشرط على طول خياطة السهمي (الشكل 1F).
- تتخلص من العضلات وسمحاق بعيداً عن الجمجمة باستخدام قضيب تطبيق عقيمة القطن ذات الرؤوس طوال عملية جراحية لمراقبة النزيف (الشكل 1F).
- استخدام الإحداثيات المحددة مسبقاً من أطلس (الشكل 2A)، تحديد الموقع (نقطة بريجما مم-3.30، 2.6 مم الحق في خط الوسط) اوديما (الشكل 1).
- أداء اوديما استخدام حفر لدغ مع قليلاً نصيحة الجولة (رقم 106) (الشكل 1 ح)، ومواصلة الحفر إلى حول عمق 1 ملم في غضون دقائق قليلة حتى وصلت إلى السحايا (1I الشكل).
- المكوس الأم الجافية باستخدام ميكروفورسيبس لفضح قشرة الدماغ عبر موقع الحقن (1I الشكل).
- تغيير البارافين السائل في الدقيقة-المحاقن مع 10% BDA (10,000 الجزيئي الوزن، في الماء المقطر) الحل (1J الشكل).
- جبل المحاقن في جهاز microinjection، والاتصال مع مضخة صغيرة (الشكل 1 K).
ملاحظة: حجم حقن فيعتمد على سرعة مايكرو-المضخة. هنا أنه عدل إلى 30 nL/دقيقة (الشكل 1 لتر). - تحت ستيريوميكروسكوبي، إدراج ميكروبيبيتي زجاج يدوياً مع جهاز microinjection VPM من خلال سطح القشرية في الدماغ في عمق 5.8 مم (الشكل 1 م).
- الضغط--حقن 100 nL 10% BDA إلى VPM على مدى فترة 3 دقيقة (35 nL/دقيقة) مع مضخة صغيرة (الشكل 1 L، M).
- بعد الحقن، الحفاظ الماصة في مكان مدة 5 دقائق إضافية، وثم سحب ببطء.
- خياطة الجرح بخيط معقم (1N الشكل). اتبع المبادئ التوجيهية اللجنة الرعاية الحيوانية المحلية الخاصة بك لتسكين ما قبل وبعد الجراحة.
- وضع الفئران في منطقة حارة انتعاش حتى يستعيد وعيه وهو شُفي تماما.
- العودة الفئران المستردة إلى قفصة.
2-بيرفوسيونس والمقاطع
- بعد فترة بقاء عادة 10 أيام، حقن الحيوان بجرعة زائدة من 10% يوريتان (2 مل/100 غرام) عن طريق الحقن داخل للحث على القتل الرحيم.
- نتخلل الفئران التجريبية في هود (1O الشكل).
- بمجرد توقف عن التنفس، استخدام المقص والملقط، فتح تجويف الصدر من الفئران للوصول إلى القلب. إدراج قسطرة الوريدية في البطين الأيسر إلى الشريان الاورطي، ثم ثم افتح صوان الصحيح.
- نتخلل أولاً مع 0.9% فوسفات مخزنة المالحة (PBS) في درجة حرارة الفسيولوجية (37 درجة مئوية) حوالي 1-2 دقيقة حتى أن الدم تخرج من القلب واضحة، وثم تابع مع 250-300 مل 4% بارافورمالدهيد في المخزن المؤقت للفوسفات 0.1 M (الجريدة الرسمية، درجة الحموضة 7.4).
- بعد نضح، جداً جلد الرأس وفتح الجمجمة، ومن ثم تشريح خارج الدماغ الفئران. بعد إصلاح تشريح الدماغ في بارافورمالدهيد 4% ح 2 في درجة حرارة الغرفة (26 درجة مئوية)، ثم كريوبروتيكت في السكروز 30% في م 0.1 برنامج تلفزيوني (درجة الحموضة 7.4) لمدة 3 أيام في 4 درجات مئوية حتى الدماغ هي مغمورة في الحل (الشكل 1 ف).
- مرة واحدة هي مغمورة في الدماغ في الحل، تقسيم الدماغ إلى ثلاث كتل في اتجاه الاكليلية في مصفوفات الدماغ (1Q الشكل). ويتضمن كتلة وسط VPM و S1.
