Summary
यहां, हम एक परिष्कृत प्रोटोकॉल वर्तमान को प्रभावी ढंग से प्रकट biotinylated dextran अमीन (बीडीए) एक पारस्परिक तंत्रिका मार्ग के माध्यम से एक फ्लोरोसेंट धुंधला विधि के साथ लेबल । यह बीडीए लेबलिंग के ठीक संरचना का विश्लेषण करने के लिए उपयुक्त है और यह एक फोकल स्कैनिंग माइक्रोस्कोप के तहत अंय तंत्रिका तत्वों से अलग ।
Abstract
उच्च आणविक वजन biotinylated dextran अमीन (बीडीए) कई दशकों के लिए एक अति संवेदनशील neuroanatomical अनुरेखक के रूप में इस्तेमाल किया गया है. इसके लेबलिंग की गुणवत्ता के बाद से विभिन्न कारकों से प्रभावित था, यहाँ, हम केंद्रीय तंत्रिका तंत्र में इष्टतम तंत्रिका लेबलिंग के अध्ययन के लिए उच्च आणविक वजन बीडीए के आवेदन के लिए एक परिष्कृत प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं. एक नाजुक कांच VPM के माध्यम से चूहे में thalamus के ventral posteromedial नाभिक (पिपेट) में बीडीए के स्टीरियोटैक्टिक इंजेक्शन के बाद, बीडीए फ्लोरोसेंट streptavidin के साथ दाग-Alexa (वायुसेना) ५९४ और फ्लोरोसेंट counterstained दाग Nissl के साथ AF500/ हरे Nissl धुंधला की पृष्ठभूमि पर, लाल बीडीए लेबलिंग, जिसमें न्यूरॉन सेल बॉडीज और axonal टर्मिनल शामिल थे, somatosensory प्रांतस्था में अधिक स्पष्ट रूप से प्रदर्शित किया गया था । इसके अलावा, डबल फ्लोरोसेंट धुंधला बीडीए के लिए और कैल्शियम-बाध्यकारी प्रोटीन parvalbumin (पीवी) बाहर किया गया था बीडीए लेबलिंग और PV-cortical लक्ष्य में सकारात्मक न्यूरॉन्स के सहसंबंध का पालन करने के लिए, स्थानीय तंत्रिका अध्ययन करने का अवसर प्रदान सर्किट और उनकी रासायनिक विशेषताओं । इस प्रकार, इस परिष्कृत विधि केवल उच्च गुणवत्ता तंत्रिका thalamus और सेरेब्रल प्रांतस्था के बीच पारस्परिक तंत्रिका रास्ते के माध्यम से उच्च आणविक वजन बीडीए के साथ लेबलिंग, लेकिन यह भी एक साथ प्रदर्शन की अनुमति देगा visualizing के लिए उपयुक्त नहीं है अंय फ्लोरोसेंट histochemistry या immunochemistry के साथ तंत्रिका मार्करों ।
Introduction
उच्च आणविक वजन बीडीए (१०,००० आणविक वजन), एक अति संवेदनशील अनुरेखक, पर 20 साल के लिए केंद्रीय तंत्रिका तंत्र में तंत्रिका रास्ते अनुरेखण के लिए इस्तेमाल किया गया है1. हालांकि बीडीए का उपयोग एक आम तंत्रिका तकनीक अनुरेखण पथ है, बीडीए लेबलिंग की गुणवत्ता में विभिंन कारकों द्वारा पशुओं में प्रभावित किया जा सकता है1,2,3। हमारे हाल के अध्ययन में संकेत दिया है कि बीडीए लेबलिंग की इष्टतम संरचना न केवल एक उचित पोस्ट के साथ जुड़ा है इंजेक्शन अस्तित्व का समय है, लेकिन यह भी धुंधला विधि4के साथ संबंधित है । अब तक, पारंपरिक avidin-बायोटिन-peroxidase परिसर (एबीसी), streptavidin-fluorescein isothiocyanate, और streptavidin-AF594 धुंधला तरीकों का खुलासा करने के लिए इस्तेमाल किया गया बीडीए पिछले अध्ययन में लेबलिंग2,3, 4,5. इसकी तुलना में बीडीए के लिए फ्लोरोसेंट दाग आसानी से किया जा सकता है ।
उच्च आणविक भार बीडीए के आवेदन का विस्तार करने के लिए, एक परिष्कृत प्रोटोकॉल वर्तमान अध्ययन में पेश किया गया था । चूहे मस्तिष्क में thalamus के VPM में बीडीए के इंजेक्शन के बाद, बीडीए लेबलिंग मानक एबीसी धुंधला के रूप में के रूप में अच्छी तरह से डबल फ्लोरोसेंट धुंधला है, जो बीडीए लेबल और बुनियादी के संबंध देख के लिए किया गया था द्वारा नियमित रूप से विधि से पता चला था streptavidin-AF594 और फ्लोरोसेंट Nissl histochemistry या पीवी-immunochemistry के साथ cortical लक्ष्य