Summary
כאן, אנו מציגים פרוטוקול מעודן לחשוף ביעילות biotinylated לתוספי אמין (BDA) תיוג עם פלורסנט צביעת שיטת דרך מסלול עצבי הדדיים. היא מתאימה לניתוח המבנה קנס של BDA תיוג, המבדיל אותו רכיבים עצביים אחרים תחת מיקרוסקופ סורק לייזר קונפוקלי.
Abstract
משקל מולקולרי גבוה biotinylated לתוספי אמין (BDA) שימש בתור מכשיר מעקב neuroanatomical רגישה מאוד במשך עשורים רבים. מאז האיכות של תיוג שלה הושפע על ידי גורמים שונים, כאן, אנו מספקים פרוטוקול מעודן של יישום משקל מולקולרי גבוה BDA לימוד אופטימליים תיוג עצבי במערכת העצבים המרכזית. לאחר הזרקת סטיאוטטי BDA לתוך הגרעין הגחוני posteromedial (VPM) של התלמוס בחולדה באמצעות פיפטה מזכוכית עדינה, BDA היה מוכתם streptavidin פלורסנט-(AF) 594 אלקסה, counterstained עם Nissl פלורסנט הכתם AF500/525. על הרקע של צביעת Nissl ירוק, אדום BDA תיוג, כולל מסופים עצב, וגופי תאים עצביים היה ביתר בירור הפגינו קליפת המגע. יתר על כן, להכפיל מכתים פלורסנט עבור BDA וביצעו סידן מחייב חלבון parvalbumin (PV) היה להתבונן הקורלציה של BDA תיוג ו interneurons PV-חיובית בתוך המטרה קורטיקלית, מתן הזדמנות ללמוד המקומי עצבית מעגלים ומאפיינים הכימי שלהם. לכן, בשיטה זו מעודן מתאים לא רק להמחיש באיכות גבוהה עצבית תיוג עם משקל מולקולרי BDA גבוהה דרך מסלולים עצביים הדדיים בין קליפת המוח תלמוס, אבל גם יאפשרו הדגמה סימולטני של סמנים עצביים אחרים עם להסטולוגיה פלורסנט או נוגדנים.
Introduction
משקל מולקולרי גבוה BDA (10,000 מולקולרית משקל), מכשיר מעקב רגישים, שימש במשך מעקב מסלולים עצביים במערכת העצבים המרכזית עבור יותר מ-20 שנים1. למרות השימוש BDA הוא משחק טרקטו עצבית נפוצות עקיבה טכניקה, האיכות של BDA תיוג עשויה להיות מושפעת בבעלי חיים שונים גורמים1,2,3. מחקר שנערך שלנו ציינו כי המבנה האופטימלי של BDA תיוג זה המשויך זמן הישרדות שלאחר הזרקה נכונה אלא גם בקורלציה עם שיטת צביעת4. עד עכשיו, מתחם אבידין-ביוטין-peroxidase קונבנציונאלי (ABC), streptavidin-fluorescein isothiocyanate, streptavidin-AF594 שיטות מכתימים שימשו חשיפת BDA תיוג הקודם מחקרים2,3, 4,5. לשם השוואה, צביעת פלורסנט עבור BDA ניתן בקלות לבצע.
