Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Verbetering van de toepassing van ultrahoog moleculair gewicht biotinyleerd Dextran Amine voor Thalamocortical projectie traceren in de Rat

Published: April 12, 2018 doi: 10.3791/55938
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1, 1, 1
1Institute of Acupuncture and Moxibustion, China Academy of Chinese Medical Sciences
* These authors contributed equally

Summary

Hier presenteren we een verfijnde protocol om effectief biotinyleerd dextran amine (BDA) labelen met een fluorescerende vlekken methode via een wederzijdse neurale traject weer te geven. Het is geschikt voor het analyseren van de fijnstructuur van BDA labeling en onderscheiden van andere neurale elementen onder een confocale laser scanning microscoop.

Abstract

Ultrahoog moleculair gewicht biotinyleerd dextran amine (BDA) heeft als een hooggevoelige neuroanatomische tracer gebruikt voor vele decennia. Aangezien de kwaliteit van haar labeling werd beïnvloed door verschillende factoren, hier, bieden wij een verfijnde protocol voor de toepassing van ultrahoog moleculair gewicht BDA voor het bestuderen van de optimale neurale labelen in het centrale zenuwstelsel. Na de stereotactische injectie van BDA in de kern van de ventrale posteromedial (VPM) van de thalamus in de rat door middel van een fijne glazen pipet, was de BDA gekleurd met fluorescerende streptavidine-Alexa (AF) 594 en counterstained met fluorescerende Nissl vlek AF500/525. Op de achtergrond van de groene Nissl kleuring, werd de rode BDA labeling, met inbegrip van de neuronale cel organen en axonale terminals, meer duidelijk aangetoond in de Somatosensorische cortex. Bovendien Dubbel fluorescerend kleuring voor BDA en de calcium-bindende eiwit parvalbumin (PV) werd uitgevoerd om te observeren van de correlatie van BDA labeling en PV-positieve interneuronen in de corticale doelgroep, bieden de mogelijkheid om te studeren van de lokale neurale circuits en hun chemische kenmerken. Dus, deze verfijnde methode is niet alleen geschikt voor het visualiseren van hoge kwaliteit neurale labelen met het hoge molecuulgewicht BDA via wederzijdse zenuwbanen tussen de thalamus en cortex cerebri, maar ook toestaat de gelijktijdige demonstratie van andere neurale markeringen met fluorescerende histochemie of Immunochemie.

Introduction

Ultrahoog moleculair gewicht BDA (10.000 moleculair gewicht), een zeer gevoelige tracer, is gebruikt voor het traceren van de zenuwbanen in het centrale zenuwstelsel voor meer dan 20 jaar1. Hoewel het gebruik van de BDA een gemeenschappelijk neurale tract traceren techniek is, kan de kwaliteit van het BDA labeling in dieren worden beïnvloed door verschillende factoren1,-2,3. Onze recente onderzoek is gebleken dat de optimale structuur van BDA labeling is niet alleen een goede na injectie overlevingstijd is gekoppeld, maar ook gecorreleerd met de kleuring methode4. Tot nu, conventionele avidin-Biotine-peroxidase complex (ABC) en daar-fluoresceïne isothiocyanaat streptavidine-AF594 werden kleuring methoden gebruikt voor het openbaren van de BDA labeling in eerdere studies2,3, 4,5. In vergelijking, kan fluorescerende vlekken voor BDA worden eenvoudig uitgevoerd.

