Summary
שתי שיטות biotinylation מבוססות, שנועדו לקביעת ביטוי פני התא ואת שיעור endocytic של חלבונים לידי ביטוי בקרום פלזמה, מוצגים בדוח זה.
Abstract
חלבונים של תאים סלולריים מתווכים מגוון רחב של פונקציות. במקרים רבים, פעילותם מוסדרת על ידי תהליכים אנדוציטיים המווסתים את רמותיהם בקרום הפלזמה. כאן, אנו מציגים פרוטוקולים מפורטים עבור 2 שיטות להקל על המחקר של תהליכים כאלה, אשר שניהם מבוססים על העיקרון של biotinylation של חלבונים משטח התא. הראשון נועד לאפשר את קביעת חצי כמותי של רמות היחסי של חלבון מסוים על פני התא. בתוך זה, שאריות ליזין של חלבונים קרום פלזמה של תאים מסומנים הראשון עם מחלת ביוטין. לאחר התאים lysed, חלבונים אלה עשויים להיות זירז במיוחד באמצעות שימוש agreose- משותקת streptavidin על ידי ניצול הזיקה הטבעית של האחרון עבור ביוטין. החלבונים מבודדים בצורה כזו ניתן לאחר מכן ניתח באמצעות גישה סופנית המערבי סופג. השיטה השנייה מספקת אמצעי לקביעת קצב אנדוציטי של חלקיקהמטרה של פני השטח על פני תקופה של זמן. תאים חלבונים פנימיים הם שונו לראשונה עם נגזרות ביוטין המכיל קשר disculfide חדה. התאים מועברים בחזרה לתנאי התרבות הרגילים, מה שגורם ספיגה endocytic של חלק של חלבונים biotinylated. לאחר מכן, את הקשרים דיסולפיד של קבוצות ביוטין שאינם מופחתים מופחתים באמצעות קרום בלתי חדיר צמצום גלוטתיון סוכן. באמצעות גישה זו, חלבונים endocytosed ולכן יכול להיות מבודד לכמת עם רמה גבוהה של ספציפיות.
Introduction
חלבונים על פני התא לשחק מגוון של תפקידים מרכזי לשמירה על תפקוד התא. במקרים רבים הפעילות שלהם תלויה, או מאופיינת על ידי תהליכים אנדוציטיים, כי גם לרשום אותם באופן זמני באתרים תאיים, או לכוון אותם כלפי מסלולים השפלה 1 , 2 , 3 , 4 , 5 . כאן, אנו מדגישים 2 biotinylation מבוסס גישות שנועדו לאפשר למשתמש לתייג באופן ספציפי לבודד חלבונים לידי ביטוי על קרום פלזמה, ואלו החדשה הופנמו. באמצעות שיטות אלה, את פני השטח של התא ואת שיעור endocytic של כל חלבון של עניין ניתן לכמת, ובכך מאפשר הערכה ברורה של הרגולציה שלה להיות מושגת.
קביעת יחסית תא פני השטח חלבון הביטוי על ידי biotinylation
ביוטין, או ויטמין B7, המכונה בעבר ויטמין H 6 , הוא מולקולה מסיס מים קטן שניתן להשתמש בהם כדי לשנות כימית אמינים, sulfhydryl, קבוצות carboxyl של מולקולות ביולוגיות. היבול הנוכחי של ריאגנטים biotinylation פני השטח של התא מורכב בעיקר של קרום nul hydroxysuccinimide (sulfo-NHS) אסטרונומים של ביוטין או נגזרות שלה, שנועד להגיב עם אמינים נוכח על שרשראות הצד של ליסין שאריות של חלבונים לידי ביטוי ב את משטח התא כאשר אלה הופכים deprotonated בתנאים בסיסיים, וכתוצאה מכך האחרון להרכיב קשר amide עם מחלת ביוטין 7 . כך, למשל, חלבונים של תאי-תאים עשויים להיות מבודדים באמצעות שימוש ב- avidin, חלבון tetrameric של 66 - 69 kDa בעל זיקה רבה לביוטין, המחייב את השני עם קבוע דיסוציאציה של כ -15-15 , מסמן אותו כאחד אינטראקציות noncovalent החזק ביותר הידוע 8 , 9 .