में तंत्रिका तत्वों या न्यूरॉन्स क्रमशः । VPM और प्राथमिक somatosensory प्रांतस्था के बीच पारस्परिक तंत्रिका रास्ते के माध्यम से (एस1) 6,7,8, हम thalamocortical में बीडीए लेबलिंग पर हमारे प्रेक्षण ध्यान केंद्रित axons और corticothalamic अनुमानित सेल में एस । इस प्रक्रिया के द्वारा, हम उच्च आणविक भार बीडीए के साथ लेबलिंग तंत्रिका के उच्च गुणवत्ता प्राप्त करने के लिए न केवल एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रदान करने की उंमीद है, लेकिन यह भी फ्लोरोसेंट बीडीए लेबलिंग और अंय के साथ फ्लोरोसेंट तंत्रिका मार्करों के संयोजन पर एक परिष्कृत प्रोटोकॉल histochemistry या immunochemistry । इस दृष्टिकोण के लिए स्थानीय तंत्रिका सर्किट और उनके एक फोकल स्कैनिंग माइक्रोस्कोपी लेजर के तहत रासायनिक विशेषताओं का अध्ययन बेहतर है ।
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Protocol
चाइना एकेडमी ऑफ चाइनीज मेडिकल साइंसेज (संदर्भ संख्या २०१६००१४) में एथिक्स कमेटी द्वारा इस अध्ययन को मंजूरी दी गई थी । सभी प्रक्रियाओं की देखभाल और प्रयोगशाला जानवरों (नेशनल एकेडमी प्रेस, वाशिंगटन, डीसी, १९९६) के उपयोग के लिए स्वास्थ्य गाइड के राष्ट्रीय संस्थानों के अनुसार आयोजित किया गया । इस अध्ययन में चार वयस्क नर चूहों (वजन 250-280 ग्राम) का उपयोग किया गया । सभी जानवरों को नियंत्रित तापमान और आर्द्रता के साथ एक 12 ज प्रकाश/अंधेरे चक्र में स्थित थे, और भोजन और पानी के लिए स्वतंत्र पहुँच की अनुमति दी । वर्तमान अध्ययन में प्रयुक्त यंत्रों एवं सामग्रियों को चित्रा 1में दिखाया गया । सर्जरी से पहले, सभी उपकरणों, जैसे stereotaxic फ्रेम और ग्लास पिपेट, ७०% इथेनॉल का उपयोग कर साफ किया गया ।
1. सर्जिकल प्रक्रियाओं
- एक stereotaxic एटलस9 (चित्रा 2a) का उपयोग कर VPM में ब्याज के समंवय क्षेत्र का निर्धारण ।
- एक 1 µ एल माइक्रो-एक ग्लास micropipette के साथ सुसज्जित सिरिंज तैयार (लगभग 10-20 µm के एक टिप व्यास के साथ) (चित्र 1 d) और यह तरल तेल के साथ परीक्षण.
- चूहों को Anesthetize के साथ 7% chloral हाइड्रेट (०.७ mL/100 ग्राम) द्वारा intraperitoneal इंजेक्शन ।
- एक बार गहरी संज्ञाहरण पूंछ चुटकी और पेडल वापसी पलटा के साथ की पुष्टि की है, एक बिजली के रेजर के साथ जानवर के सिर के ऊपर दाढ़ी और 10% povidone आयोडीन क्रमशः ७०% इथेनॉल के बाद के साथ सर्जिकल साइट 3 बार साफ़ ।
- कान में कुंद कान सलाखों रखकर stereotaxic डिवाइस में चूहे प्लेस और चूहे के ऊपरी कृन्तक मुंह धारक (चित्रा 1E) में जगह है, और फिर आंखों पर नेत्र मरहम लागू होते हैं ।
- सर्जिकल साइट के सिर त्वचा फिर से साफ ७०% इथेनॉल का उपयोग कर । बाँझ शर्तों के तहत सर्जरी बनाए रखने के लिए बाँझ सर्जिकल दस्ताने और तौलिए का प्रयोग करें ।
- sagittal टांका (चित्रा 1F) के साथ एक स्केलपेल के साथ त्वचा में एक sagittal चीरा बनाओ ।
- मांसपेशियों और periosteum बाँझ कपास का उपयोग कर खोपड़ी से दूर परिमार्जन-applicators को नियंत्रित करने के लिए शल्य चिकित्सा भर में इत्तला दे दी (चित्रा 1F) ।
- एक एटलस (चित्र 2a) से पूर्वनिर्धारित निर्देशांक का उपयोग करना, craniotomy (चित्रा 1G) के स्थान (-३.३ मिमी Bregma बिंदु, २.६ mm सही करने के लिए midline) का निर्धारण ।
- एक गोल टिप बिट (#106) (चित्रा1) के साथ एक गड़गड़ाहट ड्रिल का उपयोग कर एक craniotomy प्रदर्शन, और मेनिन्जेस (चित्रा 1I) तक पहुँचने तक कुछ ही मिनटों के भीतर एक 1 मिमी गहराई के बारे में करने के लिए ड्रिलिंग जारी.