- قص الكتلة المركزية للمخ في 40 ميكرومتر في مرحلة تجميد انزلاق نظام مبضع في اتجاه الاكليلية. جمع هذه المقاطع منظم في طبق 6-جيدا مع 0.1 M برنامج تلفزيوني (درجة الحموضة 7.4) (1R الأرقام، ق).
3-معيار أي بي سي تلطيخ
ملاحظة: استخدمت الأقسام العائمة مجاناً من كل قسم الاكليلية الثالث من الدماغ لتصور العلامات BDA مع إجراء أية بي سي القياسية10.
- شطف المقاطع في برنامج تلفزيوني 0.1 M لحوالي 1 دقيقة.
- احتضان المقاطع في حل أي بي سي 1% في الجريدة الرسمية م 0.1 (درجة الحموضة 7.4) يحتوي على 0.3% X-100 تريتون ح 1 في درجة حرارة الغرفة.
- أغسل المقاطع ثلاث مرات في 50 ملم تريس المخزن المؤقت (درجة الحموضة 7.4).
- وصمة عار المقاطع في محلول يحتوي على 0.02% 3، 3 '--ديامينوبينزيديني تيتراهيدروتشلوريدي (DAB) و 0.01 ٪ ح2س2 في 50 ملم تريس العازلة لحوالي 2-5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
- أغسل المقاطع ثلاث مرات في 50 ملم تريس المخزن المؤقت (درجة الحموضة 7.4).
- تحميل المقاطع على مجهر الشرائح باستخدام تقنيات histochemical القياسية (الرقم 1T؛ انظر التكميلي الثالث ملف الفيديو، نضح والأقسام).
- الجاف للمقاطع في الهواء بين عشية وضحاها في درجة حرارة الغرفة.
- يذوي المقاطع بإيجاز في سلسلة من الحلول الكحول (70%، 50%، 100%، 95%). غمر الشرائح في كل حل لحوالي 15 ثانية. لا تسمح للشرائح لتجف بين كل خطوة.
- امسح المقاطع في زيلين نفط ثلاث مرات، حوالي 20 دقيقة.
- وضع قطرات 2 أو 3 من بلسم على الشرائح، ثم ضع كوفيرسليبس على المقاطع.
4-ضعف تلطيخ الفلورسنت BDA والعناصر الأساسية العصبية في قشرة الدماغ
ملاحظة: على النقيض من ذلك، تلطيخ الفلورسنت مزدوجة وأجريت لرصد العلاقة بين العلامات BDA والعناصر العصبية الأساسية في الأقسام المجاورة لما ورد أعلاه المستخدمة مع ستريبتافيدين-AF594 وكونتيرستينيد بوصمة عار الفلورسنت نسل AF500/525.
- شطف المقاطع في برنامج تلفزيوني 0.1 M لحوالي 1 دقيقة.
- احتضان المقاطع في حل مختلطة من ستريبتافيدين-AF594 (1: 500) و AF500/525 أخضر نيون نسل وصمة (1:1، 000) في برنامج تلفزيوني م 0.1 (درجة الحموضة 7.4) يحتوي على 0.3% X-100 تريتون ح 2 في درجة حرارة الغرفة.
- تغسل الأجزاء ثلاث مرات في الجريدة الرسمية م 0.1 (درجة الحموضة 7.4).
- تحميل المقاطع على مجهر الشرائح باستخدام تقنيات histochemical القياسية. الجاف للمقاطع في الهواء لحوالي 1 ساعة.
- تطبيق كوفيرسليبس للمقاطع الفلورسنت مع الغليسرين 50% في الماء المقطر قبل الملاحظة.
5-مضاعفة تلطيخ الفلورسنت BDA وإينتيرنيورونس في قشرة الدماغ
ملاحظة: تلطيخ الفلورسنت مزدوجة أجريت لمراقبة الترابط وسم BDA وإينتيرنيورونس على مقاطع تمثيلية في الهدف القشرية مع ستريبتافيدين-AF594 والكهروضوئية-إيمونوتشيميستري.
