Summary
Burada, etkili bir floresan yöntemi aracılığıyla karşılıklı bir sinirsel yol boyama ile etiketleme biotinylated dextran Amin (BDA) ortaya çıkarmak için rafine bir iletişim kuralı mevcut. Bu güzel yapı çözümleniyor için uygundur, etiketleme ve confocal bir lazer tarama mikroskop altında sinirsel diğer öğelerinden ayırt BDA.
Abstract
Yüksek molekül ağırlıklı biotinylated dextran Amin (BDA) son derece hassas bir nöroanatomik izleyici onlarca yıl için kullanılmıştır. Onun etiketleme kalitesini çeşitli etkenlere göre burada, etkilendi biz rafine bir protokol yüksek molekül ağırlıklı BDA uygulama için en uygun sinir merkezi sinir sistemi etiketleme çalışmak için sağlar. BDA farenin hassas cam pipet ile talamus ventral posteromedial çekirdeği (VPM) içine stereotaksik enjeksiyon sonra BDA floresan streptavidin ile-Alexa (AF) 594 lekeli ve floresan Nisl leke AF500/525 ile counterstained. Yeşil Nisl boyama arka plan üzerinde kırmızı BDA, nöronal hücre gövdeleri ve aksonal terminaller gibi etiketleme daha belirgin korteks somatosensor gösterilmiştir. Ayrıca, floresan BDA için boyama çift ve kalsiyum bağlayıcı protein parvalbumin (PV) korelasyon BDA etiketleme ve PV-pozitif interneurons sinirsel yerel çalışma fırsatı sağlayan kortikal hedefteki gözlemlemek için yapılmıştır Devreler ve kimyasal özellikleri. Böylece, rafine bu yöntem sadece yüksek kaliteli talamus ve serebral korteks arasında karşılıklı Sinirsel yollar aracılığıyla yüksek molekül ağırlıklı BDA ile etiketleme sinirsel görüntülenmesi için uygun değildir, ancak aynı zamanda eşzamanlı gösteri verecektir Floresan histochemistry veya İmmünokimya diğer sinir işaretleyicilerle.
Introduction
Yüksek molekül ağırlıklı BDA (10.000 moleküler ağırlık), son derece hassas bir izleyici, merkezi sinir sistemi üzerinde 20 yıl1için Sinirsel yollar izleme için kullanılmıştır. BDA kullanımı teknik izleme ortak bir sinir yolu olsa da, BDA etiketleme kalitesini hayvanlarda çeşitli faktörler1,2,3tarafından etkilenebilir. Bizim son çalışma BDA etiketleme en uygun yapısı sadece uygun sonrası enjeksiyon yaşam süresi ile ilgili ama aynı zamanda boyama yöntemi4ile korelasyon göstermiştir. Şimdi, geleneksel avidin-biotin-peroksidaz kompleksi (ABC), streptavidin floresein isothiocyanate ve streptavidin-AF594 kadar boyama yöntemleri BDA önceki çalışmalar2,3' teetiketleme ifşa için kullanılması, 4,5. Buna karşılık, floresan BDA için boyama kolayca gerçekleştirilebilir.