- एक्साइज इंजेक्शन साइट (फिगर 1I) पर सेरेब्रल प्रांतस्था का पर्दाफाश करने के लिए microforceps बाडी मेटर का उपयोग कर ।
- माइक्रो-10% बीडीए (आसुत जल में १०,००० आणविक वजन) के साथ सिरिंज में तरल तेल बदलें समाधान (चित्रा 1J).
- microinjection तंत्र में सिरिंज माउंट और एक माइक्रो पंप के साथ कनेक्ट (चित्र १-/
नोट: मात्रा इंजेक्शन माइक्रो पंप की गति पर निर्भर है । यहां यह 30 nL/मिनट (चित्रा 1L) के लिए समायोजित किया गया था । - एक stereomicroscope के तहत, ५.८ mm (चित्र 1m) की गहराई पर मस्तिष्क की cortical सतह के माध्यम से VPM में microinjection उपकरण के साथ एक गिलास micropipette मैन्युअल रूप से डालें.
- दबाव-एक माइक्रो पंप (चित्रा 1L, एम) के साथ 3 मिनट (३५ nL/मिनट) की अवधि में VPM में 10% बीडीए के एक १०० nL सुई ।
- इंजेक्शन के बाद, एक अतिरिक्त 5 मिनट के लिए जगह में पिपेट रखने के लिए और फिर धीरे से वापस ले लो ।
- टांका बाँझ धागे के साथ घाव (चित्रा 1N) । पूर्व और बाद सर्जिकल analgesia के लिए अपने स्थानीय पशु देखभाल समिति के दिशा निर्देशों का पालन करें ।
- एक गर्म वसूली क्षेत्र में चूहे प्लेस जब तक यह चेतना फिर से प्राप्त है और पूरी तरह से बरामद किया है ।
- बरामद चूहे को वापस उसके पिंजरे में लौटा दें ।
2. Perfusions और अनुभाग
- आम तौर पर 10 दिनों के एक अस्तित्व के समय के बाद, इच्छामृत्यु प्रेरित करने के लिए intraperitoneal इंजेक्शन द्वारा 10% urethane (2 मिलीलीटर/100 ग्राम) की अधिक मात्रा के साथ पशु इंजेक्षन ।
- डाकू (चित्रा 1O) में प्रयोगात्मक चूहों Perfuse ।
- एक बार साँस रुक जाती है, कैंची और संदंश का प्रयोग करते हुए, दिल का उपयोग करने के लिए चूहे की वक्ष गुहा खोलो । महाधमनी की ओर बाईं निलय में एक नसों कैथेटर डालें, और फिर सही auricle खोलें ।
- पहले ०.९% फॉस्फेट के साथ perfuse (पीबी) शारीरिक तापमान पर (३७ डिग्री सेल्सियस) के बारे में 1-2 मिनट रक्त दिल से बाहर निकलने तक स्पष्ट है, और फिर ०.१ एम फॉस्फेट बफर (पंजाब, पीएच ७.४) में 250-300 मिलीलीटर 4% paraformaldehyde के साथ जारी है ।
- छिड़काव के बाद सिर की त्वचा को incise और खोपड़ी को खोलकर, और फिर बाहर काटना चूहे मस्तिष्क को । पोस्ट-फिक्स 4% paraformaldehyde में 2 ज के लिए कमरे के तापमान पर (26 डिग्री सेल्सियस), तो cryoprotect 30% सुक्रोज में ०.१ मीटर पंजाबियों (पीएच ७.४) में 3 दिनों के लिए 4 ° c पर जब तक मस्तिष्क में डूब जाता है समाधान (चित्रा 1P) ।
- एक बार जब मस्तिष्क समाधान में डूब जाता है, मस्तिष्क मैट्रिक्स (चित्रा 1Q) पर कोरोनरी दिशा में तीन ब्लॉकों में विभाजित । केंद्रीय ब्लॉक VPM और एस सी शामिल हैं ।
- कोरोनरी दिशा में microtome प्रणाली फिसलने एक ठंड चरण पर ४० µm पर मस्तिष्क के केंद्रीय ब्लॉक में कटौती । ०.१ मीटर पंजाबियों (पीएच ७.४) (आंकड़े 1R, एस) के साथ एक 6 अच्छी डिश में अर्दली इन वर्गों को इकट्ठा ।
3. मानक एबीसी धुंधला
नोट: मस्तिष्क के हर तीसरे राज्याभिषेक खंड से मुक्त फ्लोटिंग वर्गों मानक एबीसी प्रक्रिया10के साथ बीडीए लेबलिंग visualizing के लिए इस्तेमाल किया गया ।
- के बारे में 1 मिनट के लिए ०.१ मी पंजाब में वर्गों कुल्ला ।
- ०.१ एम पंजाब (पीएच ७.४) में 1% एबीसी समाधान में वर्गों के कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए ०.३% ट्राइटन एक्स-१०० युक्त मशीन ।