Oog op de uitbreiding van de toepassing van ultrahoog moleculair gewicht BDA, was een geraffineerde protocol van Madrid introduceerde in de huidige studie. Na de injectie van BDA in de VPM van de thalamus in de rat hersenen werd BDA labeling geopenbaard door de gewone methode van het standaard ABC kleuring en dubbele fluorescerende vlekken, die werd uitgevoerd voor het observeren van de correlatie van BDA labeling en basic neurale elementen of interneuronen in de corticale doelstelling met streptavidine-AF594 en fluorescerende Nissl histochemie of PV-Immunochemie, respectievelijk. Door de wederzijdse zenuwbanen tussen VPM en de primaire Somatosensorische cortex (S1)6,7,8, we gericht onze waarneming op BDA labelen in de axonen van het thalamocortical geprojecteerd en corticothalamic geprojecteerde cel Soma in de S1. Door dit proces moeten wij bieden niet alleen een gedetailleerd protocol voor het verkrijgen van de hoge kwaliteit van neurale labelen met ultrahoog moleculair gewicht BDA, maar ook een geraffineerde protocol betreffende de combinatie van fluorescent BDA labeling en andere tl neurale markeringen met histochemie of Immunochemie. Deze aanpak verdient de voorkeur om de lokale neurale circuits en hun chemische kenmerken onder een confocale laser scanning microscopie te studeren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Deze studie werd goedgekeurd door de ethische Commissie op de China Academy van Chinese medische wetenschappen (referentienummer 20160014). Alle procedures zijn uitgevoerd met inachtneming van de nationale instituten van gezondheid gids voor de zorg en het gebruik van proefdieren (nationale academie Press, Washington, D.C., 1996). Vier volwassen mannelijke ratten (gewicht 250-280 g) werden gebruikt in deze studie. Alle dieren zijn gehuisvest in een 12 h licht/donker cyclus met gecontroleerde temperatuur en vochtigheid, en gratis toegang hebben tot voedsel en water. De instrumenten en materialen die worden gebruikt in de huidige studie werden toonde in Figuur 1.  Vóór de operatie, werden alle instrumenten, zoals het stereotaxic frame en glazen pipet, gereinigd met behulp van 70% ethanol.

1. chirurgische Procedures

  1. Het bepalen van de coördinaat interessegebied in VPM met behulp van een stereotaxic atlas9 (figuur 2A).
  2. Bereiden van een 1 µL micro-injectiespuit voorzien van een glazen micropipet (met een tip diameter van ongeveer 10-20 µm) (Figuur 1 d) en test het met vloeibare paraffine.
  3. Anesthetize de ratten met 7% Chloraalhydraat (0,7 mL/100 g) door intraperitoneale injectie.
  4. Zodra diepe verdoving wordt bevestigd met staart knijpen en pedaal terugtrekking reflex, de bovenkant van het hoofd van het dier met een elektrisch scheerapparaat te scheren en scrub de chirurgische site 3 keer met 10% Povidon jodium gevolgd door 70% ethanol respectievelijk.
  5. Plaats de rat in het stereotaxic apparaat door het plaatsen van botte oor bars in de oren van de rat bovenste snijtanden in de mond houder (figuur 1E) plaatsen en vervolgens toepassen ophthalmic zalf op de ogen.
  6. Reinig de hoofdhuid van de chirurgische site weer met behulp van 70% ethanol. Gebruik steriele chirurgische handschoenen en handdoeken om de operatie onder steriele omstandigheden.
  7. Maak een Sagittaal incisie in de huid met een scalpel langs de Sagittaal hechtdraad (figuur 1F).
  8. Schraap de spier en het periosteum uit de buurt van de schedel met behulp van steriele katoen-tipped applicatoren tijdens de operatie te controleren (figuur 1F) bloeden.
  9. Met behulp van vooraf gedefinieerde coördinaten van een atlas (figuur 2A), bepalen de locatie (3,3-mm Bregma punt, 2,6 mm recht aan middellijn) van craniotomy (figuur 1G).
  10. Het uitvoeren van een craniotomy met behulp van een burr boor met een ronde-tip beetje (#106) (Figuur 1 H), en blijven boren om over een 1 mm diepte binnen een paar minuten tot het bereiken van de hersenvliezen (figuur 1I).
  11. De dura mater bloot van de hersenschors over de injectieplaats (figuur 1I) van microforceps met accijnzen.
  12. Vloeibare paraffine in de micro-spuit met 10% BDA (10.000 molecuulgewicht, in gedestilleerd water) oplossing (figuur 1J) wijzigen
  13. Monteren van de spuit in de apparatuur van microinjection en verbinding maken met een micro-pomp (Figuur 1 K).
    Opmerking: De geïnjecteerd volume is afhankelijk van de snelheid van de micro-pomp. Hier werd het aangepast aan 30 nL/min (Figuur 1 L).
  14. Onder een stereomicroscoop, plaatst u een glas micropipet handmatig met de apparatuur van microinjection in de VPM via de corticale oppervlak van de hersenen op de diepte van 5.8 mm (Figuur 1 M).
  15. Druk-injecteren een 100 nL 10% BDA in de VPM over een periode van 3 min (35 nL/min) met een micro-pomp (Figuur 1 L, M).
  16. Na injectie, bewaar de pipet op plaats voor een extra 5 min en vervolgens langzaam te trekken.
  17. Suture de wonde met steriele draad (figuur 1N). Volg uw lokale dierenverzorgers Comité richtlijnen voor pre- en post chirurgische analgesie.
  18. Plaats de rat in een warme herstel ruimte totdat het bewustzijn herwint en weer volledig wordt hersteld.
  19. De herstelde rat terugkeren naar zijn kooi.

