Summary
تم عرض اثنين من الطرق القائمة على بيوتينيلاتيون، والمصممة لتحديد التعبير سطح الخلية ومعدل إندوسيتيك من البروتينات أعرب في غشاء البلازما، في هذا التقرير.
Abstract
بروتينات سطح الخلية توسط مجموعة واسعة من الوظائف. في كثير من الحالات، وينظم نشاطها من قبل عمليات إندوسيتيك التي تعدل مستوياتها في غشاء البلازما. هنا، نقدم بروتوكولات مفصلة لطريقتين التي تسهل دراسة مثل هذه العمليات، وكلاهما تقوم على مبدأ بيوتينيلاتيون من البروتينات سطح الخلية. تم تصميم الأول للسماح لتحديد شبه الكمي من المستويات النسبية للبروتين معين على سطح الخلية. في ذلك، يتم وصف بقايا ليسين من البروتينات غشاء البلازما من الخلايا لأول مرة مع شراب البيوتين. مرة واحدة يتم ليسد الخلايا، ويمكن بعد ذلك عجلت هذه البروتينات على وجه التحديد عن طريق استخدام الاغاروز يجمد ستريبتافيدين من خلال استغلال تقارب الطبيعي من هذا الأخير لالبيوتين. ويمكن بعد ذلك تحليل البروتينات المعزولة في مثل هذه الطريقة عن طريق نهج الغربية النشاف القياسية. الطريقة الثانية توفر وسيلة لتحديد معدل إندوسيتيك من الجسيماتأر على سطح الخلية على مدى فترة من الزمن. يتم تعديل البروتينات سطح الخلية لأول مرة مع مشتق البيوتين تحتوي على السندات ثاني كبريتيد قابل للانقسام. ثم تحولت الخلايا مرة أخرى إلى ظروف الثقافة العادية، والذي يسبب امتصاص الإتقان من نسبة من البروتينات البيروكسيديز. بعد ذلك، يتم تقليل السندات ثاني كبريتيد مجموعات البيوتين غير استيعابها باستخدام غلوتاثيون عامل غشاء كتيمة الحد. من خلال هذا النهج، وبالتالي يمكن أن تكون معزولة البروتينات إندوسيتوسد وكمية مع درجة عالية من الخصوصية.
Introduction
البروتينات على سطح الخلية تلعب مجموعة متنوعة من الأدوار المركزية للحفاظ على وظيفة الخلية. في العديد من الحالات، يعتمد نشاطهم على، أو التشكيل من قبل عمليات التطعيم التي إما احتجازها مؤقتا في المواقع داخل الخلايا، أو أن توجهها نحو مسارات التحلل 1 ، 2 ، 3 ، 4 ، 5 . هنا، ونحن نسلط الضوء على 2 النهج القائم على بيوتينيلاتيون تهدف إلى السماح للمستخدم على وجه التحديد علامة وعزل البروتينات أعرب في غشاء البلازما، وتلك التي استوعبت حديثا. وباستخدام هذه الطرق، يمكن تقدير حجم التعبير عن سطح الخلية ومعدل الإلتهاب من أي بروتين من الفائدة، مما يسمح بإجراء تقييم أوضح لتنظيمها.
تحديد النسبي البروتين سطح الخلية التعبير عن طريق بيوتينيلاتيون
البيوتين، أو فيتامين B7، المعروف سابقا باسم فيتامين H 6 ، هو جزيء صغير قابل للذوبان في الماء يمكن استخدامه لتعديل كيميائي أمين تفاعلي، سلفهيدريل، وكربوكسيل مجموعات من الجزيئات البيولوجية. يتكون المحصول الحالي من الكواشف بيوتينيلاتيون سطح الخلية في المقام الأول من استرات سولفوناتد N- هيدروكسيسوتشينيميد (سولفو-نهس) غشاء من البيوتين أو مشتقاته في المقام الأول، مصممة للرد مع الأمينات الموجودة على سلاسل جانبية من بقايا الليزين من البروتينات أعرب في سطح الخلية عندما تصبح هذه ديبروتوناتد في ظل الظروف الأساسية، مما أدى إلى الأخير تشكيل رابطة أميد مع شراب البيوتين 7 . وهكذا يمكن عزل البروتينات سطح الخلية بعد ذلك عن طريق استخدام أفيدين، وهو 66-69 كيلو دالتون تيترامريك البروتين التي تمتلك تقارب كبير للبيوتين، ملزمة لهذا الأخير مع ثابت التفكك ما يقرب من 10 -15 ، بمناسبة أنها واحدة من أقوى التفاعلات غير التكافلية المعروفة 8 ، 9 .