על מנת להרחיב את היישום של משקל מולקולרי גבוה BDA, הוצג פרוטוקול מעודן במחקר הנוכחי. לאחר ההזרקה של BDA לתוך VPM של התלמוס במוח עכברוש, תיוג BDA היה חשף בשיטה הרגילה של צביעת ABC סטנדרטיים, כמו גם על ידי זוגי פלורסנט מכתים, אשר בוצע להתבוננות הקורלציה של BDA תיוג, בסיסי אלמנטים עצבית או interneurons בתוך המטרה קורטיקלית עם streptavidin-AF594, להסטולוגיה Nissl פלורסנט או PV-נוגדנים, בהתאמה. דרך מסלולים עצביים הדדיים בין VPM של קליפת המגע העיקרית (S1)6,7,8, התמקדנו שלנו תצפית על BDA תיוג thalamocortical מוקרן אקסונים ו corticothalamic somas תא המתוכננת ב ו- S1. באמצעות תהליך זה, אנו אמורים לספק לא רק פרוטוקול מפורט להשגת האיכות הגבוהה של תיוג עצביים עם משקל מולקולרי גבוה BDA, אלא גם פרוטוקול מעודנת על השילוב של תיוג BDA פלורסנט, סמנים עצביים אחרים פלורסנט עם להסטולוגיה או נוגדנים. גישה זו עדיפה ללמוד את המעגלים העצביים מקומיים ו שלהם מאפיינים כימיים תחת לייזר קונפוקלי סורק מיקרוסקופ.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
מחקר זה אושרה על ידי ועדת האתיקה-סין האקדמיה הסינית למדעי הרפואה (אסמכתא מס ' 20160014). כל ההליכים נערכו לפי מוסדות לאומיים של בריאות המדריך על טיפוח ועל שימוש של חיות מעבדה (הלאומית האקדמיה Press, וושינגטון די. סי., 1996). ארבעה חולדות זכר בוגר (משקל 250-280 גרם) השתמשו במחקר זה. כל בעלי החיים היו בבניין מחזור/כהה 12 שעות עם מבוקר טמפרטורה ולחות, איפשרה גישה ללא מזון ומים. כלים וחומרים השתמשו במחקר הנוכחי היו הראה באיור1. לפני הניתוח, כל הכלים, כגון מסגרת stereotaxic פיפטה מזכוכית, נוקו באמצעות אתנול 70%.
1. ניתוחים
- קובעים את האזור קואורדינטות עניין ב- VPM באמצעות stereotaxic אטלס9 (איור 2 א).
- להכין 1 µL מיקרו-מזרק מצויד micropipette זכוכית (בקוטר טיפ של 10-20 מיקרומטר) (איור 1D) לבדוק את זה עם שמן פראפין.
- עזים ומתנגד החולדות עם 7% כלורין (0.7 מ של 100 גרם) על ידי הזרקת בקרום הבטן.
- לאחר הרדמה עמוקה הוא אישר עם זנב קמצוץ, פדלים רפלקס הנסיגה, לגלח את הראש של החיה עם מכונת גילוח חשמלית ו לשפשף את האתר כירורגית 3 פעמים עם 10% povidone יוד ואחריו אתנול 70% בהתאמה.
- למקם את החולדה המכשיר stereotaxic על-ידי הצבת האוזן בוטה ברים לתוך אוזניה, למקם החותכות העליונות של החולדה בעל הפה (איור 1E), ולאחר מכן החל אופטלמולוגיות משחה על העיניים.
- לנקות את העור הראשי של האתר כירורגית שוב באמצעות אתנול 70%. להשתמש כפפות כירורגי סטרילי ומגבות כדי לשמור את הניתוח בתנאים סטריליים.
- עושים חתך הסאגיטלי בעור עם איזמל לאורך התפר המשונן (איור 1F).
- לגרד את השריר ואת קרום העצם מן הגולגולת באמצעות applicators שקצהו כותנה סטרילי לאורך כל הניתוח כדי לשלוט הדימום (איור 1F).
- בעזרת הקואורדינטות מוגדרת מראש מתוך אטלס (איור 2 א), לקבוע את המיקום (-3.3 מ מ Bregma נקודות, 2.6 מ מ הזכות קו האמצע) של גולגולת (איור 1 ג'י).
- לבצע ניתוח של פתיחת גולגולת באמצעות תרגיל בר עם מעט עגול-טיפ (#106) (איור 1 H) ולהמשיך קידוח כדי על 1 מ מ לעומק תוך מספר דקות עד שהגיע קרומי המוח (איור 1I).
- בלו קרום הדורה באמצעות microforceps לחשוף את קליפת המוח במהלך ההזרקה (איור 1I).
- לשנות פרפין נוזלי במזרק המיקרו-עם 10% BDA (10,000 משקל מולקולרי, במים מזוקקים) פתרון (איור 1J).
- בעיא המזרק המנגנון microinjection וחבר עם מיקרו-משאבה (איור 1 K).
הערה: אמצעי האחסון מוזרק נמצא תלוי על המהירות של המיקרו-המשאבה. כאן זה היה מותאם nL 30/min (איור 1 L). - תחת stereomicroscope, הכנס של micropipette זכוכית באופן ידני עם המנגנון microinjection VPM דרך השטח בקליפת המוח של המוח בעומק של 5.8 מ מ (איור 1 מ').