מספר שיטות חלופיות לכימות ביטוי חלבון על פני התא שימשו מחקרים קודמים. תיוג של תאים unpermeabilized באמצעות נוגדנים מתויגים fluorescently ספציפי לחלבון של עניין, ואחריו ויזואליזציה באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי, למשל, היא גישה נפוץ, אבל הוא מסתמך במידה רבה על הזמינות של נוגדנים שיכולים להיקשר epitopes תאיים. לאחרונה, שיטות המעורבות בשימוש חלבונים chimeric הנושאת fluorophores רגישים ל- pH המגיבים לחשיפה לחומרי חומצה, הועסקו בהצלחה גם 10 . עם זאת, מבחני כזה בדרך כלל כרוך הביטוי אקסוגני של מבנים אלה בקווים התא שבו החלבון של עניין לא נמצא באופן מקורי. גישות אלה בכל זאת מסוגלים לספק מידע בעל ערך לגבי לוקליזציה תת-תאית ומסע exocytic שלחלבון היעד, ולכן יש להשתמש בשילוב עם גישות biotinylation מבוסס המתואר כאן אם הכלים זמינים.
ב assay biotinylation טיפוסי, התאים נשטפים תחילה ביסודיות 4 מעלות צלזיוס PBS. זה מסיר כל עקבות של חלבונים בסרום הציג על ידי המדיום התרבות, ובכך להבטיח כי אלה לא יצרוך כמויות עודפות של ביוטין בשלב הבא. חשוב יותר, הירידה בטמפרטורה גורמת לאנדוציטוזה להאט משמעותית. מגיב biotinylation לאחר מכן הוסיף. לאחר מכן, התאים נשטפים שוב, ולאחר מכן מודגרות עם חיץ מרווה המכיל גם גליצין או NH 4 Cl, המטרה של אשר היא להשבית את כל עקבות הנותרים של ביוטין בלתי ממומש. התאים הם lysed אז, בעקבות אשר agarose- משותק streptavidin נוסף כדי להאיץ את החלבונים biotinylated. ניתוח מבוצע בדרך כלל באמצעות סופג המערבי, ומאפשר את פני השטח של תא יחסית של יחסי ציבור שוניםOutins להיות לכמת.
בשל הבסיס של assay זה, הוא מתאים לשימוש רק עם חלבונים בעלי חלקים חשופים הסביבה תאיים. מולטיפאס טרנסממברני חלבונים, אשר סביר להניח שיש מספר lysines תגובתי בתוך אזורי לולאה שלהם, הם המתאימים ביותר לשיטה זו, ואילו חלבונים לעבור יחיד נוטים להיות רגישים פחות להיות biotinylated. אפילו במקרים אלה, נותרה אפשרות ששינויים קונפורמטיביים או אינטראקציות בין-מולקולאריות עשויים לחסום אתרים תגובתיים מסוימים, וכתוצאה מכך תשואה ביוטילינאצית נמוכה מהצפוי.
קביעת שיעור ההפנמה של חלבונים משטח התא על ידי biotinylation
העקרונות של assay זה דומים במידה רבה לאלה של biotinylation בתא השטח, עם מספר חריגים, החשוב שבהם הוא השימוש reagents biotinylation הפיך. קבוצות ביוטין (של אלה) יש disuLfide, בתוך המבנים שלהם, כי הם רגישים לצמצום סוכנים; זה מנוצל על מנת להבטיח כי רק חלבונים משטח התא נלקח לאתרים תאיים במהלך תקופת assay יישאר biotinylated. Assay מתרחשת בדרך כלל באופן הבא. התאים נשטפים הראשון biotinylated עם ריאגנטים קר, ואז בינוני תרבות התא ב 37 ° C הוא מחדש הציג, ואת התאים מוחזרים החממה; זה גורם לתאים שכותרתו חלבונים פני כדי לעבור אנדוציטוזה. הפחתת הסוכר גלוטתיון - אשר לא יכול לחדור את הממברנה - לאחר מכן הוסיף לשבור את הקשרים דיסולפיד של moieties ביוטין המצורפת חלבונים שנותרו על פני התא. לבסוף, קשרים disulfide שבור מגיבים עם iodoacetamide, לצרוך את קבוצות thiol labile ומניעת הקשרים מ רפורמה. כמו קודם, התאים הם lysed אז, ואת החלבונים שכותרתו הם זירז באמצעות streptavidin-agarose.
דיסק המגבלותבסעיף הקודם חל גם כאן בשל הדמיון המשותף בין השיטות. בנוסף, כדאי לזכור כי משמרות הטמפרטורה המעורבים assay זה למנוע את הקביעה המדויקת של כמה חלבון הוא endocytosed עבור כל תוספת של זמן, במיוחד במקרה של במהירות מופנם או במהירות מיחזור חלבונים. Assay ולכן מספק רק הערכה semiquantitative של שיעורי endocytic. סך הכל מיקרוסקופ השתקפות הקרינה הפנימית ניתן להשתמש כדי לעקוב אחר ספיגה של כל שלפוחית טעון לספק מדידה מדויקת יותר של הקינטיקה של אנדוציטוזה. זה יכול ולכן לספק השלמה מאוד שימושי assay זה, בהנחה כי fluorescently מתויג chimeric לבנות של חלבון של עניין זמין 11 .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. קביעת יחסית חלבון חלבון הביטוי ב Astrocytes ידי Biotinylation
הערה: כאן, אנו ממחישים את היישום של טכניקה biotinylation זו לחקר ההשפעות של laminin מולקולה תאית מולקולרית על לוקליזציה משטח התא של ערוץ חדיר מים aquaporin-4 (AQP4). חומרים מיוחדים הנדרשים assay זה כוללים sulfo-NHS-LC ביוטין שרף streptavidin-agarose (ראה טבלה של חומרים ).