2. perfusions en secties

  1. Na een overlevingstijd van typisch 10 dagen, door het dier met een overdosis van 10% urethaan (2 mL/100 g) door intraperitoneale injectie voor het opwekken van euthanasie te injecteren.
  2. Perfuse de experimentele ratten in de kap (figuur 1O).
    1. Zodra de adem stopt, open met schaar en pincet, de borstholte van de rat tot het hart. Invoegen van een intraveneuze katheter in het linkerventrikel naar de aorta, en open vervolgens de juiste oorschelp.
    2. Eerst perfuse met 0,9%-fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) bij fysiologische temperatuur (37 ° C) ongeveer 1-2 minuten totdat het bloed uit het hart verlaten is duidelijk, en ga dan verder met 250-300 mL 4% paraformaldehyde in 0,1 M fosfaatbuffer (PB, pH 7.4).
  3. Na de perfusie, incise van de hoofdhuid en open de schedel en vervolgens uit de rat hersenen ontleden. Na het vaststellen van de ontleed hersenen in 4% paraformaldehyde gedurende 2 uur bij kamertemperatuur (26 ° C), vervolgens de cryoprotect in 30% sacharose in 0,1 M PBS (pH 7.4) voor 3 dagen bij 4 ° C tot de hersenen is ondergedompeld in de oplossing (Figuur 1 P).
  4. Zodra de hersenen wordt ondergedompeld in de oplossing, verdeel de hersenen in drie blokken in de coronale richting op de hersenen matrices (figuur 1T). Het centrale blok bevat de VPM en S1.
  5. Snijd het centrale blok van de hersenen bij 40 µm een bevriezing werkgebied microtoom systeem in de coronale richting glijden. Het verzamelen van deze secties ordelijk in een 6-well schotel met 0,1 M PBS (pH 7.4) (cijfers 1R, S).

3. standaard ABC kleuring

Opmerking: Gratis zwevende secties van elk derde coronale deel van de hersenen werden gebruikt voor het visualiseren van de BDA labelen met standaard ABC procedure10.

  1. Spoel de secties in 0,1 M PBS voor ongeveer 1 minuut.
  2. Incubeer de secties in 1%-oplossing van de ABC in 0,1 M PB (pH 7.4) met 0,3% Triton X-100 gedurende 1 uur bij kamertemperatuur.
  3. Wassen van de secties driemaal in 50 mM Tris buffer (pH 7.4).
  4. Vlek van de secties in een oplossing met 0,02% 3, 3'-diaminobenzidine tetrahydrochloride (DAB) en 0,01% H2O2 in 50 mM Tris buffer voor ongeveer 2-5 minuten bij kamertemperatuur.
  5. Wassen van de secties driemaal in 50 mM Tris buffer (pH 7.4).
  6. Monteer de secties op Microscoop dia's met behulp van standaard histochemische technieken (figuur 1T; Zie Aanvullende Video bestand III, perfusie en secties).
  7. De secties in de lucht bij kamertemperatuur 's nachts droog.
  8. Uitdrogen van de secties kort in een reeks van alcohol (50%, 70%, 95%, 100%) oplossingen. Onderdompelen van de dia's in elke oplossing voor ongeveer 15 s. Laat de dia's te drogen tussen elke stap niet.
  9. Schakel de secties in xyleen driemaal, ongeveer 20 min.
  10. Doe 2 of 3 druppels balsem op de segmenten dan plaatst u coverslips op de secties.