Yüksek molekül ağırlıklı BDA uygulanması genişletmek için rafine bir iletişim kuralı da çalışmanın kullanılmaya başlandı. Talamus sıçan beyin VPM içine BDA enjeksiyonu, BDA etiketleme ortaya standart ABC boyama düzenli yöntemi yanı sıra çift Floresan, hangi BDA etiketleme korelasyon gözlemleyerek için gerçekleştirildiği boyama ve temel Sinirsel öğeleri veya interneurons kortikal hedef streptavidin-AF594 ve floresan Nisl histochemistry veya PV-İmmünokimya, anılan sıraya göre. VPM ve Primer somatosensor korteks (S1)6,7,8arasında karşılıklı Sinirsel yollar, biz bizim gözlem BDA etiketleme öngörülen thalamocortical akson ve corticothalamic üzerinde duruldu S1 içinde öngörülen hücre somas. Bu işlem tarafından sadece sinirsel yüksek molekül ağırlıklı BDA ile etiketleme yüksek kalitesini elde etmek için ayrıntılı bir iletişim kuralı, aynı zamanda rafine bir protokol floresan BDA etiketleme ile birlikte ve diğer floresan sinirsel belirteçleri ile sağlamak bekleniyor histochemistry veya İmmünokimya. Bu yaklaşım yerel sinir devreleri ve confocal bir lazer mikroskobu tarama altında kimyasal özellikleri çalışma için tercih edilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Bu çalışmada, Çin Çince tıbbi Bilimler Akademisi (referans numarası 20160014) Etik Komitesi tarafından kabul edildi. Tüm yordamları bakım ve laboratuvar hayvanlarının kullanımı (Ulusal Akademisi basın, Washington, DC, 1996) için Ulusal Sağlık Rehberi Enstitüleri uygun olarak gerçekleştirilmiştir. Dört yetişkin erkek rats (ağırlığı 250-280 g) Bu çalışmada kullanılmıştır. Bütün hayvanlar kontrollü sıcaklık ve nem ile 12 h açık/koyu döngüsünde yer alan ve gıda ve su ücretsiz erişim izni. Aletleri ve malzemeler mevcut çalışmada kullanılan şekil 1' de gösterdi. Ameliyattan önce stereotaksik çerçeve ve cam pipet, gibi tüm araçları % 70 etanol kullanarak temizlenmiştir.
1. cerrahi işlemler
- Stereotaksik atlas9 (şekil 2A) kullanarak VPM ilgi koordinat alanı belirleyin.
- 1 µL mikro-cam micropipette (yaklaşık 10-20 µm ipucu çaplı) ile donatılmış şırınga hazırlamak (şekil 1 d) ve Sıvı parafin ile test edin.
- % 7 kloral hidrat (0.7 mL/100 g) farelerle mayi enjeksiyonu ile anestezi.
- Derin anestezi onaylandıktan sonra kuyruk ile pinch ve para çekme refleks pedal, hayvanın başının ile tıraş Tıraş ve cerrahi sitesi 3 kez sırasıyla % 70 etanol tarafından takip % 10 povidone iyot ile fırçalayın.
- Fareyi kulaklarına künt kulak çubuklarını yerleştirerek stereotaksik cihazın içine yerleştirin ve sıçan üst kesici dişler (şekil 1E) ağız yuvasına yerleştirin ve oftalmik merhem gözünü uygulayın.
- Tekrar % 70 etanol kullanarak cerrahi sitesinin baş cilt temizlemek. Havlu ve steril cerrahi eldiven steril koşullarda ameliyat korumak için kullanın.
- Cilt sagittal dikiş (şekil 1F) boyunca bir neşter ile sagittal bir kesi yapmak.
- Kas ve steril pamuklu uçlu uygulayıcıları (şekil 1F) kanama kontrol cerrahiye boyunca kullanarak kafatası uzak kapaklarini kazı.
- Bir Atlas (şekil 2A) önceden tanımlanmış koordinatları kullanarak, kranyotomi (şekil 1G) konumunu (-3.3 mm Bregma noktası, orta hat sağa 2.6 mm) belirleyin.
- Burr matkap ile yuvarlak uçlu biraz (#106) (Resim 1 H) kullanarak bir kranyotomi gerçekleştirmek ve meninkslerde (şekil 1I) ulaşan kadar bir kaç dakika içinde Delme hakkında 1 mm derinliği için devam edin.
- Serebral korteks enjeksiyon sitesi (şekil 1I) üzerinden ortaya çıkarmak için microforceps kullanarak dura mater tüketim.
- Sıvı parafin % 10 BDA (10.000 molekül ağırlığı, distile su içinde) çözüm (şekil 1J) mikro şırınga değiştirin.
- Şırınga mikroenjeksiyon aparatı monte ve bir mikro-pompa ile (şekil 1 K) bağlanın.
Not: enjekte birimi mikro-pompa hızına bağlıdır. Burada 30 nL/dk (şekil 1 L) ayarlandı. - Bir stereomicroscope altında VPM 5.8 mm (şekil 1 M) derinlikte beynin kortikal yüzeyi üzerinden el ile mikroenjeksiyon aparatı ile cam micropipette takın.
