Summary
To biotinyleringsbaserede metoder, der er designet til bestemmelse af celleoverfladeekspression og endocytisk hastighed af proteiner udtrykt i plasmamembranen, er præsenteret i denne rapport.
Abstract
Cell-overfladeproteiner medierer en bred vifte af funktioner. I mange tilfælde reguleres deres aktivitet ved hjælp af endocytiske processer, der modulerer deres niveauer ved plasmamembranen. Her præsenterer vi detaljerede protokoller for 2 metoder, der letter undersøgelsen af sådanne processer, som begge er baseret på biotinylering af celleoverfladeproteiner. Den første er designet til at tillade den semikvantitative bestemmelse af de relative niveauer af et bestemt protein ved celleoverfladen. Heri mærkes lysinresterne af plasmamembranproteinerne fra celler først med en biotindel. Når cellerne lyseres, kan disse proteiner derefter præcipiteres ved anvendelse af agarose-immobiliseret streptavidin ved at udnytte den naturlige affinitet af sidstnævnte til biotin. Proteinerne isoleret på en sådan måde kan derefter analyseres via en standard western blotting tilgang. Den anden fremgangsmåde tilvejebringer et middel til at bestemme den endocytiske hastighed af et partikelAr celleoverflade mål over en periode. Celleoverfladeproteiner modificeres først med et biotinderivat indeholdende en spaltbar disulfidbinding. Cellerne forskydes derefter tilbage til normale dyrkningsbetingelser, hvilket forårsager den endocytiske optagelse af en andel af biotinylerede proteiner. Dernæst reduceres disulfidbindingerne af ikke-internaliserede biotingrupper under anvendelse af det membran-impermeable reduktionsmiddel glutathion. Via denne fremgangsmåde kan endocyterede proteiner således isoleres og kvantificeres med en høj grad af specificitet.
Introduction
Proteiner på celleoverfladen spiller en række roller, der er centrale for at opretholde cellefunktionen. I mange tilfælde er deres aktivitet afhængig af eller moduleret af endocytiske processer, som enten midlertidigt sekvestrerer dem i intracellulære steder eller leder dem til nedbrydende veje 1 , 2 , 3 , 4 , 5 . Her fremhæver vi 2 biotinyleringsbaserede tilgange, der er designet til at give brugeren mulighed for specifikt at tagge og isolere proteiner udtrykt ved plasmamembranen og de nyligt internaliserede. Via disse metoder kan celleoverfladeekspression og endocytisk hastighed for ethvert protein af interesse, kvantificeres, således at en klarere vurdering af dens regulering kan opnås.
Bestemmelse af relativ celleoverfladeproteinekspression ved biotinylering
Biotin eller vitamin B7, tidligere kendt som vitamin H6, er et lille vandopløseligt molekyle, som kan anvendes til kemisk modifikation af reaktive amin, sulfhydryl og carboxylgrupper af biologiske molekyler. Den nuværende afgrøde af biotinyleringsreagenser til celleoverflade består primært af membran-impermeant sulfonerede N-hydroxysuccinimid- (sulfo-NHS) estere af biotin eller dets derivater, der er udformet til at reagere med aminerne, der er til stede på sidekæderne af lysinrester af proteiner udtrykt i Celleoverfladen, når disse bliver deprotoneret under basiske betingelser, hvilket resulterer i, at sidstnævnte danner en amidbinding med biotindelen 7 . Således modificerede celleoverfladeproteiner kan derefter isoleres ved anvendelse af avidin, et 66-69 kDa tetramert protein, som har stor affinitet for biotin, bindende til sidstnævnte med en dissociationskonstant på ca. 10-15 , der markerer den som en af de Stærkeste ikke-kovalente interaktioner kendt 8 , 9 .
En række alternative metoder til kvantificering af proteinekspression ved celleoverfladen er blevet anvendt i tidligere undersøgelser. Mærkningen af upermeabiliserede celler, der anvender fluorescensmærket antistoffer, der er specifikke for proteinet af interesse, efterfulgt af visualisering via fluorescensmikroskopi, er for eksempel en almindeligt anvendt tilgang, men er stærkt afhængig af tilgængeligheden af antistoffer, som kan binde til ekstracellulære epitoper. Mere nylig har metoder med anvendelse af kimære proteiner, der bærer pH-følsomme fluoroforer, der reagerer på at blive udsat for sure medier, også været anvendt med succes 10 . Imidlertid involverer sådanne analyser sædvanligvis den eksogene ekspression af disse konstruktioner i cellelinjer, hvori proteinet af interesse ikke er nativt fundet. Disse tilgange er dog i stand til at tilvejebringe værdifuld information vedrørende den subcellulære lokalisering og eksocytiske rejseplan forMålprotein og bør derfor anvendes sammen med de biotinyleringsbaserede fremgangsmåder, der beskrives her, hvis værktøjerne er tilgængelige.
I et typisk biotinyleringsassay vaskes cellerne først grundigt i 4 ° C PBS. Dette fjerner eventuelle spor af serumproteiner introduceret af dyrkningsmediet og sikrer således, at disse ikke vil forbruge overskydende mængder biotin i det næste trin. Endnu vigtigere forårsager reduktionen i temperaturen endocytose at decelerere betydeligt. Biotinyleringsreagenset tilsættes derefter. Derefter vaskes cellerne igen og inkuberes derefter med en quenchingsbuffer indeholdende enten glycin eller NH4CI, hvis formål er at inaktivere alle resterende spor af uomsat biotin. Cellerne lyseres derefter, hvorefter agarose-immobiliseret streptavidin tilsættes for at udfælde de biotinylerede proteiner. Analyse udføres almindeligvis via western blotting, hvilket tillader den relative celleoverfladeekspression af forskellige prOteins at blive kvantificeret.
På grund af grundlaget for dette assay er det kun egnet til anvendelse med proteiner, som har dele eksponeret for det ekstracellulære miljø. Multipass transmembrane proteiner, som sandsynligvis besidder et antal reaktive lysiner inden for deres sløjfeområder, er mest acceptable til denne metode, medens enkeltpasproteiner tendens til at være mindre modtagelige for at være biotinyleret. Selv i disse tilfælde forbliver der en mulighed for, at konformationsændringer eller intermolekylære interaktioner kan indekalde visse reaktive steder, hvilket resulterer i et lavere end forventet biotinyleringsudbytte.
Bestemmelse af internaliseringshastigheden af celleoverfladeproteiner ved biotinylering
Principperne for dette assay svarer stort set til cellerne af biotinylering af celleoverfladen, med en række undtagelser, hvoraf det vigtigste er brugen af reversible biotinyleringsreagenser. Biotingrupperne (af disse) har disuLfide bindinger inden for deres strukturer, der er modtagelige for reduktionsmidler; Dette udnyttes for at sikre, at kun celleoverfladeproteiner taget i intracellulære steder i assayperioden vil blive efterladt biotinyleret. Et assay finder generelt sted på følgende måde. Cellerne vaskes først og biotinyleres med kolde reagenser, hvorefter cellekulturmedium ved 37 ° C genindføres, og cellerne returneres til inkubatoren; Dette medfører, at de mærkede celleoverfladeproteiner undergår endocytose. Reduktionsmidlet glutathion - som ikke kan trænge ind i membranen - tilsættes derefter for at bryde disulfidbindingerne af biotindelene bundet til proteiner, som forbliver på celleoverfladen. Endelig omsættes de brækkede disulfidbindinger med iodacetamid, forbruges de labile thiolgrupper og forhindrer bindingerne i at reformere. Som tidligere lyseres cellerne derefter, og de mærkede proteiner udfældes under anvendelse af streptavidin-agarose.
Begrænsningerne diskUssed i den foregående sektion gælder også her på grund af lighederne deles mellem metoderne. Derudover er det værd at huske på, at temperaturforskydningerne involveret i dette assay udelukker den nøjagtige bestemmelse af, hvor meget protein der endocytteres for hvert tidsforløb, især i tilfælde af hurtigt internaliserede eller hurtigt genvindingsproteiner. Assayet tilvejebringer derfor kun en semikvantant estimering af endocytiske hastigheder. Total intern refleksionsfluorescensmikroskopi kan anvendes til at spore optagelsen af hver indlæst vesikel og give en mere præcis måling af kinetikken af endocytose. Det kan derfor tilvejebringe et meget nyttigt komplement til dette assay, idet man antager, at en fluorescensmærket chimær konstruktion af proteinet af interesse er tilgængelig 11 .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Bestemmelse af relativ celleoverfladeproteinekspression i astrocytter ved biotinylering
BEMÆRK: Her illustrerer vi anvendelsen af denne biotinyleringsteknik til undersøgelsen af virkningerne af det ekstracellulære matrixmolekyle laminin på lokalisering af celleoverfladen af den vandpermeable kanal aquaporin-4 (AQP4). Specialiserede materialer, der kræves til dette assay, indbefatter sulfo-NHS-LC-biotin og streptavidin-agaroseharpiks (se tabel over materialer ).
- Ved anvendelse af metoden beskrevet i Noel et al. 12 , forberede kulturer af kortikale astrocytter ca. 2 uger før analysen og dyrk dem i 75 cm 2 udluftede dyrkningskolber. Når astrocytter er 80 - 90% sammenflydende, løsne dem fra dyrkningsoverfladen ved hjælp af 0,05% trypsin og derefter passere dem 1: 3.
- Ved 48 timer forud for analysen, når cellerne igen er 80-90% sammenflydende, passerer astrocytter 1: 3 (regner med cHænge i kulturformatet) på 60 mm cellekulturskåle, så de er> 70% sammenfaldende den dag, forsøget skal finde sted. Sørg for, at cellerne fordeles jævnt mellem retterne.
- Ved 16 timer forud for assay pipetteres laminat i dyrkningsmedium til en slutkoncentration på 24 nM og inkuberes ved 37 ° C.
- Umiddelbart inden analysen udarbejdes følgende og derefter på is eller i køleskab: CM-PBS (100 mg / L MgCl2 · 6H20 og 100 mg / L CaCl2 i 1X PBS, pH 7,4), biotinpuffer (0,5 Mg / ml sulfo-NHS-LC-biotin i CM-PBS), quenchingsbuffer (50 mM NH4CI i CM-PBS), lysisbuffer (25 mM Tris, pH 7,4, 25 mM glycin, 150 mM NaCl og 5 mM EDTA, 1% triton X-100, 1X proteaseinhibitor cocktail), 3X loading buffer (150 mM Tris, pH 6,8, 6% SDS, 30% glycerol, 300 mM DTT og 0,01% bromphenolblåt) og vaskebuffer (10 mM Tris (pH 7,4), 1,5 mM EDTA, 150 mM NaCl, 1% Triton X-100, 1X proteaseinhibitor cocktail).
- RemOve retter, der holder astrocytkulturerne fra inkubatoren og kasserer mediet.
- Vask cellerne tre gange med 4 ml afkølet CM-PBS, og læg skålene på knust is.
- Pipetter 2 ml biotinpuffer i hver brønd, og skub forsigtigt retterne frem og tilbage et par gange for at sikre fuldstændig dækning. Forlad på is i 30 min.
- Fjern biotinpufferen ved hjælp af en aspirator, og erstat med 4 ml quenching buffer. Forlad på is i 10 minutter.
- Aspirer quenchingspufferen og erstat med et tilsvarende volumen af det samme. Igen, lad være på is i 10 minutter.
- Kassér quenchingsbufferen og vaske cellerne tre gange med 4 ml afkølet CM-PBS.
- Skrab cellerne i 1 ml afkølet CM-PBS ved hjælp af en celle løfter, og overfør suspensionen til mikrocentrifugerør.
- Pelletceller ved centrifugering ved 100 xg i 3 min. Kassér supernatanten og suspender cellerne igen i 500 μl lysisbuffer.
- Forlad prøver på is i 30 minutter, vortex hver 5 min eller plAce dem på en end-end-end rotator ved 4 ° C.
- Centrifuge lysatet ved 14.000 xg i 10 minutter ved 4 ° C for at pille eventuelle vaskemiddeluopløselige materialer. Overfør supernatanten til et nyt mikrocentrifugerør.
- Gem 50 μL af dette lysat og tilsæt puffer til det. Derefter denatureres ved opvarmning ved 95 ° C i et tørt bad; Dette er "input" fraktionen, der indeholder både biotinylerede celleoverfladeproteiner, såvel som ikke-biotinylerede cytosoliske proteiner.
- Forøg åbningen af en pipettespids ved at afskære ca. 0,5 cm materiale fra sin ende ved hjælp af et par skarpe saks. Ved anvendelse af denne pipettespids overføres 75 μl streptavidin-agarosekugler (normalt opbevaret ved 4 ° C) til lysatet og inkuberes ved 4 ° C i 3 timer på ryster / vippe.
- Da streptavidin-agarose ofte sælges som en opslæmning indeholdende 50% perler i volumen, suspenderet i en antimikrobiel opløsning, tritureres opslæmningen for at sikre, at perlerneSuspenderes jævnt og pipetter derefter 150 μl suspensionen i hver prøve.
- Pellet streptavidin-agarose perler ved centrifugering ved 1500 xg i 30 s ved 4 ° C.
- Gem 50 μL af supernatanten (tilsæt loading buffer og denaturere den ved 95 ° C i et vandbad eller en varmeblok); Dette repræsenterer den "intracellulære" fraktion og består primært af ikke-biotinylerede cytosoliske proteiner.
- Resuspender de pelleterede perler i 1 ml vaskebuffer og stiv dette i 3 minutter ved 4 ° C. Pelletperler (som i trin 1.16) og kassere supernatanten. Gentag denne proces 4x for at minimere den uspecifikke binding af nonbiotinylerede cytosoliske proteiner.
- Pellets perlerne ved centrifugering (1500 xg i 30 s ved 4 ° C) og kassere den overliggende vaskebuffer. Tilsæt 50 μl 1X ladningsbuffer (fortyndet under anvendelse af lysisbuffer). Frigiv biotin og streptavidin fra perler ved denaturering dette ved 95 ° C; Denne fraktion shoUld indeholder kun biotinylerede celleoverfladeproteiner ("celleoverflade" fraktion).
- Separat input, celleoverflade og intracellulære fraktioner ved SDS-PAGE 13 og analysere ved western blotting 14 .
BEMÆRK: Mens vi brugte en 4 - 20% præparatgradientgel i vores eksperimenter, bør en 12-14% separerende gel med et 4% stablingslag (hver indeholdende 0,1% SDS) være tilstrækkeligt for proteiner af interesse i dette studie. En molekylvægtstandard af det passende størrelsesområde bør også anvendes. Bemærk, at der undertiden kan være en observerbar opskiftning i de tilsyneladende molekylmasser af biotinylerede proteiner.
- Separat input, celleoverflade og intracellulære fraktioner ved SDS-PAGE 13 og analysere ved western blotting 14 .
2. Bestemmelse af internaliseringshastighed for celleoverfladeproteiner i astrocytter ved biotinylering
BEMÆRK: I det følgende beskriver vi et typisk pulse-chase biotinyleringseksperiment, der anvendes i dette tilfælde til at spore endocytosen af AQP4 i astrocytter. Det herMetoden er baseret på den, der anvendes af Madrid et al. 15 . Specialiserede materialer kræves indbefattet sulfo-NHS-SS-biotin, streptavidin-agaroseharpiks, reduceret glutathion og iodacetamid (se Materialetabellen ).
- Forbered kulturer af muskortiske astrocytter i 60 mm skåle ved hjælp af metoderne beskrevet i foregående afsnit. Sørg for, at cellerne er ca. 70% konfluente på analysedagen, og at hver skål indeholder et ækvivalent antal celler.
- Umiddelbart inden analysen forberedes følgende og anbringes på is eller køleskab: CM-PBS (100 mg / L MgCl2 · 6H20 og 100 mg / L CaCl2 i 1X PBS, pH7,4), biotinpuffer (0,5 Mg / ml sulfo-NHS-SS-biotin i CM-PBS), reducerende buffer (50 mM reduceret glutathion, 75 mM NaCl og 75 mM NaOH), quenchingsbuffer (50 mM iodacetamid, 1% BSA i CM-PBS) Lysisbuffer (25 mM Tris, pH 7,4, 25 mM glycin, 150 mM NaCI og 5 mM EDTA, 1% triton X-100, 1X-proteaseinhibitorcocktail), 3 x påfyldningsbuffer (150 mM Tris, pH 6,8, 6% SDS, 30% glycerol, 300 mM DTT og 0,01% bromphenolblåt) og vaskebuffer (10 mM Tris, pH 7,4, 1,5 mM EDTA, 150 mM NaCI, 1% triton X-100, 1X proteaseinhibitor cocktail).
- Forbered friskcellekulturmedium (DMEM suppleret med 10% føtalt bovint serum (FBS), 1% penicillin / streptomycin og 1% L-glutamin) og anbring det i et 37 ° C vandbad.
- Fjern astrocytkulturer fra inkubatoren, og aspirer mediet under anvendelse af en aspirator.
- Vask cellerne tre gange med 4 ml afkølet CM-PBS, og læg skålene på knust is.
- Pipetter 3 ml biotinbuffer i hver skål, vippes op og tilbage et par gange for at sikre, at bufferen er fordelt, og lad den stå på is i 30 minutter.
- Aspirer biotinpuffer, og erstat det med 5 ml varmt medium. Inkubér en kulturskål ved 37 ° C i 15 minutter og en anden skål ved samme temperatur i 30 minutter. Forlad en anden skål ved 46; C som 0 min prøve.
- Ved slutningen af inkubationsperioden kasseres mediet og vaskes celler tre gange med 4 ml afkølet CM-PBS. Pipetter 6 ml reducerende buffer over celler og lad den være på is i 15 minutter.
- Fjern reducerende buffer og erstatt derefter med 6 ml frisk reducerende buffer. Placer på is i yderligere 15 minutter.
- Fjern reduktionsopløsning og erstat med 6 ml quenchingsbuffer. Forlad på is i 15 min.
- Gentag quenching trin igen.
- Kassér slukningspuffer og vask celler tre gange med 4 ml kølede PBS.
- Skrab cellerne i 1 ml afkølet PBS ved hjælp af en celleoptager og overfør suspensionen i et mikrocentrifugerør.
- Pelletceller ved centrifugering ved 100 xg i 3 min. Kassér supernatanten og resuspender celler i 500 μl lysis buffer.
- Lad dette stå på is i 30 minutter og hvirvel hver 5 min. Alternativt anbringes prøverne på en roterende ende over ende ved 4 ° C i denne varighed.
- Centrifuger lySættes ved 14.000 xg i 10 minutter ved 4 ° C for at pille det detergentuopløselige materialer og derefter overføre supernatant til et nyt mikrocentrifugerør. Gem 50 μL af dette lysat, tilsæt puffer til det og denaturer ved 95 ° C i et tørt bad; Dette er "input" fraktionen, der indeholder både biotinylerede endocytoterede proteiner såvel som nonbiotinylerede proteiner.
- Tilsæt 150 μL streptavidin-agarosopslæmningen til lysatet ved hjælp af en snitpipetip, og inkuber ved 4 ° C i 3 timer på shaker / rocker. Se 1.15 for yderligere oplysninger om dette trin.
- Pellet streptavidin-agarosekugler ved centrifugering ved 1500 xg i 30 s ved 4 ° C.
- Resuspender kugler i 1 ml vaskebuffer og sten i 3 minutter ved 4 ° C. Pelletperler (som i trin 2.18) og kassere supernatanten. Gentag denne proces 4x for at minimere den uspecifikke binding af nonbiotinylerede cytosoliske proteiner.
- Pelletsperler ved centrifugering ved 1500 xg i 30 s ved 4 ° C og kasseresVaskende buffer. Tilsæt 50 μl 1X påfyldningsbuffer (fortyndet under anvendelse af lysisbuffer). Frigiv biotin og streptavidin fra perler ved denaturering ved 95 ° C; Denne fraktion bør kun indeholde internaliserede celleoverfladeproteiner ("endocytosed" fraktion).
- Separat input, celleoverflade og ubundne fraktioner ved SDS-SIDE 13 og analysere ved western blotting 14 .
BEMÆRK: Mens vi brugte en 4 - 20% præparatgradientgel i vores eksperimenter, bør en 12-14% separerende gel med et 4% stablingslag (hver indeholdende 0,1% SDS) være tilstrækkeligt for proteiner af interesse i dette studie. En molekylvægtstandard af det passende størrelsesområde bør også anvendes. Bemærk, at der undertiden kan være en observerbar opskiftning i de tilsyneladende molekylmasser af biotinylerede proteiner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Anvendelse af celleoverfladebiotinylering til vurdering af plasmamembranekspression af AQP4 i astrocytter
Lamininbehandlede astrocytkulturer og ubehandlede kontrolceller blev underkastet celleoverfladebiotinylering under anvendelse af de beskrevne fremgangsmåder. Biotinylerede proteiner blev udfældet med agarosekonjugeret streptavidin og derefter separeret via SDS-PAGE. Celleoverfladefraktioner blev probet for AQP4 og β-dystroglycan (β-DG) som en celleoverfladestyringskontrol, medens indgangs- og intracellulære fraktioner blev blottet for AQP4 og β-actin ( Figur 1A) som en belastningskontrol. Båndintensiteter for celleoverfladefraktionen blev kvantificeret via densitometri, og AQP4-niveauer for hvert sæt celler blev først normaliseret mod p-DG-værdier, og disse forhold blev derefter normaliseret over for de for kontrolcellerne. Histogrammet ( Figur 1 B ) repræsenterer middelværdierne ± SEM for tre uafhængige eksperimenter. Lamininbehandling medfører i gennemsnit en nær 2X stigning i AQP4 udtrykt ved celleoverfladen.
Undersøgelse af den endocytiske hastighed af AQP4 ved anvendelse af biotinylering
AQP4 endocytose i astrocytter blev sporet over en 30 min periode. Kort sagt blev en spaltbar biotinanalog først anvendt til at mærke overfladeproteiner i 3 retter af astrocytter. Cellerne blev forskudt til 37 ° C i henholdsvis 0, 15 og 30 minutter, hvorunder de mærkede proteiner blev internaliseret. Mærkning, som forblev på overfladen, blev derefter fjernet under anvendelse af et reduktionsmiddel, og endocytterede proteiner blev udfældet med agarosekonjugeret streptavidin. Efter adskillelse via SDS-PAGE blev disse derefter probet for AQP4 ( Figur 2A). AQP4 niveauer blev kvantificeret ved anvendelse af densitometri og de værdier, der svarer til15 og 30 min tidspunkter blev normaliseret til dem for 0 min prøven. Histogrammet ( Figur 2B ) repræsenterer de gennemsnitlige værdier ± SEM for fire sådanne forsøg.
Figur 1 . AQP4-ekspression ved cellens overflade i nærvær af laminat. (A) Celleoverfladen, intracellulær og total (Input) fraktioner fra ubehandlede astrocytter (-LN) og astrocytter behandlet med 24 nM laminin-111 (+ LN) blev probet for AQP4 og β-DG. (B) Histogram som illustrerer forskellene i celleoverfladens niveauer af AQP4 ubehandlede og lamininbehandlede astrocytter normaliseret over β-DG-niveauer. Værdier repræsenterer normaliserede gennemsnitlige pixelintensiteter ± SEM, udtrykt i forhold til værdierne for kontrolcellerne. Stjernen angiver en statisticaEn signifikant stigning i AQP4, som bestemt af en to-tailed Students t- test (n = 3, * p = 0,033). Denne figur er blevet modificeret fra Tham et al. 16 Klik venligst her for at se en større version af denne figur.
Figur 2 . AQP4- internalisering i astrocytter . (A) Proteiner internaliseret af astrocytkulturer ved 0, 15 og 30 minutter blev probet for AQP4. (B) Histogram, der opsummerer internaliseringshastighederne for AQP4 for 4 uafhængige forsøg, normaliseret mod værdier for 0 min tidspunkt. Asterisken indikerer en statistisk signifikant stigning i mængden af AQP4 endocytosed mellem 15 og 30 minutter som bestemt ved en tohaleEd Student's t- test (n = 3, * p = 0,017). (C) Når glutathion anvendes til at bryde disulfidbindingen i den spaltelige biotinanalog, reduceres bidraget fra celleoverflade AQP4 til den biotinylerede fraktion kraftigt, hvilket resulterer i en klar forskel mellem 0 og 15 min prøverne (C, øverst til venstre ) . Når dette trin udelades, gør signalet, der stammer fra celleoverfladens pool, ændringen mellem de 2 tidspunkter, der ikke kan detekteres (C, øverst til højre) . Denne figur er blevet modificeret fra Tham et al. 16 Klik venligst her for at se en større version af denne figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Ændringer:
Da disse metoder blev designet til brug sammen med adhærente celler, har vi specificeret anvendelsen af PBS indeholdende 100 mg / l MgCl2 · 6H20 og
100 mg / l CaCl2 (CM-PBS) til vaskningstrinene og som basis for visse buffere for at sikre, at cellerne forbliver fastgjort til kulturoverfladen, og at cellecelleforbindelser ikke forstyrres. Protokollerne kan dog også anvendes til ikke-adhærente celletyper, hvis cellerne pelleteres ind mellem hvert trin af proceduren. I disse tilfælde kan CM-PBS erstattes med PBS.