- שימוש בשיטה המתוארת בנואל ואח '. 12 , להכין תרבויות של astrocytes קליפת המוח כ 2 שבועות מראש של assay, ולגדול אותם 75 ס"מ 2 צלוחיות פרקו תרבות. כאשר האסטרוציטים הם 80 - 90% confluent, לנתק אותם משטח התרבות באמצעות 0.05% טריפסין, ולאחר מכן לעבור אותם 1: 3.
- בשעה 48 שעות לפני assay, כאשר התאים שוב 80 - 90% confluent, אסטרוציטים המעבר 1: 3 (חשבונאות עבור cHange בתבנית התרבות) על גבי 60 מ"מ צלחות תרבות התא כך שהם> 70% confluent ביום הניסוי יתקיים. ודא כי התאים מחולקים באופן שווה בין הכלים.
- ב 16 שעות לפני assay, laminin פיפטה לתוך בינוני תרבות לריכוז סופי של 24 ננומטר, ו דגירה על 37 מעלות צלזיוס.
- מיד לפני assay, להכין את הבאים, ולאחר מכן למקם על קרח או קירור: CM-PBS (100 מ"ג / L MgCl 2 ∙ 6H 2 O ו 100 מ"ג / L CaCl 2 ב 1X PBS, pH 7.4), חיץ ביוטין (0.5 מ"ג / מ"ל sulfo-NHS-LC ביוטין ב CM-PBS), מרווה חיץ (50 מ"מ NH 4 Cl ב CM-PBS), חיץ תמוגה (25 מ"מ טריס, pH 7.4, גליצין 25 מ"מ, 150 מ"מ NaCl ו 5 מ"מ EDT, 1% טריטון X-100, קוקטייל 1X פרוטאז inhibitor), 3X חיץ טוען (150 מ"מ טריס, pH 6.8, SDS 6%, גליצרול 30%, 300 מ"מ DTT ו 0.01% ברומופנול כחול), לשטוף חיץ (10 מ"מ Tris (pH 7.4), 1.5 מ"מ EDTA, 150 מ"מ NaCl, 1% Triton X-100, קוקטייל 1X פרוטאז מעכב).
- RemOve מנות מחזיק את תרבויות astrocyte מן האינקובטור, וזורקים את המדיום.
- לשטוף תאים שלוש פעמים עם 4 מ"ל קר C-PBS, ומניחים את הכלים על קרח כתוש.
- פיפטה 2 מ"ל חיץ biotin לתוך כל טוב, בעדינות להטות מנות קדימה ואחורה כמה פעמים כדי להבטיח כיסוי מלא. השאירו על הקרח במשך 30 דקות.
- הסר את חיץ ביוטין באמצעות aspirator, ולהחליף עם 4 מ"ל מרווה חיץ. השאירו על הקרח במשך 10 דקות.
- לשאוב את המאגר מרווה, ולהחליף עם נפח שווה של אותו. שוב, להשאיר על קרח במשך 10 דקות.
- מחק את המאגר מרווה, לשטוף תאים שלוש פעמים עם 4 מ"ל מקורר CM-PBS.
- תאים לגרד לתוך 1 מ"ל מקורר CM-PBS באמצעות מרים התא, ולהעביר את ההשעיה כדי microcentrifuge צינור.
- תאים גלולה על ידי צנטריפוגה ב XG 100 במשך 3 דקות. מחק supernatant, מחדש להשעות תאים μL 500 של חיץ תמוגה.
- השאירו דגימות על קרח במשך 30 דקות, vortexing כל 5 דקות, או plאס אותם על סוף סוף מסובב על 4 מעלות צלזיוס.
- צנטריפוגה lysate ב XG 14,000 במשך 10 דקות על 4 מעלות צלזיוס כדי גלולה כל חומרי ניקוי מסיסים. מעבירים את supernatant לתוך צינור microcentrifuge חדש.
- שמור 50 μL של lysate ולהוסיף חיץ טוען אליו. ואז להכחיש אותו על ידי חימום על 95 מעלות צלזיוס באמבטיה יבשה; זהו חלק "קלט", המכיל שני חלבונים פני השטח biotinylated, כמו גם חלבונים cytosolic שאינם biotinylated.