- شطف المقاطع التمثيلية في م 0.1 برنامج تلفزيوني (درجة الحموضة 7.4) لحوالي 1 دقيقة.
- احتضان المقاطع في حل حظر المحتوية على مصل الماعز العادي 3% و 0.3% X-100 تريتون في برنامج تلفزيوني 0.1 م لمدة 30 دقيقة.
- تحويل الأقسام إلى إيجاد حل للماوس [مونوكلونل] مكافحة--PV مفتش (1:1، 000) في م 0.1 برنامج تلفزيوني (درجة الحموضة 7.4) تحتوي على الماعز العادي 1% مصل و 0.3% X-100 تريتون للمبيت في 4 درجات مئوية.
- اليوم التالي، يغسل المقاطع ثلاث مرات في م 0.1 برنامج تلفزيوني (درجة الحموضة 7.4).
- تعرض المقاطع إلى حل مختلطة من الماعز المضادة بعد AF488 موس جسم الثانوي (1: 500)، ستريبتافيدين-AF594 (1: 500)، و 4 ', 6-دياميدينو-2-فينيليندولي هيدروكلوريد (DAPI، 01:40، 000) في م 0.1 PBS (درجة الحموضة 7.4) تحتوي على 1% مصل الماعز العادي و 0.3% تريتون X-100 ح 1.
- كرر الخطوات من 4، 3 إلى 4.5.
6-المراقبة
- التقاط صور VPM ومحاور عصبية ثالاموكورتيكال، والخلايا العصبية كورتيكوثالاميك.
- مراقبة العينات الفلورسنت مع نظام تصوير [كنفوكل] مجهزة بعدسات الأهداف (4 x، نا: 0.13؛ 10 x، نا: x 0.40؛ و 40، نا: 0.95). استخدام أطوال موجية الإثارة والانبعاثات من 405 488 (الأزرق)، (الأخضر) وشمال البحر الأبيض المتوسط (أحمر) 559.
ملاحظة: هنا، الثقب [كنفوكل] هو 152 ميكرومتر (4 x, 10 x) و 105 ميكرون (40 x). القرار المكانية لالتقاط الصور هو 1024 × 1024 بكسل (4 x, 10 x) و 640 × 640 بيكسل (40 x). - التقاط صور العشرين في إطارات متتالية من 2 ميكرومتر من كل قسم في السمك 40 ميكرون (سلسلة Z).
- دمج الصور في صورة واحدة في التركيز مع الصورة [كنفوكل] تجهيز نظام البرمجيات لتحليل ثلاثي الأبعاد كما يلي: اختر تعيين بدء المستوى البؤري ← نهاية تعيين المستوى البؤري ← خطوة تعيين حجم ← عمق نمط ← صورة التقاط سلسلة ← Z.
- مراقبة العينات الفلورسنت مع نظام تصوير [كنفوكل] مجهزة بعدسات الأهداف (4 x، نا: 0.13؛ 10 x، نا: x 0.40؛ و 40، نا: 0.95). استخدام أطوال موجية الإثارة والانبعاثات من 405 488 (الأزرق)، (الأخضر) وشمال البحر الأبيض المتوسط (أحمر) 559.
- التقاط صور برايتفيلد مجهر خفيفة مجهزة بكاميرا رقمية (4 x، نا: 0.13؛ 10 x، نا: x 0.40؛ و 40، نا: العدسات 0.95). استخدام وقت تعرض للسيدة 500 استخدام برامج تحرير الصور لضبط السطوع والتباين من الصور وإضافة تسميات.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
وكان البقاء على قيد الحياة لمدة 10 أيام بعد ضخ BDA في VPM كافية لإنتاج المكثف العصبية وضع العلامات على المناطق القشرية المقابلة عن الجانب الحقن (الشكل 2). سي التقليدية وفلوري تلطيخ الإجراءات ل BDA كشفت عن نمط مماثل لوضع العلامات العصبية على S1، بما في ذلك أنتيروجراديلي المسمى ثالاموكورتيكال محاور عصبية والمسمى ريتروجراديلي كورتيكوثالاميك الخلايا العصبية (الشكل 2، د ).