- ५० mM Tris बफर (पीएच ७.४) में तीन बार वर्गों धो ।
- ०.०२% 3, 3 '-diaminobenzidine tetrahydrochloride (ढाब) और ०.०१% एच2हे2 में ५० mM Tris बफर के बारे में 2-5 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर युक्त समाधान में वर्गों दाग ।
- ५० mM Tris बफर (पीएच ७.४) में तीन बार वर्गों धो ।
- मानक histochemical तकनीक का उपयोग कर माइक्रोस्कोप स्लाइड पर वर्गों माउंट (चित्रा 1T; पूरक वीडियो फ़ाइल III, छिड़काव और वर्गों देखें).
- कक्ष के तापमान पर रात भर हवा में वर्गों सूखी ।
- निर्जलीकरण वर्गों संक्षेप शराब की एक श्रृंखला में (५०%, ७०%, ९५%, १००%) समाधान । लगभग 15 s के लिए प्रत्येक समाधान में स्लाइड् स जलमग्न करें । स्लाइड को प्रत्येक चरण के बीच सूखने की अनुमति न दें ।
- xylene में वर्गों स्पष्ट तीन बार, के बारे में 20 मिनट ।
- स्लाइस पर balsam के 2 या 3 बूंदें डाल दें तो अनुभागों पर coverslips लगाएं.
4. डबल फ्लोरोसेंट बीडीए और सेरेब्रल प्रांतस्था में बुनियादी तंत्रिका तत्वों के लिए धुंधला
नोट: इसके विपरीत, डबल फ्लोरोसेंट धुंधला बीडीए लेबल और आसंन वर्गों पर बुनियादी तंत्रिका तत्वों के साथ streptavidin-AF594 और फ्लोरोसेंट Nissl दाग AF500 के साथ counterstained के साथ इस्तेमाल किया के संबंध देख के लिए किया जाता है/
- के बारे में 1 मिनट के लिए ०.१ मी पंजाब में वर्गों कुल्ला ।
- streptavidin के एक मिश्रित समाधान में वर्गों की मशीन-AF594 (1:500) और AF500/525 हरी फ्लोरोसेंट Nissl दाग (1:1000) में ०.१ एम पंजाबियों (pH ७.४) युक्त ०.३% ट्राइटन X-१०० कमरे के तापमान पर 2 घंटे के लिए ।
- ०.१ मीटर पंजाब (पीएच ७.४) में तीन बार वर्गों धो ।
- मानक histochemical तकनीक का उपयोग कर माइक्रोस्कोप स्लाइड पर वर्गों माउंट. के बारे में 1 एच के लिए हवा में वर्गों सूखी ।
- निरीक्षण से पहले आसुत पानी में ५०% ग्लिसरीन के साथ फ्लोरोसेंट वर्गों के लिए coverslips लागू करें ।
5. डबल फ्लोरोसेंट बीडीए और सेरेब्रल प्रांतस्था में न्यूरॉन्स के लिए दाग
नोट: डबल फ्लोरोसेंट दाग streptavidin-AF594 और पीवी-immunochemistry के साथ cortical लक्ष्य में प्रतिनिधि वर्गों पर बीडीए लेबलिंग और न्यूरॉन्स के सहसंबंध के अवलोकन के लिए किया गया था ।
- के बारे में 1 मिनट के लिए ०.१ मीटर पंजाबियों (पीएच ७.४) में प्रतिनिधि वर्गों कुल्ला ।
- 30 मिनट के लिए ०.१ मीटर पंजाब में 3% सामांय बकरी सीरम और ०.३% ट्राइटन एक्स-१०० युक्त एक अवरुद्ध समाधान में वर्गों की मशीन ।
- ०.१ एम पंजाब (पीएच ७.४) में माउस मोनोक्लोनल विरोधी पीवी आईजीजी (1:1000) के एक समाधान में वर्गों स्थानांतरण 1% सामांय बकरी सीरम और ०.३% ट्राइटन एक्स-१०० से युक्त 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर के लिए ।
- अगले दिन, ०.१ मीटर पंजाबियों (पीएच ७.४) में तीन बार वर्गों धो ।
- बकरी विरोधी माउस की एक मिश्रित समाधान करने के लिए वर्गों बेनकाब-AF488 माध्यमिक एंटीबॉडी (1:500), streptavidin-AF594 (1:500), और 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI, 1:40000) में ०.१ मीटर पंजाबियों (पीएच ७.४) से युक्त 1% सामान्य बकरी सीरम और ०.३% ट्राइटन एक्स-१०० के लिए 1 एच.
