Summary
Aqui, apresentamos um protocolo refinado para efetivamente revelar biotinilado amina de dextrano (BDA) rotulagem com uma fluorescente método através de um caminho neural recíproco de coloração. É apropriado para analisar a estrutura fina do BDA, rotulagem e distinguindo-a das outros elementos neurais sob microscópio confocal laser.
Abstract
Amina de dextrano de biotinilado de alto peso molecular (BDA) tem sido usada como um marcador altamente sensível neuroanatômica por muitas décadas. Desde que a qualidade da sua rotulagem foi afetada por vários fatores, aqui, nós fornecemos um protocolo refinado para a aplicação de alto peso molecular BDA para estudar a rotulagem neural ideal no sistema nervoso central. Após a injeção estereotáxica de BDA para o núcleo ventral póstero-medial (VPM) do tálamo em ratos através de uma pipeta de vidro delicado, BDA foi manchado com fluorescente streptavidin-Alexa (AF) 594 e counterstained com fluorescente Nissl mancha AF500/525. Sobre o fundo de coloração de Nissl do verde, o vermelho BDA etiquetando, incluindo organismos de célula neuronais e axonal terminais, mais distintamente foi demonstrada no córtex somatossensorial. Além disso, a dupla coloração fluorescente para BDA e o parvalbumin de proteína ligadora de cálcio (PV) foi realizado para observar a correlação de BDA rotular e interneurônios PV-positivas no destino cortical, proporcionando a oportunidade de estudar o local neural circuitos e suas características químicas. Assim, este método refinado não só é adequado para a visualização de alta qualidade neural de rotulagem com o alto peso molecular BDA através de vias neurais recíprocas entre o tálamo e o córtex cerebral, mas também permitirá a simultânea demonstração de outros marcadores neurais com fluorescente histoquímica ou imunoquímica.
Introduction
Alto peso molecular BDA (10.000 peso molecular), um marcador altamente sensível, tem sido utilizado para rastreamento de vias neurais no sistema nervoso central por mais de 20 anos1. Embora o uso do BDA é um trato neural comum técnica de rastreamento, a qualidade da rotulagem BDA pode ser afetada em animais por vários fatores1,2,3. Nosso estudo recente indicou que a estrutura ideal do BDA rotulagem é não só associada com um tempo de sobrevivência de pós-injeção adequada, mas também correlacionada com a coloração do método4. Até agora, convencional complexo avidina-biotina-peroxidase (ABC), isotiocianato de fluoresceína-streptavidin e streptavidin-AF594 coloração métodos foram usados para revelar a rotulagem BDA em estudos anteriores2,3, 4,5. Em comparação, a coloração fluorescente para BDA pode ser facilmente executada.
A fim de estender a aplicação de alto peso molecular, BDA, um protocolo refinado foi introduzido no presente estudo. Após a injeção do BDA para a VPM do tálamo em cérebro de ratos, BDA rotulagem foi revelada pelo método regular de coloração padrão do ABC, bem como manchando duplo fluorescente, que foi realizado para observar a correlação da BDA rotulagem e básico elementos neurais ou interneurônios no destino cortical com streptavidin-AF594 e histoquímica de Nissl fluorescente ou PV-imunoquímica, respectivamente. Através de vias neurais recíprocas entre VPM e o córtex somatossensorial primário (S1)6,7,8, focamos nossa observação na BDA rotulagem nos axônios thalamocortical projetada e corticothalamic somas de célula projetada em S1. Por este processo, que esperávamos fornecer não somente um protocolo detalhado para a obtenção da alta qualidade da rotulagem neural com alto peso molecular BDA, mas também um protocolo refinado sobre a combinação de rotulagem de BDA fluorescente e outros marcadores fluorescentes neurais com histoquímica ou imunoquímica. Esta abordagem é preferível estudar os circuitos neurais locais e suas características químicas sob um laser confocal, microscopia eletrônica de varredura.
