Summary
Due metodi basati sulla biotinilazione, progettati per determinare l'espressione della superficie cellulare e la percentuale endocitica di proteine espressi alla membrana plasmatica, sono presentati in questa relazione.
Abstract
Le proteine delle cellule superano una vasta gamma di funzioni. In molti casi, la loro attività è regolata da processi endocitici che modulano i loro livelli alla membrana plasmatica. Qui presentiamo protocolli dettagliati per 2 metodi che facilitano lo studio di tali processi, entrambi basati sul principio della biotinilazione delle proteine della superficie cellulare. Il primo è stato progettato per consentire la determinazione semiquantitativa dei livelli relativi di una particolare proteina sulla superficie cellulare. In esso, i residui di lisina delle proteine della membrana plasmatica delle cellule vengono prima etichettate con una parte di biotina. Una volta che le cellule sono lisate, queste proteine possono essere specificamente precipitate mediante l'uso di streptavidina immobilizzato da agarosio sfruttando l'affinità naturale di quest'ultimo per la biotina. Le proteine isolate in tal modo possono quindi essere analizzate mediante un approccio Western blotting standard. Il secondo metodo fornisce un mezzo per determinare la velocità endocitica di un particulTarget di superficie cellulare per un periodo di tempo. Le proteine della superficie cellulare vengono prima modificate con un derivato della biotina contenente un legame disolfuro schiarente. Le cellule vengono quindi spostate indietro a condizioni di coltura normali, che provocano l'assunzione endocitica di una percentuale di proteine biotinilate. Successivamente, i legami disolfuro di gruppi di biotina non internalizzati vengono ridotti utilizzando il glutatione impermeabile per riduzione della membrana. Attraverso questo approccio, le proteine endocitose possono quindi essere isolate e quantificate con un elevato grado di specificità.
Introduction
Le proteine alla superficie cellulare svolgono una serie di ruoli centrali per mantenere la funzione cellulare. In numerosi casi, la loro attività dipende o modulata da processi endocitici che li privano temporaneamente in siti intracellulari o che li dirigono verso percorsi degradativi 1 , 2 , 3 , 4 , 5 . Qui evidenziamo 2 approcci basati sulla biotinilazione progettati per consentire all'utente di specificare e isolare in modo specifico le proteine espresse alla membrana plasmatica e quelle recentemente internalizzate. Attraverso questi metodi, l'espressione della superficie cellulare e la velocità endocitica di qualsiasi proteina di interesse possono essere quantificati, consentendo così di ottenere una più chiara valutazione della sua regolamentazione.
Determinazione dell'espressione proteica relativa alla superficie cellulare mediante biotinilazione
La biotina o la vitamina B7, precedentemente nota come vitamina H 6 , è una piccola molecola solubile in acqua che può essere usata per modificare chimicamente gruppi amminici, sulfidrilici e carbossilici reattivi delle molecole biologiche. La coltura attuale di reagenti di biotinilazione a superficie cellulare è costituita principalmente da esteri di N-idrossisuccinimide (sulfo-NHS) solfonati a membrana, biotina o suoi derivati, progettati per reagire con le ammine presenti sulle catene laterali di residui di lisina di proteine espressi La superficie cellulare quando questi diventano deprotonati in condizioni di base, con conseguente formazione di un legame amidico con la parte biotina 7 . Così modificate, le proteine della superficie cellulare possono essere isolate tramite l'uso di avidin, una proteina tetramerica da 66 a 69 kDa che possiede una grande affinità per la biotina, legandola a quest'ultimo con una costante di dissociazione di circa 10-15 , che la contrassegna come uno dei Interazioni non-covalenti più forti conosciute 8 , 9 .