4. dubbele fluorescerende vlekken voor BDA en neurale basiselementen in de hersenschors

Opmerking: In tegenstelling, dubbele fluorescerende vlekken werd uitgevoerd voor de observatie van de correlatie van BDA labeling en neurale basiselementen op de aangrenzende secties met het bovenstaande gebruikt met streptavidine-AF594 en counterstained met fluorescerende Nissl vlek AF500/525.

  1. Spoel de secties in 0,1 M PBS voor ongeveer 1 minuut.
  2. Incubeer de secties in een gemengde oplossing van streptavidine-AF594 (1:500) en AF500/525 groen fluorescent Nissl vlek (1:1, 000) in 0,1 M PBS (pH 7.4) met 0,3% Triton X-100 gedurende 2 uur bij kamertemperatuur.
  3. Wassen van de secties driemaal in 0,1 M PB (pH 7.4).
  4. Monteer de secties op Microscoop dia's met behulp van standaard histochemische technieken. Droog de secties in de lucht gedurende ongeveer 1 uur.
  5. Coverslips toepassen op de fluorescerende secties met 50% glycerine in gedistilleerd water voor observatie.

5. dubbele fluorescerende vlekken voor BDA en interneuronen in de hersenschors

Opmerking: Dubbele fluorescerende vlekken werd uitgevoerd voor het observeren van de correlatie van BDA labeling en interneuronen op de representatieve secties in de corticale doelstelling met streptavidine-AF594 en PV-Immunochemie.

  1. Spoel de representatieve secties in 0,1 M PBS (pH 7.4) voor ongeveer 1 minuut.
  2. Incubeer de secties in een blokkerende oplossing met 3% normale geit serum en 0,3% Triton X-100 in 0,1 M PBS voor 30 min.
  3. Breng de secties in een oplossing van muis monoklonaal anti-PV IgG (1:1, 000) in 0,1 M PBS (pH 7.4) met 1% normale geit serum en 0,3% Triton X-100 voor overnachting bij 4 ° C.
  4. Wassen op de volgende dag, de secties driemaal in 0,1 M PBS (pH 7.4).
  5. Blootstellen van de afdelingen tot een gemengde oplossing van geit anti-mouse-AF488 secundair antilichaam (1:500), streptavidine-AF594 (1:500), en 4', 6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI, 1:40, 000) in 0,1 M PBS (pH 7.4) met 1% normale geit serum en 0,3% Triton X-100 voor 1 h.
  6. Herhaal stap 4.3 tot 4.5.

6. waarneming

  1. Het nemen van beelden van de VPM axonen van de thalamocortical en de corticothalamic neuronen.
    1. Observeren van de fluorescerende monsters met een confocal imaging systeem uitgerust met doelstellingen lenzen (4 x, NB: 0.13; 10 x, NB: 0,40; en 40 x, NB: 0.95). Gebruik excitatie en emissie golflengten van 405 (blauw), 488 (groen) en 559 (rood) nm.
      Opmerking: Hier, de confocal pinhole is 152 µm (4 x, 10 x) en 105 µm (40 x). De ruimtelijke resolutie van Fotolader is 1024 × 1024 pixels (4 x, 10 x) en 640 × 640 pixel (40 x).
    2. Neem twintig beelden in opeenvolgende frames van 2 µm van elke sectie op de dikte van 40 µm (Z-serie).
    3. De beelden te integreren in een enkel beeld in-focus met de confocal beeldverwerking softwaresysteem voor het analyseren van driedimensionale als volgt: set start brandvlak → set einde brandvlak → stap instellen grootte → Kies diepte patroon → afbeelding capture → Z serie.
  2. Helderveld beelden maken door een lichte Microscoop uitgerust met een digitale camera (4 x, NB: 0.13; 10 x, NB: 0,40; en 40 x, NB: 0.95 lenzen). Gebruik een belichtingstijd van 500 ms. gebruik foto-editing software aanpassen van de helderheid en het contrast van afbeeldingen en labels toevoegen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Voortbestaan van 10 dagen post injectie van BDA in de VPM volstond voor de productie van intense neurale etiketten op de bijbehorende corticale gebieden ipsilaterale aan de zijkant van de injectie (Figuur 2). Zowel conventionele ABC en fluorescerende vlekken van procedures voor de BDA bleek de vergelijkbaar patroon van neurale labeling op de S1, inclusief anterogradely label thalamocortical axonen en retrogradely met het label corticothalamic neuronen (figuur 2C, D ).