- Basınç enjekte-bir %100 10 nL BDA VPM 3 dk (35 nL/dk) bir mikro-pompa (şekil 1 L, M) ile bir süre içine.
- Sonra enjeksiyon, pipet, yerde bir ek 5 min için tutun ve sonra yavaş yavaş geri.
- Yara steril vida (şekil 1N) dikiş. Öncesi ve ameliyat sonrası analjezi için senin yerel hayvan bakımı Komitesi yönergeleri izleyin.
- Bilincinin tekrar yerine geleceğinden ve tamamen iyileşti kadar fareyi bir sıcak kurtarma alanında koyun.
- Kurtarılan fareyi onun kafes için geri dönün.
2. perfusions ve bölümler
- Sonra bir yaşam süresi genellikle 10 günlük hayvan mayi enjeksiyonu ile ötenazi ikna etmek için % 10 üretan (2 mL/100 g) aşırı dozda enjekte et.
- Hood (şekil 1O) deneysel fareler sıvı.
- Bir kez nefes durur, makas ve forseps, kullanarak kalp erişmek için fareyi göğüs boşluğuna açın. Sol ventrikül aort doğru bir damar içi kateter takın ve doğru auricle açın.
- İlk % 0,9 fosfat tamponlu tuz (PBS), fizyolojik sıcaklığında (37 ° C) ile sıvı kadar kan kalpten çıktıktan 1-2 dk temizleyin ve 250-300 mL % 4 paraformaldehyde 0.1 M fosfat tampon (PB, pH 7,4) ile devam edin.
- Perfüzyon sonra baş cilt deşmek ve kafatasını açıp sıçan beyin incelemek. Oda sıcaklığında (26 ° C), o zaman cryoprotect içinde % 30 Sükroz 0.1 M PBS (pH 7,4) beyin çözüm (şekil 1 P) batırılır kadar 4 ° C'de 3 gün içinde 2 h için %4 paraformaldehyde disseke beyinde sonrası tamir et.
- Bir kez beyin çözümde batırılır, beyin üzerinde beyin matrisler (şekil 1Ç) Koronal yönde üç sokak bölün. Merkezi bloğu VPM ve S1 içerir.
- Koronal microtome sistemini sürgülü bir dondurucu sahnede merkezi bloğu 40 µm, beynin kesti. Bu bölümlerde düzenli bir 6-iyi yemek (rakamlar 1R, S) 0.1 M PBS (pH 7,4) ile toplamak.
3. standart ABC boyama
Not: Beynin her üçüncü koronal bölümünden ücretsiz kayan bölümler BDA standart ABC yordamı10ile etiketleme görüntülenmesi için kullanılmıştır.
- 0.1 M PBS için yaklaşık 1 dakika bölümlerde durulayın.
- (PH 7,4) içeren %0,3 %1 0.1 M PB ABC çözümde bölümlerde kuluçkaya Triton X-100 oda sıcaklığında 1 h için.
- Sonraki bölümlerde 50 mM Tris arabellek (pH 7,4) üç kere yıkayın.
- %0,02 3, 3'-diaminobenzidine tetrahydrochloride (DAB) ve %0.01 H2O2 oda sıcaklığında yaklaşık 2-5 dakika için 50 mM Tris arabellek içeren bir çözüm bölümlerde leke.
- Sonraki bölümlerde 50 mM Tris arabellek (pH 7,4) üç kere yıkayın.
- Bölümler standart histochemical teknikleri (1T rakam; bkz: Ek Video dosyası III, perfüzyon ve bölümler) kullanarak mikroskop slaytlarda bağlayın.
- Gecede, oda sıcaklığında hava bölümlerde kuru.
- Alkol (% 50, % 70, % 95, % 100) çözümleri kısa bir süre içinde bir dizi bölümlerini kurutmak. Her çözüm için yaklaşık 15 slaytları daldırın s. Slaytlar arasında her adım kurumasına izin vermez.