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Protocol
Este estudo foi aprovado pelo Comitê de ética em China Academy de chinês ciências médicas (número de referência 20160014). Todos os procedimentos foram conduzidos de acordo com os institutos nacionais de saúde guia para o cuidado e o uso de animais de laboratório (National Academy Press, Washington, D.C., 1996). Quatro ratos macho adulto (250-280 g de peso) foram utilizados neste estudo. Todos os animais foram alojados em um ciclo claro/escuro de 12 h com umidade e temperatura controlada e permitiu o livre acesso à comida e água. Os instrumentos e os materiais utilizados no presente estudo foram mostrou na Figura 1. Antes da cirurgia, todos os instrumentos, tais como armação estereotáxica e pipeta de vidro, foram limpas com etanol a 70%.
1. cirurgias
- Determine a coordenar área de interesse em VPM usando um atlas estereotáxica9 (Figura 2A).
- Prepare uma 1 µ l microseringa equipada com uma micropipeta de vidro (com um diâmetro de ponta de aproximadamente 10-20 µm) (Figura 1) e testá-lo com parafina líquida.
- Anestesia os ratos com 7% hidrato de cloral (0,7 mL/100 g) por injeção intraperitoneal.
- Uma vez confirmada anestesia profunda com cauda beliscar e pedal reflexo de retirada, raspar a parte superior da cabeça do animal com um barbeador elétrico e esfregue o local cirúrgico 3 vezes com 10% de iodopovidona seguida de etanol a 70%, respectivamente.
- Coloque o rato em dispositivo estereotáxica colocando barras de orelha contundente para as orelhas e coloque os incisivos superiores o rato está no suporte da boca (Figura 1E) e em seguida, aplique pomada oftálmica nos olhos.
- Limpe a pele cabeça do local cirúrgico novamente usando etanol a 70%. Use luvas cirúrgicas estéreis e toalhas para manter a cirurgia sob condições estéreis.
- Faça uma incisão sagital na pele com um bisturi ao longo da sutura sagital (Figura 1F).
- Raspe o músculo e o periósteo para longe do crânio utilizando aplicadores com ponta de algodão estéril durante a cirurgia para controle do sangramento (Figura 1F).
- Usando coordenadas predefinidas de um atlas (Figura 2A), determine a localização (ponto de Bregma mm-3,30, 2,6 mm direito mediana) de craniotomia (Figura 1).
- Executar uma craniotomia usando uma broca de rebarba com um pouco de ponta redonda (#106) (Figura 1 H) e continuar a perfuração para sobre uma profundidade de 1 mm dentro de alguns minutos até atingir as meninges (Figura 1I).
- Impostos especiais de consumo a dura-máter usando um microfórceps para expor o córtex cerebral o local da injeção (Figura 1I).
- Alterar a parafina líquida na microseringa com solução a 10% BDA (peso molecular 10.000, em água destilada) (Figura 1J).
- Monte a seringa no aparelho de microinjeção e conectar-se com uma microbomba (Figura 1 K).
Nota: O volume injetado é dependente da velocidade da microbomba. Aqui ele foi ajustado para 30 nL/min (Figura 1 L). - Sob um estereomicroscópio, insira uma micropipeta de vidro manualmente com o aparelho de microinjeção a VPM através da superfície cortical do cérebro na profundidade de 5,8 mm (Figura 1 M).
- Pressão-injetar um 100 nL 10% BDA para a VPM durante um período de 3 min (35 nL/min) com uma microbomba (Figura 1 L, M).
- Após a injeção, manter a pipeta no lugar por um adicional 5 min e depois retirar lentamente.
- Suture a ferida com rosca estéril (Figura 1N). Siga as guias de Comitê de cuidados animais locais para analgesia pré e pós-operatória.
- Coloque o rato em uma área de recuperação de calor até que recupere a consciência e está totalmente recuperado.
- Retorna o rato recuperado para sua gaiola.
2. perfusions e seções
- Depois de um tempo de sobrevivência de geralmente de 10 dias, injete o animal com uma overdose de uretano de 10% (2 mL/100 g) por injeção intraperitoneal de induzir a eutanásia.
- Perfundir os ratos experimentais de capuz (Figura 1O).
- Uma vez que a respiração para, usando uma tesoura e pinça, abra a cavidade torácica do rato para acessar o coração. Inserir um cateter intravenoso para o ventrículo esquerdo para a aorta e em seguida, abra a orelha direita.
- Primeiro perfundir com 0,9% fosfato salino (PBS) a temperatura fisiológica (37 ° C) cerca de 1-2 min até que o sangue sair do coração é claro e depois continuar com paraformaldeído 4% de 250-300 mL de tampão de fosfato 0,1 M (PB, pH 7,4).