Voor het anterogradely label axonen, ze werden waargenomen uit laag 2 naar laag 6 met hogere dichtheid op de laag 4 en de typische soort thalamocortical axonen werd waargenomen in het vat gebied (figuur 2C, D). Volgens de hogere vergroting, BDA labeling duidelijk gepresenteerd op de axonale stam, de takken, de zekerheden, en de kleine varicosities (figuur 3A). Onder de axonen van de gelabelde thalamocortical moet worden weergegeven, de retrogradely gelabelde piramidale corticale neuronen hingen en hun cel lichaam verspreid op de lagen 5/6, maar hun apicale dendrites uitgebreid tot laag 2 (figuur 2C, D). Niet alleen de BDA labeling gepresenteerd in de neuronale cel organen en dendrites, maar ook in dendritische spines, verschijnen als Golgi-achtige resolutie (figuur 3B).

Dubbele fluorescerende vlekken was daarnaast ook uitgevoerd voor het observeren van de correlatie van BDA labeling en interneuronen in de corticale doelstelling met streptavidine-AF594 en PV-Immunochemie. Rond de BDA labelen in de corticale doelstelling, werden PV-positieve neuronen gedistribueerd van laag 2 naar laag 6 met hoge concentraties in de layer 4 (figuur 4A). Er waren geen PV-positieve neuronen worden gelabeld met BDA, echter met de BDA-label axonale terminals werden gevonden rond het oppervlak van de PV-positieve cel organen en PV-positieve axonale terminals rond BDA-geëtiketteerden corticale piramidale neuronen (figuur 4B, C ).