- להרחיב את הפתח של קצה פיפטה ידי חיתוך כ 0.5 ס"מ של חומר מקצהו באמצעות זוג מספריים חדים. באמצעות קצה זה פיפטה, העברת 75 μL של חרוזים streptavidin-agarose (מאוחסן בדרך כלל 4 מעלות צלזיוס) כדי lysate, ו דגירה על 4 מעלות צלזיוס במשך 3 שעות על שייקר / נדנדה.
- כמו streptavidin-agarose נמכר לעתים קרובות כמו סלורי המכיל 50% חרוזים על ידי נפח, מושעה פתרון מיקרוביאלית, triturate slurry כדי להבטיח כי חרוזיםהם מושעה באופן שווה, ולאחר מכן פיפטה 150 μL ההשעיה לתוך כל מדגם.
- גלולה streptavidin-agarose חרוזים על ידי צנטריפוגה ב XG 1500 עבור 30 s ב 4 ° C.
- שמור 50 μL של supernatant (להוסיף חיץ טוען וללכת אותו על 95 מעלות צלזיוס באמבט מים או בלוק חימום); זה מייצג את החלק "תאיים", והוא מורכב בעיקר של biotinylated cytosolic חלבונים.
- Resuspend את החרוזים pelleted במאגר 1 מ"ל לשטוף, רוק זה 3 דקות ב 4 ° C. גלולות חרוזים (כמו בשלב 1.16), ולזנוח supernatant. חזור על תהליך זה 4x כדי למזער את החיבור הלא ספציפי של חלבונים cytosolic nonbiotinylated.
- גלולה את החרוזים על ידי צנטריפוגה (1500 xg במשך 30 s ב 4 ° C), ולבטל את החיץ לשטוף מעל. הוסף 50 μL של חיץ 1X טוען (מדולל באמצעות חיץ תמוגה). שחרור ביוטין ו streptavidin מחרוזים על ידי denaturing זה ב 95 מעלות צלזיוס; זה קטע שוUld מכילים biotinylated תאים חלבונים פני השטח בלבד ("שטח התא" שבר).
- נפרד קלט, משטח התא, שברים תאיים ידי SDS-PAGE 13 , ולנתח על ידי סופג המערבי 14 .
הערה: למרות שהשתמשנו בג'ל מדורג של 4% -20% בניסוי שלנו, הפרדה של 12% 14% עם שכבה של 4% בערימה (כל אחת המכילה 0.1% SDS) צריכה להספיק עבור החלבונים המעניינים במחקר זה. תקן משקל מולקולרי של טווח הגודל המתאים צריך לשמש גם. שים לב כי לפעמים יכול להיות upshift הנצפים בהמונים המולקולרית לכאורה של חלבונים biotinylated.
- נפרד קלט, משטח התא, שברים תאיים ידי SDS-PAGE 13 , ולנתח על ידי סופג המערבי 14 .
2. קביעת שיעור הפנמה של חלבונים על פני התא באסטרוציטים על ידי Biotinylation
הערה: להלן, אנו מתארים ניסוי טיפוסי הדופק לרדוף biotinylation בשימוש במקרה זה כדי לעקוב אחר אנדוציטוזה של AQP4 ב astrocytes. זֶההשיטה מבוססת על זה בשימוש על ידי מדריד et al. 15 . חומרים מיוחדים הנדרשים כוללים sulfo-NHS-SS- ביוטין, שרף streptavidin-agarose, מופחת גלוטתיון, ו iodoacetamide (ראה טבלה של חומרים ).
- הכינו תרבויות של astrocytes קליפת המוח במנות 60 מ"מ באמצעות השיטות המתוארות בסעיף הקודם. ודא כי תאים הם כ 70% confluent ביום assay, וכי כל מנה מכילה מספר שווה של תאים.
- מיד לפני assay, להכין את הבאים, ומניחים על קרח או קירור: CM-PBS (100 מ"ג / L MgCl 2 ∙ 6H 2 O ו 100 מ"ג / L CaCl 2 ב 1X PBS, pH7.4), חיץ ביוטין (0.5 מ"ג / מ"ל sulfo-NHS-SS-biotin ב CM-PBS), צמצום חיץ (50 מ"מ מופחת גלוטתיון, 75 מ"מ NaCl ו 75 מ"מ NaOH), חיץ מרווה (50 מ"מ iodoacetamide, 1% BSA, ב CM- PBS) חיץ תמוגה (25 מ"מ טריס, pH 7.4, גליצין 25 מ"מ, 150 מ"מ NaCl ו 5 מ"מ EDTA, 1% טריטון X-100, 1קוקטייל מעכב פרוטאז X), חיץ 3X טעינה (150 מ"מ טריס, pH 6.8, SDS 6%, גליצרול 30%, 300 מ"מ DTT ו 0.01% ברומופנול כחול), לשטוף חיץ (10 מ"מ טריס, pH 7.4, 1.5 מ"מ EDTA, 150 מ"מ NaCl, 1% טריטון X-100, קוקטייל 1X פרוטאז מעכב).