- Após a perfusão, faça uma incisão na pele da cabeça e abrir o crânio e então dissecar o cérebro de rato. Fixe o cérebro dissecado em paraformaldeído 4% para 2 h à temperatura ambiente (26 ° C), então crioproteção em 30% de sacarose em PBS 0,1 M (pH 7,4) por 3 dias a 4 ° C até que o cérebro está imerso na solução (Figura 1, P).
- Uma vez que o cérebro está imersa na solução, dividem o cérebro em três blocos em direção coronal em matrizes de cérebro (Figura 1T). O bloco central contém a VPM e S1.
- Corte o bloco central do cérebro em 40 µm em um palco de congelação micrótomo sistema na direção coronal deslizante. Colete essas seções ordenadas em um prato de 6-poços com PBS 0,1 M (pH 7,4) (figuras 1R, S).
3. padrão ABC coloração
Nota: Enciclopédia seções flutuantes de cada terceira seção coronal do cérebro foram utilizadas para visualizar a rotulagem de BDA com padrão ABC procedimento10.
- Enxague as seções em PBS 0,1 M por cerca de 1 min.
- Incubar as secções em solução a 1% ABC em PB 0,1 M (pH 7,4) contendo 0,3% Triton X-100 por 1h à temperatura ambiente.
- Lave as seções três vezes em tampão Tris de 50mm (pH 7,4).
- Manche as seções em uma solução contendo 0,02% 3, tetrahydrochloride 3'-diaminobenzidine (DAB) e 0,01% H2O2 em tampão Tris de 50 mM para cerca de 2-5 min à temperatura ambiente.
- Lave as seções três vezes em tampão Tris de 50mm (pH 7,4).
- Monte as seções em corrediças do microscópio usando técnicas histoquímicas padrão (Figura 1T; ver III de arquivo de vídeo suplementar, perfusão e seções).
- Seque as seções no ar durante a noite em temperatura ambiente.
- Desidrate as seções brevemente em uma série de soluções de álcool (50%, 70%, 95%, 100%). Mergulhe os slides em cada solução para cerca de 15 s. Não permita que os slides secar entre cada etapa.
- Limpe as seções em xilol três vezes, cerca de 20 min.
- Coloque 2 ou 3 gotas do bálsamo sobre as fatias, em seguida, coloque as lamelas nas seções.
4. dupla coloração fluorescente para BDA e elementos básicos de Neural no córtex Cerebral
Nota: em contraste, coloração fluorescente duplo foi realizado para observar a correlação da BDA rotulagem e elementos neurais básicos nas secções adjacentes ao acima usado com streptavidin-AF594 e counterstained com fluorescente Nissl mancha AF500/525.
- Enxague as seções em PBS 0,1 M por cerca de 1 min.
- Incubar as seções em uma solução mista de streptavidin-AF594 (1: 500) e AF500/525 verde fluorescente Nissl mancha (1:1, 000) em PBS 0,1 M (pH 7,4) contendo 0,3% Triton X-100 para 2 h à temperatura ambiente.
- Lave as seções três vezes em PB 0,1 M (pH 7,4).
- Monte as seções em corrediças do microscópio usando técnicas histoquímicas padrão. Seque as seções no ar por cerca de 1h.
- Aplica as lamelas para as seções fluorescentes com glicerina 50% em água destilada antes de observação.
5. dupla coloração fluorescente para BDA e interneurônios no córtex Cerebral
Nota: Coloração fluorescente duplo foi realizado para observar a correlação de BDA rotular e interneurônios nas secções representativas no destino cortical com streptavidin-AF594 e PV-imunoquímica.
- Enxague as seções representativas em PBS 0,1 M (pH 7,4) por cerca de 1 min.
- Incubar as seções em uma solução de bloqueio contendo 3% de soro de cabra normal e 0,3% Triton X-100 em PBS 0,1 M durante 30 min.
- Transferir as seções para uma solução de rato anticorpo monoclonal anti-PV IgG (1:1, 000) em 0,1 M PBS (pH 7,4) contendo soro de cabra normal de 1% e 0,3% Triton X-100 para uma noite a 4 ° C.