Figure 1
Figuur 1. Foto's van belangrijke chirurgische stappen en belangrijkste instrumenten die worden gebruikt in dit experiment.
A: het stereotaxic apparaat. B: de tandheelkundige boor. C: chirurgische instrumenten (scalpel, microforceps en etc.) D: Micro-injectiespuit voorzien van een glazen micropipet. E: plaatsen van het hoofd van de rat in het stereotaxic apparaat. F: schoonmaken van het chirurgische site. G: bevestigen van het Bregma punt. H: boren van de schedel. Ik: bloot van de hersenschors. J: 10% laden BDA in de micro-spuit. K: monteren van de spuit op het apparaat voor micro-injectie. L: pas de snelheid van de micro-pomp. M: de micropipet van het glas in de VPM invoegen. N: Suture van de wond met steriele draad. O: Perfuse van de rat in de kap. P: ontleden uit de hersenen. Q: Verdeel de hersenen in drie blokken met de hersenen-matrices. R: knippen van de hersenen op een bevriezing podium glijden microtoom systeem. S: verzamelen van hersenen secties ordelijk in een 6-well schotel. T: monteren van de secties op Microscoop dia's. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 2
Figuur 2. Injectieplaats en typische neurale labelen met ultrahoog moleculair gewicht BDA in de Somatosensorische cortex.
A: injectieplaats werd bepaald op een stereotaxic atlas. B: vertegenwoordiger gekleurd tonen de injectieplaats van BDA (rood) in het ventrale posteromedial nucleus van de thalamus (VPM) op de achtergrond van de groene Nissl kleuring. C: gekleurd van fluorescerende BDA labeling, met inbegrip van thalamocortical axonen in laag 4 en corticothalamic neuronen in lagen 5/6. D: gekleurd van conventionele BDA labelen met een standaardprocedure van de avidin-Biotine-peroxidase, tonen de vergelijkbaar patroon van neurale labeling aan fluorescerende BDA labeling. VPL, ventrale posterolateral nucleus van de thalamus. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 3
Figuur 3. Hoge kwaliteit van neurale labelen met ultrahoog moleculair gewicht BDA op de achtergrond van de groene Nissl kleuring.
A: hogere vergroting weergave van de anterogradely met het label axonale arbors (rood) in detail. B: hoge resolutie foto's tonen de retrogradely gelabelde neuronale cel lichaam dendrites, en dendritische spines (rood) in detail. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 4
Figuur 4. De correlatie van BDA labeling en calcium-bindend-proteïne PV-positieve interneuronen in de corticale doel.
A: de distributie van BDA labeling (rood) en de PV-positieve interneuronen (groen) in de Somatosensorische cortex. B: hogere vergroting weergave van de verdeling van de BDA-geëtiketteerden axonen en PV-positieve interneuronen in laag 4. C: hoge resolutie foto van BDA-geëtiketteerden corticale piramidale cel (rood) en PV-positieve interneuronen (groen) in lagen 5/6. Alle monsters werden counterstained met DAPI (blauw). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Aanvullende Video bestanden: De aanvullende video's tonen kort de chirurgische ingreep, injectie van BDA in de VPM, perfusie en segmenteren, en resultaten. In de video-bestand met de naam "IV. Vertegenwoordiger resultaat", de drie-dimensionale confocale laser scanning microscopie en analyse systeem resultaten worden weergegeven. Hoge resolutie animatie toont de retrogradely gelabelde neuronale cel lichaam dendrites, en dendritische spines (rood) in detail. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Het selecteren van een juiste tracer is een cruciale stap voor een succesvolle neurale tracering experiment. In de familie van de BDA, ultrahoog moleculair gewicht BDA (10.000 molecuulgewicht) werd aanbevolen bij voorkeur worden vervoerd via het traject anterograde neurale in tegenstelling tot laag molecuulgewicht BDA (3.000 molecuulgewicht)2,3 , 11 , 12 , 13. vele studies stelde echter ook dat ultrahoog moleculair gewicht BDA ook potentieel kan worden gebruikt voor retrograde traject tracering in parallel met anterograde traceren van1,2,3. Door de wederzijdse zenuwbanen tussen VPM en S1 verstrekt we verdere bewijs ter ondersteuning van het idee dat hoge moleculaire gewicht BDA geschikt voor bidirectionele tract tracering4 is. Op een vergelijkbare manier in dit domein ultrahoog moleculair gewicht BDA was ook in het visuele en auditieve systeem gebruikt voor de behandeling van de onderlinge verbindingen tussen het dorsale laterale geniculate lichaam en visuele cortex, evenals de mediale geniculate lichaam en auditieve cortex 3 , 14.

In het experiment van de neurale tracering is de andere belangrijke overweging de keuze van de methode voor het labelen van de neurale kleuring. In de meeste van de eerdere studies, zijn zowel het conventionele ABC-protocol en de fluorescerende streptavidine kleuring methode gebruikt voor de behandeling van de BDA labeling en bleek de soortgelijke morfologische patroon1,2,3 , 4 , 5. hier, we vonden dat daar-AF594 was niet alleen een goede keuze voor het BDA labelen, maar ook geschikt om te combineren met andere neurale marker, zoals TL Nissl en PV-antigeen, het verstrekken van een nieuwe kans voor de observatie van de correlatie van BDA labeling en andere neurale elementen. Hoewel de conventionele dubbel-kleuring methode voor BDA en andere neurale markeringen werden ook vaak uitgevoerd met de twee kleuren DAB procedure14,15, het is niet geschikt voor het gebruik van een systeem van de drie-dimensionale analyse onder een confocale laser scanning microscopie. Vanuit technisch oogpunt levert onze huidige studie een waardevolle verwijzing naar duidelijk vergelijk tussen de BDA labeling en andere labeling.