- הכן בינוני תרבית תאים טרי (DMEM בתוספת 10% עוברי Bbovine בסרום (FBS), 1% פניצילין / סטרפטומיצין, ו -1% L- גלוטמין), ומניחים אותו באמבט מים 37 מעלות צלזיוס.
- הסר תרבויות astrocyte מן האינקובטור, לשאוב את המדיום באמצעות aspirator.
- לשטוף תאים שלוש פעמים עם 4 מ"ל קר C-PBS, ומניחים את הכלים על קרח כתוש.
- פיפטה 3 מ"ל חיץ biotin לתוך כל מנה, להטות מנות קדימה ואחורה כמה פעמים על מנת להבטיח כי חיץ מופץ היטב, ולהשאיר את זה על קרח במשך 30 דקות.
- לשאוב חיץ ביוטין, ולהחליף אותו עם בינוני 5 מ"ל חם. דגירה צלחת תרבות על 37 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות, וכן צלחת שנייה באותה טמפרטורה במשך 30 דקות. השאירו מנה נוספת ב 46; C כמו 0 דקות מדגם.
- בסוף תקופת הדגירה, להשליך בינוני, לשטוף תאים שלוש פעמים עם 4 מ"ל קר C-PBS. פיפטה 6 מ"ל חיץ הפחתת על תאים, ולהשאיר על קרח במשך 15 דקות.
- הסר חיץ הפחתת, ולאחר מכן להחליף עם חיץ 6 מ"ל צמצום טרי. מניחים על הקרח במשך 15 דקות נוספות.
- הסר פתרון הפחתת להחליף עם 6 מ"ל מרווה חיץ. השאירו על הקרח במשך 15 דקות.
- חזור על מרווה צעד שוב.
- מחק חיץ מרווה, לשטוף תאים שלוש פעמים עם 4 מ"ל PBS צונן.
- תאים לגרד לתוך 1 מ"ל מקורר PBS באמצעות מרים התא, ולהעביר את ההשעיה לתוך צינור microcentrifuge.
- תאים גלולה על ידי צנטריפוגה ב XG 100 במשך 3 דקות. מחק supernatant, תאים resuspend במאגר 500 תמוגה μL.
- השאירו את זה על קרח במשך 30 דקות ו מערבולת כל 5 דקות. לחלופין, במקום דגימות על מסובבי סוף סוף על 4 מעלות צלזיוס למשך זמן זה.
- צנטריפוגה לייסיאט ב XG 14,000 במשך 10 דקות ב 4 מעלות צלזיוס כדי גלולה חומרי ניקוי חומרי ניקוי, ולאחר מכן להעביר supernatant לצינור microcentrifuge חדש. שמור 50 μL של lysate זה, להוסיף חיץ טוען אליו ולפגוע ב 95 ° C באמבטיה יבשה; זהו חלק "קלט", המכיל שני חלבונים endocytosed biotinylated, כמו גם חלבונים nonbiotinylated.
- בעזרת קצה פיפטה לחתוך, להוסיף 150 μL של slrery streptavidin-agarose כדי lysate, ו דגירה על 4 מעלות צלזיוס למשך 3 שעות על שייקר / נדנדה. לפרטים נוספים על שלב זה ראה 1.15.
- גלולה streptavidin-agarose חרוזים על ידי צנטריפוגה ב XG 1500 במשך 30 s ב 4 ° C.
- חרוזים Resuspend במאגר 1 מ"ל לשטוף, רוק במשך 3 דקות ב 4 מעלות צלזיוס. גלולות חרוזים (לפי שלב 2.18), ולזנוח supernatant. חזור על תהליך זה 4x כדי למזער את החיבור הלא ספציפי של חלבונים cytosolic nonbiotinylated.
- גלולה חרוזים על ידי צנטריפוגה ב XG 1500 במשך 30 s, ב 4 ° C, וזורקים oveלשטוף לשטוף חיץ. הוסף 50 μL חיץ 1X טוען (מדולל באמצעות חיץ תמוגה). שחרור ביוטין ו streptavidin מחרוזים על ידי denaturing ב 95 ° C; שבר זה צריך להכיל חלבונים פנימיים פנימיים בלבד ("endocytosed" חלק).
- הפרד את הקלט, את פני השטח של התא, ואת החלקים הלא מאוגדים על-ידי SDS-PAGE 13 , ונותח על-ידי סופג מערבי 14 .