أنتيروجراديلي المسمى محاور عصبية، أنها لوحظت من الطبقة الثانية إلى طبقة 6 مع كثافة أعلى على الطبقة 4، وقد لوحظ نوع نموذجي من محاور عصبية ثالاموكورتيكال في منطقة البرميل (الشكل 2، د). في طريقة عرض تكبير أعلى، وسم BDA تعرض بوضوح على الجذع محواري والفروع، والضمانات، وفاريكوسيتيس الصغيرة (الشكل 3A). تحت محاور ثالاموكورتيكال المسمى عصبية ليتم عرضها، تم عرض الخلايا العصبية الهرمية القشرية المسماة ريتروجراديلي، وأجسادهم خلية موزعة على الطبقات 5/6، ولكن ما dendrites قمي الموسعة للطبقة 2 (الشكل 2، د). العلامات BDA قدمت ليس فقط في هيئات الخلايا العصبية و dendrites، ولكن أيضا في العمود الفقري الجذعية، تظهر كالقرار مثل غولجي (الشكل 3B).
وباﻹضافة إلى ذلك، صبغة الفلورسنت مزدوجة قد أنجز أيضا لمراقبة الترابط وسم BDA وإينتيرنيورونس في الهدف القشرية مع ستريبتافيدين-AF594 وإيمونوتشيميستري الكهروضوئية. حول BDA وسم في الهدف القشرية، وزعت الكهروضوئية-إيجابية الخلايا العصبية من الطبقة الثانية على الطبقة 6 بتركيز عال في طبقة 4 (الشكل 4 أ). وكانت هناك لا الخلايا العصبية الكهروضوئية-إيجابية يكون المسمى مع BDA، ومع ذلك، تم العثور على محطات محواري المسمى BDA حول سطح الهيئات الخلايا الفلطائية الضوئية-إيجابية والمحطات الكهروضوئية-إيجابية محواري حول المسمى BDA القشرية الهرمية الخلايا العصبية (الشكل 4 باء، ج ).
الشكل 1. صور فوتوغرافية للخطوات الجراحية الرئيسية والأدوات الرئيسية التي ستستخدم في هذه التجربة.
A: الجهاز ستيريوتاكسيك. ب: حفر الأسنان. ج: الأدوات الجراحية (مشرط، ميكروفورسيبس، و ما إلى ذلك) د: الصغرى-المحاقن مجهزة زجاج ميكروبيبيتي. ﻫ: ضع رأس الجرذ إلى الجهاز ستيريوتاكسيك. واو: تنظيف موقع الجراحية. ز: تأكيد هذه النقطة بريجما. ح: حفر في الجمجمة. أنا: فضح قشرة الدماغ. ي: تحميل 10% BDA في الدقيقة-المحاقن. ك: جبل المحاقن في الجهاز لحقن الصغرى. L: ضبط سرعة مايكرو-المضخة. M: إدراج ميكروبيبيتي الزجاج VPM. N: خياطة الجرح بخيط معقم. س: نتخلل الفئران في غطاء محرك السيارة. P: تشريح خارج الدماغ. س: تقسيم الدماغ إلى ثلاث كتل مع المصفوفات الدماغ. R: قص الدماغ في مرحلة تجميد انزلاق النظام مبضع. S: جمع أقسام الدماغ المنظم في طبق 6-جيدا. T: تحميل المقاطع على شرائح المجهر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الرقم 2. موقع الحقن ووضع العلامات العصبية نموذجية مع ارتفاع الوزن الجزيئي BDA في قشرة سوماتوسينسوري.
أ: تم تحديد موقع الحقن في أطلس ستيريوتاكسيك. ب: الصورة المجهرية الممثل عرض موقع الحقن BDA (أحمر) في نواة المهاد (VPM) على خلفية خضراء تلطيخ نسل بوستيروميديال البطني. ج: الصورة المجهرية لوسم BDA الفلورسنت، بما في ذلك محاور عصبية ثالاموكورتيكال في طبقة 4 والخلايا العصبية كورتيكوثالاميك في الطبقات 5/6. د: الصورة المجهرية لوسم BDA التقليدية مع إجراء عبدين-البيوتين-البيروكسيديز قياسية يظهر نمط مماثل لوضع العلامات العصبية لوسم BDA الفلورسنت. VPL، نواة posterolateral البطني المهاد. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3. جودة عالية من العلامات العصبية مع ارتفاع الوزن الجزيئي BDA على خلفية خضراء نسل تلطيخ.