- Ksilen bölümlerde üç kez, yaklaşık 20 dk temizleyin.
- 2-3 damla balsam dilimleri koyun sonra coverslips bölümleri yerleştirin.
4. çift floresan BDA ve serebral korteks nöral temel öğeleri için boyama
Not: Buna ek olarak, çift floresan boyama BDA etiketleme korelasyon gözlemleyerek için yapılmıştır ve yukarıdaki bitişik bölümleri üzerinde temel sinir öğelerini streptavidin-AF594 ile kullanılan ve floresan Nisl leke AF500/525 ile counterstained.
- 0.1 M PBS için yaklaşık 1 dakika bölümlerde durulayın.
- Streptavidin-AF594 (1:500) ve AF500/525 yeşil flüoresan Nisl leke (1:1, 000) 0.1 M PBS karışık bir çözümde bölümlerini (pH 7,4) içeren %0,3 kuluçkaya Triton X-100 oda sıcaklığında 2 h için.
- Sonraki bölümlerde 0.1 M PB (pH 7,4) üç kere yıkayın.
- Bölümler standart histochemical teknikleri kullanarak mikroskop slaytlarda bağlayın. Kuru havada yaklaşık 1 h için bölümler.
- Coverslips % 50 gliserin gözlem önce distile su ile floresan bölümlerine uygulanır.
5. çift floresan BDA ve Interneurons serebral korteks için boyama
Not: Çift floresan boyama BDA etiketleme ve interneurons streptavidin-AF594 ve PV-İmmünokimya kortikal hedefle temsilcisi bölümlerde Tarih korelasyon gözlemleyerek için gerçekleştirilmiştir.
- 0.1 M PBS (pH 7,4) yaklaşık 1 dakika için temsilcisi bölümlerde durulayın.
- % 3 normal keçi serum ve %0,3 içeren bir engelleme çözüm bölümlerde kuluçkaya Triton X-100 0.1 M PBS için 30 dk içinde.
- Fare monoklonal anti-PV IgG (1:1, 000) 0.1 M PBS (pH 7,4) içeren % 1 normal keçi serum ve %0,3 bir çözüm içine bölümleri transfer Triton X-100 gecede 4 ° C'de için
- Ertesi gün, sonraki bölümlerde 0.1 M PBS (pH 7,4) üç kere yıkayın.
- Karışık bir çözüm bölümlerine keçi mouse-AF488 ikincil antikor (1:500), Serumda 0.1 M PBS (pH 7,4) içeren % 1 normal keçi streptavidin-AF594 (1:500) ve 4', 6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI, 1:40, 000) ve 0,3 açığa % Triton 1 h için X-100.
- 4.3-4.5 adımları yineleyin.
6. gözlem
- VPM, thalamocortical akson ve corticothalamic nöronlar görüntülerini almak.
- Hedefleri lensler ile donatılmış bir confocal görüntüleme sistemi ile floresan örnekleri gözlemlemek (4 x, NA: 0,13; 10 x, NA: 0.40; ve 40 x, NA: 0.95). 405 (mavi), 488 (yeşil), uyarma ve emisyon dalga boylarında ve 559 (kırmızı) nm kullanın.
Not: Burada, confocal iğne deliği 152 µm (4 x, 10 x) ve 105 µm (40 x). Görüntü yakalama Uzaysal çözünürlük 1024 × 1024 piksel (4 x, 10 x) ve 640 × 640 piksel (40 x) olduğunu. - Yirmi görüntüler 40 µm (Z serisi) kalınlığı, her bölüm 2 µm ardışık çerçeveler içinde tutar.
- Görüntüleri tek bir odakta görüntü confocal görüntü işleme için aşağıdaki gibi üç boyutlu analiz yazılım sistemi ile entegre: ayarla başlat odak düzlemi → set sonunda odak düzlemi → set adım boyutu → derinlik desen → görüntü yakalama → Z serisi seçin.