הערה: למרות שהשתמשנו בג'ל מדורג של 4% -20% בניסוי שלנו, הפרדה של 12% 14% עם שכבה של 4% בערימה (כל אחת המכילה 0.1% SDS) צריכה להספיק עבור החלבונים המעניינים במחקר זה. תקן משקל מולקולרי של טווח הגודל המתאים צריך לשמש גם. שים לב כי לפעמים יכול להיות upshift הנצפים בהמונים המולקולרית לכאורה של חלבונים biotinylated.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
באמצעות biotinylation תא השטח כדי להעריך את ביטוי הממברנה פלזמה של AQP4 ב astrocytes
Laminin שטופלו תרבויות astrocyte ותאי שליטה מטופלים היו כפופים biotinylation תא של התא באמצעות השיטות המתוארות. חלבונים Biotinylated היו זירז עם streptavidin agarose- מצומדות, ולאחר מכן מופרדים באמצעות SDS-PAGE. שברים משטח נייד נבדקו עבור AQP4 ו β-dystroglycan (β-DG) כמשטח הטעינה משטח הטעינה, בעוד שברים קלט תאיים היו מסוממים עבור AQP4 ו β- אקטין ( איור 1 א ) כמו בקרת הטעינה. עוצמות הלהקה עבור חלק משטח התא נמדדו באמצעות densitometry, ורמות AQP4 עבור כל קבוצה של תאים היו מנורמל הראשון נגד ערכי β-DG, יחסים אלה היו מנורמל אז נגד אלה של תאי השליטה. ההיסטוגרמה ( איור 1) B ) מייצג את ערכי ממוצע ± SEM עבור שלושה ניסויים עצמאיים. טיפול Laminin, בממוצע, גורם עלייה כמעט 2X AQP4 לידי ביטוי על פני התא.
חקירת קצב אנדוציטי של AQP4 באמצעות biotinylation
AQP4 endocytosis ב astrocytes היה במעקב במשך תקופה של 30 דקות. בקצרה, אנלוגי ביוטין חרוך שימש לראשונה כדי לתייג חלבונים פני השטח ב 3 מנות של האסטרוציטים. התאים הועברו ל 37 מעלות צלזיוס במשך 0, 15, ו 30 דקות, בהתאמה, במהלכו את החלבונים שכותרתו הופנמו. תיוג שנותר על פני השטח הוסר לאחר מכן באמצעות סוכן הפחתת, חלבונים endocytosed זירז עם streptavidin agarose מצומדות. בעקבות הפרדה באמצעות SDS-PAGE, אלה היו לאחר מכן נבדק עבור AQP4 ( איור 2 א ). רמות AQP4 היו לכמת באמצעות densitometry, ואת הערכים המקביל ב15 ו 30 דקות נקודות זמן היו מנורמל לאלה של 0 דקות מדגם. היסטוגרמה ( איור 2 ב ' ) מייצג את ערכי ממוצעים ± SEM עבור ארבעה ניסויים כאלה.
איור 1 . AQP4 הביטוי על פני התא בנוכחות של Laminin. (A) השטח של התא, intracular, ואת סך (Input) שברים מ אסטרוציטים מטופלים (-LN) ואסטרוציטים שטופלו עם 24 nM laminin-111 (+ LN) נבדקו עבור AQP4 ו β-DG. (B) היסטוגרמה המדגימה את ההבדלים ברמת פני השטח של התא של AQP4 מטופל laminin שטופלו האסטרוציטים, מנורמל נגד רמות β-DG. ערכים מייצגים עוצמות פיקסל ממוצעות ממוצעות ± SEM, המתבטא ביחס לערכים של תאי הבקרה. הכוכבית מציינת סטטיסטיקהעלייה משמעותית ב- AQP4, כפי שנקבע על ידי סטודנט של זנב t- test (n = 3, * p = 0.033). נתון זה שונה מ- Tham et al. 16 אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 2 . AQP4 הפנמה באסטרוציטים (א) החלבונים המופנמים על ידי תרבויות האסטרוציטים ב 0, 15 ו 30 דקות נבדקו עבור AQP4. (ב) היסטוגרמה מסכם את שיעורי הפנמה של AQP4 עבור 4 ניסויים עצמאיים, מנורמל נגד ערכים עבור נקודת זמן 0 דקות. כוכבית מציין עלייה משמעותית סטטיסטית בכמות של endocytosed AQP4 בין 15 & 30 דקות כפי שנקבע על ידי שני זנבסטודנט של t- test (n = 3, * p = 0.017). (ג) כאשר גלוטתיון משמש לשבור את הקשר דיסולפיד אנלוגי ביוטין חרוך, התרומה של AQP4 משטח התא לשבר biotinylated מופחת בצורה חדה, וכתוצאה מכך הבדל ברור בין 0 & 15 דקות דגימות (C, משמאל למעלה ) . כאשר השלב הזה מושמט, האות שמקורו בבריכת פני התא הופך את השינוי בין שתי נקודות הזמן לבלתי ניתנות לגילוי (C, למעלה מימין) . נתון זה שונה מ- Tham et al. 16 אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
שינויים:
כמו שיטות אלה נועדו לשימוש עם תאים חסיד, ציינו את השימוש של PBS המכיל 100 מ"ג / L MgCl 2 ∙ 6H 2 O ו
100 מ"ג / L CaCl 2 (CM-PBS) על מדרגות כביסה כבסיס למאגרים מסוימים, על מנת להבטיח כי התאים להישאר מחוברים למשטח התרבות, כי צמתים תא התא אינם משבשים. עם זאת, הפרוטוקולים עשויים להיות מיושמים גם על סוגי תאים nonadherent אם התאים הם pelleted בין כל שלב של ההליך. במקרים אלה, CM-PBS ניתן להחליף עם PBS.