- לחץ-להזריק 100 nL של 10% BDA לתוך VPM על פני תקופה של 3 דקות (nL 35/דקה) עם מיקרו-משאבה (איור 1 L, M).
- לאחר ההזרקה, לשמור על פיפטה במקומם 5 דקות נוספות, ואז לסגת לאט.
- תפר את הפצע עם חוט סטרילי (איור 1N). בצע את הנחיות ועדת טיפול בבעלי חיים מקומיים מראש, לאחר ניתוח נגד כאבים.
- למקם את החולדה באזור השחזור חמים עד שהיא תשוב להכרה הוא התאושש לחלוטין.
- להחזיר את החולדה התאושש בחזרה לכלוב שלו.
2. perfusions ומקטעים
- כעבור זמן הישרדות של בדרך כלל 10 ימים, להזריק החיה עם מנת יתר של 10% urethane (2 מ"ל של 100 גרם) על ידי הזרקת בקרום הבטן לזירוז המתת חסד.
- Perfuse העכברושים ניסיוני בשכונה (איור 1O).
- לאחר עוצר הנשימה, באמצעות מספריים, מלקחיים, לפתוח את חלל בית החזה של העכברוש לגשת הלב. להכניס קטטר תוך ורידי של החדר השמאלי כלפי אבי העורקים, ולאחר מכן פתח את auricle נכון.
- קודם perfuse עם 0.9% באגירה פוספט תמיסת מלח (PBS) בטמפרטורת פיזיולוגיים (37 מעלות צלזיוס) כ 1-2 דקות עד היציאה מן הלב הוא נקה ולאחר מכן המשך עם 250-300 מ ל 4% paraformaldehyde במאגר פוספט 0.1 M (PB, pH 7.4).
- לאחר זלוף, פצעים וחתכים בעור הראש, לפתוח את הגולגולת, ואז לנתח את המוח חולדה. פוסט-לתקן את המוח ביתור ב 4% paraformaldehyde עבור 2 h בטמפרטורת החדר (26 ° C), אז cryoprotect ב- 30% סוכרוז ב- PBS 0.1 M (pH 7.4) במשך 3 ימים ב 4 ° C עד המוח הוא שקוע הפתרון (איור 1 P).
- ברגע המוח הוא שקוע הפתרון, לחלק את המוח שלושה גושי בניינים לכיוון הילתית על מטריצות המוח (איור 1Q). הגוש המרכזי מכיל את VPM ואת S1.
- חותכים את הגוש המרכזי של המוח-40 µm על שלב ההקפאה הזזה מיקרוטום מערכת בכיוון הילתית. איסוף מקטעים אלה מסודרת בצלחת 6-ובכן עם 0.1 M PBS (pH 7.4) (דמויות 1R, S).
3. תקן ABC מכתים
הערה: חינם צף מקטעים של כל קטע הילתית השלישי של המוח שימשו להמחשת BDA תיוג עם ABC סטנדרטי הליך10.
- לשטוף בסעיפים PBS 0.1 M עבור-1 דקות.
- דגירה בסעיפים 1% פתרון ABC 0.1 M PB (pH 7.4) המכיל 0.3% טריטון X-100 לשעה בטמפרטורת החדר.
- לשטוף את המקטעים שלוש פעמים ב 50 מ מ טריס מאגר (pH 7.4).
- כתם הסעיפים בתמיסה המכילה 0.02 נקודות % 3, 3'-diaminobenzidine tetrahydrochloride (DAB) ו- 0.01% H2O2 במאגר טריס 50 מ מ, כ- 2-5 דקות בטמפרטורת החדר.
- לשטוף את המקטעים שלוש פעמים ב 50 מ מ טריס מאגר (pH 7.4).
- הר הסעיפים על שקופיות מיקרוסקופ באמצעות טכניקות פתולוגיה סטנדרטי (איור 1T; ראה משלימה השלישי קובץ וידאו, זלוף ומקטעים).
- יבש הסעיפים באוויר הלילה בטמפרטורת החדר.
- מייבשים את המקטעים בקצרה בסדרה של אלכוהול (50%, 70%, 95%, 100%) פתרונות. להטביע את השקופיות כל פתרון עבור-15 s. אל תאפשר את השקופיות להתייבש בין שלב לשלב.