- No dia seguinte, lave as seções três vezes em PBS 0,1 M (pH 7,4).
- Expor as seções de uma solução mista de anticorpo secundário de cabra anti-mouse-AF488 (1: 500), streptavidin-AF594 (1: 500) e 4' 6-diamidino-2-phenylindole dicloridrato (DAPI, 01:40, 000) em 0,1 M PBS (pH 7,4) com 1% cabra normal soro e 0.3% Triton X-100 por 1h.
- Repita as etapas de 4.3 a 4.5.
6. observação
- Com imagens do VPM, thalamocortical axônios e corticothalamic os neurônios.
- Observar as amostras fluorescentes com um sistema da imagem latente confocal equipado com lentes de objectivos (4x, at: 0,13; 10 x, at: x 0.40; e 40, at: 0,95). Use a excitação e emissão de comprimentos de onda de 405 (azul), 488 (verde) e 559 nm (vermelho).
Nota: Aqui, o pinhole confocal é 152 µm (4x, 10x) e 105 µm (40 x). A resolução espacial de captura de imagem é 1024 × 1024 pixels (4x, 10x) e 640 × 640 pixels (40 x). - Pegue vinte imagens em quadros sucessivos de 2 µm de cada seção para a espessura de 40 µm (série Z).
- Integrar as imagens em uma única imagem em foco com a sistema de software para análise tridimensional da seguinte forma de processamento de imagem confocal: conjunto Iniciar plano focal → final conjunto plano focal → etapa definir tamanho → escolha profundidade padrão → imagem captura → Z série.
- Observar as amostras fluorescentes com um sistema da imagem latente confocal equipado com lentes de objectivos (4x, at: 0,13; 10 x, at: x 0.40; e 40, at: 0,95). Use a excitação e emissão de comprimentos de onda de 405 (azul), 488 (verde) e 559 nm (vermelho).
- Tomar brightfield imagens por um microscópio óptico equipado com uma câmera digital (4x, at: 0,13; 10 x, at: x 0.40; e 40, at: 0,95 lentes). Use um tempo de exposição de fotografia de uso de 500 ms. software de edição para ajustar o brilho e o contraste das imagens e adicionar rótulos.
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Representative Results
Sobrevivência da injeção de pós 10 dias da BDA para o VPM foi suficiente para produzir intenso neural rotulagem nas áreas corticais correspondentes ipsilateral ao lado de injeção (Figura 2). ABC convencional e fluorescentes mancha procedimentos para BDA revelaram o padrão semelhante de rotulagem neural sobre a S1, incluindo anterogradely rotulado thalamocortical axônios e rotulado retrogradely corticothalamic neurônios (Figura 2, D ).
Para o anterogradely rotulado axônios, eles foram observados da camada 2 para a camada 6 com maior densidade na camada 4, e o tipo típico de axônios thalamocortical foi observado na área de barril (Figura 2, D). Em vista da maior ampliação, BDA rotulagem claramente apresentado no tronco axonal, ramos, cauções e pequenas varicosidades (Figura 3A). Sob os axônios thalamocortical rotulada a ser exibido, foram exibidos os neurônios piramidais corticais retrogradely etiquetados, e seus corpos celulares distribuídos sobre as camadas de 5/6, mas suas dendrites apicais alargada a camada 2 (Figura 2, D). Não só a rotulagem BDA apresentado no neuronais corpos celulares e dendritos, mas também em espinhas dendríticas, aparecendo como resolução de Golgi-como (Figura 3B).
Além disso, a dupla coloração fluorescente também foi realizada para observar a correlação de BDA rotular e interneurônios no destino cortical com streptavidin-AF594 e PV-imunoquímica. Em torno do BDA rotulagem no destino cortical, neurônios PV-positivos foram distribuídos da camada 2 a camada 6 com alta concentração na camada 4 (Figura 4A). Não havia nenhum neurônios PV-positivo a ser rotulados com BDA, no entanto, BDA-rotulado axonal terminais foram encontrados ao redor da superfície de corpos de células PV-positivo e PV-positivo axonal terminais ao redor BDA-rotulado corticais piramidais neurônios (Figura 4B, C ).
Figura 1. Fotografias das principais etapas cirúrgicas e principais instrumentos usados neste experimento.