وقد تم استخدام عدد من الطرق البديلة لقياس التعبير البروتين على سطح الخلية في الدراسات السابقة. وضع العلامات من الخلايا أونرمبيليزد باستخدام الأجسام المضادة الموسومة فلورزنتلي محددة للبروتين من الفائدة، تليها التصور عن طريق المجهر مضان، على سبيل المثال، هو نهج شائع الاستخدام، ولكن يعتمد بشكل كبير على توافر الأجسام المضادة التي يمكن أن ترتبط إلى الحواتم خارج الخلية. وفي الآونة الأخيرة، استخدمت أيضا أساليب تنطوي على استخدام البروتينات خيالية تحمل فلوروفوريس الحساسة الرقم الهيدروجيني التي تتفاعل مع التعرض لوسائل الإعلام الحمضية بنجاح 10 . ومع ذلك، مثل هذه المقايسات وعادة ما تنطوي على التعبير الخارجي لهذه البنيات في خطوط الخلايا التي لم يتم العثور على البروتين من الفائدة أصلا. هذه النهج هي مع ذلك قادرة على توفير معلومات قيمة بشأن توطين تحت الخلوية وخط سير إكسوسيتيك منالبروتين المستهدف، وبالتالي يجب أن تستخدم جنبا إلى جنب مع النهج القائم على بيوتينيلاتيون الموصوفة هنا إذا كانت الأدوات المتاحة.
في مقايسة بيوتينيلاتيون نموذجي، يتم غسلها لأول مرة الخلايا تماما في 4 درجات مئوية بس. هذا يزيل أي آثار من البروتينات المصل التي أدخلتها وسائل الإعلام، وبالتالي ضمان أن هذه لن تستهلك كميات زائدة من البيوتين في الخطوة التالية. الأهم من ذلك، انخفاض درجة الحرارة يسبب الإلتقام إلى التباطؤ بشكل ملحوظ. ثم يتم إضافة كاشف بيوتينيلاتيون. بعد ذلك، يتم غسل الخلايا مرة أخرى، ومن ثم حضنت مع المخزن المؤقت التبريد التي تحتوي على إما الجلايسين أو نه 4 كل، والغرض منها هو تعطيل جميع الآثار المتبقية من البيوتين غير المتفاعل. ثم يتم ليسد الخلايا، وبعد ذلك يضاف أغاروس ستريبتافيدين يجمد لترسيب البروتينات البيروكسيديز. ويتم التحليل عادة عن طريق النشاف الغربية، مما يسمح للتعبير النسبي سطح الخلية من مختلف العلاقات العامةأوتينز أن يكون كميا.
ويرجع ذلك إلى أساس هذا الفحص، وهي مناسبة للاستخدام فقط مع البروتينات التي تمتلك أجزاء تتعرض للبيئة خارج الخلية. تعدد البروتينات الغشائية، التي تمتلك على الأرجح عددا من ليسينس رد الفعل داخل المناطق حلقة، هي الأكثر قابلية لهذا الأسلوب، في حين أن البروتينات تمرير واحد تميل إلى أن تكون أقل عرضة لكونها بيوتينيلاتد. حتى في هذه الحالات، لا يزال هناك احتمال أن التغيرات التوافقية أو التفاعلات بين الجزيئات قد تلغي بعض المواقع رد الفعل، مما أدى إلى العائد بيوتينيلاتيون أقل من المتوقع.
تحديد معدل الاستيعاب للبروتينات سطح الخلية بواسطة بيوتينيلاتيون
مبادئ هذه المقايسة مشابهة إلى حد كبير لتلك التي بيوتينيلاتيون سطح الخلية، مع عدد من الاستثناءات، وأهمها هو استخدام الكواشف بيوتينيلاتيون عكسها. مجموعات البيوتين (من هذه) تمتلك ديسوفي إطار هياكلها، التي تكون عرضة لعوامل الاختزال؛ يتم استغلال هذا لضمان أن البروتينات فقط سطح الخلية التي اتخذت في المواقع داخل الخلايا خلال فترة الفحص سيتم ترك البيروكسيديز. عادة ما يتم إجراء الفحص على النحو التالي. يتم غسلها لأول مرة الخلايا والبيروكسيديز مع الكواشف الباردة، ثم يتم إعادة إدخال وسط ثقافة الخلية عند 37 درجة مئوية، ويتم إرجاع الخلايا إلى الحاضنة. وهذا يسبب البروتينات السطحية الخلية المسمى لخضوع الإلتقام. ثم يضاف عامل الجلوتاثيون المختزل - الذي لا يمكن أن يخترق الغشاء - لكسر السندات ثنائية الكبريتيد من شقوق البيوتين المرتبطة بالبروتينات المتبقية على سطح الخلية. وأخيرا، يتم تفاعل السندات ثاني كبريتيد كسر مع يودواسيتاميد، تستهلك مجموعات ثيول عاملة ومنع الروابط من الإصلاح. كما كان من قبل، ثم يتم ليسد الخلايا، وترسب البروتينات المسمى باستخدام ستريبتافيدين-أغاروس.
قرص القيودأوسد في القسم السابق ينطبق أيضا هنا بسبب أوجه التشابه المشتركة بين الأساليب. وبالإضافة إلى ذلك، فإنه من الجدير أن نضع في اعتبارنا أن التحولات درجة الحرارة المشاركة في هذا الفحص يحول دون التحديد الدقيق لكمية البروتين هو إندوسيتوسد لكل زيادة الوقت، لا سيما في حالة البروتينات استيعابها بسرعة أو بسرعة إعادة التدوير. وبالتالي فإن الفحص يوفر فقط تقدير سيميكانتيتاتيف من معدلات الإلتقام. مجموع المجهر انعكاس الانعكاس الداخلي يمكن استخدامها لتتبع امتصاص كل حويصلة محملة وتوفير قياس أكثر دقة من حركية الإلتقام. وبالتالي يمكن أن توفر مكملا مفيدا جدا لهذا الفحص، على افتراض أن بناء فلورزنتلي الموسومة خيالية من البروتين من الفائدة متاح 11 .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. تحديد النسبية سطح البروتين التعبير البروتين في الخلايا النجمية بواسطة بيوتينيلاتيون
ملاحظة: هنا، ونحن توضيح تطبيق هذه التقنية بيوتينيلاتيون لدراسة آثار خارج الخلية مصفوفة جزيء لامينين على توطين سطح الخلية من أكوابورين-4 قناة المياه نفاذية (AQP4). المواد المتخصصة اللازمة لهذا الاختبار تشمل سولفو-نهس-LC- البيوتين وراتنج ستريبتافيدين الاغاروز (انظر جدول المواد ).
- باستخدام الطريقة الموضحة في نويل وآخرون. 12 ، وإعداد الثقافات من الخلايا النجمية القشرية حوالي 2 أسابيع في وقت مبكر من الفحص، وتنمو في 75 سم 2 القوارير ثقافة تنفيس. عندما النجمية هي 80-90٪ متموجة، فصل لهم من سطح الثقافة باستخدام 0.05٪ التربسين، ومن ثم مرور لهم 1: 3.
- في 48 ساعة قبل الفحص، عندما تكون الخلايا مرة أخرى 80-90٪ متموجة، الخلايا النجمية مرور 1: 3 (وهو ما يمثل cهانج في شكل الثقافة) على 60 ملم أطباق ثقافة الخلية بحيث تكون> 70٪ متموجة في يوم التجربة هو أن تأخذ مكان. تأكد من أن الخلايا موزعة بالتساوي بين الأطباق.
- في 16 ساعة قبل الفحص، مامين لامينين في وسط الثقافة إلى تركيز النهائي من 24 نانومتر، واحتضان عند 37 درجة مئوية.
- مباشرة قبل الفحص، وإعداد ما يلي، ثم وضع على الجليد أو التبريد: سم-بس (100 ملغ / لتر مغكل 2 ∙ 6H 2 O و 100 ملغ / لتر كاكل 2 في برنامج تلفزيوني 1X، ودرجة الحموضة 7.4)، البيوتين العازلة (0.5 ملغ / مل سولفو-نهس-لك-بيوتين في سم-بس)، تبريد المخزن المؤقت (50 ملي NH4 كل في سم-بس)، العازلة تحلل (25 ملي تريس، ودرجة الحموضة 7.4، 25 ملي جلايسين، 150 ملي كلوريد الصوديوم و 5 ملي إدتا، 1٪ تريتون X-100، 1X بروتيز المانع كوكتيل)، 3X تحميل العازلة (150 ملي تريس، ودرجة الحموضة 6.8، 6٪ سدز، 30٪ الجلسرين، 300 ملي دت و 0.01٪ بروموفينول الأزرق)، وغسل العازلة (10 ملم تريس (الرقم الهيدروجيني 7.4)، 1.5 ملي إدتا، 150 ملي كلوريد الصوديوم، 1٪ تريتون X-100، 1X بروتياز كوكتيل المانع).
- ريمأوفي الأطباق عقد ثقافات الخلايا النجمية من الحاضنة، وتجاهل المتوسطة.
- غسل الخلايا ثلاث مرات مع 4 مل المبردة سم-بس، ووضع الأطباق على الجليد المسحوق.
- ماصة 2 مل العازلة البيوتين في كل بئر، وإمالة بلطف أطباق ذهابا وإيابا عدة مرات لضمان التغطية الكاملة. ترك على الجليد لمدة 30 دقيقة.
- إزالة العازلة البيوتين باستخدام الشافطة، واستبدالها مع 4 مل العازلة التبريد. ترك على الجليد لمدة 10 دقيقة.
- نضح العازلة التبريد، واستبدال مع حجم يعادل من نفسه. مرة أخرى، وترك على الجليد لمدة 10 دقيقة.
- تجاهل المخزن المؤقت التبريد، وغسل الخلايا ثلاث مرات مع 4 مل المبرد سم-بس.
- كشط الخلايا في 1 مل المبرد سم-بس باستخدام رافع الخلية، ونقل التعليق إلى أنبوب ميكروسنتريفوج.
- خلايا بيليه بواسطة الطرد المركزي في 100 x ج لمدة 3 دقائق. تجاهل طاف، وإعادة تعليق الخلايا في 500 ميكرولتر من العازلة تحلل.
- ترك عينات على الجليد لمدة 30 دقيقة، فورتيكسينغ كل 5 دقائق، أو بلإيس لهم على نهاية-- نهاية-- نهاية المدورة في 4 درجات مئوية.
- أجهزة الطرد المركزي المحللة في 14،000 x ج لمدة 10 دقيقة في 4 درجات مئوية لبيليه أي المواد المنظفات غير قابلة للذوبان. نقل طاف إلى أنبوب ميكروسنتريفوج جديد.
- حفظ 50 ميكرولتر من هذا المحللة وإضافة عازلة التحميل لذلك. ثم ينكر ذلك عن طريق التسخين في 95 درجة مئوية في حمام جاف. وهذا هو "المدخلات" جزء، تحتوي على كل من البروتينات الخلية السطحية البيروكسيديز، فضلا عن البروتينات عصاري خلوي غير بيوتينيلاتد.
- توسيع افتتاح طرف ماصة عن طريق قطع حوالي 0.5 سم من المواد من نهايته باستخدام زوج من مقص حاد. باستخدام هذه غيض ماصة، ونقل 75 ميكرولتر من الخرز ستريبتافيدين-أغاروس (عادة تخزينها في 4 درجات مئوية) إلى المحللة، واحتضان في 4 درجات مئوية لمدة 3 ساعة على شاكر / الروك.
- كما يتم بيع ستريبتافيدين-أغاروس في كثير من الأحيان كما الطين التي تحتوي على حبات 50٪ من حيث الحجم، علقت في حل مضاد للميكروبات، تريتورات الطين للتأكد من أن الخرزيتم تعليق بالتساوي، ومن ثم ماصة 150 ميكرولتر من تعليق في كل عينة.
- بيليه ستريبتافيدين-الاغاروز الخرز بواسطة الطرد المركزي في 1500 x ج لمدة 30 ثانية في 4 درجات مئوية.
- حفظ 50 ميكرولتر من طاف (إضافة تحميل المخزن المؤقت و ينكر ذلك في 95 درجة مئوية في حمام الماء أو كتلة التدفئة). وهذا يمثل "داخل الخلية"، ويتكون في المقام الأول من البروتينات عصاري خلوي غير البيروكسيديز.
- ريسوسبيند الخرز مكعبات في 1 مل غسل العازلة، والصخور هذا لمدة 3 دقائق في 4 درجات مئوية. حبات بيليه (كما هو الحال في الخطوة 1.16)، وتجاهل طاف. كرر هذه العملية 4x لتقليل ملزمة غير محددة من البروتينات عصاري خلوي نونبيوتينيلاتد.
- بيليه الخرز بواسطة الطرد المركزي (1500 x ج لمدة 30 ثانية في 4 درجات مئوية)، وتجاهل العازلة غسل المغطي. إضافة 50 ميكرولتر من 1X تحميل العازلة (المخفف باستخدام العازلة تحلل). الافراج عن البيوتين و ستريبتافيدين من الخرز عن طريق تغيير طبيعة هذا في 95 درجة مئوية. هذا الجزء شوأولد يحتوي على البروتينات سطح الخلية البيروكسيديز فقط ("سطح الخلية" جزء).
- مدخلات منفصلة، سطح الخلية، والكسور داخل الخلايا عن طريق سدز-بادج 13 ، وتحليل بواسطة النشاف الغربية 14 .
ملاحظة: في حين استخدمنا هلام التدرج برياكاست 4-20٪ في تجاربنا، يجب أن يكون 12 - 14٪ فصل هلام مع طبقة التراص 4٪ (كل تحتوي على 0.1٪ سدز) كافية للبروتينات التي تهم هذه الدراسة. وينبغي أيضا استخدام معيار الوزن الجزيئي من حجم الحجم المناسب. لاحظ أنه يمكن أن يكون هناك أحيانا أوبشيفت يمكن ملاحظتها في الجماهير الجزيئية واضحة من البروتينات البيروكسيديز.
- مدخلات منفصلة، سطح الخلية، والكسور داخل الخلايا عن طريق سدز-بادج 13 ، وتحليل بواسطة النشاف الغربية 14 .
2. تحديد معدل تدخيل بروتينات الخلية السطحية في الخلايا النجمية بواسطة بيوتينيلاتيون
ملاحظة: في ما يلي، ونحن تصف نموذجية بيوتينيلاتيون نبض مطاردة التجربة المستخدمة في هذه الحالة لتتبع الإلتقام من AQP4 في الخلايا النجمية. هذهتعتمد على الطريقة التي استخدمها مدريد وآخرون. 15 - المواد المتخصصة المطلوبة تشمل سولفو-نهس-SS- البيوتين، الراتنج ستريبتافيدين الاغاروز، وانخفاض الجلوتاثيون، و يودواسيتاميد (انظر جدول المواد ).
- إعداد ثقافات الفأر النجمية القشرية في أطباق 60 ملم باستخدام الأساليب المذكورة في القسم السابق. تأكد من أن الخلايا ما يقرب من 70٪ متموجة في يوم الفحص، وأن كل طبق يحتوي على عدد مماثل من الخلايا.
- مباشرة قبل الفحص، وإعداد ما يلي، ومكان على الجليد أو التبريد: سم-بس (100 ملغ / L مغكل 2 ∙ 6H 2 O و 100 ملغ / لتر كاكل 2 في برنامج تلفزيوني 1X، PH7.4)، البيوتين العازلة (0.5 ملغ / مل سولفو-نهس-SS- البيوتين في سم-بس)، والحد من العازلة (50 ملي الجلوتاثيون خفض، 75 ملي كلوريد الصوديوم و 75 ملي هيدروكسيد الصوديوم)، التبريد العازلة (50 ملي يودواسيتاميد، 1٪ بسا، في سم-بس) تحلل العازلة (25 ملي تريس، ودرجة الحموضة 7.4، 25 ملي جليكاين، 150 ملي كلوريد الصوديوم و 5 ملي إدتا، 1٪ تريتون X-100، 1X بروتيز المانع كوكتيل)، 3X تحميل العازلة (150 ملي تريس، ودرجة الحموضة 6.8، 6٪ سدز، 30٪ الجلسرين، 300 ملي دت و 0.01٪ بروموفينول الأزرق)، وغسل العازلة (10 ملي تريس، ودرجة الحموضة 7.4، 1.5 ملي إدتا، 150 ملي كلوريد الصوديوم، 1٪ تريتون X-100، 1X بروتيز مثبط كوكتيل).
- إعداد مستنبت خلية جديدة (دمم تستكمل مع 10٪ مصل الجنين ببوفين (فبس)، 1٪ البنسلين / الستربتومايسين، و 1٪ L- الجلوتامين)، ووضعه في حمام مائي 37 درجة مئوية.
- إزالة الثقافات نجمي من الحاضنة، ونضح المتوسطة باستخدام الشافطة.
- غسل الخلايا ثلاث مرات مع 4 مل المبردة سم-بس، ووضع الأطباق على الجليد المسحوق.
- ماصة 3 مل العازلة البيوتين في كل طبق، أطباق الميل ذهابا وإيابا عدة مرات لضمان أن العازلة يتم توزيعها بشكل جيد، وترك هذا على الجليد لمدة 30 دقيقة.
- نضح العازلة البيوتين، واستبدالها مع 5 مل المتوسطة الدافئة. احتضان صحن الثقافة عند 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة، وطبق الثاني في نفس درجة الحرارة لمدة 30 دقيقة. ترك طبق آخر في 46؛ C كعينة 0 دقيقة.
- في نهاية فترة الحضانة، تجاهل المتوسطة، وغسل الخلايا ثلاث مرات مع 4 مل المبرد سم-بس. ماصة 6 مل الحد من المخزن المؤقت على الخلايا، وترك على الجليد لمدة 15 دقيقة.
- إزالة المخزن المؤقت الحد، ثم استبدل مع 6 مل العازلة الحد الجديدة. مكان على الجليد لمدة 15 دقيقة إضافية.
- إزالة حل الحد واستبدالها مع 6 مل العازلة التبريد. ترك على الجليد لمدة 15 دقيقة.
- كرر خطوة التبريد مرة أخرى.
- تجاهل المخزن المؤقت التبريد، وغسل الخلايا ثلاث مرات مع 4 مل المبردة برنامج تلفزيوني.
- كشط الخلايا في 1 مل برنامج تلفزيوني مبردة باستخدام رافع الخلية، ونقل تعليق في أنبوب ميكروسنتريفوج.
- خلايا بيليه بواسطة الطرد المركزي في 100 x ج لمدة 3 دقائق. تجاهل طاف، و ريسوسبيند الخلايا في 500 ميكرولتر العازلة تحلل.
- ترك هذا على الجليد لمدة 30 دقيقة ودوامة كل 5 دقائق. بدلا من ذلك، ضع العينات على نهاية نهاية المدورة في 4 درجات مئوية لهذه المدة.
- الطرد المركزي ليسيت في 14،000 x ج لمدة 10 دقيقة في 4 درجات مئوية لبيليه المواد المنظفات غير قابلة للذوبان، ثم نقل طاف إلى أنبوب ميكروسنتريفوج جديد. حفظ 50 ميكرولتر من هذا المحللة، إضافة تحميل المخزن المؤقت لذلك وانكماش في 95 درجة مئوية في حمام جاف. هذا هو "المدخلات" جزء، تحتوي على كل من البروتينات إندوسيتوسد البيروكسيديز، فضلا عن البروتينات نونبيوتينيلاتد.
- باستخدام طرف ماصة قطع، إضافة 150 ميكرولتر من الطين ستريبتافيدين أغاروس إلى المحللة، واحتضان في 4 درجات مئوية لمدة 3 ساعة على شاكر / الروك. راجع 1.15 للحصول على تفاصيل إضافية حول هذه الخطوة.
- بيليه ستريبتافيدين-الاغاروز الخرز بواسطة الطرد المركزي في 1500 x ج لمدة 30 ثانية في 4 درجات مئوية.
- الخرز ريسوسبيند في 1 مل غسل العازلة، والصخور لمدة 3 دقائق في 4 درجات مئوية. حبات بيليه (وفقا للخطوة 2.18)، وتجاهل طاف. كرر هذه العملية 4x لتقليل ملزمة غير محددة من البروتينات عصاري خلوي نونبيوتينيلاتد.
- حبات بيليه بواسطة الطرد المركزي في 1500 x ج لمدة 30 ثانية، في 4 درجات مئوية، وتجاهل أوفتحلق غسل العازلة. إضافة 50 ميكرولتر 1X تحميل العازلة (المخفف باستخدام العازلة تحلل). الافراج عن البيوتين و ستريبتافيدين من الخرز عن طريق تغيير طبيعة في 95 درجة مئوية. يجب أن يحتوي هذا الجزء على بروتينات سطح الخلية الداخلية فقط ("إندوسيتوسد" جزء).
- مدخلات منفصلة، سطح الخلية، والكسور غير منضم من قبل سدز-بادج 13 ، وتحليل بواسطة النشاف الغربية 14 .
ملاحظة: في حين استخدمنا هلام التدرج برياكاست 4-20٪ في تجاربنا، يجب أن يكون 12 - 14٪ فصل هلام مع طبقة التراص 4٪ (كل تحتوي على 0.1٪ سدز) كافية للبروتينات التي تهم هذه الدراسة. وينبغي أيضا استخدام معيار الوزن الجزيئي من حجم الحجم المناسب. لاحظ أنه يمكن أن يكون هناك أحيانا أوبشيفت يمكن ملاحظتها في الجماهير الجزيئية واضحة من البروتينات البيروكسيديز.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
باستخدام بيوتينيلاتيون سطح الخلية لتقييم التعبير غشاء البلازما من AQP4 في الخلايا النجمية
كانت الثقافات الخلايا النجمية المعاملة لامينين وخلايا التحكم غير المعالجة تخضع ل بيوتينيلاتيون سطح الخلية باستخدام الطرق الموصوفة. وقد عجلت البروتينات البيروكسيديز مع ستريبتافيدين مترافق الاغاروز، ومن ثم فصلها عن طريق سدز-بادج. تم البحث عن كسور سطح الخلية ل AQP4 و β-ديستروغليكان (β-دغ) كسيطرة تحميل الخلية السطح، في حين تم نقط المدخلات وكسور داخل الخلايا ل AQP4 و β-أكتين ( الشكل 1 A ) باعتبارها السيطرة تحميل. تم قياس كثافة الشدة لجزء سطح الخلية عن طريق قياس الكثافة، وتمت تسوية مستويات AQP4 لكل مجموعة من الخلايا لأول مرة مقابل قيم β-دغ، ثم تم تطبيع هذه النسب مع تلك الخاصة بخلايا التحكم. الرسم البياني ( الشكل 1 B ) يمثل القيم المتوسطة ± سيم لثلاثة تجارب مستقلة. علاج لامينين، في المتوسط، يسبب زيادة 2X تقريبا في AQP4 أعرب على سطح الخلية.
التحقيق في معدل التحمل من AQP4 باستخدام بيوتينيلاتيون
تم تعقب AQP4 الإلتقام في الخلايا النجمية على مدى فترة 30 دقيقة. باختصار، تم استخدام بيوتين التناظرية انقسام لأول مرة لتسمية البروتينات السطحية في 3 أطباق من الخلايا النجمية. تم تحويل الخلايا إلى 37 درجة مئوية لمدة 0، 15، و 30 دقيقة، على التوالي، والتي تم خلالها استيعاب البروتينات المسمى. ثم تم إزالة وضع العلامات التي بقيت على السطح باستخدام عامل الحد، وعجلت البروتينات إندوسيتوسد مع الاغاروز مترافق ستريبتافيدين. بعد الانفصال عن طريق سدز-بادج، ثم تم بحث هذه ل AQP4 ( الشكل 2 A ). تم قياس مستويات AQP4 باستخدام قياس الكثافة، والقيم المقابلة فيتم تطبيع 15 و 30 نقطة زمنية دقيقة لتلك التي لعينة 0 دقيقة. يمثل الرسم البياني ( الشكل 2 ب ) القيم المتوسطة ± سيم لأربع تجارب من هذا القبيل.
الشكل 1 . AQP4 التعبير في الخلية السطح في وجود لامينين. (A) تم البحث عن الكسور السطحية، داخل الخلايا، والإجمالي (الإدخال) الكسور من الخلايا النجمية غير المعالجة (-LN) والنجمية تعامل مع 24 نانومتر لامينين -111 (+ لن) ل AQP4 و β-دغ. (B) رسم بياني يوضح الاختلافات في مستويات سطح الخلية من AQP4 غير المعالجة و نامينوسيات الناميين المعالجة، تطبيع ضد مستويات β-دغ. تمثل القيم شدة البكسل المتوسطة العادية ± سيم، معبرا عنها بالنسبة لقيم خلايا التحكم. تشير العلامة النجمية إلى إحصائيةزيادة كبيرة في AQP4، كما هو محدد من قبل t-تيست الطالب ذيل اثنين (ن = 3، * p = 0.033). تم تعديل هذا الرقم من ثام إت آل. 16 الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2 . AQP4 التسمم في الخلايا النجمية (A) تم بحث البروتينات التي استوعبت الثقافات النجمية في 0 و 15 و 30 دقيقة ل AQP4. (B) الرسم البياني تلخيص معدلات الاستيعاب الداخلي لل AQP4 لمدة 4 تجارب مستقلة، تطبيع ضد القيم لمدة 0 دقيقة نقطة زمنية. وتشير العلامة النجمية إلى زيادة ذات دلالة إحصائية في كمية AQP4 إندوسيتوسد بين 15 و 30 دقيقة على النحو الذي يحدده ذيل اثنينإد الطالب t -test (ن = 3، * p = 0.017). (C) عندما يستخدم الجلوتاثيون لكسر السندات ثاني كبريتيد في البيوتين التناظرية انشقاق، مساهمة AQP4 سطح الخلية إلى جزء البيروكسيديز انخفض بشكل حاد، مما أدى إلى فرق واضح بين 0 و 15 دقيقة عينات (C، أعلى اليسار ) . عندما يتم حذف هذه الخطوة، فإن الإشارة الصادرة من تجمع سطح الخلية تجعل التغيير بين 2 نقطة زمنية غير قابل للكشف (C، أعلى اليمين) . تم تعديل هذا الرقم من ثام إت آل. 16 الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
التعديلات:
كما تم تصميم هذه الأساليب للاستخدام مع الخلايا الملتصقة، حددنا استخدام برنامج تلفزيوني يحتوي على 100 ملغ / L مغكل 2 ∙ 6H 2 O و
100 ملغم / لتر كاكل 2 (سم-بس) لخطوات الغسيل وكقاعدة بعض المخازن المؤقتة لضمان أن الخلايا لا تزال تعلق على سطح الثقافة وأن تقاطعات الخلية الخلوية لا تتعطل. ومع ذلك، يمكن أيضا أن تطبق البروتوكولات على أنواع الخلايا غير متماسكة إذا كانت الخلايا مكعبات بين كل خطوة من الإجراء. في هذه الحالات، يمكن استبدال سم-بس مع برنامج تلفزيوني.
بالإضافة إلى ذلك، من المهم أن نلاحظ أن كل من الشروط المذكورة هنا هي محددة لهذا البروتوكول، وينبغي أن تعتبر فقط المبادئ التوجيهية الخام إذا كانت الأساليب لاستخدامها لتطبيقات أخرى. على وجه الخصوص، ينبغي للمرء أن يتحقق بشكل مستقل من أن الإجراء استخراج المنظفات هو المناسب ل ثيr نوع الخلية، وأن إعدادات الطرد المركزي هي مناسبة لنوع الخلية، و ستريبتافيدين-الاغاروز الخرز المستخدمة.
وأخيرا، إذا كانت هناك مخاوف بشأن غير محددة ملزمة، و / أو الخلفية المفرطة، يمكن للمرء أن استبدال ستريبتافيدين مع مختلف أشكال أفيدين الأخرى المتاحة حاليا في السوق. على سبيل المثال، أفيدين ديغليكوسيلاتد، لديها تقارب أقل بكثير ل ليكتينس، وجزيئات مشحونة سلبا مثل الحمض النووي.
تحري الخلل وإصلاحه والتحكم فيه:
في حين أن الإجراءات التي تم استعراضها في هذا التقرير هي واضحة إلى حد ما، ينبغي للمرء أن يدرك عدد من القضايا الحرجة التي يمكن أن تؤثر على نتائج التجربة. أولا، في حين أن كلا المقايسات تعتمد بشكل كبير على طبيعة غشاء-مغمورة من الكواشف بيوتينيلاتيون كبريتات، يمكن أن يسبب بعض الشروط غشاء البلازما من الخلايا لتصبح تعطلت، مما أدى إلى بعض بروت الخلاياالبيروكسيديز. للسيطرة على هذا الاحتمال، يقترح أن يتم بحثها الكسور البيروكسيديز لأهداف معروفة لعدم التعبير عنها في غشاء البلازما، مثل β أكتين.
وينبغي للمرء أن يكون حريصا على التمسك ظروف التخزين المناسبة للكواشف بيوتينيلاتيون (عادة 4 أو -20 درجة مئوية، مع شكل من أشكال التجفيف)، وهذه قد تفشل خلاف ذلك، نظرا لطبيعة حساسة للغاية. ومع ذلك، فمن الممارسة الجيدة للتحقيق في المدخلات، والكسور بيوتينيلاتد، والكسور نونبيوتينيلاتد مع ستريبتافيدين-هرب للتأكد من أن بيوتينيلاتيون وقعت بالفعل، وأن البروتينات البيروكسيديز قد عجلت بكفاءة (والتي سوف تكون واضحة من عدم وجود إشارة في غير البيروكسيديز). القيام بذلك يجب أن تسمح للقضاء على إمكانية الكواشف المعيبة.
خفض ثاني كبريتيد السندات هو خطوة حاسمة في إجراء بيوتينيلاتيون إندوسيتيك، كما أنه يضمنأن البروتينات الداخلية فقط سوف تكون معزولة في جزء البيروكسيديز. دمج الضوابط التي يتم حذف كاشف الحد ( الشكل 1 C ) يسمح واحد للحصول على انطباع من فعالية العلاج.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب تعلن أي تضارب في المصالح.
Acknowledgments
وقد تم دعم هذا المشروع من قبل المعهد الكندي للبحوث الصحية بغ # 20R47867.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ammonium chloride (NH4Cl) | Fisher Scientific | A661-500 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A9647-50 | |
| Bromophenol blue | Bio-Rad | #1610404 | |
| cOmplete protease inhibitor cocktail | Sigma-Aldrich | 11697498001 | |
| Disodium Ethylenediaminetetraacetate dihydrate (EDTA) | Bio-Rad | #1610729 | |
| Dithiothreitol (DTT) | Bio-Rad | #1610611 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibco/Thermo Fisher Scientific | 11960-044 | |
| EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotin | Thermo Fisher Scientific | #21335 | |
| EZ-Link Sulfo-NHS-SS-Biotin | Thermo Fisher Scientific | #21331 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco/Thermo Fisher Scientific | 16000-044 | |
| Glycerol | Fisher Scientific | BP229-1 | |
| Glycine | Sigma-Aldrich | G8898 | |
| Iodoacetamide | Bio-Rad | #163-2109 | |
| Laminin from Engelbreth-Holm-Swarm murine sarcoma basement membrane | Sigma-Aldrich | L2020 | Thaw on ice. |
| L-glutamine | Gibco/Thermo Fisher Scientific | 25030-081 | |
| Mouse monoclonal anti-β-actin antibody (AC-15) | Sigma-Aldrich | A5441 | |
| Mouse monoclonal anti-β-dystroglycan antibody (43DAG1/8D5) | Leica Biosystems | B-DG-CE | |
| Penicillin/streptomycin | Gibco/Thermo Fisher Scientific | 15140-122 | |
| Peroxidase AffiniPure Donkey anti-Mouse IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 715-035-150 | |
| Peroxidase AffiniPure Goat anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 111-035-045 | |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Gibco/Thermo Fisher Scientific | 10010-023 | |
| Reduced glutathione | Sigma-Aldrich | G6529 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Fisher Scientific | S271-500 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) | Sigma-Aldrich | 862010 | |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Fisher Scientific | S318-100 | |
| Streptavidin agarose resin | Thermo Fisher Scientific | #20347 | |
| Rabbit polyclonal anti-AQP4 antibody | Alomone | AQP-004 | |
| Tris base (Trizma base) | Fisher Scientific | BP152-1 | |
| Tris-HCl | Fisher Scientific | BP153-1 | |
| Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151-500 |
References
- Baskin, G., Schenker, S., Frosto, T., Henderson, G. Transforming growth factor beta 1 inhibits epidermal growth factor receptor endocytosis and down-regulation in cultured fetal rat hepatocytes. J Biol Chem. 266 (20), 13238-13242 (1991).
- Hazum, E., Cuatrecasas, P., Marian, J., Conn, P. M. Receptor-mediated internalization of fluorescent gonadotropin-releasing hormone by pituitary gonadotropes. Proc Natl Acad Sci U S A. 77 (11), 6692-6695 (1980).
- Hemmaplardh, D., Morgan, E. H. Transferrin uptake and release by reticulocytes treated with proteolytic enzymes and neuraminidase. Biochim Biophys Acta. 426 (3), 385-398 (1976).
- Katsura, T., et al. Constitutive and regulated membrane expression of aquaporin 1 and aquaporin 2 water channels in stably transfected LLC-PK1 epithelial cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 92 (16), 7212-7216 (1995).
- Li, Y., Cam, J., Bu, G. Low-density lipoprotein receptor family: endocytosis and signal transduction. Mol Neurobiol. 23 (1), 53-67 (2001).
- Gyorgy, P., Melville, D. B., Burk, D., Du Vigneaud, V. The possible identity of vitamin H with biotin and coenzyme R. Science. 91 (2358), 243-245 (1940).
- Cole, S. R., Ashman, L. K., Ey, P. L. Biotinylation: an alternative to radioiodination for the identification of cell surface antigens in immunoprecipitates. Mol Immunol. 24 (7), 699-705 (1987).
- Green, N. M. Avidin 1. the use of [14-C]biotin for kinetic studies and for assay. Biochem J. 89 (3), 585-591 (1963).
- Korpela, J. Avidin, a high affinity biotin-binding protein, as a tool and subject of biological research. Med Biol. 62 (1), 5-26 (1984).
- Li, Y., et al. Imaging pHluorin-tagged receptor insertion to the plasma membrane in primary cultured mouse neurons. J Vis Exp. (69), e4450 (2012).
- Soohoo, A. L., Bowersox, S. L., Puthenveedu, M. A. Visualizing clathrin-mediated endocytosis of G protein-coupled receptors at single-event resolution via TIRF microscopy. J Vis Exp. (92), e51805 (2014).
- Noel, G., Tham, D. K., Moukhles, H. Interdependence of laminin-mediated clustering of lipid rafts and the dystrophin complex in astrocytes. J Biol Chem. 284 (29), 19694-19704 (2009).
- Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).
- Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. Proc Natl Acad Sci U S A. 76 (9), 4350-4354 (1979).
- Madrid, R., et al. Polarized trafficking and surface expression of the AQP4 water channel are coordinated by serial and regulated interactions with different clathrin-adaptor complexes. EMBO J. 20 (24), 7008-7021 (2001).
- Tham, D. K., Joshi, B., Moukhles, H. Aquaporin-4 Cell-Surface Expression and Turnover Are Regulated by Dystroglycan, Dynamin, and the Extracellular Matrix in Astrocytes. PLoS One. 11 (10), 0165439 (2016).