בנוסף, חשוב לציין כי כל התנאים שהוזכרו כאן הם ספציפיים לפרוטוקול זה, צריך רק להיחשב הנחיות גסות אם השיטות הן להיות מועסקים עבור יישומים אחרים. במיוחד, יש לוודא באופן עצמאי כי הליך החילוץ דטרגנט מתאים הR סוג התא, וכי הגדרות צנטריפוגה מתאימים סוג התא, ועל החרוזים streptavidin-agarose בשימוש.
לבסוף, אם יש חששות לגבי מחייב לא ספציפי, ו / או רקע מוגזם, ניתן להחליף streptavidin עם צורות avidin שונים אחרים הקיימים כיום בשוק. לדוגמה, avidin deglycosylated יש זיקה נמוכה משמעותית עבור lectins, ועל מולקולות טעונות שליליות כגון DNA.
פתרון בעיות ובקרות:
בעוד שהנהלים הנסקרים בדוח זה הם פשוטים למדי, יש לשים לב למספר נושאים קריטיים שיכולים להשפיע על תוצאות הניסוי. ראשית, בעוד שני מבחני תלויים בכבדות על הטבע קרום- impermant של ריאגנטים biotinylation סולפט, תנאים מסוימים עלולים לגרום קרום הפלזמה של התאים כדי להיות שיבשו, וכתוצאה מכך חלבונים תאיים מסוימיםביוטין. כדי לשלוט על אפשרות זו, הוא הציע כי שברים biotinylated צריך לחקור עבור מטרות הידוע לא לבוא לידי ביטוי בקרום פלזמה, כגון β- אקטין.
יש להיזהר לדבוק בתנאי אחסון נאותים עבור ריאגנטים biotinylation (בדרך כלל 4 או 20 ° C, עם צורה כלשהי של יובש), כמו אלה עשויים להיכשל אחרת, בשל אופי רגיש מאוד שלהם. עם זאת, מומלץ לבדוק את השברים, biotinylated, ו nonbiotinylated שברים עם streptavidin-HRP כדי לוודא biotinylation אכן התרחשה, וכי חלבונים biotinylated כבר זירז ביעילות (אשר יתברר מן העדר אות ב שאינו biotinylated חלק). פעולה זו צריכה לאפשר את חיסול האפשרות של ריאגנטים פגומים.
Disulfide הפחתת האג"ח היא צעד מכריע בהליך biotinylation endocytic, כפי שהיא מבטיחהכי רק חלבונים מופנם יהיה מבודד חלק biotinylated. שילוב בקרות בהם מגיב הפחתת מושמט ( איור 1 ג ) מאפשר אחד כדי לקבל רושם על היעילות של הטיפול.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים אינם מכריזים על ניגוד עניינים.