A: O dispositivo estereotáxica. B: A broca odontológica. C: instrumentos cirúrgicos (bisturi, um microfórceps e etc) D: Microseringa equipada com uma micropipeta de vidro. E: Coloque a cabeça do rato no dispositivo estereotáxica. F: limpar o local cirúrgico. G: confirmar o ponto de Bregma. H: perfurar o crânio. Eu: expor o córtex cerebral. J: carregar 10% BDA para a microseringa. K: montar a seringa dentro do aparelho para microinjecção. L: ajustar a velocidade da microbomba. M: inserir a VPM a micropipeta de vidro. N: suturar a ferida com discussão estéril. O: perfundir o rato no capô. P: dissecar o cérebro. Q: dividem o cérebro em três blocos com as matrizes de cérebro. R: cortar o cérebro num palco de congelação micrótomo sistema deslizante. S: recolher seções de cérebro ordenadas em um prato bem-6. T: montar as seções em corrediças do microscópio. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2. Local da injeção e rotulagem neural típica com alto peso molecular BDA no córtex somatossensorial.
A: local da injeção foi determinada em um atlas estereotáxica. B: representante Fotomicrografia mostrando o local da injeção do BDA (vermelho) no núcleo ventral póstero-medial do tálamo (VPM) sobre o fundo de coloração de Nissl do verde. C: Fotomicrografia de fluorescente BDA etiquetando, incluindo thalamocortical axônios na camada 4 e corticothalamic neurônios nas camadas 5/6. D: Fotomicrografia de rotulagem, BDA convencional com um procedimento padrão de avidina-biotina-peroxidase mostrando o padrão semelhante de rotulagem neural a rotulagem fluorescente do BDA. VPL, núcleo ventral póstero-lateral do tálamo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3. Alta qualidade da rotulagem neural com alto peso molecular BDA sobre o fundo de coloração de Nissl do verde.
A: maior visão de ampliação da anterogradely rotulado mandris axonal (vermelho) em detalhe. B: fotografias de alta resolução mostrando o corpo de célula neuronal retrogradely rotulado, dendrites e espinhas dendríticas (vermelho) em detalhe. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4. A correlação de BDA rotular e interneurônios proteína cálcio-PV-positivas no destino cortical.
A: A distribuição de BDA rotulagem (vermelho) e interneurônios PV-positivo (verde) no córtex somatossensorial. B: vista superior de ampliação da distribuição de axônios BDA-etiquetadas e interneurônios PV-positivo na camada 4. C: fotografia de alta resolução de BDA-rotulado cortical célula piramidal (vermelha) e interneurônios PV-positivo (verdes) em camadas de 5/6. Todas as amostras foram counterstained com DAPI (azul). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Arquivos de vídeo suplementares: Os vídeos suplementares mostram brevemente o procedimento cirúrgico, injeção de BDA para a VPM, perfusão e seccionamento e resultados. No arquivo de vídeo chamado "IV. Resultado de representante", os tridimensional do laser confocal varredura microscopia e análise de resultados do sistema são mostrados. Animação de alta resolução mostra o corpo de célula neuronal retrogradely rotulado, dendrites e espinhas dendríticas (vermelho) em detalhe. Clique aqui para baixar este arquivo.
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Discussion
Selecionar um traçador adequado é um passo fundamental para uma experiência bem sucedida de rastreamento neural. Na família de BDA, alto peso molecular BDA (10.000 peso molecular) foi recomendado preferencialmente ser transportado pela via anterógrada neural em contraste com baixo peso molecular BDA (3.000 peso molecular)2,3 , 11 , 12 , 13. no entanto, muitos estudos também sugeriram que alto peso molecular BDA também pode ser usado potencialmente para rastreamento via retrógrada em paralelo com anterógrada rastreamento1,2,3. Através de vias neurais recíprocas entre VPM e S1, nós fornecemos a evidência adicional para apoiar a ideia de alto peso molecular BDA apropriado para bidirecional do trato rastreamento4. De forma semelhante, neste domínio, alto peso molecular BDA também foi usado no sistema visual e auditivo para examinar as conexões recíprocas entre o corpo geniculado lateral dorsal e córtex visual, bem como o corpo geniculado medial e o córtex auditivo 3 , 14.
No experimento de rastreamento neural, a outra consideração importante é a escolha do método para a rotulagem neural de coloração. Na maioria dos estudos anteriores, tanto o protocolo convencional do ABC e streptavidin fluorescente método de coloração têm sido utilizados para examinar BDA rotulagem e revelou o semelhante padrão morfológico1,2,3 , 4 , 5. aqui, encontramos o streptavidin-AF594 não era apenas uma escolha adequada para a rotulagem de BDA, mas também adequado para combinar com outro marcador neural, tais como fluorescente Nissl e PV-antígeno, proporcionando uma nova oportunidade para observar a correlação da BDA rotulagem e outros elementos neurais. Embora o método de duplo-coloração convencional para BDA e outros marcadores neurais foram também frequentemente realizadas com as duas cores DAB procedimento14,15, não é adequado para o uso de um sistema de análise tridimensional sob uma microscopia confocal do laser. Do ponto de vista técnica, nosso presente estudo fornece uma referência valiosa para comparar distintamente entre BDA rotulagem e outros rótulos.
A técnica de rastreamento do trato neural foi inicialmente usada por revelar conexões neuronais entre o local da injeção e seu destino no sistema nervoso; no entanto, os pesquisadores ainda foram em busca da estrutura ideal de rotulagem neural com um marcador apropriado16,17. Em contraste com outros marcadores, tais como a peroxidase de rábano e subunidade B da toxina da cólera, alto peso molecular BDA produz a qualidade superior de rotulagem neural para quantificar o número de mandris axonal e neuronal dendrites16,17 . Embora a análise quantitativa da BDA rotulagem não foi realizada no presente estudo, a maior qualidade da rotulagem neural com BDA oferece oportunidades mais intimamente, compreender as características morfológicas em mandris axonal etiquetados e neuronal dendrites.
Semelhante à aplicação de muitos outros marcadores, uma série de questões importantes deve ser considerada para este procedimento experimental, incluindo: a concentração e o volume de BDA usado para injeção, site correto de injeção, o diâmetro da ponta da pipeta de vidro, processo cirúrgico, tempo ideal de sobrevivência, perfusão, seção e observação ao microscópio. Está diretamente associado com a qualidade do BDA rotular o que esperávamos. Para além dos passos críticos acima mencionados, existem limitações técnicas que requerem atenção, como a distância do local injetado ao destino marcado, que é dependente da espécie animal modelo usado no experimento3, 5 , 18. em uma palavra, um estudo de rastreamento bem sucedida depende de cada passo em todo o procedimento experimental.
No presente estudo, nós fornecemos um protocolo refinado para demonstrar que o BDA fluorescente método de coloração é uma forma eficaz para a obtenção da alta qualidade da rotulagem neural, que pode ser simultaneamente combinado com outros marcadores neurais usando histoquímica fluorescente ou imunoquímica. Comparando a coloração convencional de BDA com o procedimento DAB, podemos mais facilmente analisar a estrutura fina do BDA rotulagem e distingui-lo do outros elementos neurais no destino traçado sob um laser confocal, microscopia eletrônica de varredura pela presente fluorescente abordagem.
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Disclosures
Os autores não têm nada para divulgar.
Acknowledgments
Este estudo foi financiado pelo Nacional Natural Science Foundation da China (projeto código n º 81373557; n. º 81403327).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Biotinylated dextran amine (BDA) | Molecular Probes | D1956 | 10,000 molecular weight |
| Streptavidin-Alexa Fluor 594 | Molecular Probes | S32356 | Protect from light |
| 500/525 green fluorescent Nissl stain | Molecular Probes | N21480 | Protect from light |
| Brain stereotaxis instrument | Narishige | SR-50 | |
| Freezing microtome | Thermo | Microm International GmbH | |
| Confocal imaging | Olympus | FV1200 | |
| system | |||
| Micro Drill | Saeyang Microtech | Marathon-N7 | |
| Sprague Dawley | Institute of Laboratory Animal Sciences, Chinese Academy of Medical Sciences | SCKX (JUN) 2012-004 | |
| Vectastain ABC Kit | Vector Laboratories | PK-4000 | |
| superfrost plus microscope slides | Thermo | #4951PLUS-001 | 25x75x1mm |
| Photoshop and Illustration | Adobe | CS5 |
References
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