- נקה בסעיפים קסילן שלוש פעמים, בערך 20 דקות.
- לשים הפרוסות 2 או 3 טיפות בלזם ואז במקום coverslips על הסעיפים.
4. צביעת פלורסנט כפול BDA ולא בסיסיות עצביים רכיבי בתוך קליפת המוח
הערה: לעומת זאת, צביעת פלורסנט כפול בוצע להתבוננות הקורלציה של BDA תיוג, אלמנטים בסיסיים עצבית על הסעיפים סמוכים לעיל להשתמש עם streptavidin-AF594, counterstained עם Nissl פלורסנט הכתם AF500/525.
- לשטוף בסעיפים PBS 0.1 M עבור-1 דקות.
- דגירה בסעיפים פתרון מעורבות של streptavidin-AF594 (שבערך), AF500/525 ירוק ניאון Nissl הכתם (1:1, 000) ב- PBS 0.1 M (pH 7.4) המכיל 0.3% טריטון X-100 עבור 2 h בטמפרטורת החדר.
- לשטוף את המקטעים שלוש פעמים ב 0.1 M PB (pH 7.4).
- הר הסעיפים על שקופיות מיקרוסקופ בטכניקות פתולוגיה סטנדרטי. יבש הסעיפים באוויר לשעה בערך.
- חלות coverslips הסעיפים פלורסנט עם גליצרין 50% במים מזוקקים לפני התצפית.
5. צביעת פלורסנט כפול BDA ו Interneurons של קליפת המוח
הערה: צביעת פלורסנט כפול בוצע להתבוננות הקורלציה של BDA תיוג ו interneurons על הסעיפים נציג את המטרה קורטיקלית עם streptavidin-AF594, PV-נוגדנים.
- לשטוף בסעיפים נציג 0.1 M PBS (pH 7.4) במשך כ- 1 דקות.
- דגירה בסעיפים פתרון חסימה המכיל סרום עז רגיל 3% ו- 0.3% טריטון X-100 ב 0.1 M PBS למשך 30 דקות.
- להעביר את המקטעים לתוך פתרון של העכבר monoclonal אנטי-PV IgG (1:1, 000) 0.1 M PBS (pH 7.4) המכיל 1% עז נורמלי סרום ו- 0.3% טריטון X-100 נלון ב 4 º C.
- למחרת, לשטוף את המקטעים שלוש פעמים ב- PBS 0.1 M (pH 7.4).
- לחשוף את הסעיפים פתרון מעורבות של עז אנטי-mouse-AF488 משני נוגדנים (שבערך), streptavidin-AF594 (שבערך) ו 4 אינץ ', 6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (דאפי, 1:40, 000) בנסיוב 0.1 M PBS (pH 7.4) המכיל 1% עז רגילה 0.3% טריטון X-100 לשעה.
- חזור על שלבים 4.3-4.5.
6. תצפית
- קח תמונות של VPM, thalamocortical אקסונים, corticothalamic נוירונים.
- להתבונן הדגימות פלורסנט עם מערכת הדמיה קונאפוקלית מצויד עם מטרות עדשות (4 x, נה: 0.13; 10 x, נה: x 0.40; ל-40, נה: 0.95). השתמש אורכי הגל עירור, פליטה של 405 (ירוק) (כחול), 488 ננומטר (אדום) 559.
הערה: כאן חריר קונאפוקלית זה 152 מיקרומטר (4 x, 10 x) ו- 105 מיקרומטר (40 x). הרזולוציה המרחבית של לכידת התמונה הוא 1024 × 1024 פיקסלים (4 x, 10 x) 640 × 640 פיקסל (40 x). - סעו עשרים תמונות במסגרות רצופים של 2 מיקרומטר כל סעיף בעובי של 40 µm (סדרת Z).
- לשלב התמונות תמונה אחת בפוקוס בתמונה קונאפוקלית עיבוד מערכת תוכנה לניתוח תלת מימדי כדלקמן: התחל קבע במישור המוקד ← סוף קבע במישור המוקד ← שלב הגדרת גודל ← לבחור עומק דפוס ← תמונת לכידת ← Z סדרות.