أ: عرض التكبير أعلى من أنتيروجراديلي المسمى محواري العرش (أحمر) بالتفصيل. ب: الصور عالية الدقة تظهر الجسم الخلايا العصبية المسماة ريتروجراديلي و dendrites، والعمود الفقري الجذعية (أحمر) بالتفصيل. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 4. الترابط بين وسم BDA وإينتيرنيورونس البروتين الكالسيوم الملزمة الكهروضوئية-الإيجابية في الهدف القشرية.
أ: توزيع BDA وسم (أحمر) وإيجابية PV إينتيرنيورونس (الأخضر) في قشرة سوماتوسينسوري. ب: عرض التكبير أعلى من توزيع محاور عصبية المسمى BDA وإينتيرنيورونس الكهروضوئية-الإيجابية في طبقة 4. ج: صورة عالية الدقة المسمى BDA القشرية الهرمية الخلية (أحمر) وإيجابية PV إينتيرنيورونس (الأخضر) في الطبقات 5/6. وقد كونتيرستينيد جميع العينات مع DAPI (أزرق). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
ملفات الفيديو التكميلي: وتظهر أشرطة الفيديو تكميلية بإيجاز العملية الجراحية، ضخ BDA في VPM ونضح وتمزيقها، والنتائج. في ملف الفيديو اسمه "الرابع. الممثل نتيجة "، تظهر نتائج نظام ليزر ثلاثية الأبعاد [كنفوكل] مجهرية وتحليل المسح الضوئي. ويبين الرسوم المتحركة عالية الدقة الهيئة الخلايا العصبية المسماة ريتروجراديلي، dendrites، والعمود الفقري الجذعية (أحمر) بالتفصيل. اضغط هنا لتحميل هذا الملف.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
تحديد تتبع الصحيح خطوة حاسمة لتجربة ناجحة من اقتفاء أثر العصبية. في عائلة BDA، عالية الوزن الجزيئي BDA (الوزن الجزيئي 10,000) وأوصى بشكل تفضيلي نقلها عن طريق المسار العصبية anterograde على النقيض من الوزن الجزيئي المنخفض BDA (الوزن الجزيئي 3,000)2،3 , 11 , 12 , 13-ومع ذلك، اقترح العديد من الدراسات أيضا أن الوزن الجزيئي عالية BDA يمكن استخدامها المحتمل أيضا لتتبع مسار إلى الوراء بالتوازي مع anterograde تتبع1،،من23. من خلال المسارات العصبية متبادلة بين VPM و S1، قدمنا المزيد من الأدلة لدعم فكرة أن ارتفاع الوزن الجزيئي BDA مناسبة ل تتبع المسالك ثنائية الاتجاه4. بطريقة مماثلة في هذا المجال، ارتفاع الوزن الجزيئي BDA استخدمت أيضا في المنظومة البصرية والسمعية لدراسة الصلات المتبادلة بين الجسم يتناول الظهرية الجانبية والقشرة البصرية، فضلا عن هيئة يتناول الآنسي واللحاء السمعي 3 , 14.
في هذه التجربة تتبع العصبية، هو النظر الهامة الأخرى في اختيار تلطيخ الأسلوب للعلامات العصبية. في معظم الدراسات السابقة، سواء كانت التقليدية ABC البروتوكول ونيون streptavidin تلطيخ الأسلوب المستخدمة لفحص العلامات BDA وكشف مماثلة في نمط المورفولوجية1،،من23 , 4 , 5-هنا، وجدنا أن ستريبتافيدين-AF594 لم يكن سوى خيار مناسب لوسم BDA، لكن أيضا مناسبة للجمع بين علامة العصبية الأخرى، مثل الفلورسنت نسل والكهروضوئية-مستضد، توفير فرصة جديدة لمراقبة الترابط بين BDA وضع العلامات وغيرها من العناصر العصبية. على الرغم من أن أسلوب تلطيخ مزدوجة التقليدية الأخرى علامات العصبية و BDA أجريت أيضا في كثير من الأحيان مع اللونين الدأب الإجراء14،15، أنها ليست مناسبة لاستخدام نظام تحليل ثلاثي الأبعاد تحت ليزر [كنفوكل] الفحص المجهري. من وجهة النظر تقنية، يوفر لنا هذه الدراسة مرجعاً قيماً لمقارنة اختلافاً واضحا بين وسم BDA والعلامات الأخرى.