De neurale tract tracering techniek werd aanvankelijk gebruikt voor het openbaren van neuronale verbindingen tussen de injectieplaats en haar doelstelling in het zenuwstelsel; onderzoekers waren echter nog steeds bij het nastreven van de ideale structuur van neurale labelen met een juiste tracer16,17. In tegenstelling tot andere tracers, zoals mierikswortelperoxidase en subunit B cholera-toxine, produceert ultrahoog moleculair gewicht BDA de hogere kwaliteit van neurale labeling voor het kwantificeren van het aantal axonale arbors en neuronale dendrites16,17 . Hoewel de kwantitatieve analyse van BDA labeling werd niet uitgevoerd in de huidige studie, biedt de hogere kwaliteit van neurale labelen met BDA meer mogelijkheden om nauwkeurig begrijpen de morfologische kenmerken op gelabelde axonale arbors en neuronale dendrites.

Gelijkaardig aan de toepassing van de vele andere verklikstoffen, een aantal belangrijke kwesties moet worden overwogen voor deze experimentele procedure, met inbegrip van: de concentratie en het volume van de BDA gebruikt voor injectie, juiste site van injectie, de tip diameter van de glazen pipet, chirurgische proces, optimale overlevingstijd, perfusie, sectie en observatie onder een microscoop. Het is direct gekoppeld aan de kwaliteit van de BDA labeling wat we hadden verwacht. Naast de bovengenoemde kritische stappen, zijn er technische beperkingen die aandacht vereisen, zoals de afstand van de geïnjecteerde site aan de gelabelde doelgroep, dat afhankelijk van de diersoort van model gebruikt in de experiment3, is 5 , 18. in een woord, een succesvolle tracering studie hangt af van elke stap in het gehele experimentele procedure.

In de huidige studie bieden we een verfijnde protocol om aan te tonen dat de fluorescerende BDA kleuring methode een effectieve manier is voor het verkrijgen van de hoge kwaliteit van neurale labeling, die kan gelijktijdig worden gecombineerd met andere neurale markeringen met behulp van fluorescerende histochemie of Immunochemie. Vergelijken van de conventionele BDA kleuring met de DAB-procedure, kunnen we gemakkelijker analyseren van de fijnstructuur van BDA labeling en onderscheiden van andere neurale elementen in het doel van de tracering onder een confocale laser scanning microscopie door de huidige TL aanpak.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgments

Deze studie werd gefinancierd door het National Natural Science Foundation of China (Project Code no. 81373557; nr. 81403327).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Biotinylated dextran amine (BDA) Molecular Probes D1956 10,000 molecular weight
Streptavidin-Alexa Fluor 594 Molecular Probes S32356 Protect from light
500/525 green fluorescent Nissl stain Molecular Probes N21480 Protect from light
Brain stereotaxis instrument Narishige SR-50
Freezing microtome Thermo Microm International GmbH
Confocal imaging Olympus FV1200
system
Micro Drill Saeyang Microtech Marathon-N7
Sprague Dawley Institute of Laboratory Animal Sciences, Chinese Academy of Medical Sciences SCKX (JUN) 2012-004
Vectastain ABC Kit Vector Laboratories PK-4000
superfrost plus microscope slides Thermo #4951PLUS-001 25x75x1mm
Photoshop and Illustration Adobe CS5