- להתבונן הדגימות פלורסנט עם מערכת הדמיה קונאפוקלית מצויד עם מטרות עדשות (4 x, נה: 0.13; 10 x, נה: x 0.40; ל-40, נה: 0.95). השתמש אורכי הגל עירור, פליטה של 405 (ירוק) (כחול), 488 ננומטר (אדום) 559.
- לקחת תמונות brightfield על ידי מיקרוסקופ אור מצויד with a מצלמה דיגיטלית (4 x, נה: 0.13; 10 x, נה: x 0.40; ל-40, נה: 0.95 עדשות). השתמש את זמן החשיפה של גב' 500 להשתמש בתוכנה לעריכת תמונות כדי להתאים את הבהירות והחדות של התמונות להוסיף תוויות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
הישרדות של 10 ימים שלאחר הזרקה של BDA לתוך VPM היה מספיקות לייצור אינטנסיבי עצבית תיוג על אזורים קורטיקליים המתאימים חולשת לצד הזרקה (איור 2). קונבנציונלי ABC והן פלורסנט מכתימה את ההליכים עבור BDA חשף דפוס דומה של תיוג עצבית על ו- S1, כולל anterogradely הנקרא thalamocortical אקסונים ומתויגים retrogradely corticothalamic נוירונים (איור 2C, D ).
Anterogradely עם התווית אקסונים, הם נצפו משכבה 2 שכבה 6 עם צפיפות גבוהה יותר על השכבה 4, הסוג האופייני של אקסונים thalamocortical נצפתה באזור חבית (איור 2C, יח). בתצוגת הגדלה גבוהה יותר, תיוג BDA בבירור הציג על עצב גזע, ענפים, בהתקפה, קטן varicosities (איור 3 א). תחת thalamocortical שכותרתו האקסונים שיוצגו, הנוירונים כפירמידה קורטיקליים retrogradely שכותרתו הוצגו, גופם תא מופץ על הרבדים 5/6, אבל שלהם דנדריטים הפסגה להרחיב שכבה 2 (איור 2C, יח). BDA תיוג לא רק הציגה גופי תאים עצביים, דנדריטים, אלא גם הדנדריטים, מופיעה גולג'י דמוי רזולוציה (איור 3B).
בנוסף, צביעת פלורסנט כפול גם בוצעה להתבוננות הקורלציה של BDA תיוג ו interneurons את המטרה קורטיקלית עם streptavidin-AF594, PV-נוגדנים. בסביבה BDA תיוג ביעד קורטיקלית, PV-חיוביות נוירונים הופצו משכבה 2 שכבה 6 עם ריכוז גבוה של שכבה 4 (איור 4A). היו אין נוירונים PV-חיוביות כדי להיקרא עם BDA, בכל אופן, התווית על-ידי BDA מסופי עצב נמצאו סביב השטח של גופים תא PV-חיוביות ומסופי עצב PV-חיוביות סביב התווית על-ידי BDA קורטיקלית כפירמידה נוירונים (איור 4B, C ).
איור 1. צילומים של השלבים החשובים כירורגי וכלים הראשי שישמש בניסוי זה.
A: המכשיר stereotaxic. B: מקדחת שיניים. C: כלי ניתוח (אזמל, microforceps ו וכו) D: מיקרו-מזרק מצויד micropipette זכוכית. E: שים את ראשך עכברוש לתוך המכשיר stereotaxic. F: לנקות באתר כירורגית. G: לאשר את נקודת Bregma. H: לקדוח את הגולגולת. אני: לחשוף את קליפת המוח. J: לטעון 10% BDA לתוך המזרק המיקרו. K: בעיא המזרק המנגנון להזרקה-מיקרו. L: להתאים את המהירות של המיקרו-המשאבה. ז: להכניס את micropipette זכוכית VPM. N: תפר את הפצע עם חוט סטרילי. O: Perfuse העכברוש בשכונה. P: לנתח את המוח. Q: לחלק את המוח שלושה רחובות עם מטריצות המוח. R: לחתוך את המוח על שלב ההקפאה הזזה מיקרוטום המערכת. S: לאסוף את המוח מקטעים מסודרת מנה 6-. טוב. T: הר הסעיפים על שקופיות מיקרוסקופ. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
באיור 2. ההזרקה, תיוג עצבית טיפוסי עם משקל מולקולרי גבוה BDA בתוך קליפת המגע.