كان يستخدم تقنية تتبع المسالك العصبية في البداية للكشف عن الاتصالات العصبية بين الحقن وهدفه في الجهاز العصبي؛ بيد أن الباحثين كانت لا تزال سعيا لتحقيق هيكل مثالي العلامات العصبية مع16،تتبع مناسب17. وعلى النقيض من تتبع الأخرى، مثل الفجل البيروكسيديز، ووحدة فرعية ب السم الكوليرا، تنتج عالية الوزن الجزيئي BDA نوعية أعلى العلامات العصبية للتحديد الكمي لعدد محواري العرش والعصبية dendrites16،17 . على الرغم من أن التحليل الكمي لوسم BDA لم ينفذ في هذه الدراسة، جودة أعلى العلامات العصبية مع BDA يوفر المزيد من الفرص لفهم الخصائص المورفولوجية على العرش محواري المسمى والعصبية عن كثب dendrites.
مماثلة لتطبيق العديد من تتبع الأخرى، ينبغي النظر سلسلة من القضايا الهامة لهذا الإجراء التجريبي، بما في ذلك: التركيز وحجم BDA المستخدمة للحقن، والموقع الصحيح للحقن، قطر تلميح ماصة زجاجية، العملية الجراحية ووقت بقاء الأمثل والتروية، والقسم والمراقبة تحت مجهر. أنها مباشرة المرتبطة بنوعية BDA وسم ما كنا نتوقعه. بالإضافة إلى الخطوات الأساسية المذكورة أعلاه، هناك القيود التقنية التي تتطلب اهتماما، مثل المسافة من موقع الحقن إلى الهدف المسمى، الذي يعتمد على الأنواع الحيوانية النموذجية المستخدمة في التجربة3، 5 , 18-في كلمة واحدة، دراسة تتبع ناجح يعتمد على كل خطوة في الإجراء التجريبي بأكمله.
في هذه الدراسة، وقد قدمنا بروتوكول المكرر لإثبات أن BDA الفلورسنت تلطيخ الأسلوب وسيلة فعالة للحصول على الجودة العالية لوضع العلامات العصبية، التي يمكن أن تكون في نفس الوقت جنبا إلى جنب مع سائر علامات العصبية باستخدام نيون هيستوتشيميستري أو إيمونوتشيميستري. مقارنة تلطيخ BDA التقليدية مع الإجراء الدأب، يمكننا بسهولة أكبر تحليل هيكل غرامة وسم BDA وتمييزها عن العناصر الأخرى العصبية في اقتفاء أثر الهدف تحت [كنفوكل] ليزر المسح المجهري الفلورسنت الحالية النهج.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
Acknowledgments
تم تمويل هذه الدراسة الوطنية العلوم الطبيعية مؤسسة من الصين (مشروع القانون رقم 81373557؛ 81403327 رقم).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Biotinylated dextran amine (BDA) | Molecular Probes | D1956 | 10,000 molecular weight |
| Streptavidin-Alexa Fluor 594 | Molecular Probes | S32356 | Protect from light |
| 500/525 green fluorescent Nissl stain | Molecular Probes | N21480 | Protect from light |
| Brain stereotaxis instrument | Narishige | SR-50 | |
| Freezing microtome | Thermo | Microm International GmbH | |
| Confocal imaging | Olympus | FV1200 | |
| system | |||
| Micro Drill | Saeyang Microtech | Marathon-N7 | |
| Sprague Dawley | Institute of Laboratory Animal Sciences, Chinese Academy of Medical Sciences | SCKX (JUN) 2012-004 | |
| Vectastain ABC Kit | Vector Laboratories | PK-4000 | |
| superfrost plus microscope slides | Thermo | #4951PLUS-001 | 25x75x1mm |
| Photoshop and Illustration | Adobe | CS5 |
References
- Veenman, C. L., Reiner, A., Honig, M. G. Biotinylated dextran amine as an anterograde tracer for single- and double-labeling studies. J Neurosci Methods. 41, 239-254 (1992).