Alcuni metodi alternativi di quantificazione dell'espressione di proteine sulla superficie cellulare sono stati utilizzati negli studi precedenti. L'etichettatura delle cellule non-permeabilizzate usando anticorpi fluorescenti specifici per la proteina di interesse, seguita dalla visualizzazione tramite microscopia a fluorescenza, ad esempio, è un approccio comunemente impiegato, ma è fortemente dipendente dalla disponibilità di anticorpi che possono legarsi ad epitopi extracellulari. Più recentemente sono stati impiegati anche metodi che prevedono l'uso di proteine chimiche contenenti fluorofori sensibili al pH che reagiscono ad essere esposti a supporti acidi. Tuttavia, tali analisi coinvolgono solitamente l'espressione esogena di questi costrutti nelle linee cellulari in cui la proteina di interesse non viene trovata nativamente. Questi approcci sono comunque in grado di fornire informazioni preziose sulla localizzazione subcellulare e l'itinerario esocitario delProteina bersaglio, e quindi dovrebbe essere utilizzato in combinazione con gli approcci basati sulla biotinilazione qui descritti se gli strumenti sono disponibili.
In un test di biotinilazione tipico, le cellule vengono prima lavate accuratamente in PBS a 4 ° C. Ciò elimina tutte le tracce di proteine del siero introdotte dal mezzo di coltura, assicurando così che queste non consumino quantità eccessive di biotina nel passo successivo. Ancora più importante, la riduzione della temperatura induce l'decociazione significativa dell'endocitosi. Viene quindi aggiunto il reagente di biotinazione. Successivamente, le cellule vengono nuovamente lavate e successivamente incubate con un tampone di cottura contenente sia glicina che NH 4 Cl, il cui scopo è quello di inattivare tutte le residue tracce di biotina non reagita. Le cellule vengono quindi lisate, seguendo il quale viene aggiunto streptavidina immobilizzato agarosio per precipitare le proteine biotinilate. L'analisi viene comunemente eseguita mediante blotting occidentale, permettendo la relativa espressione della superficie cellulare su vari prQuantitativi di otteini.
A causa della base di questo test, è adatto solo per le proteine che possiedono porzioni esposte all'ambiente extracellulare. Le proteine di transmembrana multipass, che probabilmente possiedono un certo numero di lisine reattive all'interno delle loro regioni di ciclo, sono il più idoneo a questo metodo, mentre le proteine a singolo passaggio tendono ad essere meno suscettibili di essere biotinilate. Anche in questi casi, resta la possibilità che le modificazioni conformazionali o le interazioni intermolecolari possano occludere determinati siti reattivi, con conseguente rendimento inferiore a quello previsto della biotinilazione.
Determinare la velocità di internalizzazione delle proteine della superficie cellulare mediante biotinilazione
I principi di questo test sono in gran parte simili a quelli della biotinilazione a superficie cellulare, con una serie di eccezioni, il più importante dei quali è l'uso di reattivi reattivi di biotinilazione. I gruppi di biotina (di questi) possiedono disuOsservi le obbligazioni, all'interno delle loro strutture, suscettibili di ridurre gli agenti; Questo è sfruttato per garantire che solo le proteine della superficie cellulare prese in siti intracellulari durante il periodo di dosaggio saranno lasciati biotinilati. Un dosaggio si svolge generalmente nel seguente modo. Le cellule vengono prima lavate e biotinilate con reagenti freddi, quindi viene riportato il terreno di coltura a 37 ° C e le cellule vengono riportate all'incubatrice; Ciò induce le etichettate proteine della superficie cellulare a subire l'endocitosi. L'agente riducente glutatione - che non può penetrare nella membrana - viene quindi aggiunto per rompere i legami disolfuro delle parti biotiniche attaccate a proteine rimaste sulla superficie cellulare. Infine, i legami disolfuro rotti vengono reagiti con iodoacetamide, consumando i gruppi tiolici labili e impedendo i legami di riformare. Come prima, le cellule vengono poi lisate e le proteine etichettate vengono precipitate usando streptavidina-agarosio.
Il disco delle limitazioniUtilizzati nella sezione precedente si applicano anche qui per le somiglianze condivise tra i metodi. Inoltre, vale la pena ricordare che gli spostamenti di temperatura coinvolti in questo dosaggio precludono l'esatta determinazione di quanto proteina sia endocitata per ogni incremento di tempo, in particolare nel caso di proteine rapidamente internalizzate o riciclate rapidamente. Il dosaggio fornisce quindi una stima semiquantitative di tassi endocitici. La microscopia a fluorescenza completa di riflessione interna può essere usata per monitorare l'assorbimento di ogni vescolina caricata e fornire una misurazione più precisa della cinetica dell'endocitosi. Può quindi fornire un complemento molto utile a questo dosaggio, supponendo che sia disponibile un costrutto chimerico tagliato fluorescente della proteina di interesse 11 .
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Protocol
1. Determinazione dell'espressione della proteina cellulare-superficie in astrociti mediante biotinilazione
NOTA: Qui illustriamo l'applicazione di questa tecnica di biotinilazione allo studio degli effetti della laminina molecolare della matrice extracellulare sulla localizzazione della superficie del canale aquaporin-4 (AQP4) permeabile all'acqua. I materiali specializzati necessari per questo dosaggio comprendono la resina sulfo-NHS-LC-biotina e la streptavidina-agarosio (vedi tabella dei materiali ).
- Utilizzando il metodo descritto in Noel et al. 12 , preparare le colture di astrociti corticali circa 2 settimane prima del dosaggio e svilupparle in 75 cm2 palloni di coltura sfiorata. Quando gli astrociti sono confluenti 80-90%, staccandoli dalla superficie della coltura usando il 0,05% di tripsina e quindi passarli 1: 3.
- A 48 ore prima del dosaggio, quando le cellule sono nuovamente confluenti 80-90%, astrociti di passaggio 1: 3Hange nel formato della cultura) su piatti di coltura di cellule da 60 mm in modo che siano> confluenti del 70% al giorno in cui si svolge l'esperimento. Assicurarsi che le celle siano distribuite uniformemente tra i piatti.
- A 16 h prima del dosaggio, pipettare la laminina nel mezzo di coltura fino ad una concentrazione finale di 24 nM ed incubare a 37 ° C.
- Immediatamente prima del dosaggio, preparare quanto segue e quindi mettere in ghiaccio o refrigerare: CM-PBS (100 mg / L MgCl2 · 6H2O e 100 mg / L CaCl2 in 1X PBS, pH 7,4), tampone biotina (0,5 ), Tampone di lisi (25 mM Tris, pH 7,4, 25 mM glicina, 150 mM NaCl e 5 mM), tensioattivo (50 mM NH4Cl in CM-PBS) EDTA, 1% tritone X-100, 1X proteasi inibitore), tampone di carico 3X (150 mM Tris, pH 6,8, 6% SDS, 30% glicerolo, 300 mM DTT e 0,01% blu bromofenolo) Tris (pH 7,4), 1,5 mM EDTA, 150 mM NaCl, 1% Triton X-100, 1 x proteasi inibitore cocktail).
- RemQuesti piatti che tengono le culture astrociste dall'incubatore e scartano il mezzo.
- Lavare le cellule tre volte con 4 ml di CM-PBS refrigerato e mettere i piatti su ghiaccio tritato.
- Pipettare 2 mL di tampone biotino in ogni pozzetto e piegare delicatamente i piatti avanti e indietro qualche volta per assicurare una copertura completa. Lasciare in ghiaccio per 30 min.
- Rimuovere il tampone di biotina usando un aspiratore e sostituirlo con 4 mL di tampone di tiro. Lasciare in ghiaccio per 10 min.
- Aspirare il buffer di spegnimento e sostituire con un volume equivalente dello stesso. Ancora una volta, lasciare in ghiaccio per 10 minuti.
- Scartare il tampone di spegnimento e lavare le cellule tre volte con 4 ml di CM-PBS refrigerato.
- Stabilizzare le cellule in 1 ml di CM-PBS refrigerato usando un sollevatore di celle e trasferire la sospensione al tubo di microcentrifuga.
- Pellet cellule mediante centrifugazione a 100 xg per 3 min. Scartare il supernatante e ri-sospendere le cellule in 500 μl di tampone di lisi.
- Lasciare i campioni in ghiaccio per 30 minuti, vorticando ogni 5 minuti, o plIn un rotatore a 4 ° C.
- Centrifugare il lisato a 14.000 xg per 10 minuti a 4 ° C per far pelliccare tutti i materiali insolubili nel detergente. Trasferire il surnatante in un nuovo tubo di microcentrifuga.
- Salva 50 μL di questo lisato e aggiunge il tampone di caricamento ad esso. Quindi denaturarlo riscaldandosi a 95 ° C in un bagno asciutto; Questa è la frazione "input" contenente sia proteine della superficie cellulare biotinilata, sia proteine citosoliche non biotinilate.
- Estendere l'apertura di una punta pipetta tagliando circa 0,5 cm di materiale dalla sua estremità usando un paio di forbici affilate. Utilizzando questa punta pipetta, trasferire 75 μl di branchi streptavidina-agarosio (normalmente conservati a 4 ° C) al lisato e incubare a 4 ° C per 3 ore su agitatore.
- Poiché lo streptavidina agarosio viene spesso venduto come una sospensione contenente 50% di brani in volume, sospesa in una soluzione antimicrobica, triturare la sospensione per garantire che le perleSono sospesi uniformemente e quindi pipettate 150 μL di sospensione in ciascun campione.
- Pellet streptavidin-agarose per centrifugazione a 1500 xg per 30 s a 4 ° C.
- Salvare 50 μL del supernatante (aggiungere il tampone di caricamento e denaturarlo a 95 ° C in un bagno d'acqua o un blocco di riscaldamento); Questo rappresenta la frazione "intracellulare" e comprende principalmente proteine citosoliche non biotinilate.
- Resispendere le perline di pellet in 1 ml di tampone di lavaggio e scaldare questo per 3 minuti a 4 ° C. Perline di pellicole (come nel punto 1.16) e scartare il surnatante. Ripetere questo processo 4x per ridurre al minimo il legame non specifico di proteine citosoliche non biotinilate.
- Pelletare le perle per centrifugazione (1500 xg per 30 s a 4 ° C) e scartare il buffer di lavaggio sovrastante. Aggiungere 50 μl di tampone di carico 1X (diluito utilizzando buffer lisi). Rilasciare la biotina e streptavidina dai branchi denaturandoli a 95 ° C; Questa frazione di shoUld contengono solo le proteine della superficie delle cellule biotinilate (frazione "superficie cellulare").
- Ingressi separati, cellule superficiali e frazioni intracellulari da SDS-PAGE 13 e analisi mediante blotting occidentale 14 .
NOTA: Mentre abbiamo utilizzato un gel di gradi prefabbricato da 4 a 20% nei nostri esperimenti, un gel di separazione del 12-14% con uno strato di impilamento del 4% (ciascuno contenente 0,1% SDS) dovrebbe bastare per le proteine di interesse in questo studio. Dovrebbe essere utilizzato anche uno standard di peso molecolare della gamma di dimensioni appropriata. Si noti che talvolta ci può essere un upshift osservabile nelle masse molecolari apparenti delle proteine biotinilate.
- Ingressi separati, cellule superficiali e frazioni intracellulari da SDS-PAGE 13 e analisi mediante blotting occidentale 14 .
2. Determinazione della velocità di internalizzazione delle proteine della superficie cellulare in astrociti per biotinilazione
NOTA: Qui di seguito descriviamo un tipico esperimento di biotinilazione impulso-chase utilizzato in questo caso per monitorare l'endocitosi di AQP4 in astrociti. QuestoIl metodo è basato su quello utilizzato da Madrid et al. 15 . I materiali specializzati necessari includono la solfo-NHS-SS-biotina, la resina streptavidina-agarosio, il glutatione ridotto e l'iodoacetamide (vedi tabella dei materiali ).
- Preparare le colture di astrociti corticali del miele in piatti da 60 mm utilizzando i metodi descritti nella sezione precedente. Assicurarsi che le cellule siano circa confluenti del 70% al giorno del dosaggio e che ogni piatto contiene un numero equivalente di celle.
- Immediatamente prima del dosaggio preparare quanto segue e mettere in ghiaccio o refrigerare: CM-PBS (100 mg / L MgCl2 · 6H2O e 100 mg / L CaCl2 in 1X PBS, pH 7,4), tampone biotina (0,5 (50 mM di glutatione ridotta, 75 mM di NaCl e 75 mM di NaOH), di tampone di quenching (50 mM iodoacetamide, 1% di BSA in CM-PBS) Tampone di lisi (25 mM Tris, pH 7.4, 25 mM glicina, 150 mM NaCl e 5 mM EDTA, 1% tritone X-100, 1(10 mM Tris, pH 7,4, 1,5 mM EDTA), tampone di carica 3 volte (150 mM Tris, pH 6,8, 6% SDS, 30% glicerolo, 300 mM DTT e 0,01% bromofenolo blu) 150 mM NaCl, 1% tritone X-100, 1 x proteasi inibitore cocktail).
- Preparare il mezzo di coltura fresco di cellule (DMEM integrato con 10% Fetal Bbovine Serum (FBS), 1% penicillina / streptomicina e 1% L-glutammina) e collocarlo in un bagno d'acqua di 37 ° C.
- Rimuovere le culture astrociste dall'incubatore e aspirare il mezzo utilizzando un aspiratore.
- Lavare le cellule tre volte con 4 ml di CM-PBS refrigerato e mettere i piatti su ghiaccio tritato.
- Pipettare 3 ml di tampone biotino in ogni piatto, inclinare i piatti avanti e indietro qualche volta per assicurare che il tampone sia ben distribuito e lasciarlo su ghiaccio per 30 minuti.
- Aspirare il tampone di biotina e sostituirlo con 5 mL di terreno caldo. Incubare un piatto di coltura a 37 ° C per 15 minuti e un secondo piatto alla stessa temperatura per 30 min. Lasciare un altro piatto a 46; C come campione di 0 min.
- Alla fine del periodo di incubazione, scartare il mezzo e lavare le cellule tre volte con 4 ml di CM-PBS refrigerati. Pipettare 6 mL di tampone riducente sulle cellule e lasciare in ghiaccio per 15 minuti.
- Rimuovere il tampone riducente e quindi sostituirlo con 6 mL di tampone riducente fresco. Mettere in ghiaccio per altri 15 minuti.
- Rimuovere la soluzione riducente e sostituirla con 6 mL di tampone di cottura. Lasciare in ghiaccio per 15 minuti.
- Ripetere lo spegnimento ancora una volta.
- Scartare il tampone di spegnimento e lavare le cellule tre volte con 4 ml di PBS refrigerato.
- Staccare le cellule in 1 ml di PBS refrigerato utilizzando un sollevatore di celle e trasferire la sospensione in un tubo di microcentrifuga.
- Pellet cellule mediante centrifugazione a 100 xg per 3 min. Scartare il surnatante e risospendere le cellule in 500 μl di tampone di lisi.
- Lasciare questo su ghiaccio per 30 minuti e vorticarsi ogni 5 min. In alternativa, posizionare i campioni su un rotatore di fine corsa a 4 ° C per questa durata.
- Centrifugare la lyA 14.000 xg per 10 minuti a 4 ° C per far pelliccare i materiali insolubili nel detersivo, quindi trasferire il surnatante in un nuovo tubo di microcentrifuga. Salvare 50 μl di questo lisato, aggiungere il tampone di caricamento e denaturare a 95 ° C in un bagno asciutto; Questa è la frazione "input", contenente sia proteine endocitose biotinilate, sia proteine non biotinilate.
- Utilizzando una punta di pipetta tagliata, aggiungere 150 μL di slurry di streptavidina-agarosio al lisato e incubare a 4 ° C per 3 ore su agitatore. Vedere 1.15 per ulteriori dettagli su questo passaggio.
- Pellet streptavidin-agarose per per centrifugazione a 1.500 xg per 30 s a 4 ° C.
- Resispendere le perle in 1 ml di tampone di lavaggio e scalpellare per 3 min a 4 ° C. Perline di pellicole (come al punto 2.18), e scartare il supernatante. Ripetere questo processo 4x per ridurre al minimo il legame non specifico di proteine citosoliche non biotinilate.
- Le pellicole vengono centrifugate a 1.500 xg per 30 s, a 4 ° C, e scartano questeTampone lavaggio. Aggiungere 50 μL di tampone di caricamento 1X (diluito utilizzando lysis buffer). Rilasciare biotina e streptavidina da branelli denaturando a 95 ° C; Questa frazione dovrebbe contenere solo proteine delle cellule-superficie internalizzate (frazione "endocitosed").
- Ingresso separato, superficie cellulare e frazioni non legate da SDS-PAGE 13 e analisi mediante blotting occidentale 14 .
NOTA: Mentre abbiamo utilizzato un gel di gradi prefabbricato da 4 a 20% nei nostri esperimenti, un gel di separazione del 12-14% con uno strato di impilamento del 4% (ciascuno contenente 0,1% SDS) dovrebbe bastare per le proteine di interesse in questo studio. Dovrebbe essere utilizzato anche uno standard di peso molecolare della gamma di dimensioni appropriata. Si noti che talvolta ci può essere un upshift osservabile nelle masse molecolari apparenti delle proteine biotinilate.
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Representative Results
Utilizzando la biotinilazione della superficie cellulare per valutare l'espressione della membrana plasmatica di AQP4 in astrociti
Le colture astrocitiche trattate con Laminin e le cellule di controllo non trattate sono state soggette a biotinilazione a superficie cellulare utilizzando i metodi descritti. Le proteine biotinilate sono state precipitate con streptavidina coniugata con agarosio e quindi separate mediante SDS-PAGE. Le frazioni di superficie cellulare sono state analizzate per AQP4 e β-distroglicano (β-DG) come controllo di caricamento a superficie cellulare, mentre le frazioni di input e intracellulari sono state blottate per AQP4 e β-actina ( Figura 1 A ) come controllo di caricamento. Le intensità della banda per la frazione della superficie cellulare sono state quantificate mediante densitometria e i livelli di AQP4 per ciascuna serie di cellule sono normalmente normalizzati contro i valori di β-DG e questi rapporti sono stati normalizzati rispetto a quelli per le cellule di controllo. L'istogramma ( Figura 1 B ) rappresenta i valori medi ± SEM per tre esperimenti indipendenti. Il trattamento con Laminin, in media, provoca un aumento di quasi 2 volte in AQP4 espresso alla superficie cellulare.
Indagare la velocità endocitica di AQP4 usando la biotinilazione
L'endocitosi AQP4 in astrociti è stata monitorata per un periodo di 30 minuti. In breve, un anidride biotina cleavable è stato usato per etichettare le proteine superficiali in 3 piatti di astrociti. Le cellule sono state spostate a 37 ° C rispettivamente per 0, 15 e 30 min, durante le quali le proteine etichettate sono state internalizzate. L'etichettatura rimasta sulla superficie è stata quindi rimossa usando un agente riducente e le proteine endocitose sono state precipitate con streptavidina con agarosio-coniugato. A seguito della separazione tramite SDS-PAGE, questi sono stati quindi esaminati per AQP4 ( Figura 2 A ). I livelli AQP4 sono stati quantificati usando la densitometria ei valori corrispondenti allaI punti temporali di 15 e 30 minuti sono stati normalizzati a quelli per il campione di 0 min. L'istogramma ( Figura 2 B ) rappresenta i valori medi ± SEM per quattro tali esperimenti.
Figura 1 . Espressione AQP4 alla superficie cellulare nella presenza di Laminin. (A) Le frazioni di cellule, intracellulari e totali (Input) da astrociti non trattati (-LN) e astrociti trattati con 24 nM laminin-111 (+ LN) sono stati saggiati per AQP4 e β-DG. (B) Istogramma che illustra le differenze nei livelli di superficie della cellula di astrociti AQP4 non trattati e trattati con laminina, normalizzati contro i livelli di β-DG. I valori rappresentano intensità di pixel mediali normalizzate ± SEM, espresse in rapporto ai valori delle celle di controllo. L'asterisco indica una statisticaL'aumento significativo di AQP4, come determinato da una t- test di due studenti (n = 3, * p = 0.033). Questa cifra è stata modificata da Tham et al. 16 Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2 . AQP4 Internalizzazione negli astrociti (A) Le proteine interne da culture astrociste a 0, 15 e 30 minuti sono state sondate per AQP4. (B) Istogramma che riassume i tassi di internalizzazione di AQP4 per 4 esperimenti indipendenti, normalizzati contro i valori per il tempo di 0 min. L'asterisco indica un aumento statisticamente significativo della quantità di AQP4 endocituted tra 15 e 30 minuti come determinato da una due codaIl test t dell'allievo (n = 3, * p = 0.017). (C) Quando il glutatione viene usato per rompere il legame disolfuro nell'analogo biotina cleavable, il contributo della superficie cellulare AQP4 alla frazione biotinilata è notevolmente ridotto, determinando una chiara differenza tra i campioni 0 e 15 min (C, in alto a sinistra ) . Quando questo passaggio viene omesso, il segnale proveniente dalla piscina di superficie della cella rende la variazione tra i due punti temporali non rilevabili (C, in alto a destra) . Questa cifra è stata modificata da Tham et al. 16 Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
modifiche:
Poiché questi metodi sono stati progettati per l'uso con le cellule aderenti, abbiamo specificato l'uso di PBS contenente 100 mg / L di MgCl2 · 6H2O e
100 mg / L CaCl2 (CM-PBS) per i passaggi di lavaggio e come base di alcuni tamponi in modo da garantire che le cellule rimangano attaccate alla superficie di coltura e che le giunzioni delle cellule cellulari non siano interrotte. Tuttavia, i protocolli possono essere applicati anche a tipi di cellule non aderenti se le cellule vengono raggruppate tra ciascuna fase della procedura. In questi casi, CM-PBS può essere sostituito con PBS.
Inoltre, è importante notare che ognuna delle condizioni qui indicate è specifica per questo protocollo e dovrebbe essere considerata come linee guida ruvide se i metodi devono essere utilizzati per altre applicazioni. In particolare, si deve verificare in modo indipendente che la procedura di estrazione del detergente sia appropriataR e che le impostazioni della centrifuga sono adatte per il tipo di cella e per le perle di streptavidina-agarosio in uso.
Infine, se ci sono preoccupazioni per uno sfondo vincolante e / o eccessivo non specifico, uno può sostituire streptavidina con le varie forme avidiniche attualmente disponibili sul mercato. Ad esempio, l'avidina degglosilata ha una affinità significativamente più bassa per le lectine e per le molecole caricate negativamente come il DNA.
Risoluzione dei problemi e controlli:
Mentre le procedure esaminate in questa relazione sono abbastanza semplici, bisogna considerare una serie di problemi critici che possono influenzare il risultato dell'esperimento. Innanzitutto, sebbene entrambi i dosaggi dipendono fortemente dalla natura impermeante dei reagenti di biotinilazione solfati, alcune condizioni potrebbero causare la membrana plasmatica delle cellule per essere interrotta, determinando così una certa proteina intracellulareIns biotinilati. Per controllare questa possibilità, si suggerisce che le frazioni biotinilate debbano essere esaminate per obiettivi noti per non essere espressi alla membrana plasmatica, come β-actina.
Bisogna fare attenzione a rispettare le condizioni di stoccaggio adeguate per i reagenti di biotinilazione (tipicamente 4 o -20 ° C, con una qualche forma di essiccazione), poiché questi potrebbero non funzionare altrimenti, a causa della loro natura altamente sensibile. Tuttavia, è buona pratica sondare le frazioni in ingresso, biotinilate e non biotinilate con streptavidin-HRP per accertare che la biotinilazione è effettivamente verificata e che le proteine biotinilate sono state precipitate in modo efficiente (che sarà evidente dall'assenza di un segnale nel Frazione non biotinilata). Ciò dovrebbe permettere l'eliminazione della possibilità di reagenti difettosi.
La riduzione del legame di disolfuro è un passo cruciale nella procedura di biotinilazione endocitica, in quanto garantisceChe solo le proteine interne saranno isolate nella frazione biotinilata. Incorporando controlli in cui il reagente riduttore è omesso ( Figura 1 C ) permette di ottenere un'impressione dell'efficacia del trattamento.
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Disclosures
Gli autori dichiarano assenza di conflitto di interesse.
Acknowledgments
Questo progetto è stato sostenuto dall'Istituto canadese di ricerca sulla salute PG # 20R47867.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ammonium chloride (NH4Cl) | Fisher Scientific | A661-500 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A9647-50 | |
| Bromophenol blue | Bio-Rad | #1610404 | |
| cOmplete protease inhibitor cocktail | Sigma-Aldrich | 11697498001 | |
| Disodium Ethylenediaminetetraacetate dihydrate (EDTA) | Bio-Rad | #1610729 | |
| Dithiothreitol (DTT) | Bio-Rad | #1610611 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibco/Thermo Fisher Scientific | 11960-044 | |
| EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotin | Thermo Fisher Scientific | #21335 | |
| EZ-Link Sulfo-NHS-SS-Biotin | Thermo Fisher Scientific | #21331 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco/Thermo Fisher Scientific | 16000-044 | |
| Glycerol | Fisher Scientific | BP229-1 | |
| Glycine | Sigma-Aldrich | G8898 | |
| Iodoacetamide | Bio-Rad | #163-2109 | |
| Laminin from Engelbreth-Holm-Swarm murine sarcoma basement membrane | Sigma-Aldrich | L2020 | Thaw on ice. |
| L-glutamine | Gibco/Thermo Fisher Scientific | 25030-081 | |
| Mouse monoclonal anti-β-actin antibody (AC-15) | Sigma-Aldrich | A5441 | |
| Mouse monoclonal anti-β-dystroglycan antibody (43DAG1/8D5) | Leica Biosystems | B-DG-CE | |
| Penicillin/streptomycin | Gibco/Thermo Fisher Scientific | 15140-122 | |
| Peroxidase AffiniPure Donkey anti-Mouse IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 715-035-150 | |
| Peroxidase AffiniPure Goat anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 111-035-045 | |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Gibco/Thermo Fisher Scientific | 10010-023 | |
| Reduced glutathione | Sigma-Aldrich | G6529 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Fisher Scientific | S271-500 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) | Sigma-Aldrich | 862010 | |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Fisher Scientific | S318-100 | |
| Streptavidin agarose resin | Thermo Fisher Scientific | #20347 | |
| Rabbit polyclonal anti-AQP4 antibody | Alomone | AQP-004 | |
| Tris base (Trizma base) | Fisher Scientific | BP152-1 | |
| Tris-HCl | Fisher Scientific | BP153-1 | |
| Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151-500 |
References
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