A: ההזרקה נקבע על אטלס stereotaxic. B: נציג photomicrograph מציג האתר הזרקה של BDA (אדום) בגרעין posteromedial הגחוני של תלמוס (VPM) על רקע ירוק Nissl מכתים. C: Photomicrograph של פלורסנט BDA תיוג, כולל אקסונים thalamocortical בשכבה 4 ו- corticothalamic נוירונים בשכבות 5/6. D: Photomicrograph של BDA קונבנציונאלי תיוג עם הליך סטנדרטיים אבידין-ביוטין-peroxidase מציג את דפוס דומה של תיוג עצבית כדי BDA תיוג פלורסנט. VPL, גרעין posterolateral הגחוני של התלמוס. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3. איכות גבוהה של תיוג עצביים עם משקל מולקולרי גבוה BDA על רקע ירוק Nissl מכתים.
A: הגדלה גבוהה יותר, השקפת anterogradely תווית ובשבילים עצב (אדום) בפירוט. B: צילומים ברזולוציה גבוהה מראה את הגוף תאים עצביים retrogradely שכותרתו דנדריטים, הדנדריטים (אדום) בפירוט. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
באיור 4. המתאם של BDA תיוג ו סידן מחייב חלבון PV-חיוביות interneurons בתוך המטרה קורטיקלית.
A: והפצה של BDA תיוג (אדום) ו- interneurons PV-חיוביות (ירוק) בתוך קליפת המגע. B: תצוגה גבוהה יותר הגדלה של ההתפלגות של התווית על-ידי BDA אקסונים ו PV-חיוביות interneurons בשכבה 4. C: שכבות צילום ברזולוציה גבוהה של התווית על-ידי BDA קורטיקלית כפירמידה (אדום) ותא interneurons PV-חיוביות (ירוק) ב- 5/6. כל הדגימות היו counterstained עם דאפי (כחול). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
משלימה קבצי וידאו: קטעי וידאו משלימה הצג בקצרה את הליך כירורגי, הזרקה של BDA לתוך VPM, זלוף, חלוקתה ותוצאות. בקובץ הווידאו בשם "IV. נציג התוצאה", לייזר קונפוקלי תלת מימדי סריקה מיקרוסקופ וניתוח מערכת התוצאות יוצגו. אנימציה ברזולוציה גבוהה מציגה את הגוף תאים עצביים retrogradely שכותרתו, דנדריטים, הדנדריטים (אדום) בפירוט. אנא לחץ כאן כדי להוריד את הקובץ.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
בחירת מכשיר מעקב ראוי הוא שלב קריטי עבור ניסוי מוצלח עקיבה עצבית. במשפחה של BDA, משקל מולקולרי גבוה BDA (משקל מולקולרי 10,000) הומלץ מעדיפים להיות מועבר דרך מסלול עצבי anterograde בניגוד נמוך משקל מולקולרי BDA (משקל מולקולרי 3,000)2,3 , 11 , 12 , 13. עם זאת, מחקרים רבים גם הציע את משקל מולקולרי גבוה BDA אולי פוטנציאל לשמש גם לצורך מעקב אחר מסלול רטרוגרדית במקביל anterograde עקיבה1,2,3. דרך מסלולים עצביים הדדיים בין VPM ל- S1, סיפקנו הוכחה נוספת כדי לתמוך את הרעיון כי משקל מולקולרי גבוה BDA מתאים דו-כיווני מערכת עקיבה4. באופן דומה בתחום זה, משקל מולקולרי גבוה BDA שימש גם במערכת חזותיים ושמיעתיים לבחינת הקשרים הדדיים בין הגוף הברך הצדי הגבי לרוחב ו קליפת הראייה וכן המדיאלי הברך הצדי הגוף קליפת השמיעה 3 , 14.
בניסוי עקיבה עצבית, השיקול החשוב השני הוא הבחירה של צביעת שיטת תיוג עצבית. ברוב המחקרים הקודמים, היה פרוטוקול ABC קונבנציונלי והן פלורסנט streptavidin מכתים שיטת המשמש לבחינת BDA תיוג, חשף את דומה בתבנית מורפולוגית1,2,3 , 4 , 5. הנה, מצאנו את streptavidin-AF594 היתה לא רק בחירה נכונה של BDA תיוג, אבל מתאים גם עבור שילוב עם מרקר עצביות אחרות, כגון פלורסנט Nissl PV-אנטיגן, מתן הזדמנות חדשה להתבוננות הקורלציה של BDA תיוג ורכיבים אחרים עצבית. למרות השיטה המקובלת מכתים כפול עבור BDA סמנים עצביים אחרים בוצעו גם לעתים קרובות עם14,15הליך DAB שני צבעים, זה לא מתאים באמצעות מערכת ניתוח תלת מימדי תחת מיקרוסקופ לייזר קונפוקלי סריקה. מבחינה טכנית, המחקר הנוכחי שלנו מספק הפניה חשוב להשוות מובהק בין BDA תיוג תיוג אחרים.
הטכניקה עקיבה מערכת עצבית שימש במקור לחשוף קשרים עצביים בין ההזרקה המטרה שלו במערכת העצבים; עם זאת, החוקרים עדיין היו במרדף אחר המבנה האידיאלי של תיוג עצביים עם מעקב נאות16,17. בניגוד המשדרים אחרים, כגון חזרת peroxidase ו יחידת משנה ב' של רעלן כולרה, משקל מולקולרי גבוה BDA מייצרת איכות גבוהה יותר של תיוג עצביים אורגנים מספר ובשבילים עצב ו דנדריטים עצביים16,17 . למרות ניתוח כמותי של BDA תיוג לא בוצע במחקר הנוכחי, איכות גבוהה יותר של תיוג עצביים עם BDA מספקת יותר הזדמנויות להבין היטב את מאפייני מורפולוגי ב שכותרתו ובשבילים עצב ו עצביים דנדריטים.
בדומה היישום של רבים אחרים המשדרים, סדרה של נושאים חשובים להתייחס להליך זה ניסיוני, כולל: ריכוז ונפח של BDA משמש הזרקה, האתר הנכון של הזרקת, הקוטר עצה של זכוכית הפיפטה תהליך כירורגי, זמן הישרדות אופטימלית, זלוף, סעיף, והתבוננות במיקרוסקופ. . זה ישירות הקשורים לאיכות BDA תיוג שציפינו. בנוסף לשלבים הקריטיים שהוזכרו לעיל, ישנן מגבלות טכניות המחייבות התייחסות, כמו המרחק מן האתר מוזרק אל המטרה שכותרתו, אשר תלויה דגם מיני בעלי חיים המשמשים את ניסוי3, 5 , 18. במילה אחת: מחקר מעקב מוצלח תלוי בכל שלב בהליך ניסיוני כולו.
במחקר הנוכחי, סיפקנו פרוטוקול מעודן כדי להדגים כי BDA פלורסנט מכתים השיטה היא דרך יעילה להשגת האיכות הגבוהה של תיוג עצבית, אשר יכול להיות בו זמנית בשילוב עם סמנים עצביים אחרים באמצעות להסטולוגיה פלורסנט או נוגדנים. השוואת קונבנציונאלי BDA ההכתמה ההליך DAB, שנוכל בקלות רבה יותר לנתח את המבנה הדק של BDA תיוג, להבדיל אותו מרכיבים עצביים אחרים בתוך המטרה עקיבה תחת לייזר קונפוקלי לסריקות מיקרוסקופיה פלורסנט הנוכחי הגישה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים אין לחשוף.
Acknowledgments
מחקר זה מומן על ידי נבחרת מדעי הטבע קרן של סין (פרוייקט קוד מס 81373557; 81403327 מס).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Biotinylated dextran amine (BDA) | Molecular Probes | D1956 | 10,000 molecular weight |
| Streptavidin-Alexa Fluor 594 | Molecular Probes | S32356 | Protect from light |
| 500/525 green fluorescent Nissl stain | Molecular Probes | N21480 | Protect from light |
| Brain stereotaxis instrument | Narishige | SR-50 | |
| Freezing microtome | Thermo | Microm International GmbH | |
| Confocal imaging | Olympus | FV1200 | |
| system | |||
| Micro Drill | Saeyang Microtech | Marathon-N7 | |
| Sprague Dawley | Institute of Laboratory Animal Sciences, Chinese Academy of Medical Sciences | SCKX (JUN) 2012-004 | |
| Vectastain ABC Kit | Vector Laboratories | PK-4000 | |
| superfrost plus microscope slides | Thermo | #4951PLUS-001 | 25x75x1mm |
| Photoshop and Illustration | Adobe | CS5 |
References
- Veenman, C. L., Reiner, A., Honig, M. G. Biotinylated dextran amine as an anterograde tracer for single- and double-labeling studies. J Neurosci Methods. 41, 239-254 (1992).