- Hedefleri lensler ile donatılmış bir confocal görüntüleme sistemi ile floresan örnekleri gözlemlemek (4 x, NA: 0,13; 10 x, NA: 0.40; ve 40 x, NA: 0.95). 405 (mavi), 488 (yeşil), uyarma ve emisyon dalga boylarında ve 559 (kırmızı) nm kullanın.
- Bir dijital fotoğraf makinesi ile donatılmış bir ışık mikroskobu tarafından aydınlık alan görüntü alabilir (4 x, NA: 0,13; 10 x, NA: 0.40; ve 40 x, NA: 0.95 lensler). Bir çekim hızı 500 Bayan kullanım fotoğraf düzenleme yazılımı, parlaklık ve kontrast görüntülerin ve etiket eklemek için kullanın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
BDA 10 gün sonrası enjeksiyon VPM içine yaşama yoğun nöral karşılık gelen kortikal alanlarda enjeksiyon yüz (Şekil 2) Ipsilateral etiketleme üretmek için yeterli idi. Hem geleneksel ABC ve yordamlar için BDA boyama floresan sinir anterogradely de dahil olmak üzere S1 üzerinde etiketleme benzer desen thalamocortical akson etiketli ve retrogradely (şekil 2C, D corticothalamic nöronlar etiketli ortaya ).
Akson etiketli anterogradely için onlar ile 4 katmandaki yüksek yoğunluk 6 Katman Katman 2 gözlendi ve thalamocortical akson tipik türü varil alanında (şekil 2C, D) gözlenmiştir. Yüksek büyütme görünümünde BDA etiketleme açıkça aksonal gövde, dal, teminat ve küçük varicosities (şekil 3A) üzerinde sundu. Görüntülenecek etiketli thalamocortical akson altında retrogradely etiketli kortikal piramidal nöronların sergilendi ve onların hücre bütün katmanlarda 5/6 dağıtılmış, ama onların apikal dendrites Katman 2 (şekil 2C, D) genişletilmiş. BDA etiketleme sadece nöronal hücre organları ve dendrites aynı zamanda dendritik omurgalar, Golgi gibi çözünürlük (3B rakam) görünen sundu.
Ayrıca, çift floresan boyama da BDA etiketleme ve interneurons kortikal hedef streptavidin-AF594 ve PV-İmmünokimya ile korelasyon gözlemleyerek için gerçekleştirildi. Kortikal hedef etiketleme BDA, PV-pozitif nöronlar katman 4 (şekil 4A) yüksek konsantrasyon ile katmana 6 Katman 2 dağıtıldı. BDA ile etiketlenir yok PV-pozitif nöronlar vardı, ancak, aksonlar terminalleri BDA etiketli PV-pozitif hücre gövdeleri ve PV-pozitif aksonal terminalleri BDA etiketli kortikal piramidal nöronların (şekil 4B, C etrafında yüzeyinin çevresinde bulundu ).
Şekil 1. Anahtar cerrahi adımlar ve bu deneyde kullanılacak ana aletleri fotoğrafları.
A: stereotaksik aygıt. B: diş matkap. C: cerrahi araçlar (neşter, microforceps ve benzeri) D: mikro-şırınga cam micropipette ile donatılmıştır. E: fare kafa stereotaksik cihazın içine yerleştirin. F: cerrahi sitesi temiz. G: Bregma noktası onaylayın. H: kafatası matkap. Ben: serebral korteks ortaya çıkarmak. J: yük % 10 BDA mikro şırınga içine. K: mikro-enjeksiyon için aleti içine şırınga Mount. L: mikro-pompa hızını ayarlayın. M: cam micropipette VPM yerleştirin. N: yara steril iplik ile dikiş. O: başlık içinde sıçan sıvı. P: beynini incelememize. Q: beyin beyin matrisler ile üç sokak bölün. R: beyin microtome sistem sürgülü dondurucu bir sahnede kesti. S: toplamak beyin bölümlerde düzenli bir 6-iyi yemek. T: mikroskop slaytlarda bölümleri Mount. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 2. Enjeksiyon yeri ve tipik sinirsel yüksek molekül ağırlıklı BDA somatosensor korteks ile etiketleme.
A: enjeksiyon izi stereotaksik bir atlas kararlıydım. B: BDA enjeksiyon yeri (kırmızı) ventral posteromedial çekirdeği çevreleyen talamus (VPM) yeşil Nisl boyama ve arka plan üzerinde gösterilen temsilcisi photomicrograph. C: floresan BDA, katman 4 thalamocortical akson ve Katmanlar 5/6 corticothalamic nöronlarda dahil olmak üzere etiketleme Photomicrograph. D: geleneksel BDA sinirsel floresan BDA etiketleme için etiketleme benzer yol gösteren bir prosedür avidin-biotin-peroksidaz ile etiketleme Photomicrograph. VPL, ventral posterolateral talamus çekirdeği. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3. Yüksek molekül ağırlıklı BDA yeşil Nisl boyama arka planda ile sinirsel etiketleme yüksek kalite.
A: anterogradely daha yüksek büyütme görünümünü aksonal arbors (kırmızı) ayrıntılı olarak etiketlenmiş. B: retrogradely etiketli nöronal hücre beden, dendrites ve dendritik spines (ayrıntılı olarak kırmızı) gösterilen yüksek çözünürlüklü fotoğrafları. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 4. BDA etiketleme ve kalsiyum bağlayıcı protein PV-pozitif interneurons kortikal hedefindeki korelasyon.
A: BDA (kırmızı) etiketleme dağıtılması ve PV-pozitif interneurons (yeşil) somatosensor korteks. B: BDA etiketli akson ve PV-pozitif interneurons katman 4 içinde dağıtımını daha yüksek büyütme görünümünü. C: yüksek çözünürlüklü fotoğraf kortikal piramit hücre (kırmızı) BDA etiketli ve PV-pozitif interneurons (yeşil), 5/6 katmanlı. Tüm örneklerini DAPI (mavi) ile counterstained. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Ek Video dosyaları: Tamamlayıcı video kısa bir süre cerrahi işlem, BDA enjeksiyon VPM, perfüzyon ve kesit ve sonuçları gösterir. "IV. adlı video dosyasında Temsilcisi sonucu", üç boyutlu confocal lazer tarama mikroskobu ve analiz sistemi sonuçları gösterilir. Yüksek çözünürlüklü animasyon retrogradely etiketli nöronal hücre beden, dendrites ve dendritik spines (ayrıntılı olarak kırmızı) gösterir. Bu dosyayı indirmek için buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Uygun izleme aygıtı seçme başarılı sinirsel izleme deneme için kritik bir adımdır. BDA, yüksek molekül ağırlıklı BDA ailesi (10.000 moleküler ağırlık) düşük moleküler ağırlıklı BDA (3.000 moleküler ağırlık)2,3 aksine anterograd sinir yolu ile tercihen taşınması için tavsiye edilir , 11 , 12 , 13. ancak, birçok çalışma Ayrıca BDA da potansiyel olarak kullanılabilir retrograd pathway izleme anterograd1,2,3izleme ile paralel olarak bu yüksek molekül ağırlıklı önerdi. VPM ve S1 arasında karşılıklı Sinirsel yollar, biz yüksek moleküler ağırlıklı BDA çift yönlü yolu izleme4için uygun olduğu fikrini desteklemek için daha fazla kanıt sağladı. Bu etki alanındaki benzer bir şekilde, yüksek molekül ağırlıklı BDA Ayrıca görsel ve işitsel sistem dorsal yanal geniculate vücut ve görsel korteksin yanı sıra medial geniculate vücut ve işitsel korteks arasındaki karşılıklı bağlantıları incelenmesi için kullanıldı 3 , 14.
Sinirsel izleme deneyde, diğer önemli bir göz boyama yöntemi sinirsel etiketleme için seçimdir. Önceki çalışmalarda çoğunda, geleneksel ABC Protokolü ve floresan streptavidin boyama yöntemi olmuştur BDA etiketleme incelenmesi için kullanılan ve benzer ortaya morfolojik desen1,2,3 , 4 , 5. burada, biz o streptavidin AF594 sadece uygun bir seçim değildi bulundu BDA, floresan Nisl ve PV-antijen, gibi diğer sinir marker ile birleştirmek için de uygundur ama etiketleme için sağlayan BDA korelasyon gözlemleyerek için yeni bir fırsat etiketleme ve sinirsel diğer öğeler. Her ne kadar geleneksel çift boyama yöntemi BDA ve diğer sinir işaretçileri için de sık sık yürütülen ile iki renkli DAB yordamı14,15, üç boyutlu analiz sistemi altında kullanmak için uygun değildir bir confocal lazer tarama mikroskobu. Bir teknik açıdan bizim çalışmada belirgin BDA etiketleme ve diğer etiketleme arasında karşılaştırmak için değerli bir referans sağlar.
Sinirsel yolu izleme tekniği enjeksiyon yeri ve sinir sisteminde hedef arasındaki nöronal bağlantıları açığa için başlangıçta kullanılan; Ancak, araştırmacılar hala sinir ile uygun izleyici16,17etiketleme ideal yapısı peşinde idi. Horseradish peroksidaz ve alt birim B kolera toksin, gibi diğer tarayıcıları aksine yüksek molekül ağırlıklı BDA sinirsel aksonal arbors ve nöronal dendrites16,17 sayısı miktarının için etiketleme yüksek kalitesini üretir . BDA etiketleme, kantitatif analiz da çalışmanın gerçekleştirildiği değil, sinirsel BDA ile etiketleme yüksek kalitesini yakından Morfolojik özellikleri etiketli aksonal arbors ve nöronal anlamak için daha fazla fırsat sağlar dendrites.
Birçok diğer tarayıcıları uygulamaya benzer, önemli konularda bir dizi bu deneysel bir işlem için düşünülmelidir dahil: konsantrasyon ve kullanılan enjeksiyon, enjeksiyon doğru site, cam pipet ucu çapının BDA hacmi cerrahi işlem, en uygun yaşam süresi, perfüzyon, bölüm ve gözlem bir mikroskop altında. Doğrudan olduğunu ne bekleniyor etiketleme BDA kalitesi ile ilişkili. Yukarıda belirtilen kritik adımları ek olarak deney3' te, kullanılan modeli hayvan türleri bağlıdır etiketli hedef enjekte sitesinden uzaklık gibi dikkat gerektiren teknik sınırlamalar vardır 5 , 18. diğer bir deyişle, tüm deneysel işlemin her adımda bir başarılı izleme çalışma bağlıdır.
Bu da çalışmanın, biz aynı anda diğer sinir işaretleri ile kullanarak kombine edilebilir yöntemi boyama floresan BDA sinirsel etiketleme, yüksek kalitesini elde etmek için etkili bir yol olduğunu ispat için rafine bir protokol sağladı Floresan histochemistry veya İmmünokimya. Geleneksel BDA DAB yordamı ile boyama karşılaştırma, biz daha kolay BDA etiketleme ince yapısı analiz ve izleme hedefi confocal bir lazer tarafından mevcut floresan mikroskobu tarama altında sinirsel diğer öğelere ayırmak yaklaşım.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa gerek yok.
Acknowledgments
Bu çalışmada Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı Çin tarafından (proje kod No 81373557; No 81403327) finanse edildi.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Biotinylated dextran amine (BDA) | Molecular Probes | D1956 | 10,000 molecular weight |
| Streptavidin-Alexa Fluor 594 | Molecular Probes | S32356 | Protect from light |
| 500/525 green fluorescent Nissl stain | Molecular Probes | N21480 | Protect from light |
| Brain stereotaxis instrument | Narishige | SR-50 | |
| Freezing microtome | Thermo | Microm International GmbH | |
| Confocal imaging | Olympus | FV1200 | |
| system | |||
| Micro Drill | Saeyang Microtech | Marathon-N7 | |
| Sprague Dawley | Institute of Laboratory Animal Sciences, Chinese Academy of Medical Sciences | SCKX (JUN) 2012-004 | |
| Vectastain ABC Kit | Vector Laboratories | PK-4000 | |
| superfrost plus microscope slides | Thermo | #4951PLUS-001 | 25x75x1mm |
| Photoshop and Illustration | Adobe | CS5 |
References
- Veenman, C. L., Reiner, A., Honig, M. G. Biotinylated dextran amine as an anterograde tracer for single- and double-labeling studies. J Neurosci Methods. 41, 239-254 (1992).
- Reiner, A., Veenman, C. L., Medina, L., Jiao, Y., Del Mar, N., Honig, M. G. Pathway tracing using biotinylated dextran amines. J Neurosci Methods. 103, 23-37 (2000).
- Ling, C., Hendrickson, M. L., Kalil, R. E. Resolving the detailed structure of cortical and thalamic neurons in the adult rat brain with refined biotinylated dextran amine labeling. PLoS One. 7, e45886 (2012).
- Zhang, W. J., et al. Anterograde and retrograde tracing with high molecular weight biotinylated dextran amine through thalamocortical and corticothalamic pathways. Microsc Res Tech. 80, 260-266 (2017).
- Han, X., et al. Biotinylated dextran amine anterograde tracing of the canine corticospinal tract. Neural Regen Res. 7, 805-809 (2012).
- Armstrong-James, M., Callahan, C. A. Thalamo-cortical processing of vibrissal information in the rat. II. spatiotemporal convergence in the thalamic ventroposterior medial nucleus (VPm) and its relevance to generation of receptive fields of S1 cortical "barrel" neurones. J Comp Neurol. 303, 211-224 (1991).
- Armstrong-James, M., Callahan, C. A., Friedman, M. A. Thalamo-cortical processing of vibrissal information in the rat. I. Intracortical origins of surround but not centre-receptive fields of layer IV neurones in the rat S1 barrel field cortex. J Comp Neurol. 303, 193-210 (1991).
- Agmon, A., Yang, L. T., Jones, E. G., O'Dowd, D. K. Topological precision in the thalamic projection to neonatal mouse barrel cortex. J Neurosci. 15, 549-561 (1995).
- Paxinos, G., Watson, C. The rat brain in stereotaxic coordinates. , Academic Press. San Diego. (1998).
- Davidoff, M., Schulze, W. Standard avidin-biotin-peroxidase complex (ABC) staining combination of the peroxidase anti-peroxidase (PAP)-and avidin-biotin-peroxidase complex (ABC)-techniques: an amplification alternative in immunocytochemical staining. Histochemistry. 93, 531-536 (1990).
- Fritzsch, B. Fast axonal diffusion of 3000 molecular weight dextran amines. J Neurosci Methods. 50, 95-103 (1993).
- Kaneko, T., Saeki, K., Lee, T., Mizuno, N. Improved retrograde axonal transport and subsequent visualization of tetramethylrhodamine (TMR) -dextran amine by means of an acidic injection vehicle and antibodies against TMR. J Neurosci Methods. 65, 157-165 (1996).
- Medina, L., Reiner, A. The efferent projections of the dorsal and ventral pallidal parts of the pigeon basal ganglia, studied with biotinylated dextran amine. Neuroscience. 81, 773-802 (1997).
- DE Venecia, R. K., Smelser, C. B., McMullen, N. T. Parvalbumin is expressed in a reciprocal circuit linking the medial geniculate body and auditory neocortex in the rabbit. J Comp Neurol. 400, 349-362 (1998).
- Ojima, H., Takayanagi, M. Use of two anterograde axon tracers to label distinct cortical neuronal populations located in close proximity. J Neurosci Methods. 104, 177-182 (2001).
- Kobbert, C., Apps, R., Bechmann, I., Lanciego, J. L., Mey, J., Thanos, S.
- Vercelli, A., Repici, M., Garbossa, D., Grimaldi, A. Recent techniques for tracing pathways in the central nervous system of developing and adult mammals. Brain Res Bull. 51, 11-28 (2000).
- Liao, C. C., Reed, J. L., Kaas, J. H., Qi, H. X. Intracortical connections are altered after long-standing deprivation of dorsal column inputs in the hand region of area 3b in squirrel monkeys. J Comp Neurol. 524, 1494-1526 (2016).