Acknowledgments
פרויקט זה נתמך על ידי המכון הקנדי לבריאות מחקר PG # 20R47867.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ammonium chloride (NH4Cl) | Fisher Scientific | A661-500 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A9647-50 | |
| Bromophenol blue | Bio-Rad | #1610404 | |
| cOmplete protease inhibitor cocktail | Sigma-Aldrich | 11697498001 | |
| Disodium Ethylenediaminetetraacetate dihydrate (EDTA) | Bio-Rad | #1610729 | |
| Dithiothreitol (DTT) | Bio-Rad | #1610611 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibco/Thermo Fisher Scientific | 11960-044 | |
| EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotin | Thermo Fisher Scientific | #21335 | |
| EZ-Link Sulfo-NHS-SS-Biotin | Thermo Fisher Scientific | #21331 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco/Thermo Fisher Scientific | 16000-044 | |
| Glycerol | Fisher Scientific | BP229-1 | |
| Glycine | Sigma-Aldrich | G8898 | |
| Iodoacetamide | Bio-Rad | #163-2109 | |
| Laminin from Engelbreth-Holm-Swarm murine sarcoma basement membrane | Sigma-Aldrich | L2020 | Thaw on ice. |
| L-glutamine | Gibco/Thermo Fisher Scientific | 25030-081 | |
| Mouse monoclonal anti-β-actin antibody (AC-15) | Sigma-Aldrich | A5441 | |
| Mouse monoclonal anti-β-dystroglycan antibody (43DAG1/8D5) | Leica Biosystems | B-DG-CE | |
| Penicillin/streptomycin | Gibco/Thermo Fisher Scientific | 15140-122 | |
| Peroxidase AffiniPure Donkey anti-Mouse IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 715-035-150 | |
| Peroxidase AffiniPure Goat anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 111-035-045 | |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Gibco/Thermo Fisher Scientific | 10010-023 | |
| Reduced glutathione | Sigma-Aldrich | G6529 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Fisher Scientific | S271-500 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) | Sigma-Aldrich | 862010 | |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Fisher Scientific | S318-100 | |
| Streptavidin agarose resin | Thermo Fisher Scientific | #20347 | |
| Rabbit polyclonal anti-AQP4 antibody | Alomone | AQP-004 | |
| Tris base (Trizma base) | Fisher Scientific | BP152-1 | |
| Tris-HCl | Fisher Scientific | BP153-1 | |
| Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151-500 |
References
- Baskin, G., Schenker, S., Frosto, T., Henderson, G. Transforming growth factor beta 1 inhibits epidermal growth factor receptor endocytosis and down-regulation in cultured fetal rat hepatocytes. J Biol Chem. 266 (20), 13238-13242 (1991).
- Hazum, E., Cuatrecasas, P., Marian, J., Conn, P. M. Receptor-mediated internalization of fluorescent gonadotropin-releasing hormone by pituitary gonadotropes. Proc Natl Acad Sci U S A. 77 (11), 6692-6695 (1980).
- Hemmaplardh, D., Morgan, E. H. Transferrin uptake and release by reticulocytes treated with proteolytic enzymes and neuraminidase. Biochim Biophys Acta. 426 (3), 385-398 (1976).
- Katsura, T., et al. Constitutive and regulated membrane expression of aquaporin 1 and aquaporin 2 water channels in stably transfected LLC-PK1 epithelial cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 92 (16), 7212-7216 (1995).
- Li, Y., Cam, J., Bu, G. Low-density lipoprotein receptor family: endocytosis and signal transduction. Mol Neurobiol. 23 (1), 53-67 (2001).
- Gyorgy, P., Melville, D. B., Burk, D., Du Vigneaud, V. The possible identity of vitamin H with biotin and coenzyme R. Science. 91 (2358), 243-245 (1940).
- Cole, S. R., Ashman, L. K., Ey, P. L. Biotinylation: an alternative to radioiodination for the identification of cell surface antigens in immunoprecipitates. Mol Immunol. 24 (7), 699-705 (1987).
- Green, N. M. Avidin 1. the use of [14-C]biotin for kinetic studies and for assay. Biochem J. 89 (3), 585-591 (1963).
- Korpela, J. Avidin, a high affinity biotin-binding protein, as a tool and subject of biological research. Med Biol. 62 (1), 5-26 (1984).
- Li, Y., et al. Imaging pHluorin-tagged receptor insertion to the plasma membrane in primary cultured mouse neurons. J Vis Exp. (69), e4450 (2012).
- Soohoo, A. L., Bowersox, S. L., Puthenveedu, M. A. Visualizing clathrin-mediated endocytosis of G protein-coupled receptors at single-event resolution via TIRF microscopy. J Vis Exp. (92), e51805 (2014).
- Noel, G., Tham, D. K., Moukhles, H. Interdependence of laminin-mediated clustering of lipid rafts and the dystrophin complex in astrocytes. J Biol Chem. 284 (29), 19694-19704 (2009).
- Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).
- Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. Proc Natl Acad Sci U S A. 76 (9), 4350-4354 (1979).
- Madrid, R., et al. Polarized trafficking and surface expression of the AQP4 water channel are coordinated by serial and regulated interactions with different clathrin-adaptor complexes. EMBO J. 20 (24), 7008-7021 (2001).
- Tham, D. K., Joshi, B., Moukhles, H. Aquaporin-4 Cell-Surface Expression and Turnover Are Regulated by Dystroglycan, Dynamin, and the Extracellular Matrix in Astrocytes. PLoS One. 11 (10), 0165439 (2016).