- Reiner, A., Veenman, C. L., Medina, L., Jiao, Y., Del Mar, N., Honig, M. G. Pathway tracing using biotinylated dextran amines. J Neurosci Methods. 103, 23-37 (2000).
- Ling, C., Hendrickson, M. L., Kalil, R. E. Resolving the detailed structure of cortical and thalamic neurons in the adult rat brain with refined biotinylated dextran amine labeling. PLoS One. 7, e45886 (2012).
- Zhang, W. J., et al. Anterograde and retrograde tracing with high molecular weight biotinylated dextran amine through thalamocortical and corticothalamic pathways. Microsc Res Tech. 80, 260-266 (2017).
- Han, X., et al. Biotinylated dextran amine anterograde tracing of the canine corticospinal tract. Neural Regen Res. 7, 805-809 (2012).
- Armstrong-James, M., Callahan, C. A. Thalamo-cortical processing of vibrissal information in the rat. II. spatiotemporal convergence in the thalamic ventroposterior medial nucleus (VPm) and its relevance to generation of receptive fields of S1 cortical "barrel" neurones. J Comp Neurol. 303, 211-224 (1991).
- Armstrong-James, M., Callahan, C. A., Friedman, M. A. Thalamo-cortical processing of vibrissal information in the rat. I. Intracortical origins of surround but not centre-receptive fields of layer IV neurones in the rat S1 barrel field cortex. J Comp Neurol. 303, 193-210 (1991).
- Agmon, A., Yang, L. T., Jones, E. G., O'Dowd, D. K. Topological precision in the thalamic projection to neonatal mouse barrel cortex. J Neurosci. 15, 549-561 (1995).
- Paxinos, G., Watson, C. The rat brain in stereotaxic coordinates. , Academic Press. San Diego. (1998).
- Davidoff, M., Schulze, W. Standard avidin-biotin-peroxidase complex (ABC) staining combination of the peroxidase anti-peroxidase (PAP)-and avidin-biotin-peroxidase complex (ABC)-techniques: an amplification alternative in immunocytochemical staining. Histochemistry. 93, 531-536 (1990).
- Fritzsch, B. Fast axonal diffusion of 3000 molecular weight dextran amines. J Neurosci Methods. 50, 95-103 (1993).
- Kaneko, T., Saeki, K., Lee, T., Mizuno, N. Improved retrograde axonal transport and subsequent visualization of tetramethylrhodamine (TMR) -dextran amine by means of an acidic injection vehicle and antibodies against TMR. J Neurosci Methods. 65, 157-165 (1996).
- Medina, L., Reiner, A. The efferent projections of the dorsal and ventral pallidal parts of the pigeon basal ganglia, studied with biotinylated dextran amine. Neuroscience. 81, 773-802 (1997).
- DE Venecia, R. K., Smelser, C. B., McMullen, N. T. Parvalbumin is expressed in a reciprocal circuit linking the medial geniculate body and auditory neocortex in the rabbit. J Comp Neurol. 400, 349-362 (1998).
- Ojima, H., Takayanagi, M. Use of two anterograde axon tracers to label distinct cortical neuronal populations located in close proximity. J Neurosci Methods. 104, 177-182 (2001).
- Kobbert, C., Apps, R., Bechmann, I., Lanciego, J. L., Mey, J., Thanos, S. Current concepts in neuroanatomical tracing. Prog Neurobiol. 62, 327-351 (2000).
- Vercelli, A., Repici, M., Garbossa, D., Grimaldi, A. Recent techniques for tracing pathways in the central nervous system of developing and adult mammals. Brain Res Bull. 51, 11-28 (2000).
- Liao, C. C., Reed, J. L., Kaas, J. H., Qi, H. X. Intracortical connections are altered after long-standing deprivation of dorsal column inputs in the hand region of area 3b in squirrel monkeys. J Comp Neurol. 524, 1494-1526 (2016).