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Veenman, C. L., Reiner, A., Honig, M. G. Biotinylated dextran amine as an anterograde tracer for single- and double-labeling studies. J Neurosci Methods. 41, 239-254 (1992).
  2. Reiner, A., Veenman, C. L., Medina, L., Jiao, Y., Del Mar, N., Honig, M. G. Pathway tracing using biotinylated dextran amines. J Neurosci Methods. 103, 23-37 (2000).
  3. Ling, C., Hendrickson, M. L., Kalil, R. E. Resolving the detailed structure of cortical and thalamic neurons in the adult rat brain with refined biotinylated dextran amine labeling. PLoS One. 7, e45886 (2012).
  4. Zhang, W. J., et al. Anterograde and retrograde tracing with high molecular weight biotinylated dextran amine through thalamocortical and corticothalamic pathways. Microsc Res Tech. 80, 260-266 (2017).
  5. Han, X., et al. Biotinylated dextran amine anterograde tracing of the canine corticospinal tract. Neural Regen Res. 7, 805-809 (2012).
  6. Armstrong-James, M., Callahan, C. A. Thalamo-cortical processing of vibrissal information in the rat. II. spatiotemporal convergence in the thalamic ventroposterior medial nucleus (VPm) and its relevance to generation of receptive fields of S1 cortical "barrel" neurones. J Comp Neurol. 303, 211-224 (1991).
  7. Armstrong-James, M., Callahan, C. A., Friedman, M. A. Thalamo-cortical processing of vibrissal information in the rat. I. Intracortical origins of surround but not centre-receptive fields of layer IV neurones in the rat S1 barrel field cortex. J Comp Neurol. 303, 193-210 (1991).
  8. Agmon, A., Yang, L. T., Jones, E. G., O'Dowd, D. K. Topological precision in the thalamic projection to neonatal mouse barrel cortex. J Neurosci. 15, 549-561 (1995).
  9. Paxinos, G., Watson, C. The rat brain in stereotaxic coordinates. , Academic Press. San Diego. (1998).
  10. Davidoff, M., Schulze, W. Standard avidin-biotin-peroxidase complex (ABC) staining combination of the peroxidase anti-peroxidase (PAP)-and avidin-biotin-peroxidase complex (ABC)-techniques: an amplification alternative in immunocytochemical staining. Histochemistry. 93, 531-536 (1990).
  11. Fritzsch, B. Fast axonal diffusion of 3000 molecular weight dextran amines. J Neurosci Methods. 50, 95-103 (1993).
  12. Kaneko, T., Saeki, K., Lee, T., Mizuno, N. Improved retrograde axonal transport and subsequent visualization of tetramethylrhodamine (TMR) -dextran amine by means of an acidic injection vehicle and antibodies against TMR. J Neurosci Methods. 65, 157-165 (1996).
  13. Medina, L., Reiner, A. The efferent projections of the dorsal and ventral pallidal parts of the pigeon basal ganglia, studied with biotinylated dextran amine. Neuroscience. 81, 773-802 (1997).
  14. DE Venecia, R. K., Smelser, C. B., McMullen, N. T. Parvalbumin is expressed in a reciprocal circuit linking the medial geniculate body and auditory neocortex in the rabbit. J Comp Neurol. 400, 349-362 (1998).
  15. Ojima, H., Takayanagi, M. Use of two anterograde axon tracers to label distinct cortical neuronal populations located in close proximity. J Neurosci Methods. 104, 177-182 (2001).
  16. Kobbert, C., Apps, R., Bechmann, I., Lanciego, J. L., Mey, J., Thanos, S. Current concepts in neuroanatomical tracing. Prog Neurobiol. 62, 327-351 (2000).
  17. Vercelli, A., Repici, M., Garbossa, D., Grimaldi, A. Recent techniques for tracing pathways in the central nervous system of developing and adult mammals. Brain Res Bull. 51, 11-28 (2000).
  18. Liao, C. C., Reed, J. L., Kaas, J. H., Qi, H. X. Intracortical connections are altered after long-standing deprivation of dorsal column inputs in the hand region of area 3b in squirrel monkeys. J Comp Neurol. 524, 1494-1526 (2016).

Tags

Neurowetenschappen kwestie 134 biotinyleerd dextran amine tracer neurale labeling axon neuron Somatosensorische cortex
Verbetering van de toepassing van ultrahoog moleculair gewicht biotinyleerd Dextran Amine voor Thalamocortical projectie traceren in de Rat
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Xu, D., Cui, J., Wang, J., Zhang,… More

Xu, D., Cui, J., Wang, J., Zhang, Z., She, C., Bai, W. Improving the Application of High Molecular Weight Biotinylated Dextran Amine for Thalamocortical Projection Tracing in the Rat. J. Vis. Exp. (134), e55938, doi:10.3791/55938 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter