Summary
Twee biotinylatie-gebaseerde methoden, ontworpen voor het bepalen van de expressie van de celoppervlak en de endocytische snelheid van eiwitten uitgedrukt in het plasmamembraan, worden in dit rapport weergegeven.
Abstract
Cell-oppervlakte eiwitten bemiddelen een breed scala aan functies. In veel gevallen wordt hun activiteit gereguleerd door endocytische processen die hun niveaus op het plasmamembraan moduleren. Hier presenteren we gedetailleerde protocollen voor 2 methoden die de studie van dergelijke processen vergemakkelijken, die beide gebaseerd zijn op het principe van biotinylering van celoppervlakte-eiwitten. De eerste is ontworpen om de semi-kwantitatieve bepaling van de relatieve niveaus van een bepaald eiwit op het celoppervlak toe te staan. Daarin worden de lysine residuen van de plasmamembraan eiwitten van cellen eerst gemerkt met een biotine groep. Zodra de cellen zijn gelicht, kunnen deze eiwitten dan specifiek worden geprecipiteerd via het gebruik van agarose-geïmmobiliseerde streptavidine door de natuurlijke affiniteit van deze laatste voor biotine te exploiteren. De op dergelijke wijze geïsoleerde eiwitten kunnen dan worden geanalyseerd via een standaard western blotting benadering. De tweede methode verschaft een middel om de endocytische snelheid van een deeltje te bepalenHet doel van het celoppervlak over een periode van tijd. Cell-oppervlakte eiwitten worden eerst gemodificeerd met een biotin derivaat dat een splitsbare disulfide binding bevat. De cellen worden dan teruggeschoven naar normale kweekomstandigheden, waardoor de endocytische opname van een aandeel biotinyleerde eiwitten wordt veroorzaakt. Vervolgens worden de disulfidebindingen van niet-geïnternaliseerde biotine groepen verminderd met gebruikmaking van het membraan-impermeabele reductiemiddel glutathion. Via deze aanpak kunnen geëntocytoseerde eiwitten worden geïsoleerd en gekwantificeerd met een hoge mate van specificiteit.
Introduction
Proteïnen op het celoppervlak spelen een verscheidenheid aan rollen die centraal zijn om de celfunctie te behouden. In talrijke gevallen is hun activiteit afhankelijk van of gemoduleerd door endocytische processen die hen tijdelijk in intracellulaire plaatsen sequesteren, of die hen leiden tot afbrekende wegen 1 , 2 , 3 , 4 , 5 . Hier worden 2 biotinylatiegebaseerde benaderingen benadrukt die zijn ontworpen om de gebruiker in staat te stellen specifiek te taggen en isoleren van eiwitten die uitgedrukt zijn in het plasmamembraan, en die recent geïnternaliseerd. Via deze methoden kan de celoppervlak expressie en endocytische snelheid van elk eiwit van belang worden gekwantificeerd, waardoor een duidelijkere beoordeling van de regulering ervan kan worden bereikt.
Bepalen van relatieve celoppervlakte eiwit expressie door biotinylatie
Biotine, of vitamine B7, voorheen bekend als vitamine H6, is een klein wateroplosbaar molecuul dat kan worden gebruikt om reactieve amine-, sulfhydryl- en carboxylgroepen biologische moleculen chemisch te wijzigen. Het huidige gewas biotinyleringsreagens van celoppervlak bestaat hoofdzakelijk uit membraan-impermeante gesulfoneerde N-hydroxysuccinimide (sulfo-NHS) esters van biotine of derivaten daarvan, die zijn ontworpen om te reageren met de aanwezige aminen aan de zijketens van lysine residuen van eiwitten uitgedrukt in Het celoppervlak wanneer deze worden gedeprotoneerd onder basisomstandigheden, waardoor de laatste een amidebinding met het biotine-gedeelte 7 vormt . Zodoende gemodificeerde celoppervlakte-eiwitten kunnen dan worden geïsoleerd via het gebruik van avidin, een 66-69 kDa tetramerisch eiwit dat grote affiniteit voor biotine bezit, die bindt aan de laatste met een dissociatieconstante van ongeveer 10-15, het markeren als een van de Sterkste niet-covalente interacties bekend 8 , 9 .
Een aantal alternatieve methoden voor het kwantificeren van eiwituitdrukking bij het celoppervlak zijn in eerdere studies gebruikt. De etikettering van niet-gemanimaliseerde cellen die gebruik maken van fluorescent gemerkte antilichamen die specifiek zijn voor het eiwit van belang, gevolgd door visualisatie via fluorescentiemicroscopie, is bijvoorbeeld een veelgebruikte aanpak, maar is sterk afhankelijk van de beschikbaarheid van antilichamen die kunnen binden aan extracellulaire epitopen. Meer recentelijk zijn ook methoden die het gebruik van chimere eiwitten met pH-gevoelige fluoroforen bevatten die reageren op blootstelling aan zure media 10 toegepast. Echter, dergelijke assays betreffen gewoonlijk de exogene expressie van deze constructen in cellijnen waarin het eiwit van belang niet natief gevonden wordt. Deze benaderingen zijn niettemin in staat om waardevolle informatie te verstrekken over de subcellulaire lokalisatie en exocytische route van deDoelwit eiwit, en moet daarom worden gebruikt in combinatie met de biotinylatie-gebaseerde benaderingen die hier worden beschreven als de gereedschappen beschikbaar zijn.
Bij een typische biotinyleringsassay worden de cellen eerst grondig gewassen in 4 ° C PBS. Dit verwijdert eventuele sporen van serumproteïnen die door het kweekmedium worden geïntroduceerd, waardoor men ervoor zorgt dat deze niet in de volgende stap overmatige hoeveelheden biotine zullen verbruiken. Belangrijker nog, de vermindering van de temperatuur veroorzaakt endocytose om aanzienlijk te vertragen. Het biotinyleringsreagens wordt vervolgens toegevoegd. Vervolgens worden de cellen opnieuw gewassen en vervolgens geïncubeerd met een blusbuffer die glycine of NH4Cl bevat, die alle resterende sporen van niet gereageerd biotine inactivert. De cellen worden vervolgens gelicht, waarna agarose-geïmmobiliseerde streptavidine wordt toegevoegd om de biotinyleerde eiwitten te precipiteren. Analyse wordt gewoonlijk uitgevoerd via western blotting, waardoor de relatieve celoppervlak expressie van verschillende prOteins worden gekwantificeerd.
Door de basis van deze analyse is het alleen geschikt voor gebruik met eiwitten die porties hebben blootgesteld aan de extracellulaire omgeving. Multipass transmembrane eiwitten, die waarschijnlijk een aantal reactieve lysinen bezitten binnen hun lusregio's, zijn de meest vatbaar voor deze methode, terwijl enkel-pass eiwitten minder gevoelig zijn voor biotinyleerde. Zelfs in deze gevallen blijft er een mogelijkheid dat conformatieve veranderingen of intermoleculaire interacties bepaalde reactieve plaatsen kunnen afsluiten, wat resulteert in een lager dan verwachte biotinylatieopbrengst.
Bepalen van de internaliseringssnelheid van celoppervlakte-eiwitten door biotinylering
De principes van deze analyse zijn grotendeels vergelijkbaar met die van de celoppervlakbiotinylatie, met een aantal uitzonderingen, waarvan het belangrijkste het gebruik is van omkeerbare biotinyleringsreagentia. De biotine groepen (van deze) bezitten disuLfide bindingen, in hun structuren die gevoelig zijn voor reductiemiddelen; Dit wordt geëxploiteerd om ervoor te zorgen dat alleen celoppervlakte-eiwitten die in intracellulaire plaatsen worden genomen gedurende de testperiode biotinyleren zullen worden gelaten. Een assay vindt over het algemeen plaats op de volgende wijze. De cellen worden eerst gewassen en biotinyleerd met koude reagentia, vervolgens wordt celcultuurmedium bij 37 ° C opnieuw geïntroduceerd en worden de cellen teruggebracht naar de incubator; Dit zorgt ervoor dat de gelabelde celoppervlakte-eiwitten endocytose ondergaan. Het reductiemiddel glutathion - dat het membraan niet kan binnendringen - wordt vervolgens toegevoegd om de disulfidebindingen van de biotine-delen te verbreken die zijn gehecht aan eiwitten die overblijven op het celoppervlak. Tenslotte worden de gebroken disulfidebindingen gereageerd met iodoacetamide, waarbij de labiele thiolgroepen worden verbruikt en de bindingen voorkomen worden van hervorming. Zoals eerder worden de cellen gelyseerd en worden de gelabelde eiwitten neergeslagen met behulp van streptavidine-agarose.
De beperkingen schijfToegepast in het vorige gedeelte, gelden hier ook als gevolg van de overeenkomsten die tussen de methoden worden gedeeld. Bovendien is het de moeite waard in gedachten te houden dat de temperatuurverschuivingen die bij deze analyse betrokken zijn, de precieze bepaling van hoeveel eiwit voor elke tijdsvermindering endocytose verloopt, in het bijzonder bij snel geïnternaliseerde of snel recycle eiwitten voorkomt. De analyse verschaft daarom alleen een semiquantitatieve schatting van endocytische percentages. Totale interne reflectie fluorescentiemicroscopie kan gebruikt worden om de opname van elke geladen vesikel op te sporen en een nauwkeuriger meting van de kinetiek van endocytose te geven. Het kan derhalve een zeer nuttige aanvulling op deze bepaling verschaffen, ervan uitgaande dat een fluorescerend gemerkte chimere construct van het geïnde eiwit 11 beschikbaar is.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Bepalen van relatieve celoppervlakteproteïnexpressie in astrocyten door biotinylering
OPMERKING: Hier illustreren we de toepassing van deze biotinyleringstechniek op de studie van de effecten van het extracellulaire matrixmolecuul laminine op de celoppervlak lokalisatie van het waterdoorlaatbare kanaal aquaporin-4 (AQP4). Gespecialiseerde materialen die nodig zijn voor deze test omvatten sulfo-NHS-LC-biotine en streptavidine-agarosehars (zie tabel van materialen ).
- Met behulp van de methode beschreven in Noel et al. 12 , bereiden culturen van corticale astrocyten ongeveer 2 weken voorafgaand aan de test, en groeien ze in 75 cm2 geventileerde kweekflessen. Wanneer astrocyten 80 tot 90% samenvloeien, los ze los van het kweekoppervlak met 0,05% trypsine en ga dan 1: 3 door.
- Bij 48 uur voorafgaand aan de test, wanneer cellen opnieuw 80-90% samenvloeien, worden de astrocyten 1: 3 vergeleken (rekening houdend met de cHangen in het cultuurformaat) op 60 mm celcultuurschotels, zodat ze> 70% samenvloeien op de dag waarop het experiment plaatsvindt. Zorg ervoor dat cellen gelijkmatig verdeeld zijn.
- Om 16 uur voorafgaand aan de analyse, pipette laminine in kweekmedium tot een uiteindelijke concentratie van 24 nM en incubeer bij 37 ° C.
- Onmiddellijk voorafgaand aan de test bereiden het volgende op en plaats dan op ijs of in koelkast: CM-PBS (100 mg / L MgCl 2 × 6H 2 O en 100 mg / L CaCl 2 in 1X PBS, pH 7,4), biotine buffer Mg / ml sulfo-NHS-LC-biotine in CM-PBS), blusbuffer (50 mM NH4Cl in CM-PBS), lysisbuffer (25 mM Tris, pH 7,4, 25 mM glycine, 150 mM NaCl en 5 mM EDTA, 1% triton X-100, 1X proteaseremmercocktail), 3X laadbuffer (150 mM Tris, pH 6,8, 6% SDS, 30% glycerol, 300 mM DTT en 0,01% bromfenolblauw) en wasbuffer Tris (pH 7,4), 1,5 mM EDTA, 150 mM NaCl, 1% Triton X-100, 1X proteaseremmercocktail).
- RemOve schotels die de astrocyte culturen van de incubator houden en het medium weggooien.
- Was cellen driemaal met 4 ml gekoelde CM-PBS, en plaats de afwas op gebroken ijs.
- Pipet 2 ml biotinebuffer in elke putje, en wijs voorzichtig een paar keer schotels heen en weer om volledige dekking te garanderen. Laat 30 minuten op ijs staan.
- Verwijder de biotine buffer met behulp van een aspirator, en vervang met 4 mL quenching buffer. Laat 10 minuten op ijs staan.
- Aspireer de quenching buffer, en vervang met een equivalent volume van hetzelfde. Nogmaals, laat 10 minuten op ijs.
- Gooi de blusbuffer weg en was de cellen driemaal met 4 ml gekoelde CM-PBS.
- Schraap cellen in 1 ml gekoelde CM-PBS met behulp van een cellift, en draag de suspensie over naar de microcentrifugebuis.
- Pelletcellen door centrifugeren bij 100 xg gedurende 3 minuten. Gooi de supernatant weg en verwijder cellen opnieuw in 500 μl lysisbuffer.
- Laat monsters op ijs voor 30 minuten, vortexen elke 5 minuten, of plDoe ze op een rotatie-end-end bij 4 ° C.
- Centrifugeer het lysaat bij 14.000 xg gedurende 10 min bij 4 ° C om eventuele wasoplosbare materialen te pelletiseren. Breng de supernatant over in een nieuwe microcentrifugebuis.
- Sla 50 μL van deze lysaat op en voeg de laadbuffer eraan toe. Denatureer dan door verhitting bij 95 ° C in een droogbad; Dit is de "input" fractie, die zowel biotinyleerde celoppervlakte-eiwitten bevat als niet-biotinyleerde cytosolische eiwitten.
- Vergroot de opening van een pipettip door ongeveer 0,5 cm materiaal vanaf het uiteinde af te snijden met een paar scherpe scharen. Gebruik deze pipettip door 75 μL streptavidine-agarosepillen (normaal opgeslagen bij 4 ° C) op het lysaat te plaatsen en gedurende 3 uur bij 4 ° C op shaker / rocker te incuberen.
- Aangezien streptavidine-agarose vaak wordt verkocht als een suspensie die 50% kralen bevat, gesuspendeerd in een antimicrobiële oplossing, tritureren de suspensie om ervoor te zorgen dat de kralenWorden gelijkmatig opgeschort, en pipet vervolgens 150 μl van de suspensie in elk monster.
- Pellet streptavidine-agarose kralen door centrifugeren bij 1500 xg gedurende 30 s bij 4 ° C.
- Bespaar 50 μL van de supernatant (voeg laadbuffer toe en ontkal het bij 95 ° C in een waterbad of verwarmingsblok); Dit vertegenwoordigt de "intracellulaire" fractie, en bestaat voornamelijk uit niet-biotinyleerde cytosolische eiwitten.
- Resulteer de gepelleteerde kralen in 1 ml wasbuffer en roer dit gedurende 3 minuten bij 4 ° C. Pelletkralen (zoals in stap 1.16), en weggooien de supernatant. Herhaal dit proces 4x om de nonspecifieke binding van niet-biotinyleerde cytosolische eiwitten te minimaliseren.
- Pellet de kralen door centrifugeren (1500 xg gedurende 30 s bij 4 ° C) en gooi de overliggende wasbuffer weg. Voeg 50 μl 1X laadbuffer toe (verdund met behulp van lysisbuffer). Laat biotine en streptavidine los van kralen door deze bij 95 ° C te denatureren; Deze fractie shoUld bevatten alleen biotinyleerde celoppervlakte-eiwitten ("celoppervlak" fractie).
- Afzonderlijke invoer, celoppervlak en intracellulaire fracties door SDS-PAGE 13 , en analyseren door western blotting 14 .
OPMERKING: Terwijl we in onze experimenten een 4 - 20% precastgradiëntgel gebruikt hebben, zou een 12 - 14% scheidingsgel met een 4% stapellaag (elk 0,1% SDS) voldoende moeten zijn voor de eiwitten die van belang zijn voor deze studie. Een molecuulgewichtstandaard van het passende afmetingsbereik zou ook moeten worden gebruikt. Merk op dat er soms een waarneembare upshift in de schijnbare moleculaire massa's van biotinyleerde eiwitten kan zijn.
- Afzonderlijke invoer, celoppervlak en intracellulaire fracties door SDS-PAGE 13 , en analyseren door western blotting 14 .
2. Bepalen van de internaliseringssnelheid van celoppervlakteproteïnen in astrocyten door biotinylering
OPMERKING: In het volgende beschrijven we een typisch pulse-chase biotinylatie experiment dat in dit geval gebruikt wordt om de endocytose van AQP4 bij astrocyten te volgen. DezeMethode is gebaseerd op die van Madrid et al. 15 . Specifieke materialen benodigd zijn onder meer sulfo-NHS-SS-biotine, streptavidine-agarosehars, verminderde glutathion en jodacetamide (zie de Tabel van Materialen ).
- Bereid cultures van muizencorticale astrocyten in 60 mm schotels aan met behulp van de methoden die in het vorige gedeelte zijn beschreven. Zorg ervoor dat de cellen ongeveer 70% confluent zijn op de dag van de test, en dat elke schotel een equivalent aantal cellen bevat.
- Onmiddellijk voorafgaand aan de test bereiden het volgende op en plaats op ijs of in koelkast: CM-PBS (100 mg / L MgCl 2 × 6H 2 O en 100 mg / L CaCl 2 in 1X PBS, pH 7,4), biotine buffer (0,5 Mg / ml sulfo-NHS-SS-biotine in CM-PBS), reducerende buffer (50 mM gereduceerd glutathion, 75 mM NaCl en 75 mM NaOH), blusbuffer (50 mM iodoacetamide, 1% BSA, in CM-PBS) Lysisbuffer (25 mM Tris, pH 7,4, 25 mM glycine, 150 mM NaCl en 5 mM EDTA, 1% triton X-100, 1X-proteaseremmerscocktail), 3X laadbuffer (150 mM Tris, pH 6,8, 6% SDS, 30% glycerol, 300 mM DTT en 0,01% broomfenolblauw) en wasbuffer (10 mM Tris, pH 7,4, 1,5 mM EDTA, 150 mM NaCl, 1% triton X-100, 1X proteaseremmercocktail).
- Bereid het frisse celcultuurmedium op (DMEM aangevuld met 10% Fetale Bovine Serum (FBS), 1% Penicilline / Streptomycine en 1% L-Glutamine) en plaats het in een 37 ° C waterbad.
- Verwijder astrocyte culturen uit de incubator en aspireren het medium met behulp van een aspirator.
- Was cellen driemaal met 4 ml gekoelde CM-PBS, en plaats de afwas op gebroken ijs.
- Pipet 3 ml biotinebuffer in elk gerecht, kantel gereedschap heen en weer een paar keer om ervoor te zorgen dat de buffer goed verdeeld is en laat dit 30 minuten op ijs staan.
- Aspiratie biotine buffer, en vervang het met 5 ml warm medium. Incubeer een kweekschotel bij 37 ° C gedurende 15 minuten en een tweede schotel bij dezelfde temperatuur gedurende 30 minuten. Laat een andere schotel op 46; C als de 0 min monster.
- Aan het einde van de incubatieperiode, weggooi medium en wascellen driemaal met 4 ml gekoelde CM-PBS. Pipet 6 ml reducerende buffer over cellen, en laat 15 minuten op ijs.
- Verwijder de reducerende buffer, en vervang dan met 6 ml verse reductieruimte. Plaats op ijs voor nog eens 15 minuten.
- Verwijder de reducerende oplossing en vervang met 6 mL quenching buffer. Verlaat op ijs voor 15 minuten.
- Herhaal de quenching stap nogmaals.
- Gooi de blusbuffer weg en was de cellen driemaal met 4 ml gekoelde PBS.
- Schraap cellen in 1 ml gekoelde PBS met behulp van een cellift, en verplaats de suspensie in een microcentrifugebuis.
- Pelletcellen door centrifugeren bij 100 xg gedurende 3 minuten. Gooi de supernatant weg en verwijder cellen in 500 μl lysisbuffer.
- Laat dit 30 minuten per ijs en vortex elke 5 minuten. Als alternatief plaatst u de monsters op een eind-over-end rotator bij 4 ° C gedurende deze duur.
- Centrifugeer de lyZat bij 14.000 xg gedurende 10 minuten bij 4 ° C om de detergent-onoplosbare materialen te pelletiseren en vervolgens supernatant over te brengen naar een nieuwe microcentrifugebuis. Sla 50 μL van dit lysaat op, voeg de laadbuffer er toe en denatureer bij 95 ° C in een droogbad; Dit is de "input" fractie, die zowel biotinyleerde endocytose-eiwitten bevat als niet-biotinyleerde eiwitten.
- Met een snijpipettaart voeg 150 μL van de streptavidine-agarose-slurry toe aan het lysaat en incubeer gedurende 3 uur bij 4 ° C op shaker / rocker. Zie 1.15 voor meer informatie over deze stap.
- Pellet streptavidine-agarose kralen door centrifugeren bij 1500 xg gedurende 30 s bij 4 ° C.
- Resulteer kralen in 1 ml wasbuffer en roer 3 min bij 4 ° C. Pelletkralen (zoals in stap 2.18), en weggooien de supernatant. Herhaal dit proces 4x om de nonspecifieke binding van niet-biotinyleerde cytosolische eiwitten te minimaliseren.
- Pelletkralen door centrifugeren bij 1500 xg gedurende 30 s bij 4 ° C en weggooienWassen buffer. Voeg 50 μl 1X laadbuffer toe (verdund met behulp van lysisbuffer). Laat biotine en streptavidine los van kralen door denatureren bij 95 ° C; Deze fractie zou alleen geïndividualiseerde cel-oppervlakte eiwitten moeten bevatten ("endocytose" fractie).
- Afzonderlijke invoer, celoppervlak en ongebonden fracties door SDS-PAGE 13 , en analyseren door western blotting 14 .
OPMERKING: Terwijl we in onze experimenten een 4 - 20% precastgradiëntgel gebruikt hebben, zou een 12 - 14% scheidingsgel met een 4% stapellaag (elk 0,1% SDS) voldoende moeten zijn voor de eiwitten die van belang zijn voor deze studie. Een molecuulgewichtstandaard van het passende afmetingsbereik zou ook moeten worden gebruikt. Merk op dat er soms een waarneembare upshift in de schijnbare moleculaire massa's van biotinyleerde eiwitten kan zijn.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Gebruik biotinylatie op celoppervlak om de plasmamembraanuitdrukking van AQP4 in astrocyten te beoordelen
Laminine-behandelde astrocyteculturen en onbehandelde controlecellen werden onderworpen aan cel-oppervlakbiotinylatie onder toepassing van de beschreven methoden. Biotinyleerde eiwitten werden geprecipiteerd met agarose-geconjugeerde streptavidine, en vervolgens afgescheiden via SDS-PAGE. Cell-oppervlakfracties werden getest op AQP4 en β-dystroglycan (β-DG) als een celoppervlak laadcontrole, terwijl de invoer- en intracellulaire fracties werden uitgesplitst voor AQP4 en ß-actine ( Figuur 1A) als een laadbeheersing. Bandintensiteiten voor de celoppervlakfractie werden gekwantificeerd via densitometrie en AQP4 niveaus voor elke reeks cellen werden eerst genormaliseerd tegen β-DG waarden, en deze verhoudingen werden vervolgens genormaliseerd tegen die voor de controle cellen. Het histogram ( Figuur 1 B ) vertegenwoordigt de gemiddelde waarden ± SEM voor drie onafhankelijke experimenten. Laminine behandeling veroorzaakt gemiddeld een bijna 2X toename in AQP4 uitgedrukt op het celoppervlak.
Onderzoek naar de endocytische snelheid van AQP4 met behulp van biotinylatie
AQP4 endocytose in astrocyten werd gevolgd over een periode van 30 minuten. In het kort werd een splitsbaar biotin analoog eerst gebruikt om oppervlakte-eiwitten in 3 schotels van astrocyten te labelen. De cellen werden respectievelijk verschoven naar 37 ° C gedurende respectievelijk 0, 15 en 30 minuten, gedurende welke de gelabelde eiwitten geïnternaliseerd werden. Etikettering die op het oppervlak bleef werd vervolgens verwijderd met behulp van een reductiemiddel, en endocyteerde eiwitten werden geprecipiteerd met agarose-geconjugeerde streptavidine. Na afscheiding via SDS-PAGE werden deze vervolgens getest op AQP4 ( Figuur 2A). AQP4 niveaus werden gekwantificeerd met behulp van densitometrie en de waarden die overeenkomen met de15 en 30 min tijdspunten werden genormaliseerd aan die voor de 0 minuten voorbeeld. Het histogram ( Figuur 2B ) vertegenwoordigt de gemiddelde waarden ± SEM voor vier dergelijke experimenten.
Figuur 1 . AQP4 Expressie op het celoppervlak in de aanwezigheid van Laminine. (A) De celoppervlak-, intracellulaire en totale (Input) fracties van onbehandelde astrocyten (-LN) en astrocyten behandeld met 24 nM laminine-111 (+ LN) werden onderzocht voor AQP4 en β-DG. (B) Histogram dat de verschillen illustreert in de celoppervlakten van AQP4 onbehandelde en laminine-behandelde astrocyten, genormaliseerd tegen β-DG-niveaus. Waarden vertegenwoordigen genormaliseerde gemiddelde pixel intensiteiten ± SEM, uitgedrukt ten opzichte van de waarden voor de controle cellen. Het sterretje geeft een statistica aanLijk significante toename in AQP4, zoals bepaald door een t -toets van twee tailed studenten (n = 3, * p = 0,033). Dit cijfer is gewijzigd van Tham et al. 16 Klik hier om een grotere versie van deze figuur te zien.
Figuur 2 . AQP4-internalisatie in astrocyten. (A) Proteïnen geïnternaliseerd door astrocytekulturen bij 0, 15 en 30 min werden onderzocht voor AQP4. (B) Histogram waarin de internaliseringssnelheden van AQP4 samenvatten voor 4 onafhankelijke experimenten, genormaliseerd tegen waarden voor de 0 min tijdspunt. Het sterretje wijst op een statistisch significante toename van de hoeveelheid AQP4 endocytose tussen 15 en 30 minuten, zoals bepaald door een tweestaartEd t- test van de student (n = 3, * p = 0,017). (C) Wanneer glutathion wordt gebruikt om de disulfidebinding in het splitsbare biotine-analoog te breken, wordt de bijdrage van het celoppervlak AQP4 naar de biotinyleerde fractie sterk verminderd, wat resulteert in een duidelijk verschil tussen de 0 en 15 minuten monsters (C, linksboven ) . Wanneer deze stap wordt weggelaten, geeft het signaal dat afkomstig is van het celoppervlakte de verandering tussen de 2 keer-punten niet detecteerbaar (C, rechtsboven) . Dit cijfer is gewijzigd van Tham et al. 16 Klik hier om een grotere versie van deze figuur te zien.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
wijzigingen:
Aangezien deze methoden zijn ontworpen voor gebruik met hechtende cellen, hebben we het gebruik van PBS die 100 mg / L MgCl 2 × 6H 2 O bevat en
100 mg / l CaCl2 (CM-PBS) voor de wasstappen en als basis van bepaalde buffers om ervoor te zorgen dat de cellen vast blijven aan het kweekoppervlak en dat celcelverbindingen niet verstoord raken. De protocollen kunnen echter ook toegepast worden op niet-adherente celtypes als de cellen tussen elke stap van de procedure worden gepelleteerd. In deze gevallen kan CM-PBS worden vervangen door PBS.
Bovendien is het belangrijk om op te merken dat elk van de hier genoemde voorwaarden specifiek is voor dit protocol, en alleen als ruwe richtlijnen dienen te worden beschouwd als de methodes voor andere toepassingen moeten worden gebruikt. In het bijzonder dient men onafhankelijk te verifiëren dat de detergent extractie procedure geschikt is voor deR cel type, en dat de centrifuge instellingen geschikt zijn voor het cel type, en voor de streptavidin-agarose kralen worden gebruikt.
Tot slot, als er bezorgdheid bestaat over niet-specifieke binding en / of overmatige achtergrond, kan men streptavidine vervangen door de verschillende andere avidinvormen die momenteel op de markt beschikbaar zijn. Deglycosylated avidin heeft bijvoorbeeld een aanzienlijk lagere affiniteit voor lectines en voor negatief geladen moleculen zoals DNA.
Problemen oplossen en bedienen:
Hoewel de procedures die in dit rapport zijn onderzocht, vrij eenvoudig zijn, moet men rekening houden met een aantal kritieke problemen die de uitkomst van het experiment mogelijk kunnen beïnvloeden. Ten eerste, hoewel beide analyses sterk afhankelijk zijn van de membraan-impermeante aard van de gesulfateerde biotinyleringsreagentia, zouden bepaalde omstandigheden kunnen leiden tot het plasmamembraan van de cellen verstoord raken, waardoor een bepaald intracellulair proteïne resulteertIns biotinylated. Om te controleren op deze mogelijkheid wordt voorgesteld dat biotinyleerde fracties worden getest op doelen die niet bekend zijn op het plasmamembraan, zoals β-actine.
Men moet voorzichtig houden aan de juiste opslagomstandigheden voor de biotinyleringsreagentia (typisch 4 of -20 ° C, met enige vorm van uitdroging), omdat deze anders kunnen falen, vanwege hun zeer gevoelige aard. Niettemin is het een goede praktijk om de invoer, biotinyleerde en niet-biotinyleerde fracties met streptavidine-HRP te onderzoeken om vast te stellen dat biotinylatie inderdaad is voorgekomen en dat de biotinyleerde eiwitten efficiënt zijn geprecipiteerd (wat blijkt uit het ontbreken van een signaal in de Niet-biotinyleerde fractie). Daardoor zou het mogelijk moeten zijn om de mogelijkheid van defecte reagentia te elimineren.
Disulfide binding reductie is een cruciale stap in de endocytische biotinylatie procedure, zoals het ervoor zorgtDat alleen geïnternaliseerde eiwitten in de biotinyleerde fractie worden geïsoleerd. Inclusief controles waarbij het reductiereagens weggelaten wordt ( Figuur 1C ) kan men een indruk krijgen van de werkzaamheid van de behandeling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren geen belangenconflict.
Acknowledgments
Dit project werd ondersteund door het Canadese Instituut voor Gezondheidsonderzoek PG # 20R47867.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ammonium chloride (NH4Cl) | Fisher Scientific | A661-500 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A9647-50 | |
| Bromophenol blue | Bio-Rad | #1610404 | |
| cOmplete protease inhibitor cocktail | Sigma-Aldrich | 11697498001 | |
| Disodium Ethylenediaminetetraacetate dihydrate (EDTA) | Bio-Rad | #1610729 | |
| Dithiothreitol (DTT) | Bio-Rad | #1610611 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibco/Thermo Fisher Scientific | 11960-044 | |
| EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotin | Thermo Fisher Scientific | #21335 | |
| EZ-Link Sulfo-NHS-SS-Biotin | Thermo Fisher Scientific | #21331 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco/Thermo Fisher Scientific | 16000-044 | |
| Glycerol | Fisher Scientific | BP229-1 | |
| Glycine | Sigma-Aldrich | G8898 | |
| Iodoacetamide | Bio-Rad | #163-2109 | |
| Laminin from Engelbreth-Holm-Swarm murine sarcoma basement membrane | Sigma-Aldrich | L2020 | Thaw on ice. |
| L-glutamine | Gibco/Thermo Fisher Scientific | 25030-081 | |
| Mouse monoclonal anti-β-actin antibody (AC-15) | Sigma-Aldrich | A5441 | |
| Mouse monoclonal anti-β-dystroglycan antibody (43DAG1/8D5) | Leica Biosystems | B-DG-CE | |
| Penicillin/streptomycin | Gibco/Thermo Fisher Scientific | 15140-122 | |
| Peroxidase AffiniPure Donkey anti-Mouse IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 715-035-150 | |
| Peroxidase AffiniPure Goat anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 111-035-045 | |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Gibco/Thermo Fisher Scientific | 10010-023 | |
| Reduced glutathione | Sigma-Aldrich | G6529 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Fisher Scientific | S271-500 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) | Sigma-Aldrich | 862010 | |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Fisher Scientific | S318-100 | |
| Streptavidin agarose resin | Thermo Fisher Scientific | #20347 | |
| Rabbit polyclonal anti-AQP4 antibody | Alomone | AQP-004 | |
| Tris base (Trizma base) | Fisher Scientific | BP152-1 | |
| Tris-HCl | Fisher Scientific | BP153-1 | |
| Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151-500 |
References
- Baskin, G., Schenker, S., Frosto, T., Henderson, G. Transforming growth factor beta 1 inhibits epidermal growth factor receptor endocytosis and down-regulation in cultured fetal rat hepatocytes. J Biol Chem. 266 (20), 13238-13242 (1991).
- Hazum, E., Cuatrecasas, P., Marian, J., Conn, P. M. Receptor-mediated internalization of fluorescent gonadotropin-releasing hormone by pituitary gonadotropes. Proc Natl Acad Sci U S A. 77 (11), 6692-6695 (1980).
- Hemmaplardh, D., Morgan, E. H. Transferrin uptake and release by reticulocytes treated with proteolytic enzymes and neuraminidase. Biochim Biophys Acta. 426 (3), 385-398 (1976).
- Katsura, T., et al. Constitutive and regulated membrane expression of aquaporin 1 and aquaporin 2 water channels in stably transfected LLC-PK1 epithelial cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 92 (16), 7212-7216 (1995).
- Li, Y., Cam, J., Bu, G. Low-density lipoprotein receptor family: endocytosis and signal transduction. Mol Neurobiol. 23 (1), 53-67 (2001).
- Gyorgy, P., Melville, D. B., Burk, D., Du Vigneaud, V. The possible identity of vitamin H with biotin and coenzyme R. Science. 91 (2358), 243-245 (1940).
- Cole, S. R., Ashman, L. K., Ey, P. L. Biotinylation: an alternative to radioiodination for the identification of cell surface antigens in immunoprecipitates. Mol Immunol. 24 (7), 699-705 (1987).
- Green, N. M. Avidin 1. the use of [14-C]biotin for kinetic studies and for assay. Biochem J. 89 (3), 585-591 (1963).
- Korpela, J. Avidin, a high affinity biotin-binding protein, as a tool and subject of biological research. Med Biol. 62 (1), 5-26 (1984).
- Li, Y., et al. Imaging pHluorin-tagged receptor insertion to the plasma membrane in primary cultured mouse neurons. J Vis Exp. (69), e4450 (2012).
- Soohoo, A. L., Bowersox, S. L., Puthenveedu, M. A. Visualizing clathrin-mediated endocytosis of G protein-coupled receptors at single-event resolution via TIRF microscopy. J Vis Exp. (92), e51805 (2014).
- Noel, G., Tham, D. K., Moukhles, H. Interdependence of laminin-mediated clustering of lipid rafts and the dystrophin complex in astrocytes. J Biol Chem. 284 (29), 19694-19704 (2009).
- Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).
- Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. Proc Natl Acad Sci U S A. 76 (9), 4350-4354 (1979).
- Madrid, R., et al. Polarized trafficking and surface expression of the AQP4 water channel are coordinated by serial and regulated interactions with different clathrin-adaptor complexes. EMBO J. 20 (24), 7008-7021 (2001).
- Tham, D. K., Joshi, B., Moukhles, H. Aquaporin-4 Cell-Surface Expression and Turnover Are Regulated by Dystroglycan, Dynamin, and the Extracellular Matrix in Astrocytes. PLoS One. 11 (10), 0165439 (2016).