- चरण ४.३ के लिए ४.५ दोहराएँ ।
6. प्रेक्षण
- VPM, thalamocortical axons, और corticothalamic ंयूरॉंस की छवियों को ले लो ।
- एक फोकल इमेजिंग उद्देश्य लेंस (4x, na: ०.१३; 10x, एनए: ०.४०; और 40x, na: ०.९५) के साथ सुसज्जित प्रणाली के साथ फ्लोरोसेंट नमूनों का निरीक्षण करें । ४०५ (नीला), ४८८ (हरा) और ५५९ (लाल) एनएम के उत्तेजना और उत्सर्जन तरंग दैर्ध्य का उपयोग करें ।
नोट: यहां, फोकल pinhole १५२ µm (4x, 10x) और १०५ µm (40x) है । छवि पर कब्जा के स्थानिक संकल्प १०२४ × १०२४ पिक्सेल (4x, 10x) और ६४० × ६४० पिक्सेल (40x) है । - ४० µm (जेड श्रृंखला) की मोटाई पर प्रत्येक अनुभाग से 2 µm के क्रमिक फ्रेम में बीस छवियों ले लो ।
- एक में छवियों को एकीकृत करने के लिए फोकल छवि प्रसंस्करण सॉफ्टवेयर प्रणाली के साथ तीन आयामी विश्लेषण के लिए इस प्रकार के रूप में ध्यान केंद्रित छवि: प्रारंभ फोकल विमान → सेट अंत फोकल विमान → सेट चरण आकार → गहराई पैटर्न चुनें → छवि कैद → जेड श्रृंखला ।
- एक फोकल इमेजिंग उद्देश्य लेंस (4x, na: ०.१३; 10x, एनए: ०.४०; और 40x, na: ०.९५) के साथ सुसज्जित प्रणाली के साथ फ्लोरोसेंट नमूनों का निरीक्षण करें । ४०५ (नीला), ४८८ (हरा) और ५५९ (लाल) एनएम के उत्तेजना और उत्सर्जन तरंग दैर्ध्य का उपयोग करें ।
- एक डिजिटल कैमरा (4x, na: ०.१३; 10x, एनए: ०.४०; और 40x, na: ०.९५ लेंस) से सुसज्जित एक प्रकाश माइक्रोस्कोप द्वारा brightfield छवियों को ले लो । ५०० ms. का उपयोग फोटो संपादन सॉफ्टवेयर की चमक और विपरीत छवियों को समायोजित करने के लिए और लेबल जोड़ने के लिए एक जोखिम समय का उपयोग करें ।
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Representative Results
VPM में बीडीए के 10 दिनों के बाद इंजेक्शन की उत्तरजीविता तीव्र तंत्रिका लेबलिंग के उत्पादन के लिए पर्याप्त था इसी cortical क्षेत्रों पर ipsilateral इंजेक्शन की ओर (चित्रा 2) । दोनों पारंपरिक एबीसी और बीडीए के लिए फ्लोरोसेंट धुंधला प्रक्रियाओं के समान पैटर्न पर तंत्रिका लेबलिंग से पता चला एस 2, लेबल thalamocortical axons और प्रतिगामी लेबल corticothalamic न्यूरॉन्स (चित्रा 2cडी ).
axons लेबल anterogradely के लिए, वे परत से 2 परत 6 से मनाया गया परत 4 पर उच्च घनत्व के साथ, और thalamocortical axons के विशिष्ट प्रकार बैरल क्षेत्र में मनाया गया था (चित्रा 2c, डी) । उच्च आवर्धन दृश्य में, बीडीए लेबलिंग स्पष्ट रूप से axonal ट्रंक, शाखाओं, जमानतों, और छोटे varicosities (चित्रा 3) पर प्रस्तुत किया । के तहत प्रदर्शित किया जा करने के लिए लेबल thalamocortical axons, प्रतिगामी लेबल cortical पिरामिड न्यूरॉन्स प्रदर्शित किए गए थे, और उनके सेल निकायों 5/6 परतों पर वितरित, लेकिन उनके शिखर dendrites परत करने के लिए विस्तारित 2 (चित्रा 2c, डी). बीडीए लेबलिंग न केवल ंयूरॉन कोशिका निकायों और dendrites में प्रस्तुत किया, लेकिन यह भी वृक्ष spins, Golgi के रूप में प्रदर्शित होने के संकल्प (चित्र बी) ।
इसके अलावा, डबल फ्लोरोसेंट धुंधला भी streptavidin-AF594 और पीवी-immunochemistry के साथ cortical लक्ष्य में बीडीए लेबलिंग और न्यूरॉन्स के सहसंबंध देख के लिए प्रदर्शन किया गया । cortical लक्ष्य में बीडीए लेबलिंग के आसपास, पीवी पॉजिटिव न्यूरॉन्स लेयर 2 से लेयर 6 को लेयर 4 (फिगर 4a) में उच्च एकाग्रता के साथ वितरित किए गए । बीडीए के साथ लेबल किया जा करने के लिए कोई pv-सकारात्मक न्यूरॉन्स थे, तथापि, बीडीए-लेबल axonal टर्मिनलों पीवी पॉजिटिव सेल निकायों की सतह के आसपास पाया गया और पीवी-सकारात्मक axonal टर्मिनलों के आसपास बीडीए-लेबल cortical पिरामिड ंयूरॉंस (चित्रा 4B, सी ).
चित्र 1. इस प्रयोग में इस्तेमाल की जाने वाली प्रमुख सर्जिकल स्टेप्स और मुख्य उपकरणों के फोटोग्राफ ।
A: stereotaxic डिवाइस । ख: दंत ड्रिल । ग: सर्जिकल उपकरण (स्केलपेल, microforceps, और आदि) डी: माइक्रो सिरिंज एक गिलास micropipette के साथ सुसज्जित. ई: stereotaxic डिवाइस में चूहे का सिर रखें । एफ: सर्जिकल साइट को साफ । G: Bregma बिंदु की पुष्टि करें । एच: खोपड़ी ड्रिल । मैं: मस्तिष्क प्रांतस्था बेनकाब । जंमू: माइक्रो सिरिंज में 10% बीडीए लोड । कश्मीर: माइक्रो इंजेक्शन के लिए उपकरण में सिरिंज माउंट । L: माइक्रो-पम्प की गति समायोजित करें । M: VPM में ग् micropipette डालें । N: टांका बाँझ धागे के साथ घाव । ओ: डाकू में चूहा Perfuse । पी: मस्तिष्क बाहर काटना । Q: ब्रेन मैट्रिक्स के साथ तीन ब्लॉकों में मस्तिष्क विभाजित । आर: एक ठंड चरण फिसलने microtome प्रणाली पर मस्तिष्क में कटौती । S: एक 6-अच्छी तरह से पकवान में क्रम में मस्तिष्क वर्गों लीजिए । T: माइक्रोस्कोप स्लाइड पर अनुभाग माउंट । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
चित्र 2. इंजेक्शन साइट और ठेठ तंत्रिका somatosensory प्रांतस्था में उच्च आणविक वजन बीडीए के साथ लेबलिंग ।
a: इंजेक्शन साइट stereotaxic एटलस पर निर्धारित किया गया था । ख: प्रतिनिधि बीडीए के इंजेक्शन साइट दिखा photomicrograph (लाल) thalamus के ventral posteromedial नाभिक में (VPM) हरी Nissl धुंधला की पृष्ठभूमि पर । ग: फ्लोरोसेंट बीडीए लेबलिंग की Photomicrograph, परत 4 में thalamocortical axons और परतें 5/6 में corticothalamic न्यूरॉन्स शामिल हैं । घ: एक मानक avidin के साथ पारंपरिक बीडीए लेबलिंग के Photomicrograph-बायोटिन-peroxidase प्रक्रिया तंत्रिका लेबलिंग फ्लोरोसेंट बीडीए लेबलिंग के समान पैटर्न दिखा । VPL, thalamus के ventral posterolateral नाभिक । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
चित्र 3. उच्च गुणवत्ता तंत्रिका लेबलिंग के साथ उच्च आणविक भार बीडीए की पृष्ठभूमि पर हरे Nissl धुंधला ।
एक: विस्तार में axonal arbors (लाल) लेबल anterogradely के उच्च इज़ाफ़ा दृश्य । बी: उच्च संकल्प विस्तार से ंयूरॉन कोशिका शरीर, dendrites, और वृक्ष spins (लाल) लेबल दिखा तस्वीरें । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
चित्र 4. cortical लक्ष्य में बीडीए लेबलिंग और कैल्शियम-बाइंडिंग प्रोटीन पीवी-पॉजिटिव न्यूरॉन्स के सहसंबंध ।
A: somatosensory प्रांतस्था में बीडीए लेबलिंग (red) और पीवी-पॉजिटिव न्यूरॉन्स (green) का वितरण । B: लेयर 4 में बीडीए-लेबल्ड axons और PV-धनात्मक न्यूरॉन्स के वितरण का उच्च आवर्धन दृश्य । ग: बीडीए की उच्च संकल्प तस्वीर-लेबल्ड cortical हवामहल सेल (लाल) और पीवी पॉजिटिव न्यूरॉन्स (हरे) परतों में 5/6. सभी नमूनों को DAPI (नीला) के साथ counterstained गया । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
पूरक वीडियो फ़ाइलें: पूरक वीडियो संक्षेप में शल्य प्रक्रिया, VPM, छिड़काव और अनुभाग में बीडीए के इंजेक्शन दिखाने के लिए, और परिणाम । वीडियो फ़ाइल में नाम "IV. प्रतिनिधि परिणाम ", तीन आयामी फोकल लेजर स्कैनिंग माइक्रोस्कोपी और विश्लेषण प्रणाली के परिणाम दिखाए जाते हैं । उच्च संकल्प एनिमेशन प्रतिगामी लेबल न्यूरॉन सेल शरीर, dendrites, और वृक्ष spins (लाल) विस्तार से पता चलता है । इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए कृपया यहां क्लिक करें.
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Discussion
एक उचित अनुरेखक का चयन एक सफल तंत्रिका अनुरेखण प्रयोग के लिए एक महत्वपूर्ण कदम है । बीडीए के परिवार में उच्च आणविक भार बीडीए (१०,००० आणविक भार) को तरजीही रूप से कम आणविक भार बीडीए (३,००० आणविक भार) के विपरीत anterograde तंत्रिका मार्ग के माध्यम से पहुँचाया जा करने की सिफारिश की गई थी2,3 , 11 , 12 , 13. हालांकि, कई अध्ययनों से यह भी सुझाव दिया कि उच्च आणविक वजन बीडीए भी संभवतः anterograde अनुरेखण1,2,3के साथ समानांतर में प्रतिगामी मार्ग अनुरेखण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । VPM और एस 1 के बीच पारस्परिक तंत्रिका रास्ते के माध्यम से, हम इस विचार का समर्थन करने के लिए और अधिक सबूत प्रदान की है कि उच्च आणविक भार बीडीए द्वि-दिशा पथ के लिए उपयुक्त है4अनुरेखण । इस डोमेन में इसी तरह, उच्च आणविक भार बीडीए भी पृष्ठीय पार्श्व geniculate शरीर और दृश्य प्रांतस्था के साथ ही औसत दर्जे का geniculate शरीर और श्रवण के बीच पारस्परिक कनेक्शन की जांच के लिए दृश्य और श्रवण प्रणाली में इस्तेमाल किया गया था प्रांतस्था 3 , 14.
तंत्रिका अनुरेखण प्रयोग में, अंय महत्वपूर्ण विचार तंत्रिका लेबलिंग के लिए विधि धुंधला का विकल्प है । पिछले अध्ययनों के अधिकांश में, दोनों पारंपरिक एबीसी प्रोटोकॉल और फ्लोरोसेंट streptavidin धुंधला विधि बीडीए लेबल की जांच के लिए इस्तेमाल किया गया है और इसी तरह रूपात्मक पैटर्न से पता चला1,2,3 , 4 , 5. यहां, हमने पाया है कि streptavidin-AF594 न केवल बीडीए लेबलिंग के लिए एक उचित विकल्प है, लेकिन यह भी फ्लोरोसेंट Nissl और PV-प्रतिजन के रूप में अंय तंत्रिका मार्कर, के साथ संयोजन के लिए उपयुक्त था, बीडीए के सहसंबंध देख के लिए एक नया अवसर प्रदान लेबलिंग और अंय तंत्रिका तत्वों । हालांकि पारंपरिक दोहरे बीडीए और अंय तंत्रिका मार्करों के लिए विधि धुंधला भी अक्सर दो रंग ढाब प्रक्रिया14,15के साथ किया गया है, यह एक के तहत तीन आयामी विश्लेषण प्रणाली का उपयोग करने के लिए उपयुक्त नहीं है फोकल लेजर स्कैनिंग माइक्रोस्कोपी । एक तकनीकी दृष्टिकोण से, हमारे वर्तमान अध्ययन के लिए एक मूल्यवान संदर्भ प्रदान करता है बीडीए लेबलिंग और अंय लेबलिंग के बीच अलग तुलना ।
तंत्रिका तंत्र पता लगाने तकनीक शुरू में इंजेक्शन साइट और तंत्रिका तंत्र में अपने लक्ष्य के बीच न्यूरॉन कनेक्शन खुलासा करने के लिए इस्तेमाल किया गया था; हालांकि, शोधकर्ताओं ने अभी भी एक उचित अनुरेखक16,17के साथ लेबलिंग तंत्रिका के आदर्श संरचना की खोज में थे. अंय अनुरेखकों के विपरीत, जैसे सहिजन peroxidase और हैजा विष के उपइकाई बी के रूप में, उच्च आणविक भार बीडीए axonal arbors और न्यूरॉन dendrites की संख्या को बढ़ाता है के लिए उच्च गुणवत्ता के तंत्रिका लेबल का उत्पादन16,17 . हालांकि बीडीए लेबलिंग का मात्रात्मक विश्लेषण वर्तमान अध्ययन में नहीं किया गया था, बीडीए के साथ तंत्रिका लेबलिंग की उच्च गुणवत्ता को बारीकी से लेबल axonal arbors और न्यूरॉन पर रूपात्मक विशेषताओं को समझने के लिए अधिक अवसर प्रदान करता है Dendrites.
कई अंय अनुरेखकों के आवेदन के समान, महत्वपूर्ण मुद्दों की एक श्रृंखला इस प्रयोगात्मक प्रक्रिया के लिए विचार किया जाना चाहिए, सहित: एकाग्रता और इंजेक्शन के लिए इस्तेमाल बीडीए की मात्रा, इंजेक्शन की सही साइट, कांच पिपेट के टिप व्यास, शल्य प्रक्रिया, इष्टतम अस्तित्व समय, छिड़काव, अनुभाग, और एक खुर्दबीन के नीचे अवलोकन । यह सीधे बीडीए लेबलिंग हम क्या उंमीद की गुणवत्ता के साथ जुड़ा हुआ है । उपर्युक्त महत्वपूर्ण कदम के अलावा, वहां तकनीकी सीमाओं कि ध्यान की आवश्यकता होती है, ऐसे लेबल लक्ष्य है, जो मॉडल पशु प्रयोग में प्रयुक्त प्रजातियों पर निर्भर है के लिए इंजेक्शन साइट से दूरी के रूप में3, 5 , 18. एक शब्द में, एक सफल अनुरेखण अध्ययन पूरे प्रयोगात्मक प्रक्रिया में हर कदम पर निर्भर करता है ।
वर्तमान अध्ययन में, हम एक परिष्कृत प्रोटोकॉल को प्रदर्शित करने के लिए प्रदान की है कि फ्लोरोसेंट बीडीए धुंधला विधि तंत्रिका लेबलिंग, जो एक साथ प्रयोग द्वारा अंय तंत्रिका मार्करों के साथ संयुक्त हो सकता है की उच्च गुणवत्ता प्राप्त करने के लिए एक प्रभावी तरीका है फ्लोरोसेंट histochemistry या immunochemistry । पारंपरिक बीडीए ढाब प्रक्रिया के साथ धुंधला की तुलना, हम और अधिक आसानी से बीडीए लेबलिंग के ठीक संरचना का विश्लेषण कर सकते है और यह एक फोकल लेजर स्कैनिंग माइक्रोस्कोपी के तहत वर्तमान फ्लोरोसेंट द्वारा ट्रेसिंग लक्ष्य में अंय तंत्रिका तत्वों से अलग दृष्टिकोण.
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Disclosures
लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।
Acknowledgments
इस अध्ययन के राष्ट्रीय प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन द्वारा वित्त पोषित किया गया था चीन (परियोजना कोड no. ८१३७३५५७; सं. ८१४०३३२७).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Biotinylated dextran amine (BDA) | Molecular Probes | D1956 | 10,000 molecular weight |
| Streptavidin-Alexa Fluor 594 | Molecular Probes | S32356 | Protect from light |
| 500/525 green fluorescent Nissl stain | Molecular Probes | N21480 | Protect from light |
| Brain stereotaxis instrument | Narishige | SR-50 | |
| Freezing microtome | Thermo | Microm International GmbH | |
| Confocal imaging | Olympus | FV1200 | |
| system | |||
| Micro Drill | Saeyang Microtech | Marathon-N7 | |
| Sprague Dawley | Institute of Laboratory Animal Sciences, Chinese Academy of Medical Sciences | SCKX (JUN) 2012-004 | |
| Vectastain ABC Kit | Vector Laboratories | PK-4000 | |
| superfrost plus microscope slides | Thermo | #4951PLUS-001 | 25x75x1mm |
| Photoshop and Illustration | Adobe | CS5 |
References
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