Derudover er det vigtigt at bemærke, at hver af de her nævnte betingelser er specifikke for denne protokol og kun bør betragtes som grove retningslinjer, hvis metoderne skal anvendes til andre applikationer. Især bør man uafhængigt verificere, at detergentekstraktionsproceduren er passende for denneR-celletype, og at centrifugeringsindstillingerne er egnede til celletypen, og at streptavidin-agarose-perlerne anvendes.
Endelig, hvis der er bekymringer med hensyn til ikke-specifik binding og / eller overdreven baggrund, kan man erstatte streptavidin med de forskellige andre avidinformer, der for øjeblikket er tilgængelige på markedet. Deglycosyleret avidin har for eksempel signifikant lavere affinitet for lectiner og for negativt ladede molekyler, såsom DNA.
Fejlfinding og kontrol:
Mens de procedurer, der er gennemgået i denne rapport, er ret ligetil, skal man være opmærksom på en række kritiske problemer, der potentielt kan påvirke resultatet af eksperimentet. For det første, medens begge analyser er stærkt afhængige af de membran-impermeante karakter af de sulfaterede biotinyleringsreagenser, kan visse betingelser medføre, at plasmamembranen af cellerne bliver forstyrret og derved resultere i visse intracellulære proteinerIns er biotinyleret. For at kontrollere for denne mulighed foreslås det, at biotinylerede fraktioner undersøges for mål, der vides at ikke udtrykkes ved plasmamembranen, såsom β-actin.
Man bør være omhyggelig med at overholde de rette opbevaringsforhold for biotinyleringsreagenserne (typisk 4 eller -20 ° C, med en form for udtørring), da disse kan mislykkes ellers på grund af deres meget følsomme karakter. Ikke desto mindre er det god praksis at sonde indgang, biotinylerede og nonbiotinylerede fraktioner med streptavidin-HRP for at fastslå, at biotinylering faktisk er indtruffet, og at de biotinylerede proteiner er blevet effektivt udfældet (hvilket vil fremgå af fraværet af et signal i Ikke-biotinyleret fraktion). Dette bør gøre det muligt at fjerne muligheden for defekte reagenser.
Reduktion af disulfidbinding er et afgørende skridt i den endocytiske biotinyleringsprocedure, som det sikrerAt kun internaliserede proteiner vil blive isoleret i den biotinylerede fraktion. Inkorporering af kontroller, hvor det reducerende reagens udelades ( figur 1 C ) gør det muligt for en at få et indtryk af effektiviteten af behandlingen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen interessekonflikt.
Acknowledgments
Dette projekt blev støttet af det canadiske institut for sundhedsforskning PG # 20R47867.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ammonium chloride (NH4Cl) | Fisher Scientific | A661-500 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A9647-50 | |
| Bromophenol blue | Bio-Rad | #1610404 | |
| cOmplete protease inhibitor cocktail | Sigma-Aldrich | 11697498001 | |
| Disodium Ethylenediaminetetraacetate dihydrate (EDTA) | Bio-Rad | #1610729 | |
| Dithiothreitol (DTT) | Bio-Rad | #1610611 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibco/Thermo Fisher Scientific | 11960-044 | |
| EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotin | Thermo Fisher Scientific | #21335 | |
| EZ-Link Sulfo-NHS-SS-Biotin | Thermo Fisher Scientific | #21331 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco/Thermo Fisher Scientific | 16000-044 | |
| Glycerol | Fisher Scientific | BP229-1 | |
| Glycine | Sigma-Aldrich | G8898 | |
| Iodoacetamide | Bio-Rad | #163-2109 | |
| Laminin from Engelbreth-Holm-Swarm murine sarcoma basement membrane | Sigma-Aldrich | L2020 | Thaw on ice. |
| L-glutamine | Gibco/Thermo Fisher Scientific | 25030-081 | |
| Mouse monoclonal anti-β-actin antibody (AC-15) | Sigma-Aldrich | A5441 | |
| Mouse monoclonal anti-β-dystroglycan antibody (43DAG1/8D5) | Leica Biosystems | B-DG-CE | |
| Penicillin/streptomycin | Gibco/Thermo Fisher Scientific | 15140-122 | |
| Peroxidase AffiniPure Donkey anti-Mouse IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 715-035-150 | |
| Peroxidase AffiniPure Goat anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 111-035-045 | |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Gibco/Thermo Fisher Scientific | 10010-023 | |
| Reduced glutathione | Sigma-Aldrich | G6529 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Fisher Scientific | S271-500 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) | Sigma-Aldrich | 862010 | |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Fisher Scientific | S318-100 | |
| Streptavidin agarose resin | Thermo Fisher Scientific | #20347 | |
| Rabbit polyclonal anti-AQP4 antibody | Alomone | AQP-004 | |
| Tris base (Trizma base) | Fisher Scientific | BP152-1 | |
| Tris-HCl | Fisher Scientific | BP153-1 | |
| Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151-500 |
References
- Baskin, G., Schenker, S., Frosto, T., Henderson, G. Transforming growth factor beta 1 inhibits epidermal growth factor receptor endocytosis and down-regulation in cultured fetal rat hepatocytes. J Biol Chem. 266 (20), 13238-13242 (1991).
- Hazum, E., Cuatrecasas, P., Marian, J., Conn, P. M. Receptor-mediated internalization of fluorescent gonadotropin-releasing hormone by pituitary gonadotropes. Proc Natl Acad Sci U S A. 77 (11), 6692-6695 (1980).
- Hemmaplardh, D., Morgan, E. H. Transferrin uptake and release by reticulocytes treated with proteolytic enzymes and neuraminidase. Biochim Biophys Acta. 426 (3), 385-398 (1976).
- Katsura, T., et al. Constitutive and regulated membrane expression of aquaporin 1 and aquaporin 2 water channels in stably transfected LLC-PK1 epithelial cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 92 (16), 7212-7216 (1995).
- Li, Y., Cam, J., Bu, G. Low-density lipoprotein receptor family: endocytosis and signal transduction. Mol Neurobiol. 23 (1), 53-67 (2001).
- Gyorgy, P., Melville, D. B., Burk, D., Du Vigneaud, V. The possible identity of vitamin H with biotin and coenzyme R. Science. 91 (2358), 243-245 (1940).
- Cole, S. R., Ashman, L. K., Ey, P. L. Biotinylation: an alternative to radioiodination for the identification of cell surface antigens in immunoprecipitates. Mol Immunol. 24 (7), 699-705 (1987).
- Green, N. M. Avidin 1. the use of [14-C]biotin for kinetic studies and for assay. Biochem J. 89 (3), 585-591 (1963).
- Korpela, J. Avidin, a high affinity biotin-binding protein, as a tool and subject of biological research. Med Biol. 62 (1), 5-26 (1984).
- Li, Y., et al. Imaging pHluorin-tagged receptor insertion to the plasma membrane in primary cultured mouse neurons. J Vis Exp. (69), e4450 (2012).
- Soohoo, A. L., Bowersox, S. L., Puthenveedu, M. A. Visualizing clathrin-mediated endocytosis of G protein-coupled receptors at single-event resolution via TIRF microscopy. J Vis Exp. (92), e51805 (2014).
- Noel, G., Tham, D. K., Moukhles, H. Interdependence of laminin-mediated clustering of lipid rafts and the dystrophin complex in astrocytes. J Biol Chem. 284 (29), 19694-19704 (2009).
- Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).
- Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. Proc Natl Acad Sci U S A. 76 (9), 4350-4354 (1979).
- Madrid, R., et al. Polarized trafficking and surface expression of the AQP4 water channel are coordinated by serial and regulated interactions with different clathrin-adaptor complexes. EMBO J. 20 (24), 7008-7021 (2001).
- Tham, D. K., Joshi, B., Moukhles, H. Aquaporin-4 Cell-Surface Expression and Turnover Are Regulated by Dystroglycan, Dynamin, and the Extracellular Matrix in Astrocytes. PLoS One. 11 (10), 0165439 (2016).