- Reiner, A., Veenman, C. L., Medina, L., Jiao, Y., Del Mar, N., Honig, M. G. Pathway tracing using biotinylated dextran amines. J Neurosci Methods. 103, 23-37 (2000).
- Ling, C., Hendrickson, M. L., Kalil, R. E. Resolving the detailed structure of cortical and thalamic neurons in the adult rat brain with refined biotinylated dextran amine labeling. PLoS One. 7, e45886 (2012).
- Zhang, W. J., et al. Anterograde and retrograde tracing with high molecular weight biotinylated dextran amine through thalamocortical and corticothalamic pathways. Microsc Res Tech. 80, 260-266 (2017).
- Han, X., et al. Biotinylated dextran amine anterograde tracing of the canine corticospinal tract. Neural Regen Res. 7, 805-809 (2012).
- Armstrong-James, M., Callahan, C. A. Thalamo-cortical processing of vibrissal information in the rat. II. spatiotemporal convergence in the thalamic ventroposterior medial nucleus (VPm) and its relevance to generation of receptive fields of S1 cortical "barrel" neurones. J Comp Neurol. 303, 211-224 (1991).
- Armstrong-James, M., Callahan, C. A., Friedman, M. A. Thalamo-cortical processing of vibrissal information in the rat. I. Intracortical origins of surround but not centre-receptive fields of layer IV neurones in the rat S1 barrel field cortex. J Comp Neurol. 303, 193-210 (1991).
- Agmon, A., Yang, L. T., Jones, E. G., O'Dowd, D. K. Topological precision in the thalamic projection to neonatal mouse barrel cortex. J Neurosci. 15, 549-561 (1995).
- Paxinos, G., Watson, C. The rat brain in stereotaxic coordinates. , Academic Press. San Diego. (1998).
- Davidoff, M., Schulze, W. Standard avidin-biotin-peroxidase complex (ABC) staining combination of the peroxidase anti-peroxidase (PAP)-and avidin-biotin-peroxidase complex (ABC)-techniques: an amplification alternative in immunocytochemical staining. Histochemistry. 93, 531-536 (1990).
- Fritzsch, B. Fast axonal diffusion of 3000 molecular weight dextran amines. J Neurosci Methods. 50, 95-103 (1993).
- Kaneko, T., Saeki, K., Lee, T., Mizuno, N. Improved retrograde axonal transport and subsequent visualization of tetramethylrhodamine (TMR) -dextran amine by means of an acidic injection vehicle and antibodies against TMR. J Neurosci Methods. 65, 157-165 (1996).
- Medina, L., Reiner, A. The efferent projections of the dorsal and ventral pallidal parts of the pigeon basal ganglia, studied with biotinylated dextran amine. Neuroscience. 81, 773-802 (1997).
- DE Venecia, R. K., Smelser, C. B., McMullen, N. T. Parvalbumin is expressed in a reciprocal circuit linking the medial geniculate body and auditory neocortex in the rabbit. J Comp Neurol. 400, 349-362 (1998).
- Ojima, H., Takayanagi, M. Use of two anterograde axon tracers to label distinct cortical neuronal populations located in close proximity. J Neurosci Methods. 104, 177-182 (2001).
- Kobbert, C., Apps, R., Bechmann, I., Lanciego, J. L., Mey, J., Thanos, S.
- Vercelli, A., Repici, M., Garbossa, D., Grimaldi, A. Recent techniques for tracing pathways in the central nervous system of developing and adult mammals. Brain Res Bull. 51, 11-28 (2000).
- Liao, C. C., Reed, J. L., Kaas, J. H., Qi, H. X. Intracortical connections are altered after long-standing deprivation of dorsal column inputs in the hand region of area 3b in squirrel monkeys. J Comp Neurol. 524, 1494-1526 (2016).
